專利名稱：對(duì)映選擇性生物轉(zhuǎn)化制備蛋白酪氨酸激酶抑制劑中間體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的對(duì)映體純的立體異構(gòu)體的方法，該立體異構(gòu)體在對(duì)映體富集的醚連接的2-氨基吡啶類似物的合成中是有用的中間體，該類似物可有效抑制人肝細(xì)胞生長因子受體的自磷酸化作用，從而可用于治療癌癥和其它過度增殖性病癥。
背景技術(shù)：
獲得化合物的單一對(duì)映異構(gòu)體的策略在藥物開發(fā)中正變得日益重要，因?yàn)榻?jīng)常一種對(duì)映異構(gòu)體是有效的藥物，而另一對(duì)映異構(gòu)體具有不符合需要的生物活性。理想的是，設(shè)計(jì)不對(duì)稱合成來僅僅生產(chǎn)所需的對(duì)映異構(gòu)體。不幸的是，不對(duì)稱合成常常不能被設(shè)計(jì)，或者花費(fèi)高得驚人。
雖然用從硼氫化鈉、三甲基硅烷基氯化物和催化量的(S)-α，α-二苯基吡咯烷甲醇制備的還原劑將1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮對(duì)映選擇性地還原為了(1R)-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇，其中對(duì)映體純度為96％對(duì)映體過量(ee)(Jiang等人.Tetrahedron Lett.，2000，第41卷，第10281-10283頁)，但是仍然不能化學(xué)合成生產(chǎn)(1S)-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇，該化合物是在某些對(duì)映體富集的醚連接的2-氨基吡啶類似物的合成中的中間體，該類似物可有效抑制人肝細(xì)胞生長因子受體(HGFR或c-MET)的自磷酸化作用。c-MET(HGFR)抑制劑的實(shí)例、其合成和用途可以在2004年2月26日提交的標(biāo)題為“Aminoheteroaryl Compounds as Protein Kinase Inhibi tors”的美國專利申請(qǐng)系列第10/786,610號(hào)及2004年2月26日提交的相同標(biāo)題的相應(yīng)國際申請(qǐng)PCT/US2004/005495中找到，其公開內(nèi)容被全文引入本文作為參考。
我們嘗試使用不同的化學(xué)試劑，例如(R)-2-甲基-CBS-唑硼烷/BH3-二甲基硫醚復(fù)合物(BMS)(J.Am.Chem.Soc.1987，第109卷，第7925頁)；硼氫化鈉、三甲基硅烷基氯化物和催化量的(S)-α，α-二苯基吡咯烷甲醇(Jiang等人.Tetrahedron Lett.，2000，第41卷，第10281-10283頁)；唑硼烷/BH3-二甲基硫醚復(fù)合物(BMS)(J.Org.Chem.1993，第58卷，第2880頁)；和(-)-B-chlorodiisopinocamphenylborane(DIP-Cl)(TetrahedronLett.1997，第38卷，第2641頁)，通過1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的手性還原，制備具有足夠的對(duì)映體純度的(1S)-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇，但并不成功。
已知可以使用諸如酶或微生物等生物催化劑通過立體選擇性還原生產(chǎn)對(duì)映體純的醇。例如，來自棒狀桿菌菌株ST-10的苯乙醛還原酶有很寬的作用底物范圍，可將各種前手性芳族酮和β-酮酯還原，生成對(duì)映體純度大于98％對(duì)映體過量(ee)的旋光仲醇，Itoh等人，Eur.J.Biochem.，2002，第269卷，第2394-2402頁。根據(jù)生物催化劑不對(duì)稱還原酮類領(lǐng)域中近來發(fā)展的綜述，例如，為了還原2-甲基-3-氧代丁酸乙酯，在450個(gè)菌株中發(fā)現(xiàn)了肺炎克雷白桿菌IFO 3319能以＞99％ee.生成相應(yīng)的(2R，3S)-羥基酯，K.Nakamura等人.TetrahedronAsymmetry，2003，第14卷，第2659-2681頁。美國專利第5,310,666號(hào)公開了深紅酵母菌株，它100％還原己酮可可堿，生成S-醇。美國專利第6,451,587號(hào)提供了從酮2-氯-1-[6-(2，5-二甲基-吡咯-1-基)-吡啶-3-基]-乙酮制備醇(K)-2-氯-1-[6-(2，5-二甲基-吡咯-1-基)-吡啶-3-基]-乙醇的微生物不對(duì)稱還原法。美國專利第6,642,387和6,515,134號(hào)公開了利用微生物還原制備某些旋光羥乙基吡啶衍生物。美國專利第5,391,495號(hào)公開了立體選擇性還原某些含酮的磺酰胺化合物形成相應(yīng)的含羥基的化合物，利用能夠催化所述還原的微生物或酶。全細(xì)胞生物催化劑用于還原3，4-二氯苯酰甲基氯，以高產(chǎn)率和良好ee.到高ee.生成(K)-或(S)-氯乙醇，Barbieri等人.TetrahedronAsymmetry，1999，第10卷，第3931-3937頁。在非水性環(huán)境——無水己烷中通過生物還原苯乙酮獲得R和S構(gòu)型和高對(duì)映體純度的非外消旋的1-苯基乙基醇。Zymanczyk-Duda等人，EnzymeMicrobiol.Technol.，2004，第34卷，第578-582頁。WO 02/077258描述了通過微生物還原制備某些(S)-1-(2，4-取代的-苯基)乙醇衍生物。然而，1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的立體選擇性微生物還原和酶還原仍是未知的。
可選擇地，可以分離對(duì)映異構(gòu)體的混合物。然而，對(duì)映異構(gòu)體混合物很難、而且常常不可能分離，因?yàn)閷?duì)映異構(gòu)體的物理性質(zhì)對(duì)于非手性物質(zhì)是相同的，而且只有通過它們對(duì)于其它手性物質(zhì)的行為才能得以區(qū)分。使用手性固相的色譜法已經(jīng)被用于分離對(duì)映異構(gòu)體混合物，但是手性固體載體很昂貴，并且拆分能力通常很差。
分離對(duì)映異構(gòu)體混合物的可選擇的方法是通過將它們與手性試劑反應(yīng)。在這種方法中，對(duì)映異構(gòu)體混合物與手性試劑反應(yīng)形成非對(duì)映異構(gòu)體，在其對(duì)于非手性物質(zhì)的性質(zhì)的基礎(chǔ)上，所述非對(duì)映異構(gòu)體彼此之間是可區(qū)分的，因此可以通過諸如重結(jié)晶或色譜等技術(shù)分離。這種方法很耗時(shí)，并且導(dǎo)致產(chǎn)率損耗，因?yàn)樗枰獌蓚€(gè)額外的反應(yīng)步驟(即一個(gè)反應(yīng)是將手性助劑添加到對(duì)映異構(gòu)體中，另一個(gè)反應(yīng)是在非對(duì)映異構(gòu)體已被分離之后將其取出)。
在一些情況下，手性試劑與一種對(duì)映異構(gòu)體的反應(yīng)會(huì)比與對(duì)映異構(gòu)體混合物中另一對(duì)映異構(gòu)體的反應(yīng)快得多。在這種情況下，反應(yīng)較快的對(duì)映異構(gòu)體可以在另一對(duì)映異構(gòu)體形成之前被取出。這種方法也需要兩個(gè)額外的反應(yīng)步驟來加入手性助劑和分離之后將其取出。
上述方法不能總是成功地應(yīng)用于特定系統(tǒng)，當(dāng)它們可以應(yīng)用時(shí)，它們經(jīng)常是很昂貴的、耗時(shí)的、且導(dǎo)致產(chǎn)率損耗。因此，對(duì)于從對(duì)映異構(gòu)體混合物中獲得單一對(duì)映異構(gòu)體的新方法還存在著需求。
已知化合物的手性拆分可以利用酶例如酯酶、脂肪酶、和蛋白酶或微生物來實(shí)現(xiàn)。例如，美國專利第6,703,396號(hào)描述了核苷對(duì)映異構(gòu)體的外消旋混合物的手性拆分，其是基于C5’-核苷酯的酶水解。美國專利第6,638,758號(hào)描述了利用諸如酶或微生物等生物催化劑進(jìn)行的內(nèi)酰胺外消旋酯的酶法拆分。美國專利第5,928,933號(hào)公開了對(duì)于N-(烷氧羰基)-4-酮-D，L-脯氨酸烷基酯對(duì)映體過量值為95％的酶，這是對(duì)44種酶的反應(yīng)特異性進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，包括蛋白酶、脂肪酶和酯酶。例如在Danda等人，Tetrahedron，1991，第47卷，第8701-8716頁；Vanttinen等人.TetrahedronAsymmetry，1995，第6卷，第1779-1786頁；和Liu等人，Chirality，2002，第14卷，第25-27頁中描述了通過聯(lián)用酶水解和化學(xué)轉(zhuǎn)化制備某些旋光仲醇。
雖然生物催化劑對(duì)于分離對(duì)映異構(gòu)體混合物是非常有用的，因?yàn)閷?duì)映異構(gòu)體的選擇性和產(chǎn)物的光學(xué)純度可根據(jù)對(duì)酶或微生物的選擇以及底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)而改變，仍然需要大量的努力來尋找適合于底物的生物催化劑的聯(lián)合。尤其是，還沒有發(fā)現(xiàn)利用生物催化劑分離對(duì)映異構(gòu)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的方法。
發(fā)明概要提供了制備1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的對(duì)映體純的立體異構(gòu)體的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇，它至少70％不含(1K)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇；優(yōu)選至少80％不含(1K)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇；更優(yōu)選至少90％不含(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇；最優(yōu)選至少95％不含(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離對(duì)映異構(gòu)的式(I)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的方法 其中，R是氫、C1-C20-烷基、C3-C8-環(huán)烷基、C6-C14-芳基、C7-C15-芳烷基、C1-C20-烷氧基或C1-C20-烷氨基，其中，所述烴基可以任選被羥基、甲?；⒀趸?、C1-C6-烷氧基、羧基、巰基、磺基、氨基、C1-C6-烷氨基、硝基或鹵素單取代或多取代，該方法包括下列步驟在水溶液、有機(jī)溶劑、或有機(jī)溶劑和含水溶劑的混合物中，將式(I)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯與生物催化劑接觸，其中，只有一種對(duì)映異構(gòu)體被選擇性水解，生成1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光異構(gòu)體和1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的未反應(yīng)的旋光異構(gòu)體，和將1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光異構(gòu)體與未反應(yīng)的旋光1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯分離。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的方法，包括下列步驟將對(duì)映異構(gòu)的式(I)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物 其中，R是氫、C1-C20-烷基、C3-C8-環(huán)烷基、C6-C14-芳基、C7-C15-芳烷基、C1-C20-烷氧基或C1-C20-烷氨基，其中，所述烴基任選被羥基、甲?；?、氧基、C1-C6-烷氧基、羧基、巰基、磺基、氨基、C1-C6-烷氨基、硝基或鹵素單取代或多取代，與生物催化劑在水溶液、有機(jī)溶劑、或有機(jī)溶劑和含水溶劑的混合物中接觸，其中，只有(R)-對(duì)映異構(gòu)體被選擇性水解，生成(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物；和將(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物轉(zhuǎn)變成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
該方法中的其它具體實(shí)施方案包括那些，其中，轉(zhuǎn)變步驟包括a)在非質(zhì)子溶劑中將(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物中的(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇與有機(jī)磺酰鹵反應(yīng)，形成(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的有機(jī)磺酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物；b)在非質(zhì)子溶劑中進(jìn)一步將(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的有機(jī)磺酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物中的(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的有機(jī)磺酸酯與脂肪族羧酸的堿金屬鹽反應(yīng)，形成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的脂肪族羧酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物；和c)將(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的脂肪族羧酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物轉(zhuǎn)化成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
該方法的又一些其它具體實(shí)施方案包括那些，其中R是甲基；生物催化劑是豬肝酯酶；在反應(yīng)步驟a)中，有機(jī)磺酰鹵是甲磺酰氯，和非質(zhì)子溶劑是吡啶；在反應(yīng)步驟b)中，脂肪族羧酸的堿金屬鹽是醋酸鉀，和非質(zhì)子溶劑是二甲基甲酰胺；轉(zhuǎn)化步驟c)是在含醇或含水溶劑中，在堿性物質(zhì)的存在下的溶劑分解作用。
該方法的又一些具體實(shí)施方案包括那些，包括在接觸步驟之前通過高通量篩選法選擇生物催化劑的步驟。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光異構(gòu)體的方法，包括以對(duì)映選擇性的方式通過生物催化劑還原1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮，生成1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光異構(gòu)體的步驟。
該方法的其它具體實(shí)施方案包括那些，包括在接觸步驟之前通過高通量篩選法選擇生物催化劑的步驟。
該方法的其它具體實(shí)施方案包括那些，其中生物催化劑是馬肝醇脫氫酶或紅酵母屬微生物。
定義術(shù)語“生物催化劑”當(dāng)用于本文中時(shí)指的是酶或微生物。
本發(fā)明中所用的酶的活性用″單位″表示。單位被定義為室溫下以μmol/min表示的對(duì)硝基苯基丙酸酯的水解速率。
術(shù)語″生物轉(zhuǎn)化″當(dāng)用于本文中時(shí)指的是物質(zhì)利用酶或微生物轉(zhuǎn)化成其它化合物。
術(shù)語″生物還原″當(dāng)用于本文中時(shí)指的是其中利用酶或微生物將電子加到原子或離子上(如通過加氫或去氧)的過程；該過程總是伴隨著還原劑的氧化而發(fā)生。
術(shù)語″輔因子″或“輔酶”指的是激活酶或者對(duì)于酶的正?；钚员匦璧奈镔|(zhì)。術(shù)語″輔因子″或“輔酶”當(dāng)用于本文中時(shí)，指的是構(gòu)成酶還原系統(tǒng)的任何適當(dāng)?shù)妮o因子或輔酶諸如NADH、NADPH、FADH、FMNH和/或PQQ等，或與微生物中的酶伴隨存在的任何適當(dāng)?shù)妮o因子或輔酶。
術(shù)語″酶″包括那些那些酶，其是已知的，或者有關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的，且能夠完成本發(fā)明所公開的立體選擇性反應(yīng)。
術(shù)語″酶還原系統(tǒng)″指的是合適的氧化還原酶和對(duì)于該氧化還原酶還原形式的輔因子。構(gòu)成酶還原系統(tǒng)的酶可為游離形式或?yàn)楣潭ɑ问?，例如在柱?nèi)，或附著到珠粒上。
術(shù)語″酶法拆分″、″酶過程″、″酶方法″或″酶促反應(yīng)″表示的是利用酶或微生物的本發(fā)明的拆分、過程、方法或反應(yīng)。
術(shù)語″拆分″表示的是外消旋形式的對(duì)映異構(gòu)體的部分的、以及優(yōu)選完全的分離。
術(shù)語″立體選擇性水解″指的是一種對(duì)映異構(gòu)體相對(duì)于另一種對(duì)映異構(gòu)體的優(yōu)先水解。
術(shù)語″混合物″當(dāng)用于本文中涉及對(duì)映異構(gòu)化合物時(shí)，表示的是具有等量(外消旋)或不等量對(duì)映異構(gòu)體的混合物。
術(shù)語″對(duì)映體過量(ee)″與先前的術(shù)語″光學(xué)純度″有關(guān)。在純對(duì)映異構(gòu)體(S或R)和外消旋體的混合物中，對(duì)映體過量是對(duì)映異構(gòu)體相對(duì)于外消旋體的過量百分比。對(duì)映體過量(“ee”)可以用下列方程式1表示，例如方程式1ee=[S]-[R][S]+[R]]]>[S]＝S對(duì)映異構(gòu)體的濃度[R]＝R對(duì)映異構(gòu)體的濃度術(shù)語″對(duì)映選擇性值″或“E值”表示的是以下定義的外消旋體的各個(gè)對(duì)映異構(gòu)體的特異性常數(shù)的比(Kcat/Km)。E值可以解釋為酶對(duì)一種對(duì)映異構(gòu)體比對(duì)另一種反應(yīng)性更大的倍數(shù)(例如，E值為50表示一種對(duì)映異構(gòu)體反應(yīng)比另一種快大約50倍)。
為了確定生物催化劑對(duì)純對(duì)映異構(gòu)體(S或R)的對(duì)映選擇性，需要獲得對(duì)映選擇性值(E)(方程式2)。
方程式2E=KcatS/KSKcatR/KR=ln[1-c(1+eep)]ln[1-c(1-eep)]=ln[1-c(1-ees)]ln[1-c(1+ees)]]]>KcatS＝對(duì)映異構(gòu)體S的一級(jí)酶速率常數(shù)KS＝米氏常數(shù)c＝轉(zhuǎn)化程度eep＝產(chǎn)物的對(duì)映體過量ees＝底物的對(duì)映體過量例如，對(duì)于生物催化劑進(jìn)行的酯的立體選擇性水解來說，程序(Ee2軟件-University of Graz)可以精確地計(jì)算E值，如果醇或酯在一個(gè)特定酶轉(zhuǎn)化下的對(duì)映體過量(ee)已知的話。可以例如從方程式1獲得ee值?？梢岳缤ㄟ^HPLC獲得[S]和[R]數(shù)據(jù)。
術(shù)語“HPLC”表示高壓液相色譜。
術(shù)語“RP-HPLC”表示反相HPLC。
術(shù)語“PLE”表示豬肝酯酶。
術(shù)語″微生物還原″表示由酶還原系統(tǒng)、構(gòu)成酶還原系統(tǒng)的微生物還原酶、完整微生物或其任何制品等等完成的立體選擇性還原。
術(shù)語″微生物″包括任何完整的微生物或由此得到的制品，包括例如，微生物的破碎細(xì)胞制品；微生物的脫水制品，例如丙酮粉酶制品；沖洗過不含例如發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)肉湯等的微生物；固定的微生物，例如在柱內(nèi)、附著到珠粒上等等。
當(dāng)用于本文中時(shí)，術(shù)語″光學(xué)純的″、″對(duì)映體純的″、″純對(duì)映異構(gòu)體″和″光學(xué)純的對(duì)映異構(gòu)體″指的是包含化合物的一種對(duì)映異構(gòu)體的組合物，且基本上不含該化合物相對(duì)的對(duì)映異構(gòu)體。典型的光學(xué)純的化合物包含大于約80％重量的該化合物的一種對(duì)映異構(gòu)體，和小于約20％重量的該化合物相對(duì)的對(duì)映異構(gòu)體，更優(yōu)選大于約90％重量的該化合物的一種對(duì)映異構(gòu)體，和小于約10％重量的該化合物相對(duì)的對(duì)映異構(gòu)體，甚至更優(yōu)選大于約95％重量的該化合物的一種對(duì)映異構(gòu)體，和小于約5％重量的該化合物相對(duì)的對(duì)映異構(gòu)體，最優(yōu)選大于約97％重量的該化合物的一種對(duì)映異構(gòu)體，和小于約3％重量的該化合物相對(duì)的對(duì)映異構(gòu)體。
術(shù)語″適當(dāng)?shù)耐蛔凅w″包括那些微生物，它們是相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或可獲得的，且雖然有這樣的突變，卻仍然能夠完成本發(fā)明中公開的立體選擇性反應(yīng)。
術(shù)語″鹵(代)″或“鹵素”，當(dāng)用于本文中時(shí)，除非另外說明，表示氟、氯、溴或碘。優(yōu)選的鹵素基團(tuán)是氟、氯和溴。
術(shù)語″烷基″，當(dāng)用于本文中時(shí)，除非另外說明，包括具有直鏈或支鏈部分的飽和單價(jià)烴基。
術(shù)語″烷氧基″，當(dāng)用于本文中時(shí)，除非另外說明，包括O-烷基，其中烷基如上定義。
術(shù)語“Me”表示甲基， “Et”表示乙基，和“Ac”表示乙?；?。
術(shù)語“環(huán)烷基”，當(dāng)用于本文中時(shí)，除非另外說明，指的是非芳香的、飽和或部分飽和的、單環(huán)或稠合的、螺環(huán)或非稠合雙環(huán)或三環(huán)的烴，在本文中指代包含總共3到10個(gè)碳原子，優(yōu)選5-8個(gè)環(huán)碳原子。示范性的環(huán)烷基包括具有3-7個(gè)、優(yōu)選3-6個(gè)碳原子的單環(huán)，例如環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基和環(huán)庚基等。
術(shù)語″芳基″當(dāng)用于本文中時(shí)，除非另外說明，包括通過去除一個(gè)氫而從芳族烴衍生的有機(jī)基團(tuán)，如苯基或萘基。
發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及制備1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的對(duì)映體純的立體異構(gòu)體的生物催化方法。公開的是制備所需的(S)-對(duì)映異構(gòu)體的方法，該方法是基于對(duì)1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯的酶法拆分、化學(xué)酯化和化學(xué)水解伴隨反轉(zhuǎn)的聯(lián)合，或用諸如酶或微生物等生物催化劑立體選擇性生物還原2，6-二氯-3-氟-苯乙酮。
I.自動(dòng)生物催化劑篩選法根據(jù)本發(fā)明，使用有效且實(shí)用的高通量篩選(HTS)法從數(shù)百種諸如酶或微生物等潛在的生物催化劑中鑒定所需的生物催化劑，以及多種潛在的反應(yīng)參數(shù)中，在這些參數(shù)下它們可以最佳發(fā)揮作用。包括溶劑、溶劑含量、pH、溫度、時(shí)間和協(xié)同底物等在內(nèi)的這些參數(shù)在很多時(shí)候是非線性相關(guān)的這一事實(shí)使得篩選工作更具挑戰(zhàn)性。
已經(jīng)在Pfizer內(nèi)部經(jīng)多個(gè)整體項(xiàng)目驗(yàn)證有效的總體HTS方案描述在Yazbeck等人，Adv.Synth.Catal.，2003，第345卷，第524-532頁中。使用該方案，可以建立起數(shù)百個(gè)反應(yīng)，并在數(shù)日內(nèi)進(jìn)行分析，否則利用簡單的小瓶反應(yīng)制品可能需要花費(fèi)數(shù)周時(shí)間。使用該方案獲得的主要優(yōu)點(diǎn)在于它只需要極少量的生物催化劑例如可能相當(dāng)昂貴的酶，以及所篩選的外消旋底物，該底物通常是以有限量提供的藥物中間體。在該HTS方案背后的根本基礎(chǔ)在于酶可以在某些制備條件下在適當(dāng)?shù)?6-孔板中被穩(wěn)定并保存數(shù)月。第二個(gè)基本的要求在于很多不同的分析儀器可用來分析經(jīng)由這些96-孔板篩選的許多種底物。可用的一些分析工具包括高效液相色譜(HPLC)、毛細(xì)管電泳(CE)、氣相色譜(GC)、UV分光光度法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)。選擇利用哪個(gè)分析工具取決于底物的性質(zhì)，主要是它的吸光度特性和揮發(fā)性。通常首先分析酶對(duì)底物的反應(yīng)性，接著利用手性方法分析反應(yīng)標(biāo)的(reactive hits)。同一采樣的96-孔板既可以用于分析反應(yīng)性又可以用于分析對(duì)映選擇性。該篩選方案與統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化算法聯(lián)用可以迅速有效地讓用戶預(yù)測重要條件，和提出在哪里應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。
II.通過聯(lián)用酶法拆分和化學(xué)轉(zhuǎn)化制備旋光1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇提供了拆分1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇對(duì)映異構(gòu)體混合物的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括使用諸如酶或微生物等優(yōu)先催化混合物中一種對(duì)映異構(gòu)體的反應(yīng)的生物催化劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法包括酶法拆分，其是基于1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯的立體選擇性水解。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，基于物理結(jié)構(gòu)的新的區(qū)別，反應(yīng)過的對(duì)映異構(gòu)體可從未反應(yīng)的對(duì)映異構(gòu)體中分離。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化伴隨反轉(zhuǎn)可將反應(yīng)過的對(duì)映異構(gòu)體轉(zhuǎn)變成另一種對(duì)映異構(gòu)體。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)過的對(duì)映異構(gòu)體向另一種對(duì)映異構(gòu)體的轉(zhuǎn)變可在反應(yīng)過的對(duì)映異構(gòu)體和未反應(yīng)的對(duì)映異構(gòu)體的混合物中進(jìn)行。
II(a).基于1-(2，6-二氯氟苯基)乙基酯的立體選擇性水解的酶法拆分提供了酶法拆分1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇對(duì)映異構(gòu)體混合物的立體選擇性水解方法。按照本文的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠利用上述高通量篩選(HTS)法選擇酶或微生物，所述酶或微生物對(duì)于所選擇的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯對(duì)映異構(gòu)體是選擇性的，或?qū)τ诓幌Ｍ膶?duì)映異構(gòu)體是選擇性的(作為消除它的方法)，通過選擇以下討論的酶或微生物中的一種，或通過系統(tǒng)評(píng)價(jià)其它已知的酶或微生物。按照該公開，當(dāng)對(duì)于獲得所希望的拆分必需時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還將能知道如何修飾底物。通過利用手性NMR位移試劑、旋光分析或手性HPLC，可以測定回收的酯或醇的旋光富集。參見例如J.Am.Chem.Soc.1973，第95卷，第512頁；Trost等人，J.Org.Chem.1986，第51卷，第2370-2374頁；J.Org.Chem.1998，第63卷，第8957頁；TetrahedronAsymmetry 1995，第6卷，第2385頁；TetrahedronAsymmetry 1996，第7卷，第3285頁。
下列實(shí)施例進(jìn)一步闡示了使用酶或微生物來拆分對(duì)映異構(gòu)體的外消旋混合物。拆分外消旋混合物的其它已知方法可以與本文公開的拆分方法聯(lián)合使用。參見例如Roger A Sheldon，Chirotechnologyindustrial synthesis of optically active compounds，New York，Marcel Dekker，1993。所有這些修飾都認(rèn)為在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
在該實(shí)施方案中，該方法包括使1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇對(duì)映異構(gòu)體混合物的羥基與?；衔锓磻?yīng)，形成酯，其中，1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇在酯的″原醇(carbinol)″末端。然后用生物催化劑處理1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯對(duì)映異構(gòu)體混合物，該生物催化劑優(yōu)先裂解或水解一種對(duì)映異構(gòu)體，而非另一種對(duì)映異構(gòu)體。
該方法的優(yōu)點(diǎn)在于它可以用于拆分多種在原醇部分中被任選取代的1-(苯基)乙醇。該方法的寬適用性可以部分在于如下事實(shí)雖然酯的原醇部分可以在生物催化劑區(qū)分對(duì)映異構(gòu)體的能力中發(fā)揮作用，但是這些生物催化劑的主要識(shí)別部位卻可以在酯的羧酸部分。進(jìn)一步地，人們可以成功地將一種生物催化劑/底物研究的結(jié)果外推到另一個(gè)表面上不同的系統(tǒng)，只要這兩種底物的羧酸部分相同或基本相似。
該方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于未水解的對(duì)映異構(gòu)體和水解的對(duì)映異構(gòu)體從反應(yīng)混合物中的分離可以相當(dāng)簡單。未水解的對(duì)映異構(gòu)體可以比水解的對(duì)映異構(gòu)體更親脂，且可以通過用很多非極性有機(jī)溶劑或溶劑混合物例如己烷和己烷/乙醚中的一種進(jìn)行簡單萃取而有效回收。然后，親脂性較弱的、極性較強(qiáng)的水解了的對(duì)映異構(gòu)體可以用極性更大的有機(jī)溶劑例如乙酸乙酯萃取獲得，或通過凍干，接著例如用乙醇或甲醇萃取。
酶或微生物可單獨(dú)使用或聯(lián)合使用。根據(jù)所用的酶或微生物的類型，酯的任一種旋光異構(gòu)體被主要地水解產(chǎn)生旋光醇?？赏ㄟ^選擇適當(dāng)?shù)拿富蛭⑸铽@得任一種旋光異構(gòu)體。
將酶和底物適當(dāng)匹配之后，可以建立起分離任一1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇對(duì)映異構(gòu)體的條件。可以用水解所需的對(duì)映異構(gòu)體的酶處理外消旋混合物(接著用極性溶劑萃取極性水解產(chǎn)物)，或用水解不想要的對(duì)映異構(gòu)體的酶處理外消旋混合物(接著用非極性溶劑除去不想要的對(duì)映異構(gòu)體)，分離所需的對(duì)映異構(gòu)體。
II(b).生物催化劑在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，酶法拆分法利用作為立體選擇性水解1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯的生物催化劑的酶。催化酯水解的酶的實(shí)例包括但不限于酯酶、脂肪酶和蛋白酶(枯草桿菌蛋白酶(substillisin)和α-糜蛋白酶)。酶可為可從動(dòng)物、植物、微生物等獲得的任何酶。酶可以任何常規(guī)形式使用，例如純化形式、粗制形式、與其它酶的混合物、微生物發(fā)酵肉湯、發(fā)酵肉湯、微生物體、發(fā)酵肉湯的濾液等，或者單獨(dú)使用，或者聯(lián)合使用。另外，酶或微生物體可固定在樹脂上。
酶的具體實(shí)例是在本發(fā)明中有用的從動(dòng)物和植物中獲得的那些酶，包括但不限于，牛肝酯酶、豬肝酯酶、豬胰酯酶、馬肝酯酶、狗肝酯酶、豬磷酸酶、可從大麥和馬鈴薯中獲得的淀粉酶、和可從小麥中獲得的脂肪酶。例如，在不對(duì)稱合成中應(yīng)用豬肝酯酶描述在Tetrahedron，1990，第46卷，第6587-6611頁；Enzyme Catalysisin Organic Synthesis，第2版，Wiley-VCH 2002，第II卷，第384-397頁中。其它實(shí)例是從諸如以下的微生物中獲得的水解酶，如紅酵母屬、木霉屬、假絲酵母屬、漢森酵母屬、假單胞菌屬、桿菌屬、無色桿菌屬、諾卡菌屬、色桿菌屬、黃桿菌屬、根霉屬、毛霉屬、曲霉屬、產(chǎn)堿桿菌屬、片球菌屬、克雷白桿菌屬、地霉屬、乳桿菌屬(Lactobaccilus)、隱球菌屬、畢赤氏酵母屬、短梗霉屬、放射毛霉屬(Actinomucor)、腸桿菌屬、球擬酵母屬、棒狀桿菌屬、內(nèi)孢霉屬、糖酵母屬(Saccaromyces)、節(jié)桿菌屬、梅奇酵母屬(Metshnikowla)、灰側(cè)耳菌屬(Pleurotus)、鏈霉菌屬、變形菌屬、膠霉屬、醋酸桿菌屬、長蠕孢屬、短桿菌屬、埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、犁頭霉屬、微球菌屬、細(xì)桿菌屬、青霉屬和裂褶菌屬(Schizophyllium)，以及從地衣和藻類中獲得的。
適用于本發(fā)明的示范性的商業(yè)可獲得的酶包括酯酶，如豬肝酯酶(Biocatalytics Inc)，脂肪酶，如Amano PS-30(洋蔥假單胞菌)，Amano GC-20(念珠地絲菌)，Amano APF(黑曲霉)，Amano AK(假單胞菌)，螢光假單胞菌脂肪酶(Biocatalytics Ltd.)，Amano Lipase P30(假單胞菌)，Amano P(螢光假單胞菌)，Amano AY-30(柱狀假絲酵母)，Amano N(雪白根霉)，Amano R(青霉菌)，Amano FAP(稻根霉)，AmanoAP-12(黑曲霉)，Amano MAP(米赫毛霉)，Amano GC-4(念珠地絲菌)，Sigma L-0382和L-3126(豬胰)，Lipase OF(Sepracor)，Esterase30,000(Gist-Brocarde)，KID Lipase(Gist-Brocarde)，Lipase R(根霉屬，Amano)，Sigma L-3001(麥胚)，Sigma L-1754(柱狀假絲酵母)，Sigma L-0763(粘稠色桿菌)和Amano K-30(黑曲霉)。另外，來自動(dòng)物組織的典型的酶包括來自胰腺的糜蛋白酶和胰酶，如豬胰脂肪酶(Sigma)。當(dāng)執(zhí)行本發(fā)明的方法時(shí)，可利用兩種或多種以及單個(gè)酶。
另外，可以使用絲氨酸羧基肽酶。這些酶來自溶脂念珠菌、釀酒酵母、小麥(Triticum aestivum)和微紫青霉菌?？缮藤彽慕宦?lián)酶結(jié)晶也可使用，例如來自Altus Biologics，Inc.(例如ChiroCLEC-CR、ChiroCLEC-PC、ChiroCLEC-EC)。
本發(fā)明還涉及耐熱酯酶和遺傳工程酯酶在酯類拆分中的應(yīng)用。可購自ThermoGen，Inc.的這些酶尤其適用于工業(yè)過程，且易于使用。除了在大范圍溫度包括高溫下起作用以外，這些耐熱酶具有延長的儲(chǔ)存期，這有利于操作。由于它們?cè)诓僮鳁l件下的穩(wěn)定性，這些酶也能耐受通常與工業(yè)加工有關(guān)的苛刻的非生物條件(pH、鹽濃度等)。在多次應(yīng)用中，它們可以被固定進(jìn)行再使用，提高了操作過程的費(fèi)用效益。
在酶法拆分之后分離產(chǎn)物的過程中，酶經(jīng)常暴露于痕量有機(jī)溶劑。另外，發(fā)現(xiàn)一些酶法拆分在含水溶劑和有機(jī)溶劑的混合物中，或在單獨(dú)的有機(jī)溶劑中能很好地工作。本發(fā)明的酯酶相對(duì)于常規(guī)酶更能耐受很多有機(jī)溶劑的變性作用，這帶來了更長時(shí)間的操作半壽期。大部分酯酶是利用基因克隆的遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)的，這確保了這些酶的純度，和在規(guī)模擴(kuò)增期間易于過程控制。代替分離的酶，還可利用可以產(chǎn)生任意以上討論的酶的微生物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，酶法拆分法利用微生物作為立體選擇性水解1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯的生物催化劑。在本發(fā)明中有用的微生物的具體實(shí)例包括但不限于小紅酵母、深紅酵母、克魯氏假絲酵母、柱狀假絲酵母、熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、莓實(shí)假單胞菌、惡臭假單胞菌、螢光假單胞菌、銅綠假單胞菌、華根霉、微小毛霉、黑曲霉、糞產(chǎn)堿桿菌、耶耳氏球擬酵母、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草桿菌黑色變種、弗羅因德枸櫞酸桿菌、變易細(xì)球菌、藤黃微球菌、乳酸片球菌、肺炎克雷白桿菌、透孢犁頭霉、白地霉、裂褶菌、均勻諾卡菌津山(tsuyanarenus)變種、均勻諾卡菌、巧克力色桿菌、異常漢森酵母ciferrii變種、異常漢森酵母、多形漢森酵母、水解無色桿菌、極小無色桿菌、Achromobactersinplex、白球擬酵母、腐爛棒桿菌、地霉內(nèi)孢霉、Saccaromycescarrvisial、球形節(jié)桿菌、灰色鏈霉菌、藤黃微球菌、陰溝腸桿菌、馬棒狀桿菌、干酪乳桿菌、白色隱球菌、多形畢赤氏酵母、常見青霉、出芽短梗霉菌、雅致放射毛霉、灰色鏈霉菌、普通變形桿菌、粉紅粘帚霉、綠粘帚霉、金黃醋桿菌、長蠕孢屬、碘色桿菌、青紫色桿菌、泥色黃桿菌、美極梅奇酵母、糙皮側(cè)耳、產(chǎn)氨短桿菌、乳發(fā)酵短桿菌、大腸埃希桿菌、小紅酵母texensis變種、長枝木霉、爪哇毛霉、樹狀黃桿菌、肝素黃桿菌和莢膜黃桿菌。
在本發(fā)明中所用的酶和/或微生物可為粗產(chǎn)物形式或?yàn)楣潭ɑ问?。它們可以固定在各種固體載體上而不喪失其立體專一性或改變其立體選擇性。固體載體可以是惰性吸附劑，酶不共價(jià)鍵合到它上面。取而代之的是，酶例如通過蛋白質(zhì)的疏水或親水部分與惰性吸附劑的相似區(qū)域的相互作用，通過氫鍵，通過鹽橋形成，或通過靜電相互作用而被吸附。惰性吸附材料包括但不限于，合成聚合物(例如聚苯乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯和聚酰胺)，礦物化合物(mineralaceous compounds)(例如硅藻土和漂白土)，或天然存在的聚合物(例如纖維素)。這樣的材料的具體實(shí)例包括Celite 545硅藻土、Abelite XAD-8聚合樹脂珠粒和聚乙二醇8000。
酶也可固定在酶與之共價(jià)鍵合的載體(例如環(huán)氧乙烷-丙烯酸珠粒和戊二醛活化的載體)上。具體實(shí)例包括Eupergit C環(huán)氧乙烷-丙烯酸珠粒和戊二醛活化的Celite 545。其它可能的固定系統(tǒng)是公知的，且對(duì)于酶固定化領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是易于獲得的。
代替上述常規(guī)固定法，還可通過用硫酸銨簡單沉淀出用過的酶，而將酶方便地再循環(huán)重復(fù)利用。沉淀出的酶-硫酸銨可以直接用于下一酶水解。鹽通常用于酶的純化。它們通常通過降低溶劑的活性而保護(hù)蛋白質(zhì)酶。例如硫酸銨、硫酸鉀、磷酸鉀、氯化鈉等可以用于使酶活性恢復(fù)再生。
酶或微生物可單獨(dú)使用或聯(lián)合使用。根據(jù)所用的酶或微生物的類型，酯的任一旋光異構(gòu)體被主要水解生成旋光醇?？赏ㄟ^選擇適當(dāng)?shù)拿富蛭⑸铽@得任一旋光異構(gòu)體。
II(c).底物利用所選的酶系統(tǒng)通過評(píng)價(jià)多種同系物可以確定用于酯化1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的最有效的酰基，而不需過度的實(shí)驗(yàn)。可以被評(píng)價(jià)用于具體的酶或微生物的?；姆窍拗菩詫?shí)例包括烷基羧酸和取代的烷基羧酸，包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。對(duì)于某些酶或微生物來說，可能優(yōu)選使用顯著吸電子的?；衔镆酝ㄟ^弱化酯鍵而促進(jìn)水解。吸電子?；膶?shí)例包括α-鹵代酯，如2-氯丙酸、2-氯丁酸和2-氯戊酸。α-鹵代酯對(duì)于脂肪酶是極好的底物。另外，使用琥珀酸酐作為?；瘎┩ㄟ^脂肪酶-催化的?；饔脕韺?shí)踐拆分芳基-烷基醇已經(jīng)報(bào)道在了Bouzemi等人.Tetrahedron Lett.，2004，第45卷，第627-630頁中。
本領(lǐng)域已知的不同酯化方法可用于制備1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯底物。參見例如J.Chem.Soc.Chem.Commun.1989，第18卷，第1391頁；J.Org.Chem.1994，第59卷，第6018頁。
II(d).酶水解的反應(yīng)條件本發(fā)明的酶水解可通過將1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯與酶或微生物接觸來進(jìn)行，通常在適當(dāng)攪拌的含水緩沖介質(zhì)中。
緩沖介質(zhì)可為無機(jī)酸鹽緩沖液(例如磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉)、有機(jī)酸鹽緩沖液(例如檸檬酸鈉)、或任何其它合適的緩沖液。緩沖液的濃度可為0.005到2M，優(yōu)選0.005到0.5M，這將取決于特定1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯和所用的酶或微生物。
在非均一條件下進(jìn)行的酶水解可能會(huì)導(dǎo)致重現(xiàn)性差。因此，優(yōu)選水解在均一條件下進(jìn)行。根據(jù)1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯的溶解度，通過使用表面活性劑可以實(shí)現(xiàn)均一性。優(yōu)選的表面活性劑包括但不限于非離子表面活性劑，如烷基芳基聚醚醇。優(yōu)選的表面活性劑是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，以Triton X-100(Sigma Chemical Company)可商購。使用有效量的表面活性劑。典型的量可以是0.05％到約10％(v/v)。
然而，這些表面活性劑不僅僅幫助溶解原料，它們還增強(qiáng)產(chǎn)物的水溶性。因此，雖然通過加入非離子表面活性劑可以比在非均一條件下更有效地進(jìn)行酶促反應(yīng)，然而回收的原料和產(chǎn)物的分離卻可能更困難?？梢杂眠m當(dāng)?shù)纳V和化學(xué)(例如選擇性鹽形成)技術(shù)分離產(chǎn)物。
有時(shí)優(yōu)選加入有效量的有機(jī)共溶劑來增大產(chǎn)物的溶解度以促進(jìn)反應(yīng)。共溶劑的實(shí)例包括但不限于乙腈、THF、DMSO、DMF、醇類等。有效量的共溶劑包括1％到30％(v/v)，這取決于特定1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯和所用的酶或微生物。
酶水解通常是用催化量的酶在含水緩沖液中進(jìn)行，該緩沖液具有接近于所述酶的最佳pH的pH。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，由于釋放出的羧酸而導(dǎo)致pH下降。可以加入含水的堿來將pH維持在接近于該酶的pH的最佳值。通過監(jiān)測pH改變和維持pH所需的堿的量可以很容易地確定反應(yīng)進(jìn)程。
緩沖液的pH或反應(yīng)的pH通常為4到10，優(yōu)選5到9，最優(yōu)選7到8。反應(yīng)溫度可為0到100℃，且要取決于具體的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯和所用的酶或微生物。反應(yīng)時(shí)間通常為1小時(shí)到70小時(shí)，且要取決于具體的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯、酶濃度和所用的酶或微生物。正常地，允許酶水解進(jìn)行足以產(chǎn)生令人滿意量的所需的酯或令人滿意光學(xué)純度的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的一段時(shí)間。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，可以通過HPLC和手性HPLC監(jiān)測所需的酯或醇的量及其光學(xué)純度。正常地，轉(zhuǎn)化進(jìn)行至大約50％，之后可經(jīng)過分離以良好的產(chǎn)率獲得醇和酯。
所用的酶的量可在很大范圍內(nèi)變化，從5單位到12,000單位的酶每摩爾原料。所需的酶的量將取決于溫度，具體的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯，所用的酶和/或微生物，以及所需的反應(yīng)時(shí)間。在一些情況下也可能想要使用大量的酶來確保實(shí)踐中很短的反應(yīng)時(shí)間，尤其是當(dāng)酶是固定化的且可以重復(fù)利用多次周轉(zhuǎn)的時(shí)候。酯底物的濃度可為0.1g/L到500g/L，這取決于具體的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯和所用的酶和/或微生物。
II(e).產(chǎn)物分離可以使用常規(guī)方法從水解混合物中分離所需的產(chǎn)物，光學(xué)純的(或富集的)未反應(yīng)的酯和光學(xué)純的(或富集的)醇，上述方法例如提取、酸-堿提取、過濾、色譜法、結(jié)晶或其組合。Andreas Liese，等人，Industrial Biotransformations，WeinheimWILEY-VCH，2000?；厥盏拿富蛭⑸锟扇缟纤鲈傺h(huán)利用。
II(f).基于酯化和化學(xué)水解伴隨反轉(zhuǎn)的對(duì)映異構(gòu)轉(zhuǎn)化根據(jù)本發(fā)明，任一1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇對(duì)映異構(gòu)體可轉(zhuǎn)化為另一種1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇對(duì)映異構(gòu)體，如果需要的話?？赏ㄟ^例如伴隨著立體反轉(zhuǎn)的C-1處的親核取代反應(yīng)進(jìn)行這種轉(zhuǎn)化?？梢允褂糜H核試劑進(jìn)行這樣的反應(yīng)。
將旋光醇轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的對(duì)映異構(gòu)體的方法包括但不限于以下方法。
例如，一種方法包括將特定對(duì)映異構(gòu)體的不對(duì)稱碳原子上的羥基轉(zhuǎn)化成有機(jī)磺酸酯，優(yōu)選甲磺酸酯或?qū)妆交撬狨?，其?jīng)由其一種羧酸酯及其隨后的溶劑分解或水解，通過親核取代和構(gòu)型反轉(zhuǎn)直接轉(zhuǎn)變成另一種對(duì)映異構(gòu)體?；撬狨ナ怯梢阎椒ㄖ苽涞?，通過將任一1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇對(duì)映異構(gòu)體與有機(jī)磺酰鹵、優(yōu)選甲磺酰氯和對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)，在非質(zhì)子溶劑、優(yōu)選吡啶和二氯甲烷中反應(yīng)，如果適當(dāng)?shù)脑?，在堿例如三乙胺的存在下。
例如在Danda等人，Tetrahedron，1991，第47卷，第8701-8716頁；和Wang等人，J.Med.Chem.，2000，第43卷，第13期，第2566-2574頁中描述了一種方法，包括用發(fā)煙HNO3或甲磺酰氯將旋光醇酯化成硝酸酯或甲磺酸酯，在中性(在0.7到2.0當(dāng)量CaCO3或NaOAc的存在下)、堿性(K2CO3)或酸性條件(2.5％H2SO4水溶液或2.5％HNO3水溶液)下立體反轉(zhuǎn)水解所得的硝酸酯或甲磺酸酯。
例如在J.Am.Chem.Soc.，1965，第87卷，第3682頁；和J.Chem.Soc.，1954，第965頁中描述了一種方法，包括將旋光醇轉(zhuǎn)化成諸如對(duì)甲苯磺酸酯等磺酸酯，讓有機(jī)酸鹽諸如醋酸四乙銨和醋酸鈉(和乙酸)與所得的磺酸酯反應(yīng)，立體反轉(zhuǎn)成相應(yīng)的有機(jī)酸酯，并水解所得的有機(jī)酸酯。
例如在Chem.Lett.，1976，第893頁中描述了一種方法，包括將旋光醇酯化成諸如三氯乙酸酯等羧酸酯，并在諸如75％H2O-二烷等水-醚溶劑中水解所得的酸酸酯。
另一個(gè)實(shí)例是Mitsunobu反應(yīng)，該反應(yīng)包括將旋光醇與有機(jī)酸在三芳基膦(例如三苯基膦)和偶氮二羧酸酯如偶氮二羧酸二乙酯的存在下反應(yīng)，形成立體反轉(zhuǎn)的相應(yīng)的有機(jī)酸酯，并水解所得的酯。有機(jī)酸包括例如甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸和苯甲酸等。有機(jī)酸酯的形成可在例如約-60℃到60℃的溫度下進(jìn)行。反應(yīng)可在惰性溶劑如芳族烴(例如苯、甲苯等)和醚(例如四氫呋喃等)中進(jìn)行?；?摩爾旋光醇，三烷基膦、有機(jī)酸和偶氮二羧酸酯的比例分別是約0.7到2.0摩爾。通過諸如酸性水解或堿性水解等常規(guī)方法可以進(jìn)行有機(jī)酸酯的水解。參見例如Synthesis，1981，第1頁；Danda等人，Tetrahedron，1991，第47卷，第8701-8716頁；Vanttinen等人.TetrahedronAsymmetry，1995，第6卷，第1779-1786頁；和Liu等人，Chiraliry，2002，第14卷，第25-27頁。
II(g).酶水解、酯化和化學(xué)水解伴隨反轉(zhuǎn)的聯(lián)用酶法拆分法的一個(gè)主要的限制在于最大產(chǎn)率是基于外消旋體的50％。作為克服這個(gè)限制的方法，可使用酶水解、酯化和化學(xué)水解伴隨反轉(zhuǎn)的聯(lián)用。參見例如Danda等人，Tetrahedron，1991，第47卷，第8701-8716頁；Vanttinen等人.TetrahedronAsymmetry，1995，第6卷，第1779-1786頁；和Liu等人，Chirality，2002，第14卷，第25-27頁。
根據(jù)本發(fā)明，基于上述過程的一鍋內(nèi)的酯化和化學(xué)水解伴隨反轉(zhuǎn)，通過酶水解獲得的光學(xué)純的(或富集的)未反應(yīng)的酯和光學(xué)純的(或富集的)醇的粗混合物可以進(jìn)行對(duì)映異構(gòu)的轉(zhuǎn)變。
根據(jù)1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯底物，適當(dāng)?shù)拿富蛭⑸锟梢杂糜诿杆?，且可以選擇適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)水解條件。例如，未反應(yīng)的(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯和反應(yīng)過的(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇未分離的粗反應(yīng)物可以用甲磺酰氯來酯化，如在Danda等人，Tetrahedron，1991，第47卷，第8701-8716頁；和Wang等人，J.Med.Chem.，第43卷，第2566-2574頁中所述。接著，所得的相應(yīng)的(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基甲磺酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯未純化的粗混合物可以水解得到(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇，(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基甲磺酸酯反轉(zhuǎn)了，而(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯保留。在具體實(shí)施方案中，1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基酯底物是1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯。在具體實(shí)施方案中，酶是豬肝酯酶。
將(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇轉(zhuǎn)化成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的方法也可以應(yīng)用于將(S)-對(duì)映異構(gòu)體轉(zhuǎn)變成(R)-對(duì)映異構(gòu)體。
II(h).外消旋作用和應(yīng)用于動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分任一光學(xué)純的(或富集的)未反應(yīng)的酯和光學(xué)純的(或富集的)醇可以被外消旋化，如果想要的話。光學(xué)純的(或富集的)未反應(yīng)的酯可以在適當(dāng)條件下，在適當(dāng)堿中，通過加熱而被外消旋化?？蛇x擇地，光學(xué)純的(或富集的)未反應(yīng)的酯可以在適當(dāng)條件下，在醇的存在下，在酸中通過加熱而被外消旋化。光學(xué)純的(或富集的)未反應(yīng)的醇也可以在適當(dāng)條件下，在酸中，通過加熱而外消旋化和轉(zhuǎn)變成外消旋的酯。以這種方式，通過這種聯(lián)用立體選擇性酶水解和外消旋技術(shù)可以獲得極好產(chǎn)率的任一光學(xué)純的(或富集的)未反應(yīng)的酯或光學(xué)純的(或富集的)醇。
例如，動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分法(或二級(jí)不對(duì)稱轉(zhuǎn)化)可以用于仲醇，其中，在酶法拆分過程中，醇被諸如基于釕的催化系統(tǒng)等金屬催化劑不斷地外消旋化。Dijksman等人，TetrahedronAsymmetry，2002，第13卷，第879-884頁；Kim等人，J.Am.Chem.Soc.，2003，第125卷，第11494-11495頁；Choi等人，J.Org.Chem.，2004，第69卷，1972-1977。
II(i).酶催化的酰化作用酶促反應(yīng)已被證明對(duì)于通過動(dòng)力學(xué)拆分從外消旋形式中獲得光學(xué)富集的化合物是一種方便的方法。C.-H.Wong和G.M.Whitesides，Enzymes in Synthetic Organic Chemistry，Pergamon，Oxford(1994)；K.Faber，Biotransformations in Organic Chemistry，Springer，Berlin(1995)；Gotor，Vicente.“Enzymes In OrganicSolventsThe Use Of Lipases And(R)-Oxynitrilase For ThePreparation Of Products Of Biological Interest.”Molecules[Electronic Publication]2000，第5卷，第290-292頁。
例如，在通常不可逆的反應(yīng)中，醇可以用烯醇酯通過脂肪酶-催化的酯交換(?；?而拆分。Y.F.Wang，J.J.Lalonde，M.Momongan，D.E.Bergbreiter and C.-H.Wong.J.Am.Chem.Soc.1988，第110卷，第7200-7205頁。然而，制備感興趣的是，該過程需要(i)高對(duì)映選擇性因子E，(ii)從產(chǎn)物(酯)中容易分離未反應(yīng)的底物(醇)。已顯示使用環(huán)酐作為?；瘎樵撔枨筇峁┝吮憷慕鉀Q方法。Bouzemi等人.Tetrahedron Lett.，2004，第45卷，第627-630頁。所產(chǎn)生的酸-酯可以通過簡單的堿水溶液-有機(jī)溶劑液-液萃取而從未反應(yīng)的醇中容易地分離。而且，由于這些化合物的分離是容易的，即使產(chǎn)物和未反應(yīng)的底物的量有很大區(qū)別，也可以從外消旋底物獲得高對(duì)映體純度的醇，即使在E值很低的情況下，只要?；饔眠M(jìn)行到了高轉(zhuǎn)化率。
可以用溶于二乙醚的外消旋底物進(jìn)行反應(yīng)。然后可以加入乙酸乙烯酯或乙酸異丙烯酯(2當(dāng)量)或琥珀酸酐(1當(dāng)量)，接著加入酶。例如，可以使用可商購的脂肪酶，如螢光假單胞菌脂肪酶(PFL)和南極假絲酵母脂肪酶B(CAL B)，這是一種固定化酶。所得的混合物可以在室溫下攪拌合適的時(shí)間，以達(dá)到大約50％的轉(zhuǎn)化率。用烯醇酯作為酰化劑，通過硅膠快速色譜分離未反應(yīng)的醇和所產(chǎn)生的乙酸酯。在分離之前用手性HPLC通過分析可測定這兩種化合物的ee。用琥珀酸酐作為?；瘎?，未反應(yīng)的醇例如(S)-醇和所產(chǎn)生的(R)-單琥珀酸酯可以通過堿水溶液-有機(jī)溶劑液-液萃取分離?？梢杂脷溲趸c使水相變成堿性，所得的(R)-醇用有機(jī)溶劑萃取。未反應(yīng)的(S)-富集的-醇和所產(chǎn)生的(R)-富集的-醇的對(duì)映體過量可以通過例如手性HPLC來評(píng)價(jià)。
III.1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的對(duì)映選擇性生物還原本發(fā)明提供了制備1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇旋光異構(gòu)體的方法，包括以對(duì)映選擇性的方式在水溶液、有機(jī)溶劑、或有機(jī)溶劑和含水溶劑的混合物中，通過生物催化劑還原1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮，得到1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇旋光異構(gòu)體的步驟。根據(jù)本文的公開，通過選擇一種本文討論的酶或微生物，或通過系統(tǒng)評(píng)價(jià)其它已知的酶或微生物，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠利用上述高通量篩選(HTS)法選擇將1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮選擇性還原成任一1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇對(duì)映異構(gòu)體的酶或微生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將在本文提供的說明的基礎(chǔ)上明白如何選擇生物還原反應(yīng)的條件，以實(shí)現(xiàn)所需的立體選擇性。通過使用手性NMR位移試劑、旋光分析或手性HPLC，可以測定回收的醇的光學(xué)富集。參見例如J.Am.Chem.Soc.1973，第95卷，第512頁；Trost等人，J.Org.Chem.1986，第51卷，第2370-2374頁；J.Org.Chem.1998，第63卷，第8957頁；TetrahedronAsymmetry 1995，第6卷，第2385頁；TetrahedronAsymmetry 1996，第7卷，第3285頁。
然后在它優(yōu)選在某些對(duì)映體富集的、醚連接的2-氨基吡啶類似物(該2-氨基吡啶類似物能有效抑制人肝細(xì)胞生長因子受體的自磷酸化作用)的合成中用作中間體(如本文實(shí)施例3所述)之前，從任何殘留的底物和其它反應(yīng)組分中，利用本領(lǐng)域公知的方法(例如可以用適當(dāng)?shù)娜軇┤鏜eOH萃取反應(yīng)混合物，和用RP-HPLC分析；相應(yīng)的醇可以從其它有機(jī)物中通過快速色譜分離，和純化了的醇可以用手性HPLC分析，參見例如Allenmark等人.Enzyme Microbial Technol.，1989，第11卷，第177-179頁)，任選分離所需的對(duì)映異構(gòu)體，例如(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
一般而言，通過本發(fā)明的立體選擇性生物還原過程，只有極少量(例如約1％ee到約5％ee)(如果有的話)的所需的對(duì)映異構(gòu)體被生產(chǎn)出來。然而如果希望，所需的對(duì)映異構(gòu)體的量可以從不想要的對(duì)映異構(gòu)體的量中被實(shí)質(zhì)分離出來，例如通過結(jié)晶。
本發(fā)明的方法很容易實(shí)現(xiàn)。因此，在一定量底物1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的存在下，酶或微生物或者被溫育(酶、破碎的細(xì)胞制品、脫水制品或任何其它合適的微生物制品)，或者被發(fā)酵(完整的微生物)，由此一步產(chǎn)生比不想要的對(duì)映異構(gòu)體更大量的所需的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇對(duì)映異構(gòu)體，導(dǎo)致光學(xué)富集的對(duì)映異構(gòu)體。
對(duì)于本發(fā)明方法來說原則上適合的是能夠?qū)Ⅳ驶衔锘蛉┻€原成醇的所有微生物，如真菌、酵母或細(xì)菌，或酶或酶系統(tǒng)，如各種醇和醛脫氫酶，乳酸或甲酸脫氫酶，優(yōu)選醇和醛脫氫酶。在培養(yǎng)后(濕生物量)或在凍干后(干物質(zhì))，微生物可以直接用于本發(fā)明的方法。有利地使用的微生物或酶是能夠?qū)?-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮還原成所需的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇對(duì)映異構(gòu)體，且對(duì)映體純度超過85％ee，優(yōu)選超過90％ee，和特別優(yōu)選超過9 5％ee的那些微生物或酶。合適的微生物的實(shí)例是下列各屬的生物產(chǎn)堿桿菌屬、曲霉屬、白僵菌屬、假絲酵母屬、隱球菌屬、彎孢霉屬、色二孢屬、擬內(nèi)孢霉屬、地霉屬、漢森酵母屬、克勒克酵母屬、克魯維酵母屬、乳桿菌屬、毛霉屬、諾卡菌屬、青霉屬、Pfaffia、畢赤氏酵母屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、紅酵母屬、糖酵母屬、裂殖糖酵母屬、Sporidiobolus、鏈霉菌屬、球擬酵母菌屬或耶氏酵母屬。有利地使用上述屬的以下種富養(yǎng)產(chǎn)堿菌、黑曲霉、煙曲霉、巴西安白僵菌、吉利蒙假絲酵母、溶脂念珠菌、璞膜假絲酵母、Candida methylica、近平滑念珠菌、木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)、皺摺假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、鐮形彎孢霉、棉色二孢、瘦弱隱球菌、念珠地絲菌、異常漢森酵母、Hansenulabeckii、Hansenula holstii、溫奇氏漢森酵母、多形漢森酵母、毛霉屬、珠紅諾卡菌、Pfaffia rhodozyma、Pichia glucozyma、發(fā)酵性畢赤氏酵母、Pichia capsulata、季也蒙畢赤氏酵母、膜醭畢赤氏酵母、巴斯德畢赤氏酵母、螢光假單胞菌、洋蔥假單胞菌、紅串紅球菌、赤紅球菌、深紅酵母、纖細(xì)紅酵母、膠粘紅酵母、小紅酵母、Rhodotorulatermusruber、釀酒酵母、葡萄汁酵母、乳品酵母、魯酵母、巴斯德酵母、Saccharomyces kluyveri、日本裂殖糖酵母、解蘋果酸裂殖糖酵母、八孢裂殖糖酵母、粟酒裂殖糖酵母、Torulopsis enokii、Torulopsis methanothermo和解脂耶氏酵母。優(yōu)選使用各種酵母屬，如假絲酵母屬、漢森酵母屬、克勒克酵母屬、克魯維酵母屬、Pfaffia、畢赤氏酵母屬、紅酵母屬、糖酵母屬、裂殖糖酵母屬、球擬酵母菌屬和耶氏酵母屬。尤其優(yōu)選使用的是下列屬和種吉利蒙假絲酵母、溶脂念珠菌、璞膜假絲酵母、Candida methylica、近平滑念珠菌、木蘭假絲酵母、皺摺假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、異常漢森酵母、Hansenulabeckii、Hansenula holstii、溫奇氏漢森酵母、多形漢森酵母、Pfaffiarhodozyma、Pichia glucozyma、發(fā)酵性畢赤氏酵母、Pichiacapsulata、季也蒙畢赤氏酵母、膜醭畢赤氏酵母、巴斯德畢赤氏酵母、深紅酵母、纖細(xì)紅酵母、膠粘紅酵母、小紅酵母、Rhodotorulatermusruber、釀酒酵母、葡萄汁酵母、乳品酵母、Saccharomyceskluyveri、魯酵母、巴斯德酵母、Saccharomyces kluyveri、日本裂殖糖酵母、解蘋果酸裂殖糖酵母、八孢裂殖糖酵母、粟酒裂殖糖酵母、Torulopsis enokii、Torulopsis methanothermo和解脂耶氏酵母，非常特別優(yōu)選下列屬和種深紅酵母、釀酒酵母、葡萄汁酵母、日本裂殖糖酵母、發(fā)酵性畢赤氏酵母、多形漢森酵母、纖細(xì)紅酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和木蘭假絲酵母。
微生物可進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以提高細(xì)胞內(nèi)的酶生產(chǎn)，在同一細(xì)胞內(nèi)提供輔酶-再生的酶，由于細(xì)胞內(nèi)存在底物特異性重疊但對(duì)映選擇性不同的兩個(gè)以上的酶而提高較差的對(duì)映選擇性，解決過度代謝的問題，等等，例如在Nakamura等人.TetrahedronAsymmetry，2003，第14卷，第2659-2681頁中所述。
一種或多種任何適合的微生物可用于本發(fā)明的過程。如早先所述，在主題過程中所用的微生物可以是完整的，其任何適合的制品，例如其破碎的細(xì)胞制品、其脫水的制品，且是游離的或固定化的。然而，當(dāng)不完整的微生物用于本發(fā)明的時(shí)候，例如破碎的細(xì)胞制品，如細(xì)胞提取物、丙酮粉酶制品、或由此得到的酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解，酶的適當(dāng)?shù)妮o因子也包括在內(nèi)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將從本文提供的說明及其相關(guān)知識(shí)中理解如何制備合適的破碎細(xì)胞制品，例如描述在Patel等人，Appl.Environ.Microbiol.，1979，第38卷，第219-223頁中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將從本文提供的說明及其相關(guān)知識(shí)中理解如何制備合適的丙酮粉酶制品，例如描述在Nakamura等人，Tetrahedron Lett.，1996，第37卷，第1629-1632頁；Nakamura等人，TetrahedronAsymmetry，2003，第14卷，第2659-2681頁中。
酶可為可從動(dòng)物、植物、微生物等中獲得的任何酶。酶可以任何常規(guī)形式被利用，例如以純化形式、粗產(chǎn)物形式、與其它酶的混合物、微生物發(fā)酵肉湯、發(fā)酵肉湯、微生物體、發(fā)酵肉湯濾液等等，或者單獨(dú)，或者聯(lián)用。另外，酶或微生物體可固定在樹脂上。
另外，任何合適的微生物的酶(例如氧化還原酶)也可用于本主題過程，并且這種酶可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法從微生物中分離，且如同完整的微生物，可以游離形式或固定化形式用于本主題過程。本領(lǐng)域技術(shù)人員將從本文提供的說明及其相關(guān)知識(shí)中理解如何分離并純化合適的微生物的酶，例如描述在WO 03/093477中。
適用于本發(fā)明的典型可商購的酶包括脫氫酶和還原酶，其分類為E.C.1.1.1，且能夠催化羰基還原，例如來自Biocatalytics，Inc.的KRED-M27 KIT酮還原酶，馬肝醇脫氫酶(Grunwald等人，J.Am.Chem.Soc.，1986，第108卷，第6732-6734頁；Johansson等人，Eur.J.Biochem.，1995，第227卷，第551-555頁；Adolph等人，Biochemistry，2000，第39卷，第12885-12897頁；Wong等人.Terahedron Organic Chemistry，1994，第12卷，第149-150頁)，酵母醇脫氫酶，Thermoanaerobium brokii醇脫氫酶和高加索酸奶乳桿菌醇脫氫酶。
酶的天然底物是醇，如乙醇、乳酸酯、甘油等，和相應(yīng)的羰基化合物；然而，非天然的酮也可以被對(duì)映選擇性還原。為了表現(xiàn)出催化活性，酶需要輔酶，如NADH或NADPH，氫化物從該輔酶被轉(zhuǎn)移到底物羰基碳。有四種立體化學(xué)模式能使氫化物從輔酶NAD(P)H轉(zhuǎn)移到底物。對(duì)于E1和E2酶，氫化物攻擊羰基的si-面，而對(duì)于E3和E4酶，氫化物攻擊re-面，這分別導(dǎo)致(R)和(S)-醇的形成。另一方面，E1和E3酶轉(zhuǎn)移輔酶的前-(R)-氫化物，而E2和E4酶則利用前-(S)-氫化物。E1-E3酶的實(shí)例如下E1假單胞菌醇脫氫酶高加索酸奶乳桿菌醇脫氫酶E2念珠地絲菌甘油脫氫酶爪哇毛霉菌二羥基丙酮還原酶E3酵母醇脫氫酶馬肝醇脫氫酶莫拉菌醇脫氫酶酶的定向進(jìn)化可用于改善酶的還原功能，或用于還原的生物催化劑可通過利用例如Nakamura等人.TetrahedronAsymmetry，2003，第14卷，第2659-2681頁中所述的催化抗體技術(shù)而得以修飾。
適用于本主題的立體選擇性微生物還原的微生物可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽?。下面提供了從商業(yè)購買的原種制備微生物的適當(dāng)方法的實(shí)例。下面提供的方法可用于適用于本發(fā)明方法的任何微生物，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)從本文提供的說明中明白如何修改操作的任何部分，例如制備游離或固定的、洗過的或未洗過的微生物的方法；將一定量的底物與微生物接觸的方法；生長培養(yǎng)基組分和條件，例如溫度和pH等；或培養(yǎng)條件，以在任何特定方法中達(dá)到想要的結(jié)果。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將從本文提供的說明中明白如何制備合適的固定化的微生物，例如在Bauer等人，Biotechnol.Lett.，1996，18，第343-348頁中所述，或合適的固定化的酶，例如在Svec，F(xiàn).；Gemeiner，P.“Engineering aspects of carriers for immobilizedbiocatalysts.”Biotechnology & Genetic Engineering Reviews1996，第13卷，第217-235頁中所述。
將一定量的底物與微生物或酶還原系統(tǒng)接觸的任何合適的方法可以用于本發(fā)明。底物可以以任何合適的順序與微生物或酶還原系統(tǒng)接觸。例如，底物可以添加到培養(yǎng)基中，例如包含微生物的培養(yǎng)肉湯，微生物是游離的或固定的，或其某種組合；或培養(yǎng)基可以包含底物，然后微生物可以添加到這樣的培養(yǎng)基中；或底物和微生物可以一起添加到這樣的培養(yǎng)基中；或底物可以添加到其破碎的細(xì)胞制品中；或底物可以添加到微生物的脫水制品中；或底物或者微生物或酶還原系統(tǒng)任一者可以添加到包含另一者的適當(dāng)?shù)娜軇┲?；等等。例如，酶還原系統(tǒng)可以添加到略微有機(jī)的溶劑中，通過將底物添加到該溶劑中而發(fā)生接觸。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將根據(jù)本說明書明白如何通過添加吸附到樹脂上的底物而進(jìn)行接觸。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員將從本文提供的說明中明白如何按照期望修改主題方法的任何部分。
對(duì)于本發(fā)明的方法來說，微生物可以首先在限制氮的條件下培養(yǎng)，在例如通過離心分離收獲細(xì)胞之后，用于本發(fā)明的方法?？梢杂猛暾募?xì)胞、從細(xì)胞獲得的細(xì)胞消化液或酶粗提物、或純化的酶進(jìn)行還原。該方法可以在水性介質(zhì)中，在碳源的存在下(在全細(xì)胞的情況下)，或在諸如NADH或NADPH等還原劑的情況下，和在輔因子再循環(huán)的情況下(例如借助于甲酸脫氫酶和甲酸，并且適當(dāng)?shù)脑?，其它?(在細(xì)胞消化液、粗提物或純酶的情況下)進(jìn)行。在全細(xì)胞的還原中進(jìn)一步添加營養(yǎng)素，例如氮源、維生素或磷酸鹽是不適當(dāng)?shù)?，因?yàn)樵谶@些條件下觀察到了不希望的副反應(yīng)，例如，可以導(dǎo)致產(chǎn)物品質(zhì)缺陷，或后處理問題。對(duì)于微生物適合的碳源是能夠給細(xì)胞提供還原所必需的還原當(dāng)量的所有碳源。在此可提及的碳源的實(shí)例是單糖或二糖，如葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖，伯醇或仲醇，如甲醇、乙醇、丙醇，多元醇，如甘油，低級(jí)羧酸，如乳酸、蘋果酸，或氨基酸，如谷氨酸。在碳源的存在下，在水溶液中，用微生物轉(zhuǎn)化前體有如下優(yōu)點(diǎn)，前體或產(chǎn)物都不會(huì)被代謝，且不會(huì)形成副產(chǎn)物。
生物還原反應(yīng)可以在純水中或在含水緩沖液中進(jìn)行，而不用添加其它溶劑或溶劑混合物。為了提高前體1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的溶解度，加入水可混溶的有機(jī)溶劑是有可能的，例如四氫呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亞砜、二甲基乙酰胺、伯醇或仲醇、羧酸、諸如γ-丁內(nèi)酯等內(nèi)酯，其能夠?yàn)榉磻?yīng)提高前體1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的溶解度。
反應(yīng)可在0℃到50℃下進(jìn)行，優(yōu)選10℃到45℃，特別優(yōu)選15℃到40℃。
反應(yīng)時(shí)間取決于微生物或酶，從1到72小時(shí)，優(yōu)選1到48小時(shí)。
微生物的生長，將微生物與一定量的底物相接觸，將底物與微生物溫育的任何合適的持續(xù)時(shí)間都可以用于本發(fā)明。例如在約24h、48h或72h內(nèi)可實(shí)現(xiàn)微生物的適合的生長，在這個(gè)時(shí)間時(shí)，一定量底物在適當(dāng)溶劑優(yōu)選乙醇中的溶液的適當(dāng)?shù)确菘商砑拥脚囵B(yǎng)物中。然后發(fā)酵可持續(xù)例如約2天到約6天，優(yōu)選例如約5天。用有機(jī)溶劑提取產(chǎn)物以后，通過常規(guī)方法可以很容易地追蹤反應(yīng)進(jìn)程?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)奶崛》椒ㄌ崛“l(fā)酵肉湯，借由例如適當(dāng)?shù)娜軇?，例如乙酸乙酯、甲基異丁基酮、甲基乙基酮、二氯甲烷等，?yōu)選乙酸乙酯，從發(fā)酵肉湯中除去有機(jī)組分。甲醇也可以用于從細(xì)胞中提取物質(zhì)到甲醇-水混合物中。提取發(fā)酵肉湯和分離有機(jī)相和水相之后，可用任何適當(dāng)?shù)姆椒ā⑷缟V法、優(yōu)選手性HPLC，確定構(gòu)成有機(jī)剩余物的化合物。
反應(yīng)優(yōu)選在需氧條件下進(jìn)行，即在用微生物轉(zhuǎn)化的情況下通氣，優(yōu)選溫和通氣。然而，在厭氧條件下的轉(zhuǎn)化也是可能的。過程可以持續(xù)進(jìn)行或分批進(jìn)行。
可通過相分離和/或提取到適當(dāng)溶劑如二氯甲烷中而純化任何上述反應(yīng)的產(chǎn)物，此后，如果需要的話可進(jìn)行色譜層析。
也可使用連續(xù)生產(chǎn)法進(jìn)行上述反應(yīng)，包括在反應(yīng)或細(xì)胞固定中連續(xù)再循環(huán)有機(jī)相，將有機(jī)溶液中的底物通過柱內(nèi)的固定生物量、循環(huán)式反應(yīng)器或其它類似反應(yīng)器。
因此，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解的，可以改變生長培養(yǎng)基、發(fā)酵條件、和/或還原條件(例如溫度、pH和底物的量)的變化來控制所得化合物的產(chǎn)率及其相對(duì)的生產(chǎn)速率。一般而言，將根據(jù)工業(yè)效率選擇本發(fā)明中采用的技術(shù)。本文所述的生長培養(yǎng)基，發(fā)酵條件，和微生物或酶還原系統(tǒng)的相對(duì)量，和底物的相對(duì)量僅僅只是對(duì)范圍很大的可適用于本發(fā)明的培養(yǎng)基、發(fā)酵條件和原料的量進(jìn)行了舉例說明，如同本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解的，并不打算以任何方式作限定。
分離和/或純化主題方法的任何產(chǎn)物的任何適當(dāng)?shù)姆椒ǘ伎捎糜诒景l(fā)明，包括過濾、提取、結(jié)晶、柱色譜、薄層色譜、制備型低壓液相色譜或HPLC，或這些方法的任何適當(dāng)?shù)穆?lián)合。
本發(fā)明通過下列實(shí)施例進(jìn)行舉例說明。本發(fā)明的上述和下述說明和各個(gè)實(shí)施方案并不打算限制本發(fā)明，而是對(duì)其進(jìn)行解釋說明。因此，可以理解的是，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例的具體細(xì)節(jié)。
實(shí)施例材料.
從VWR international獲得合適的96孔板和配件。分析儀器包括Tecan Genesis 2000 Workstation(Research Triangle Park，NC)，Agilent 220 HPLC自動(dòng)采樣器和6890N GC(Agilent Technologies，CA)，SpectraMax Plus 384(Molecular Devices，USA)，BeckmanCoulter P/ACE MDQ(Fullerton，CA)和Waters/Micromass ZQ LC/MS(Waters，MA)從它們各自的供應(yīng)商購買。Eppendorf thermomixer-R購自VWR。分析中使用的手性HPLC柱獲自于Chiral Technologies(Exton，PA)和Phenomenex(Torrance，CA)。
在篩選板中使用的大多數(shù)酶獲自于多個(gè)酶供應(yīng)商，包括Amano(Nagoya，Japan)，Roche(Basel，Switzerland)，Novo Nordisk(Bagsvaerd，Denmark)，Altus Biologics Inc.(Cambridge，MA)，Biocatalytics(Pasadena，CA)，Toyobo(Osaka，Japan)，Sigma和Fluka。表1舉例說明了對(duì)應(yīng)于各種酶的具體酶來源。Lipase-PSActivity kit購自于Sigma。商業(yè)上可獲得的豬肝酯酶購自于Biocatalytics(Pasadena，CA)，其作為粗制硫酸銨混懸液以商品名PLE AS(Catalog # ICR-123)銷售。
優(yōu)化過程中使用的大多數(shù)溶劑獲自于EM Science(Gibbstown，NJ)，是可獲得的最高純度。
HPLC方法在具有96孔自動(dòng)采樣器的Agilent 1100 HPLC上進(jìn)行篩選樣品的HPLC分析。在Eppendorf thermomixer-R(VWR)中進(jìn)行反應(yīng)。
每一HPLC樣品通過從反應(yīng)混合物取2×50μL，然后合并并用2mL乙腈稀釋而制得。進(jìn)一步用400μL乙腈稀釋100μL所述溶液并注入HPLC中。
非手性HPLC方法所用檢測器波長254nm；Phenomenex luna C18柱，3μm，C18，4.6×30mm；流速2.0mL/min；注射體積5μL；流動(dòng)相A水-0.1％三氟乙酸(TFA)B乙腈-0.1％TFA；樣品運(yùn)行梯度(運(yùn)行后(post-run)0.5min)時(shí)間％B ％C％D10.005.0 0.00.021.6765.00.00.032.0095.00.00.042.5095.00.00.052.605.0 0.00.063.005.0 0.05.0手性HPLC方法醇1使用檢測器波長254nm；Chiralcel ADR-H，3μm，C18，4.6×150mm；流速0.8mL/min；注射體積10μL；流動(dòng)相A水B乙腈；恒組成50％B15分鐘。
醋酸酯2手性方法使用檢測器波長254nm；Chiralcel OJ-RH，3μm，C18，4.6×150mm；流速0.6mL/min；注射體積10μL；流動(dòng)相A水B乙腈；恒組成50％B15分鐘。
制備篩選板根據(jù)Yazbeck等人，Adv.Synth. Catal.，2003，第345卷，第524-532頁進(jìn)行了篩選板的制備。
具體而言，制備通?；ㄙM(fèi)1-2天，且要求制備酶母液(100mg/mL)和將這些母液分配到96孔篩選板，或“篩選試劑盒”中。由自動(dòng)液體處理工作站將母液分配到篩選板中，該工作站可以被編程為將10μL各種酶精確分配到每個(gè)96孔板的適當(dāng)位置。
當(dāng)選擇96孔板格式時(shí)，該板必須能抵抗溶劑和溫度，因此，推薦使用聚丙烯板。還需要考慮板容積和形態(tài)學(xué)。本文的反應(yīng)都在板中100μL的反應(yīng)容積內(nèi)進(jìn)行，不大于500μL。V底板易于提高溶液攪動(dòng)，且離心分離后易于清潔器取樣。
一旦板子制備好，就可以用粘合箔或用可透的墊蓋將它們密封，在-80℃貯藏?cái)?shù)月甚至數(shù)年。
在需要無水條件的情況下，例如?；饔煤王０坊磻?yīng)，篩選板使用前必須凍干。為了從每個(gè)孔中除去水分，篩選板在-20℃的腔室溫度下冷凍干燥10到24小時(shí)。凍干后，篩選板可以在4到8℃下貯藏。
酶篩選方法如下所述拆分1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯。將如上述制備的96孔板解凍5分鐘。然后使用多道吸移管將80μL的磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH7.2)分配到孔中。然后通過多道吸移管將10μL的底物母液(50mg/mL乙腈)加入到各個(gè)孔中，96個(gè)反應(yīng)在30℃和750rpm條件下孵育。16小時(shí)后對(duì)反應(yīng)采樣，通過將25μL的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，然后通過加入150μL的乙腈將其淬滅。接著將96孔板離心分離，從每個(gè)孔中將有機(jī)上清液轉(zhuǎn)移到另一96孔板中。然后使用可透的墊蓋密封采樣的反應(yīng)，轉(zhuǎn)移到HPLC系統(tǒng)中進(jìn)行分析。同時(shí)利用HPLC上交替的柱，利用相同的板子來分析試樣的反應(yīng)性和對(duì)映選擇性。
實(shí)施例1聯(lián)用酶法拆分和化學(xué)轉(zhuǎn)化制備旋光1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇僅為了舉例說明的目的，本發(fā)明的方法通過下述外消旋1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯生物轉(zhuǎn)化的實(shí)施例演示，其中生物轉(zhuǎn)化由路線1表示。
路線1 酶法拆分1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸(2)該方法包括進(jìn)行四個(gè)主要步驟1)制備外消旋1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯2)使用商業(yè)上可獲得的脂肪酶、蛋白酶和酯酶進(jìn)行酶篩選；3)優(yōu)化反應(yīng)條件例如pH、溫度以及酶和底物的量；和
4)通過開發(fā)酶水解、酯化作用和化學(xué)水解伴隨反轉(zhuǎn)的聯(lián)用方法而使酶法拆分方法的產(chǎn)率最大化。
1)制備外消旋1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯(化合物2)化合物11-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇 將硼氫化鈉(90mg，2.4mmol)加到2’，6’-二氯-3’-氟-苯乙酮(Aldrich，catalog # 52，294-5)(207mg，1mmol)的2mL無水CH3OH溶液中。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后蒸發(fā)得到無色油狀剩余物。通過快速色譜法(用0→10％EtOAc的己烷溶液洗脫)純化剩余物得到無色油狀化合物1(180mg；0.88mmol；86.5％產(chǎn)率)；MS(APCI)(M-H)-208；1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.64(d，J＝6.82Hz，3H)3.02(d，J＝9.85Hz，1H)6.97-7.07(m，1H)7.19-7.33(m，1H)。
化合物21-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯 將醋酸酐(1.42mL，15mmol)和吡啶(1.7mL，21mmol)順序地加入到化合物1(2.2g，10.5mmol)的20mL CH2CL2溶液中。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌12小時(shí)，然后蒸發(fā)得到微黃色油狀剩余物。通過快速色譜法(用7→9％EtOAc的己烷溶液洗脫)純化剩余物得到無色油狀化合物2(2.26g；9.0mmol；85.6％產(chǎn)率)；1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.88(d，J＝6.82Hz，3H)2.31(s，3H)6.62(q，J＝6.82Hz，1H)7.25(t，J＝8.46Hz，1H) 7.49(dd，J＝8.84，5.05Hz，1H)。
2)酶篩選篩選商業(yè)上可獲得的一系列水解酶后鑒定用于動(dòng)力學(xué)拆分外消旋1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯(化合物2)的最適合的催化劑。使用一般的酶篩選方法來篩選表1中所示的94種商業(yè)上可獲得的酶。
表1生物轉(zhuǎn)化組酶篩選試劑盒(G3)
用在pH7.2的100mM磷酸鉀緩沖液中的5％底物負(fù)荷進(jìn)行初篩后，幾種水解酶被鑒定為對(duì)于將外消旋醇酯2酶水解為醇R-1有用(路線2)。
路線2 化合物R-1(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇 通過快速色譜法(用15→17％EtOAc的己烷溶液洗脫)由化合物S-2純化化合物R-1得到無色油狀化合物R-1(92.7mg；0.45mmol)。
化合物S-2(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯 通過快速色譜法(用9→10％EtOAc的己烷溶液洗脫)由化合物R-1純化化合物S-2得到無色油狀化合物S-2(185.9mg；0.74mmol)。
如表2所示，幾種酶對(duì)1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯(2)顯示了活性。分析E值顯示其中五種酶顯示了E值大于100的良好的對(duì)映選擇性。德列馬根霉脂肪酶和豬肝酯酶(PLE)顯示E值＞150。然而，PLE顯示了對(duì)(R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯((R)-2)的最高的反應(yīng)性。
表2
通過與如路線3所示的相似底物的已知反應(yīng)相比較，最初指定PLE水解產(chǎn)生的醇(1)的絕對(duì)構(gòu)型，其描述在Bouzemi，N.等人，Tetrahedron Letters，2004，第627-630頁中。
路線3 在實(shí)驗(yàn)室中測試的和指定的(假定酶不改變識(shí)別模式) 如路線3所示，使用CAL-B的1-苯基乙醇的酶?；饔卯a(chǎn)生了1-苯乙基乙酸酯的R-對(duì)映異構(gòu)體，留下了未反應(yīng)的1-苯基乙醇的S-對(duì)映異構(gòu)體(Bouzemi，N.等人，Tetrahedron Letters，2004，第627-630頁)?？梢约僭O(shè)當(dāng)CAL-B與rac-1反應(yīng)時(shí)，底物識(shí)別應(yīng)當(dāng)相同；相應(yīng)地，獲得的酯產(chǎn)物被指定為R-對(duì)映異構(gòu)體。
當(dāng)與用PLE酶水解rac-1(相反反應(yīng))中獲得的化合物相比時(shí)，觀察到了醇的R異構(gòu)體，明顯來自于R-乙酸酯的水解作用。
可以基于Mosher’s酯產(chǎn)生的非對(duì)映異構(gòu)體的NMR測定直接確定PLE水解產(chǎn)物產(chǎn)生的醇(1)的絕對(duì)構(gòu)型。

用文獻(xiàn)TetrahedronAsymmetry 2002，第13卷，第2283頁；Tetrahedron Lett.1988，第29卷，第6211頁中報(bào)道的方法合成化合物A和化合物B。將這兩種化合物進(jìn)行1H-NMR實(shí)驗(yàn)，比較化合物A和化合物B甲基的化學(xué)位移來確定化合物A具有“S”構(gòu)型，化合物B具有“R”構(gòu)型。
合成化合物A將DCC(N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺)(1.1mmol)加到(s)-(+)-a-甲氧基苯乙酸(1mmol)的5mL無水THF溶液中。室溫下在氮?dú)猸h(huán)境下攪拌反應(yīng)混合物15分鐘。將化合物S-1(1mmol)和DMAP(4-二甲基氨基吡啶)(0.2mmol)順序加到反應(yīng)混合物中，所得混合物在室溫下攪拌36小時(shí)。蒸發(fā)混合物，在甲醇中研磨，過濾和濃縮得到剩余物。通過HPLC純化剩余物得到化合物A。
合成化合物B將DCC(N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺)(1.1mmol)加到(s)-(+)-a-甲氧基苯乙酸(1mmol)的5mL無水THF溶液中。室溫下在氮?dú)猸h(huán)境下攪拌反應(yīng)混合物15分鐘。將化合物R-1(1mmol)和DMAP(4-二甲基氨基吡啶)(0.2mmol)順序加入到反應(yīng)混合物中，所得混合物在室溫下攪拌36小時(shí)。蒸發(fā)混合物，在甲醇中研磨，過濾和濃縮得到剩余物。通過HPLC純化剩余物得到化合物B。
3)優(yōu)化使用PLE-AS的反應(yīng)條件PLE是由Roche生產(chǎn)的酶，以從豬肝制備的粗酯酶制品通過Biocatalytics Inc.銷售，通常稱為PLE-AS(購自Biocatalytics，名為ICR-123，以硫酸銨混懸液銷售)。該酶在CAS登記中被分類為“羧酸-酯水解酶，CAS no.9016-18-6”。相應(yīng)的酶分類編號(hào)是EC 3.1.1.1。已知該酶對(duì)水解許多酯具有寬的底物特異性。使用基于在pH滴定器中水解丁酸乙酯的方法測定脂肪酶活性。1LU(脂肪酶單位)是22℃、pH8.2條件下每分鐘釋放1μmol可滴定丁酸的酶的量。本文報(bào)道的制劑(PLE-AS，作為混懸液)通常作為不透明的褐綠色液體運(yùn)送，宣稱活性＞45 LU/mg(蛋白質(zhì)含量約40mg/mL)。
該反應(yīng)中被優(yōu)化的主要參數(shù)是底物和酶濃度、pH和緩沖液的類型。使用液體形式的酶進(jìn)行大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，該酶以PLE-AS在商業(yè)上是可獲得的。pH對(duì)反應(yīng)的作用不是非常關(guān)鍵的。進(jìn)行反應(yīng)的合理的pH范圍包括pH6-9，pH8.0結(jié)果最佳。大多數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。試驗(yàn)的緩沖液Tris、磷酸鹽和醋酸鈣。該反應(yīng)可以在三種緩沖液的10-100mM濃度范圍內(nèi)進(jìn)行而得到非常相似的結(jié)果。進(jìn)行反應(yīng)可以使用的其它緩沖液包括2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)(PIPES)、N，N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、三(羥甲基)氨基甲烷(TRIZMA)、N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(TRICINE)、N，N-二(2-羥乙基)甘氨酸(BICINE)、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)，或pKa值在6到9之間的任何其它緩沖液。所有實(shí)驗(yàn)使用正常的攪拌速度(500-1000rpm)。發(fā)現(xiàn)5-10％(v/v)酶含量可以有效地以接近20％的效率催化酶促反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)預(yù)混合酶和緩沖液后加入底物和強(qiáng)烈攪拌對(duì)于在最小濃度進(jìn)行反應(yīng)是有益的。使用對(duì)于酶負(fù)荷的那些優(yōu)化條件，測試0.2-2M的底物負(fù)荷并發(fā)現(xiàn)1-2M的濃度在24小時(shí)內(nèi)提供了接近50％的轉(zhuǎn)變。商業(yè)上不可獲得的其它形式的酶也可以使用，包括固定在固體載體(例如陶瓷、硅藻土、Eupergit、丙烯酸珠粒等)上的酶，交聯(lián)酶晶體(CLEC)，或交聯(lián)酶聚集物(CLEA)，硫酸銨小球，或活性和對(duì)映選擇性可以被保存或增強(qiáng)的任何其他形式。
根據(jù)路線4使用豬肝酯酶拆分外消旋1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯(2)，大規(guī)模制備化合物R-1和S-2。
路線4 向裝有pH電極、懸空攪拌裝置和堿添加管線的5L反應(yīng)器中加入PLE-AS溶液(0.125L)和2.17L的磷酸鉀緩沖溶液。使用718 StatTitrino-Metrohm pH滴定器(Brinkman instruments，Inc)進(jìn)行反應(yīng)。通過將2.17L的水、15.6mL的1M K2HPO4溶液和6.2mL的KH2PO4混合而制備磷酸鉀緩沖溶液。
然后，加入外消旋1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙基乙酸酯(2)(250g，1mol)。接著在室溫下攪拌混懸液22小時(shí)。通過加入2N NaOH將溶液的pH值維持在7.0。接著通過RP-HPLC觀察產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變和％ee而追蹤反應(yīng)，原料消耗51-52％后停止(加入～240mL堿)。
反應(yīng)完成后，加入甲基-叔丁基醚(MTBE)(900mL)，攪拌混合物5分鐘。將所得乳狀液通過硅藻土濾墊，然后轉(zhuǎn)移到分離漏斗/提取器中。該階段包括用去離子水將硅藻土和漿，然后傾入Buchner漏斗中制備硅藻土墊。過濾酶乳狀液之前除去水濾液。分層之后，各用900mLMTBE再萃取水層兩次。用Na2SO4干燥合并的MTBE層，真空濃縮得到242g粗醇和乙酸酯混合物。
4)通過開發(fā)酶水解、酯化作用和化學(xué)水解伴隨反轉(zhuǎn)的聯(lián)用方法而使酶法拆分方法的產(chǎn)率最大化。
一旦發(fā)展了酶動(dòng)力學(xué)拆分，就探索到“R-1”醇到“S-2”乙酸酯的化學(xué)轉(zhuǎn)化。該過程根據(jù)路線5進(jìn)行。
路線5
向裝有pH電極、懸空攪拌裝置和堿添加管線(1M NaOH)的50mL加套燒瓶中加入1.2ml的100mM磷酸鉀緩沖液pH7.0和0.13ml的PLE AS混懸液。然后，逐滴加入化合物2(0.13g，0.5mmol，1.00eq)，所得混合物在室溫下攪拌20小時(shí)；使用1M NaOH維持反應(yīng)的pH值恒定在7.0。通過RP-HPLC監(jiān)測反應(yīng)的轉(zhuǎn)變和ee，原料消耗50％后停止(在這些條件下近似17小時(shí))。然后用10mL乙酸乙酯萃取混合物三次以回收酯和醇作為R-1和S-2的混合物。
在氮?dú)猸h(huán)境下將甲磺酰氯(0.06mL，0.6mmol)加入到R-1和S-2混合物(0.48mmol)的4mL吡啶溶液中。室溫下攪拌反應(yīng)混合物3小時(shí)，然后蒸發(fā)得到了油。將水(20mL)加入到混合物中，然后加入EtOAc(20mL×2)萃取水溶液。合并有機(jī)層，干燥，過濾，蒸發(fā)得到R-3和S-2混合物。該混合物不進(jìn)一步純化用于下一步反應(yīng)。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.66(d，J＝7.1Hz，3H)1.84(d，J＝7.1Hz，3H)2.09(s，3H)2.92(s，3H)6.39(q，J＝7.0Hz，1H)6.46(q，J＝6.8Hz，1H)6.98-7.07(m，1H)7.07-7.17(m，1H)7.23-7.30(m，1H)7.34(dd，J＝8.8，4.80Hz，1H)。
氮?dú)猸h(huán)境下將醋酸鉀(0.027g，0.26mmol)加入到R-3和S-2混合物(0.48mmol)溶液的4mL DMF溶液中。將反應(yīng)混合物加熱到100℃持續(xù)12小時(shí)。將水(20mL)加入到反應(yīng)混合物中，加入EtOAc(20mL×2)萃取水溶液。干燥合并的有機(jī)層，過濾，蒸發(fā)得到油狀S-2(72mg，兩步驟產(chǎn)率61％)。手性ee97.6％。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm1.66(d，J＝7.1Hz，3H)2.09(s，3H)6.39(q，J＝6.8Hz，1H)7.02(t，J＝8.5Hz，1H)7.22-7.30(m，1H)。
在0℃氮?dú)猸h(huán)境下將甲醇鈉(19mmol；0.5M的甲醇溶液)緩慢加入到化合物S-2(4.64g，18.8mmol)中。室溫下攪拌所得混合物4小時(shí)。蒸發(fā)溶劑，加入H2O(100mL)。用醋酸鈉-醋酸緩沖溶液中和冷卻的反應(yīng)混合物至pH值為7。加入乙酸乙酯(100mL×2)萃取水溶液。用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，過濾，蒸發(fā)得到白色固體狀S-1(4.36g，94.9％產(chǎn)率)；SFC-MS97％ ee。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.65(d，J＝6.8Hz，3H)5.58(q，J＝6.9Hz，1H)6.96-7.10(m，1H)7.22-7.36(m，1H)。
實(shí)施例2對(duì)映選擇性生物還原1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮當(dāng)前的工藝過程開發(fā)是通過使用全細(xì)胞催化的反應(yīng)和商業(yè)上可獲得的酶達(dá)到的。該過程包括進(jìn)行三個(gè)主要步驟1)篩選主要包含酵母和真菌菌株的內(nèi)部全細(xì)胞(或分離出的酶)收集物(商業(yè)上可獲得的醇脫氫酶和酮還原酶)；2)進(jìn)行對(duì)pH、溫度及酶和底物量的反應(yīng)優(yōu)化；3)開發(fā)生物催化劑再循環(huán)的方法。
全細(xì)胞篩選如下所述對(duì)能夠?qū)τ尺x擇性還原1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的菌株進(jìn)行篩選。微生物菌株在9 6孔板(5μL/孔)中從凍干的原種生長。將200μL無菌YM培養(yǎng)基(Difco培養(yǎng)基271120)接種到各個(gè)孔中。所有菌株在28℃和250rpm轉(zhuǎn)速的旋轉(zhuǎn)振蕩器上生長。2天后，從10％母液乙醇溶液加入底物使各個(gè)孔中達(dá)到1mg/mL。然后將板子在相同速度和溫度下振蕩，2-7天后分析反應(yīng)。利用非手性柱通過HPLC分析反應(yīng)。
將顯示于表3的188種不同的微生物菌株分布到96孔板中，如上所述在底物濃度不超過1mg/mL下進(jìn)行測試。發(fā)現(xiàn)屬于紅酵母屬、鏈孢霉屬、紅冬孢酵母屬、Aerobasidium和假絲酵母屬物種的30種不同的菌株顯示了所需的活性。所有菌株都顯示了S選擇性。然后將那些菌株再篩選，選擇屬于紅酵母屬物種的酵母UC2387用于更大規(guī)模制備S-1。
通過利用紅酵母屬菌株Y2-UC2387還原1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮而大規(guī)模制備(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇(S-1)的方法根據(jù)下述路線6利用紅酵母屬菌株Y2-UC2387將1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮生物還原為 (1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇(S-1)。
路線6 建立兩階段發(fā)酵步驟，其中預(yù)培養(yǎng)物(第一階段)從搖瓶中的新鮮接種物(從瓊脂平板挑取的菌落)生長兩天。第二階段培養(yǎng)物通過將預(yù)培養(yǎng)物加入到新鮮培養(yǎng)基(1/50-1/100稀釋)開始，所得培養(yǎng)物在加入10％乙醇溶液的底物前生長1天。YM培養(yǎng)基(Difco培養(yǎng)基271120)用于液體培養(yǎng)物和瓊脂基平板。為了還原2g(9.6mmol)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮，需要1L制品。包含10mL YM和完整培養(yǎng)物的第一階段培養(yǎng)物用于接種第二階段培養(yǎng)物(1L)。生長3天后，加入凈底物，攪拌反應(yīng)7天。1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮到所需醇S-1異構(gòu)體的轉(zhuǎn)變和S-1的ee都通過RP-HPLC來監(jiān)測。達(dá)到57％的轉(zhuǎn)變后停止反應(yīng)，以5,000rpm的速度離心分離除去酵母細(xì)胞。剩余的原料和所需的產(chǎn)物通過萃取(0.5體積的乙酸乙酯三次)回收。
對(duì)最大底物負(fù)荷和酵母細(xì)胞再循環(huán)的研究測試1-20g/L的底物濃度，選擇2.5g/L，因?yàn)槠涞玫搅俗詈玫目臻g-時(shí)間產(chǎn)率(～0.5g/L/d)，相當(dāng)于每天每克微生物0.1g的產(chǎn)物形成速度。分離產(chǎn)物的產(chǎn)率在50至100％的范圍內(nèi)。前體在水中＜2.5g/L的差溶解度妨礙了更高底物負(fù)荷的使用。已知非離子XAD樹脂(Rohm和Hass生產(chǎn))吸附有機(jī)化合物(根據(jù)D’Arrigo，等人，TetrahedronAsymmetry，1997，第8卷，第2375-2379頁的論文)，可以用于底物或產(chǎn)物的捕獲(主要提供了底物的緩慢釋放和避免了底物對(duì)細(xì)胞的毒性或酶抑制)。該技術(shù)允許使用20g/L或更高的底物負(fù)荷。
根據(jù)Rotthaus，等人，Tetrahedron，2002，第58卷，第7291-93頁的方法固定在藻酸鈣中的細(xì)胞，證明是實(shí)用的方案用于再循環(huán)和更好地使用催化劑。所捕獲的酵母細(xì)胞對(duì)機(jī)械應(yīng)激更加抵抗，并且同時(shí)觀察到產(chǎn)物回收明顯改善。還看到了與使用全細(xì)胞中觀察到的相似的底物負(fù)荷。
篩選商業(yè)上可獲得的酶如下所述對(duì)能夠?qū)τ尺x擇性還原1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮的酶進(jìn)行篩選。試驗(yàn)了27種不同的酮還原酶(以KRED-M27 KIT購自Biocatalytics，Inc)，和4種獲自Sigma Aldrich的醇脫氫酶(馬肝醇脫氫酶(HLADH)、酵母醇脫氫酶、Thermoanaerobium brokii醇脫氫酶和高加索酸奶乳桿菌醇脫氫酶)。在1mg/mL的底物負(fù)荷下進(jìn)行Kred酶反應(yīng)，使用NADPH作為還原劑。使用NADH和NADPH測試醇脫氫酶。僅馬肝醇脫氫酶(HLADH)催化了1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮選擇性還原而得到(S)-1，根據(jù)路線7。
路線7 先前已經(jīng)報(bào)道HLADH遵照普瑞洛格規(guī)則(Prelog，V，Pure App.Chem.，1964，第9卷，119)還原多種底物(根據(jù)Nakamura，等人，Tetrahedron asymmetry，2003，第14卷，第2659-2681頁，其作為E3型ADH起作用)。
表4包括所評(píng)價(jià)的底物與酶(S∶E)的比率。
表4
化合物S-1(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇
通過快速色譜法(用15→20％EtOAc的己烷溶液洗脫)將化合物S-1從原料酮中純化出來得到無色油狀化合物S-1(229.8mg；1.1mmol)；SFC-MS100％ee.1H NMR(400MHz，MeOD)δppm 1.58(d，J＝7.1Hz，3H)5.61(q，J＝6.8Hz，1H)7.14(t，J＝8.6Hz，1H)7.35(dd，J＝9.0，4.9Hz，1H)。
實(shí)施例3.
(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇在合成人肝細(xì)胞生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑中的用途根據(jù)路線8，(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇在手性合成人肝細(xì)胞生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑中用作中間體，合成過程如下所述。
路線8 化合物33-[(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-2-硝基吡啶 在氮?dú)猸h(huán)境下將3-羥基-2-硝基吡啶(175mg，1.21mmol)、三苯基膦(440mg，1.65mmol)順序加入到攪拌的S-1(229.8mg，1.1mmol)的THF(10mL)溶液中。在室溫下維持反應(yīng)混合物1小時(shí)，然后在0℃下加入二異丙基偶氮二羧酸酯(0.34mL，1.65mmol)。再攪拌該混合物12小時(shí)，真空蒸發(fā)反應(yīng)混合物得到油。通過快速色譜法(用20→25％EtOAc的己烷溶液洗脫)純化剩余物得到化合物3的白色固體(321.5mg；0.97mmol；88.3％產(chǎn)率)；MS(APCI)(M+H)+331；SFC-MS99.5％ee.1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.85(d，J＝6.6Hz，3H)6.10(q，J＝6.6Hz，1H)7.04-7.13(m，1H)7.21(dd，J＝8.5，1.14Hz，1H)7.30(dd，J＝9.0，4.9Hz，1H)7.37(dd，J＝8.6，4.6Hz，1H)8.04(dd，J＝4.6，1.3Hz，1H)。
化合物43-[(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]吡啶-2-胺 在0℃下向攪拌的化合物3(321mg，0.97mmol)在EtOH(2mL)和2M HCl(0.2mL)的混合物中的溶液中加入鐵(365mg)。將所得溶液加熱到85℃ 2小時(shí)。將硅藻土(0.5g)加入到冷卻的反應(yīng)混合物中。通過硅藻土墊過濾該混合物，蒸發(fā)得到深色油狀化合物4。MS(APCI)(M+H)+301。不進(jìn)行進(jìn)一步純化將化合物4用于下一步反應(yīng)中。
化合物53-[(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-碘代-吡啶-2-胺 向攪拌著的化合物4在乙酸(3mL)和H2O(0.5mL)的混合物中的溶液中連續(xù)加入高碘酸(60mg，0.24mmol)、碘(130mg，0.5mmol)和硫酸(0.03mL)。將所得溶液加熱到80℃ 5小時(shí)。用Na2SO3(80mg)淬滅冷卻的反應(yīng)混合物，用飽和Na2CO3(2×100mL)堿化至pH為7。加入CH2Cl2(2×50mL)萃取水溶液，用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，然后過濾，真空濃縮。通過快速色譜法(用35→40％EtOAc的己烷溶液洗脫)純化剩余物得到黃色油狀化合物5(254mg；0.6mmol；61.6％產(chǎn)率)；MS(APCI)(M+H)+426。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.81(d，J＝6.8Hz，3H)4.86(s，2H)5.98(q，J＝6.57Hz，1H)6.96(d，J＝1.5Hz，1H)7.08(dd，J＝9.0，8.0Hz，1H)7.31(dd，J＝8.8，4.8Hz，1H)7.78(d，J＝1.8Hz，1H)。
化合物64-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)苯甲?；鵠哌嗪-1-甲酸叔丁酯 在惰性環(huán)境下將1，1’-羰基-二咪唑(360mg，2.2mmol)加入到4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)苯甲酸(515mg，2mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液中。室溫下攪拌反應(yīng)混合物30分鐘，然后加入1-哌嗪-甲酸叔丁酯(390mg，2mmol)。在惰性環(huán)境下攪拌所得混懸液12小時(shí)。將混合物傾入水(50mL)中攪拌，加入CH2Cl2(2×50mL)萃取水溶液。干燥合并的有機(jī)層，過濾，濃縮得到無色油狀剩余物。通過快速色譜法(用20→25％EtOAc的己烷溶液洗脫)純化剩余物得到化合物6的白色固體(461mg；1.1mmol；55.4％產(chǎn)率)； MS(APCI)(M+H)+417。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm 1.34(s，12H)1.45(s，9H)3.26-3.42(m，4H)3.44-3.56(m，2H)3.66-3.89(m，2H)7.37(d，J＝8.1Hz，2H)7.84(d，J＝8.1Hz，2H)。
化合物74-(4-{6-氨基-5-[(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]吡啶-3-基}苯甲?；?哌嗪-1-甲酸叔丁酯
將化合物6(300mg，0.72mmol)加入到化合物5(254mg，0.6mmol)的7mL DME(乙二醇二甲醚)溶液中。用氮?dú)獯迪椿旌衔飵状?，然后加入二氯雙(三苯基膦)鈀(II)(50mg，0.06mmol)。將碳酸鈉(200mg，1.8mmol)的1.5mL水溶液加入到反應(yīng)混合物中，加熱所得溶液至85℃2小時(shí)。向反應(yīng)混合物加入水(50mL)以淬滅反應(yīng)。然后加入EtOAc(2×50mL)萃取水溶液。干燥合并的EtOAc層，過濾，蒸發(fā)得到褐黃色油狀剩余物。通過硅膠色譜法(用75→80％EtOAc的己烷溶液洗脫)純化剩余物得到化合物7的白色固體(255.5mg；0.43mmol；72.9％產(chǎn)率)；MS(APCI)(M+H)+589。1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm1.45(s，9H)1.85(d，J＝6.6Hz，3H)4.92(s，2H)6.10(q，J＝6.8Hz，1H)6.97(d，J＝1.8Hz，1H)7.01-7.10(m，1H)7.29(dd，J＝9.0，4.9Hz，1H)7.36-7.42(m，3H)7.58-7.64(m，1H)7.87(d，J＝1.5Hz，1H)。
化合物83-[(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-[4-(哌嗪-1-基羰基)苯基]-吡啶-2-胺 將鹽酸(1.3mL，4.8mmol)加入到化合物7的乙醇(10mL)溶液中。室溫下攪拌反應(yīng)混合物12小時(shí)，真空蒸發(fā)得到油。通過快速色譜法(用25→40％CH3OH的己烷溶液洗脫)純化剩余物得到化合物8的白色固體(180.4mg；0.37mmol；85.2％產(chǎn)率)；MS(APCI)(M+H)+489；SFC-MS100％ee。1H NMR(400MHz，MeOD)δppm 1.88(d，J＝6.8Hz，3H)2.92-3.21(m，4H)3.58-4.07(m，4H)6.21(q，J＝6.8Hz，1H)7.02(d，J＝1.8Hz，1H)7.18-7.27(m，1H)7.41-7.45(m，1H)7.46(s，4H)7.78(d，J＝1.8Hz，1H)。C24H23Cl2FN4O22 HCl 1.25 H2O的分析計(jì)算值C49.29，H4.74，N9.58。實(shí)測值C49.53，H4.82，N9.29。
盡管通過參考具體和優(yōu)選的實(shí)施方案舉例說明了本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)和本發(fā)明的實(shí)踐進(jìn)行變化和修飾。因此，本發(fā)明不意欲被前述說明所限制，而是被所附的權(quán)利要求和等同形式定義。
本發(fā)明說明書中引述的專利和專利申請(qǐng)和非專利出版物的全部公開內(nèi)容都通過參考并入本文。
權(quán)利要求
1.(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇，其至少95％不含(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
2.分離對(duì)映異構(gòu)的式(I)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的方法 其中，R是氫、C1-C20-烷基、C3-C8-環(huán)烷基、C6-C14-芳基、C7-C15-芳烷基、C1-C20-烷氧基、C1-C20-烷氨基，其中所述烴基可以任選被羥基、甲酰基、氧基、C1-C6-烷氧基、羧基、巰基、磺基、氨基、C1-C6-烷氨基或硝基或鹵素單取代或多取代，該方法包括以下步驟在水溶液、有機(jī)溶劑、或有機(jī)溶劑和含水溶劑的混合物中將式(I)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯與生物催化劑接觸，其中，只有一種對(duì)映異構(gòu)體被選擇性水解，生成1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光異構(gòu)體和未反應(yīng)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的旋光異構(gòu)體，和將1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光異構(gòu)體與未反應(yīng)的旋光1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯分離。3.制備(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的方法，包括以下步驟將對(duì)映異構(gòu)的式(I)的1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物 其中，R是氫、C1-C20-烷基、C3-C8-環(huán)烷基、C6-C14-芳基、C7-C15-芳烷基、C1-C20-烷氧基、C1-C20-烷氨基，其中所述的烴基可以任選地被羥基、甲?；?、氧基、C1-C6-烷氧基、羧基、巰基、磺基、氨基、C1-C6-烷氨基或硝基或鹵素單取代或多取代，在水溶液、有機(jī)溶劑、或有機(jī)溶劑和含水溶劑的混合物中與生物催化劑接觸，其中，只有(R)-對(duì)映異構(gòu)體被選擇性水解，生成(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)-乙醇酯的混合物；將(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物轉(zhuǎn)變?yōu)?1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇；和回收(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中，轉(zhuǎn)變步驟包括a)在非質(zhì)子溶劑中將(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯混合物中的(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇與有機(jī)磺酰鹵反應(yīng)，形成(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的有機(jī)磺酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物；b)在非質(zhì)子溶劑中進(jìn)一步將(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的有機(jī)磺酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯混合物中的(1R)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的有機(jī)磺酸酯與脂肪族羧酸的堿金屬鹽反應(yīng)，形成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的脂肪族羧酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物；和c)將(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的脂肪族羧酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物轉(zhuǎn)化為(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中，轉(zhuǎn)化步驟c)包括在堿性物質(zhì)的存在下，在含醇或含水溶劑中，將(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的脂肪族羧酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物進(jìn)行溶劑分解，形成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中，在轉(zhuǎn)化步驟c)中，在甲醇鈉的存在下，在甲醇中，將(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的脂肪族羧酸酯和(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物進(jìn)行溶劑分解，形成(1S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中R是甲基；在反應(yīng)步驟a)中，有機(jī)磺酰鹵是甲磺酰氯，非質(zhì)子溶劑是吡啶；在反應(yīng)步驟b)中，脂肪族羧酸的堿金屬鹽是醋酸鉀，非質(zhì)子溶劑是二甲基甲酰胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中，生物催化劑是選自Amano D(德列馬根霉脂肪酶)、Amano AY(皺摺假絲酵母脂肪酶)、Amano F(稻根霉脂肪酶)和豬肝酯酶的酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中，基于100重量份的對(duì)映異構(gòu)1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物，酶的使用量是0.1到100重量份。
10.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中，對(duì)映異構(gòu)1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇酯的混合物與生物催化劑的接觸步驟在0到60℃水溶液中進(jìn)行，并維持pH值為4到12。
11.制備1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光異構(gòu)體的方法，包括在水溶液、有機(jī)溶劑、或有機(jī)溶劑和含水溶劑的混合物中通過生物催化劑以對(duì)映選擇性方式還原1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙酮而得到所述1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇旋光異構(gòu)體的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，進(jìn)一步包括回收所述1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇旋光異構(gòu)體的步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法，其中，所述1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇的旋光異構(gòu)體是(1S)-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的方法，其中，生物催化劑是酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)的方法，其中，酶是馬肝醇脫氫酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備1－(2，6－二氯－3－氟苯基)乙醇的對(duì)映體純的立體異構(gòu)體的生物催化方法。公開了制備所需(S)－對(duì)映異構(gòu)體的方法，該方法是基于對(duì)1－(2，6－二氯－3－氟苯基)乙基酯的酶法拆分、化學(xué)酯化和化學(xué)水解伴隨反轉(zhuǎn)的聯(lián)用，或用諸如酶或微生物等生物催化劑立體選擇性生物還原2，6－二氯－3－氟－苯乙酮。手性(S)－對(duì)映異構(gòu)體可以用于合成某些對(duì)映體富集的、醚連接的2－氨基吡啶化合物，該化合物能有效抑制人肝細(xì)胞生長因子受體自磷酸化作用。
文檔編號(hào)C12P41/00GK101027404SQ200580032409
公開日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2005年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月26日
發(fā)明者龔蓓蓓, C·A·馬丁尼茲, 陶軍華 申請(qǐng)人:輝瑞大藥廠