專利名稱：以細胞內(nèi)線粒體為指標的心肌細胞的選擇方法
技術領域：
本發(fā)明涉及完整心臟構成細胞群、或來自干細胞細胞群的心肌細胞的選擇方法、和利用該方法的方法。
背景技術：
在成熟個體中的心肌細胞喪失了增殖活性，重癥性心肌梗塞、心肌癥等的疾病必需依賴心臟移植。不過，目前，為了克服心臟捐獻不足的問題，找到心臟移植以外的治療方法成為了當務之急。與此相對，認為在體外制備心肌細胞，用以補充心肌細胞，是救濟必需依賴心臟移植的患者的最有希望的方法。
作為心肌細胞的制備方法，正在對使胚胎干細胞分化而使用的方法、以及選取暗示了生物內(nèi)存在的干細胞(體干細胞)、誘導分化的方法等進行了研究。不過，作為干細胞的性質(zhì)，由于存在心肌細胞以外的細胞作為副產(chǎn)物而產(chǎn)生的問題、和使未分化的細胞殘存的性質(zhì)的問題，所以至今尚不能將進行了分化、誘導的細胞集團直接用于治療。所以，為了在人中能夠?qū)嶋H應用，必需從進行了分化、誘導的細胞集團中選出心肌細胞。
目前，作為純化心肌細胞的方法，尚沒有有關向干細胞的基因組中導入某些標記基因的方法以外的有效方法的報道(FASEB J.2000；142540-2548)。不過，改變基因組由于不僅本身存在倫理上的問題，而且伴隨著細胞癌化率的變化等無法預測的重大風險，所以為了在人體實際應用還存在著很大的問題。
已知心臟中氧氣消耗量與主要的組織相比較高而且心臟中線粒體的含量比較多(Am J Physiol 1985；248R415-421)。此外，心肌細胞一旦細胞分化·成熟，分裂能顯著消失也是廣為人知的。不過，應用上述這樣的心肌細胞的性質(zhì)而對心肌細胞進行選擇的嘗試在以往的技術領域中完全未知。此外，還沒有著眼于線粒體的膜電位，將心肌細胞線粒體的膜電位和其他細胞線粒體的膜電位直接進行比較研究的例子，以線粒體的膜電位作為指標進行心肌細胞的選擇研究的例子也尚無報道。
非專利文獻1FASEB J.2000；142540-2548非專利文獻2Am J Physiol 1985；248R415-421發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明人等以開發(fā)下述內(nèi)容作為課題使用與以往直接地選出心肌細胞無關的心肌細胞的多種性質(zhì)，從完整心臟構成細胞混合物和來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物中，不伴隨基因的改變地選出心肌細胞的方法。
用于解決問題的方法本發(fā)明人等根據(jù)心肌細胞與其他全部細胞相比較，相對的線粒體含量多的性質(zhì)以及心肌細胞線粒體與其他全部的細胞線粒體相比較其膜電位高的性質(zhì)，成功地解決了上述課題，建立了使用線粒體特異性標記試劑，標記含有心肌細胞的細胞混合物，通過測定細胞的相對的線粒體含量以及/或者線粒體膜電位，不伴隨心肌細胞的基因的改變，選擇心肌細胞的開創(chuàng)性方法。
具體而言，在本發(fā)明的第一種實施方式中，提供了從含有心肌細胞的細胞混合物中，根據(jù)細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位，不伴隨心肌細胞的基因改變地選出心肌細胞的方法。
即、在本發(fā)明的方法的第一種實施方式提供了含有心肌細胞的細胞混合物中，根據(jù)細胞的相對的線粒體含量，不伴隨心肌細胞的基因改變地選出心肌細胞的方法；從含有心肌細胞的細胞混合物中，根據(jù)細胞的相對的線粒體膜電位，不伴隨心肌細胞的基因改變地選出心肌細胞的方法；或者從含有心肌細胞的細胞混合物中，根據(jù)細胞的相對的線粒體含量以及膜電位，不伴隨心肌細胞的基因改變地選出心肌細胞的方法。
本發(fā)明的方法的該實施方式，其特征在于，使用線粒體指示劑，標記含有心肌細胞的細胞混合物，對細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位進行測定。
此處，含有心肌細胞的細胞混合物，其特征在于，是完整心臟(或稱為“總心臟”)構成細胞混合物或者來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物。
此外，可能分化成肌細胞的細胞，其特征在于，是選自干細胞、前體細胞以及卵細胞構成的組。
本發(fā)明的該具體實施方式
中，使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物后，在測定細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位之前，也可以還包括在無線粒體指示劑的存在下培養(yǎng)標記的細胞的步驟。
此外，本發(fā)明的該具體實施方式
中使用的線粒體指示劑以選自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168構成的組為特征，在這實施方式中，優(yōu)選是M7512、T3168、T668或者R302。
在本發(fā)明的第二種實施方式中，提供了從含有心肌細胞的細胞混合物中不伴隨心肌細胞的基因改變地濃縮心肌細胞的方法，其特征在于，該方法包括(1)使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物的步驟；以及(2)根據(jù)細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位，選擇心肌細胞的步驟。
在本發(fā)明的第二種實施方式中，含有心肌細胞的細胞混合物是以完整心臟構成細胞混合物或者來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物為特征的。
此外，可能分化成心肌細胞的細胞是以選自干細胞、前體細胞以及卵細胞構成的組為特征的。
本發(fā)明的第二種實施方式中，在上述(1)的步驟之后、(2)的步驟之前，也可以還含有在無線粒體指示劑的存在下培養(yǎng)標記的細胞的步驟。
此外，本發(fā)明的該具體實施方式
中使用的線粒體指示劑是以選自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168構成的組為特征的，在該種實施方式中，優(yōu)選是M7512、T3168、T668或者R302。
本發(fā)明的第三種實施方式中，提供了不伴隨心肌細胞的基因改變地制備心肌細胞的方法，其特征在于，該方法包括(1)從可能分化成心肌細胞的細胞分化、誘導心肌細胞、制備含有心肌細胞的細胞混合物的步驟；(2)使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物的步驟；以及(3)根據(jù)細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位，選擇心肌細胞的步驟。
本發(fā)明的方法的第三種實施方式中，可能分化成心肌細胞的細胞，其特征在于，選自干細胞、前體細胞以及卵細胞構成的組。
此外，在上述(2)的步驟之后、(3)的步驟之前，也可以還包括在無線粒體指示劑的存在下培養(yǎng)標記的細胞的步驟。
另外，本發(fā)明的該具體實施方式
中使用的線粒體指示劑是以選自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168構成的組為特征的，在這種實施方式中，優(yōu)選M7512、T3168、T668或者R302。
本發(fā)明的第四種實施方式中，提供了評價含有心肌細胞的細胞混合物中的心肌細胞比率的方法，其特征在于，該方法包括(1)使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物的步驟；以及(2)細胞的相對的線粒體含量以及/或者根據(jù)細胞的相對的線粒體膜電位，計算測定相對于非心肌細胞的心肌細胞的比率的步驟。
本發(fā)明的方法的第四種實施方式中，含有心肌細胞的細胞混合物是以完整心臟構成細胞混合物或者來自可能分化成心肌細胞的細胞的分化細胞混合物為特征的。
此外，可能分化成心肌細胞的細胞是以選自干細胞、前體細胞以及卵細胞構成的組為特征的。
而且，本發(fā)明的該具體實施方式
中使用的線粒體指示劑，是以選自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168構成的組選為特征的，這種實施方式中優(yōu)選M7512、T3168、T668或者R302。
根據(jù)上述內(nèi)容可知，在本發(fā)明中涉及在一種實施方式中，提供了從含有心肌細胞的細胞混合物中，根據(jù)細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位，不伴隨心肌細胞的基因改變地選出心肌細胞的方法。
細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位的測定，可以通過使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物進行。
此處，提到“含有心肌細胞的細胞混合物”時候，指的是心肌細胞和此外的細胞所構成的全部細胞的混合物?？梢粤信e例如完整心臟構成細胞混合物或者來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物。所說的完整心臟構成細胞混合物，指的是從同種或者異種的心臟組織通過多種酶處理最終得到的心肌細胞、內(nèi)皮細胞、間質(zhì)細胞、平滑肌細胞等的細胞構成的混合物。此外，來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物指的是，將可能分化成心肌細胞的細胞(例如，胚胎干細胞或者體干細胞等的干細胞、前體細胞、以及受精卵細胞或者體細胞克隆等的卵細胞)在使該細胞分化成心肌細胞的條件下進行培養(yǎng)而得到的心肌細胞、非心肌細胞、未分化細胞、神精細胞、上皮細胞等的細胞構成的混合物。
細胞的線粒體含量以及線粒體膜電位能夠通過使用線粒體指示劑標記細胞內(nèi)的線粒體而進行定量化。不過，反映線粒體含量以及線粒體膜電位的來自線粒體指示劑的信號的絕對值，根據(jù)解析中使用的心肌細胞的成熟度或者標記試劑的種類、暴露時間等的暴露條件而有所變化。所以，在本發(fā)明中重要的不是來自線粒體指示劑的信號量的絕對值，而是來自心肌細胞和非心肌細胞之間的線粒體指示劑的信號量的相對關系。并且，在本發(fā)明中，能夠?qū)⒈硎鞠鄬Ω叩臒晒鈴姸鹊募毎鳛樾募〖毎x擇。實際應用的時候，使用予定的含有心肌細胞的細胞混合物的試樣，進行預試驗，對與目標一致的心肌細胞集團的限定條件(即，線粒體含量以及/或者線粒體膜電位的高低與心肌細胞的關系)進行校正。具體而言，在預試驗中，將線粒體含量以及/或者線粒體膜電位作為指標，劃分應該選擇的來自細胞線粒體指示劑的信號量的范圍，設定回收表示相對高的線粒體含量以及線粒體膜電位的細胞的范圍。
在本發(fā)明中，所說的“線粒體指示劑”指的是能夠?qū)罴毎械木€粒體進行特異性標記并測定其存在量的物質(zhì)，只要是能夠?qū)罴毎械木€粒體進行特異性標記、能夠測定線粒體膜電位的物質(zhì)、或者對活細胞中的線粒體進行特異性標記并且同時測定其存在量和線粒體膜電位的二者的物質(zhì)，可以是任何物質(zhì)?？闪信e例如(1)具有熒光，與線粒體結構物質(zhì)(例如蛋白質(zhì)、脂類、糖鏈、核酸或者它們的代謝產(chǎn)物等)結合的物質(zhì)，(2)具有熒光，根據(jù)線粒體的膜電位而被選擇性地攝取到線粒體內(nèi)的物質(zhì)，(3)通過線粒體結構物質(zhì)的作用變換成能發(fā)出熒光的物質(zhì)，或者(4)通過線粒體結構物質(zhì)的作用而不向線粒體外擴散的物質(zhì)等。
本發(fā)明中作為線粒體指示劑的具體例子，能夠使用，例如A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、S7563、T639、T668、T669或者T3168等(化合物產(chǎn)品序號均可購自Molecular Probe公司)，更優(yōu)選使用M7514、M7510、M7511、M7512、M7513、M22425、M22426、T668、R302、或者T3168，最優(yōu)選使用T668、R302、M7514或者T3168。也不局限于這些物質(zhì)。如上所示的能在本發(fā)明中使用的線粒體指示劑分別具有下述結構。
式1A1372的結構分子式C26H38BrN3分子量472.51CAS序號75168-11-5吖啶，3，6-雙(二甲基氨基)-10-壬基-，溴化物名稱(Acridinium，3，6-bis(dimethylamino)-10-nonyl-，bromide)式2D273的結構分子式C29H37IN2O2分子量572.53CAS序號53213-82-4苯并唑，3-己基-2-(3-(3-己基-2(3H)-亞苯并唑)-1-丙烯基)-，碘化物名稱(Benzoxazolium，3-hexyl-2-(3-(3-hexyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl)-，iodide)
式3D288的結構分子式C16H19IN2分子量366.24CAS序號959-81-9吡啶，4-(2-(4-(二甲基氨基)苯基)乙烯基)-1-甲基，碘化物名稱(Pyridinium，4-(2-(4-(dimethylamino)phenyl)ethenyl)-1-methyl，iodide)式4D308的結構分子式C16H19IN2分子量366.24CAS序號2156-29-8吡啶，2-(2-(4-(二甲基氨基)苯基)乙烯基)-1-甲基，碘化物名稱(Pyridinium，2-(2-(4-(dimethylamino)phenyl)ethenyl)-1-methyl，iodide)
式5D378的結構分子式C31H41N2O2I分子量600.58CAS序號N/A名稱N/A式6D426的結構分子式C17H21IN2分子量380.27CAS序號3785-01-1吡啶，2-(2-(4-(二甲基氨基)苯基)乙烯基)-1-乙基，碘化物名稱(pyridinium，2-(2-(4-dimethylamino)phenyl)ethenyl)-1-ethyl，iodide)
式7D632的結構分子式C21H18N2O3分子量346.38CAS序號109244-58-8苯甲酸，2-(3，6-二氨基-9H-氧雜蒽-9-基)-，甲基酯名稱(Benzoic acid，2-(3，6-diamino-9H-xanthene-9-yl)-，methyl ester)式8D633的結構分子式C28H32N2O3分子量444.57CAS序號N/A名稱N/A
式9D22421的結構分子式C27H21IN2O2分子量532.38CAS序號N/A名稱N/A式10D23806的結構(成分A二氫羅得明123)分子式C21H18N2O3分子量346.38CAS序號109244-58-8苯甲酸，2-(3，6-二氨基-9H-氧雜蒽-9-基)-，甲基酯名稱(Benzoic acid，2-(3，6-diamino-9H-xanthene-9-yl)-，methyl ester)
式11L6868的結構分子式C28H22N4O6分子量510.50CAS序號22103-92-0名稱9，9′-雙吖啶，10，10′-二甲基-(9，9′-Biacridinium，10，10′-dimethyl-)式12M7502的結構分子式C34H30Cl3N3O分子量602.99CAS序號N/A名稱N/A
式13M7510的結構分子式C24H24Cl2N2O分子量427.37CAS序號N/A名稱N/A
式14M7511的結構分子式C24H25ClN2O分子量392.93CAS序號N/A名稱N/A式15M7512的結構分子式C32H32Cl2N2O分子量531.52CAS序號167095-09-21H，5H，11H，15H-夾氧(雜)蒽基[2，3，4-ij5，6，7-i′j′]聯(lián)喹啉-18-，9-[4-(氯甲基)苯基]-2，3，6，7，12，13，16，17-八氫-，氯化物名稱(1H，5H，11H，15H-Xantheno[2，3，4-ij5，6，7-i′j′]diquinolizin-18-ium，9-[4-(chloromethyl)phenyl]-2，3，6，7，12，13，16，17-octahydro-，chloride)
式16M7513的結構分子式C32H33ClN2O分子量497.08CAS序號167095-08-11H，5H，9H，11H，15H-夾氧(雜)蒽基[2，3，4-ij5，6，7-i′j′]聯(lián)喹啉，9-[4-(氯甲基)苯基]-2，3，6，7，12，13，16，17-八氫-名稱(1H，5H，9H，11H，15H-Xantheno[2，3，4-ij5，6，7-i′j′]diquinolizine，9-[4-(chloromethyl)phenyl]-2，3，6，7，12，13，16，17-octahydro-)
式17M7514的結構分子式C34H28Cl5N3O分子量671.88CAS序號201860-17-5苯并唑，2-[3-[5，6-二氯-1，3-雙[[4-(氯甲基)苯基]甲基]-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-基烯]-1-丙烯基]-3-甲基-，氯化物名稱(Benzoxazolium，2-[3-[5，6-dichloro-1，3-bis[[4-(chloromethyl)phenyl]methyl]-1，3-dihydro-2H-benzimidazol-2-ylidene]-1-propenyl]-3-methyl-，chloride)
式18M22422的結構分子式C35H33ClF6N2O分子量647.10CAS序號N/A名稱N/A式19M22423的結構分子式C26H26ClN3O5分子量495.96CAS序號137993-41-01H，5H，11H，15H-夾氧(雜)蒽基[2，3，4-ij5，6，7-i′j′]聯(lián)喹啉-18-，9-氰基-2，3，6，7，12，13，16，17-八氫-，高氯酸鹽名稱(1H，5H，11H，15H-Xantheno[2，3，4-ij5，6，7-i′j′]diquinolizin-18-ium，9-cyano-2，3，6，7，12，13，16，17-octahydro-，perchlorate)
式20M22425的結構分子式C39H36Cl5N3分子量724.00CAS序號N/A名稱N/A式21M22426的結構分子式C34H36Cl2N2分子量543.58CAS序號N/A名稱N/A
式22R302的結構分子式C21H17ClN2O3分子量380.83CAS序號62669-70-9噸，3，6-二氨基-9-(2-(甲氧基羰基)苯基，氯化物名稱(Xanthylium，3，6-diamino-9-(2-(methoxycarbonyl)phenyl，chloride)
式23R634的結構分子式C28H31ClN2O3分子量479.02CAS序號989-38-8噸，9-(2-(乙氧基羰基)苯基)-3，6-雙(乙基氨基)-2，7-二甲基，氯化物名稱(Xanthylium，9-(2-(ethoxycarbonyl)phenyl)-3，6-bis(ethylamino)-2，7-dimethyl，chloride)式24R648的結構分子式C34H43ClN2O7分子量627.18CAS序號N/A名稱N/A
式25R14060的結構分子式C23H19F5N2O分子量434.41CAS序號N/A名稱N/A式26R22420的結構分子式C21H17ClN2O3分子量380.83CAS序號62669-70-9噸，3，6-二氨基-9-(2-(甲氧基羰基)苯基，氯化物名稱(Xanthylium，3，6-diamino-9-(2-(methoxycarbonyl)phenyl，chloride)
式27T639的結構分子式C23H23N2OCl分子量378.90CAS序號6837-70-3噸，3，6-雙(二甲基氨基)-9-苯基，氯化物名稱(Xanthylium，3，6-bis(dimethylamino)-9-phenyl，chloride)式28T668的結構分子式C25H25ClN2O7分子量500.93CAS序號115532-50-8噸，3，6-雙(二甲基氨基)-9-(2-(甲氧基羰基)苯基)-，高氯酸鹽，名稱(Xanthylium，3，6-bis(dimethylamino)-9-(2-(methoxycarbonyl)phenyl)-，perchlorate)
式29T669的結構分子式C26H27ClN2O7分子量514.96CAS序號115532-52-0噸，3，6-雙(二甲基氨基)-9-(2-(乙氧基羰基)苯基)-，高氯酸鹽，名稱(Xanthylium，3，6-bis(dimethylamino)-9-[2-(ethoxycarbonyl)phenyl]-，perchlorate)式30T3168的結構分子式C25H27Cl4IN4分子量652.23CAS序號47729-63-51H-苯并咪唑，5，6-二氯-2-[3-(5，6-二氯-1，3-二乙基-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-基烯)-1-丙烯基]-1，3-二乙基-，碘化物，(E)-名稱(1H-Benzimidazolium，5，6-dichloro-2-[3-(5，6-dichloro-1，3-diethyl-1，3-dihydro-2H-benzimidazol-2-ylidene)-1-propenyl]-1，3-diethyl-，iodide，(E)-)
此外，作為線粒體指示劑，也可以使用S7563、S7567以及S7585(化合物產(chǎn)品序號可購自Molecular Probe公司)。
已知這些線粒體指示劑，各個物質(zhì)分別具有特有的激發(fā)波長，能夠發(fā)出具有特有的波長的熒光。例如，已知在M7514的情況下，接受490nm的激發(fā)波長，發(fā)出516nm的熒光，此外，在T3168的情況下，接受535nm的激發(fā)波長，發(fā)出590nm的熒光。
如前所述，因為心肌細胞和其他細胞相比較，細胞內(nèi)的線粒體含量多，此外，線粒體膜電位高，所以如果使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物，心肌細胞與其他細胞相比較，表示出更強的熒光強度。在本發(fā)明中，首先測定標記了的含有心肌細胞的細胞混合物的各細胞內(nèi)中線粒體含量以及/或者線粒體膜電位。然后，規(guī)定將表示更強的標記強度的細胞作為心肌細胞以外，根據(jù)測定的線粒體含量以及/或者線粒體膜電位，分離作為含有相對高的線粒體的細胞集團、具有相對高的膜電位的含有線粒體的細胞集團、或者含有相對高的線粒體的含有細胞且具有相對高的膜電位的含有線粒體的細胞集團的心肌細胞。
如上所述，使用熒光發(fā)光性的線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物時，使用細胞分選儀，將心肌細胞(因為線粒體含量相對較多、并且含有具有相對高的膜電位的線粒體，所以表示相對較強的熒光強度)從心肌細胞以外的細胞(因為線粒體含量相對少，或者含有具有相對低的膜電位的線粒體，所以基于通過線粒體指示劑的標記，熒光強度也相對弱)中區(qū)分開，其結果能夠選擇保持活的狀態(tài)的，且不伴隨心肌細胞的基因改變的心肌細胞。在本發(fā)明中使用的細胞分選儀，只要能夠?qū)晒鈽擞浀募毎３只畹臓顟B(tài)進行分選即可，可以是任何的細胞分選儀，作為具體的裝置，例如可以使用熒光細胞分選儀(FluorescentActivated Cell Sorter；FACS(注冊商標))(BD，F(xiàn)ranklin Lakes，NJUSA)，也可以使用其他的裝置(Beckman公司、Coulter公司、Cytomation公司等)。
心肌細胞的選擇可以在將含有心肌細胞的細胞混合物用線粒體指示劑標記之后進行。不過，在期望從含有心肌細胞的細胞混合物中更確實地進行心肌細胞選擇的情況下，用線粒體指示劑標記后，還可以在無線粒體指示劑的存在下再進行培養(yǎng)，然后對心肌細胞進行選擇。用線粒體指示劑標記后，如果在無線粒體指示劑的存在下，再進行培養(yǎng)的話，隨著細胞的分裂，每個細胞中含有的線粒體指示劑含量降低。所以、增殖性細胞培養(yǎng)的時間越長，細胞內(nèi)的線粒體指示劑含量越少，熒光強度降低。另一方面，因為心肌細胞喪失了分裂能力或者非常低，所以即使培養(yǎng)的時間很長，每個細胞中的線粒體指示劑含量沒有其他的細胞那樣減少，能夠保持相對強的熒光強度。所以，將含有心肌細胞的細胞混合物用線粒體指示劑標記后，通過再在無線粒體指示劑的存在下培養(yǎng)一定時間，具體而言為數(shù)天，能夠擴大心肌細胞與其他細胞間的標記強度的差異，能夠更確實地選擇心肌細胞。
此外，在本發(fā)明的第二種實施方式中還提供了從含有心肌細胞的細胞混合物中不伴隨心肌細胞的基因改變地濃縮心肌細胞的方法，其特征在于，該方法包括(1)使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物的步驟；以及(2)根據(jù)細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位，選擇心肌細胞的步驟。
在該實施方式中，含有心肌細胞的細胞混合物可以是完整心臟構成細胞混合物或者來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物中的任何一種。此處，完整心臟構成細胞混合物是心肌細胞和非心肌細胞的混合物，如果直接以此狀態(tài)進行心臟移植的話，由于存在非心肌細胞，所以存在引起接受者的心臟中嚴重副作用的風險。所以，為了進行更安全、確實地針對接受者的心肌細胞的移植，優(yōu)選在移植前，盡可能提高含有心肌細胞的細胞混合物中的心肌細胞的比率，即，進行濃縮。此外，作為可能分化成心肌細胞的細胞，可以使用例如干細胞、前體細胞或者卵細胞。
在該方法中，為了更確實地濃縮心肌細胞，也可以在上述(1)的步驟之后、(2)的步驟之前，也可以再包括在無線粒體指示劑的存在下培養(yǎng)標記了的細胞的步驟。通過該步驟，能夠使其他細胞的熒光強度降低，使心肌細胞內(nèi)的相對的熒光強度增強，更確實地濃縮心肌細胞。
在這種實施方式中，作為線粒體指示劑，如前所述，可以使用A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669或者T3168，線粒體指示劑優(yōu)選使用M7512、T3168、T668或者R302。
此外，在本發(fā)明的第三種實施方式中提供了從含有心肌細胞的細胞混合物中不伴隨心肌細胞的基因改變地制備心肌細胞的方法，其特征在于，該方法還包括(1)從可能分化成心肌細胞的細胞分化、誘導心肌細胞、制備含有心肌細胞的細胞混合物的步驟；(2)使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物的步驟；以及(3)根據(jù)細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位，選擇心肌細胞的步驟。
在這種實施方式中，含有心肌細胞的細胞混合物是完整心臟構成細胞混合物或者來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物中的任何一種。此處，完整心臟構成細胞混合物是心肌細胞和非心肌細胞的混合物，如果以這種狀態(tài)進行心臟移植的話，由于存在非心肌細胞，所以存在引起接受者的心臟中嚴重副作用的風險。所以，優(yōu)選提供為了進行更安全、確實地針對接受者的心肌細胞的移植，在進行移植的時候，含有心肌細胞的細胞混合物中心肌細胞的比率盡可能高的制備物。此外，作為可能分化成心肌細胞的細胞可以使用例如干細胞、前體細胞或者卵細胞。
在該方法中，為了更確實地進行心肌細胞的制備，也可以在進行上述(1)的步驟之后、(2)的步驟之前，再進行在無線粒體指示劑的存在下培養(yǎng)標記了的細胞的步驟。
在這種實施方式中，作為線粒體指示劑，如前所述可以使用A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669或者T3168，線粒體指示劑優(yōu)選使用M7512、T3168、T668或者R302。
作為將心肌細胞分化、誘導的方法，從尚未分化的具有多種分化能力的多能性干細胞(pluripotent stem cells)分化、誘導的方法已紀在本技術領域中進行了多個開發(fā)。多能性干細胞是指通過體外培養(yǎng)，具有始終保持未分化的狀態(tài)，能夠幾乎永久或者長期地進行細胞增殖的、呈現(xiàn)正常的核(染色體)型，在適當?shù)臈l件下分化成所有三胚層(外胚層、中胚層、以及內(nèi)胚層)的細胞系的能力的細胞。目前，作為多能性干細胞，最為熟知有從初期胚分離的胚胎干細胞(embryonic stemcellsES細胞)、從胎兒期的始原生殖細胞分離的胚性生殖細胞(embryonic germ cellsEG細胞)、以及從成熟個體的骨髓分離的成人型多能性干細胞(multipotent adult progenitor cellsMAPC)的3種。
例如，從多能性干細胞中的胚胎干細胞進行心肌細胞的分化、誘導的方法，可以列舉釋放凝集培養(yǎng)法、懸滴(Hanging-drop)培養(yǎng)法、與飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)方法、旋轉培養(yǎng)法、軟瓊脂培養(yǎng)法、微載體培養(yǎng)法等。
已知例如使用釋放凝集培養(yǎng)法的時候，將作為單個細胞狀態(tài)(通過實施酶消化等使細胞彼此間沒有連接地、各個細胞在液相中分散的狀態(tài))的胚胎干細胞在培養(yǎng)基按照幾百個細胞/mL的細胞密度進行懸浮，進行使白血病抑制因子(leukemia inhibitory factorLIF)等的分化抑制因子不存在的懸浮培養(yǎng)，ES細胞間彼此連結、凝集，形成稱為胚樣體(embryoid bodyEB)的初期胚類似結構體，然后，通過將EB以懸浮狀態(tài)或粘附狀態(tài)進行培養(yǎng)，能夠分化、誘導出具有自律搏動性的心肌細胞。
此外，已知例如使用懸滴培養(yǎng)法的時候，在培養(yǎng)皿的蓋上，制備由20μl的培養(yǎng)液構成的液滴，使該液滴中含有數(shù)百個細胞，通過使該培養(yǎng)皿的蓋覆蓋在培養(yǎng)皿上，靜置，細胞在液滴的底面、即，在液滴的先端部分形成細胞塊，能夠?qū)⒃摷毎麎K分化、誘導成具有自律搏動性的心肌細胞。
此外，已知例如使用與飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)的共培養(yǎng)法的時候，能夠通過將具有中胚層系細胞的性質(zhì)的細胞，優(yōu)選ST2細胞、OP9細胞、PA6細胞等具有骨髓基質(zhì)細胞樣性質(zhì)的細胞進行高密度培養(yǎng)，用絲裂霉素C處理、或者通過放射線照射等的方法進行飼養(yǎng)化，此外，將在培養(yǎng)基上接種單個細胞狀態(tài)的ES細胞后，通過培養(yǎng)，能夠分化、誘導具有自律搏動性的心肌細胞。
此外，在本發(fā)明的第四種實施方式中，提供了從含有心肌細胞的細胞混合物中對心肌細胞比率進行評價的方法，其特征在于，該方法包括(1)使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物的步驟；以及根據(jù)(2)細胞的相對的線粒體含量，計算相對非心肌細胞的心肌細胞的比率的步驟以及/或者根據(jù)細胞的相對的線粒體膜電位選擇心肌細胞的步驟。
在這種實施方式中，含有心肌細胞的細胞混合物可以是完整心臟構成細胞混合物或者來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物中的任何一種。此處，完整心臟構成細胞混合物是心肌細胞和非心肌細胞的混合物，直接以現(xiàn)有的狀態(tài)進行心臟移植的話，由于存在非心肌細胞，所以存在引起在接受者的心臟中嚴重副作用的風險性。所以，為了進行更安全、確實的對于接受者的心肌細胞的移植，優(yōu)選在移植前，盡可能提高含有心肌細胞的細胞混合物中心肌細胞的比率，即優(yōu)選進行濃縮。此外，作為可能分化成心肌細胞的細胞，可以使用例如干細胞、前體細胞或者卵細胞。
在這種實施方式中，作為線粒體指示劑，如前所述，能夠使用A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669或者T3168，線粒體指示劑優(yōu)選使用M7512、T3168、T668或者R302。
在與心肌細胞的移植相關的領域中，作為將心肌細胞分化、誘導的方法，已經(jīng)公知幾種方法，此外，推測在將來會開發(fā)多種將心肌細胞進行分化、誘導的方法。不過，如上所述，如果向心臟移植的細胞中混有非心肌細胞的話，在進行心臟移植的時候，存在引起在接受者的心臟中嚴重副作用的風險。根據(jù)該方法，通過在移植前對推測向心臟移植的心肌細胞制備物中的心肌細胞的比率進行評價，能夠預先評價在移植中使用的心肌細胞制備物的確實性。
在現(xiàn)有技術領域中，作為心肌細胞的純化方法，例如以流式細胞儀和磁珠、panning法等的抗原-抗體反應為基礎的方法(MonoclonalAntibodiesprinciples and practice，Third Edition(Acad.Press，1993)；Antibody EngineeringAPractical Approach(IRL Press atOxford University Press，1996)；作為例子已知有以下方法作為親本細胞的ES細胞等的多能性干細胞的基因上添加人工修飾，通過賦予藥物耐藥性或異位蛋白質(zhì)的表達能力，回收具有作為心肌細胞的形狀性質(zhì)的細胞的方法；以及通過使用可以很容易地與純化度低的其他方法組合使用的蔗糖、珀可(percoll)等的載體的密度梯度離心的細胞分級法(Circ Res.200220；91501-508))等。
發(fā)明的效果通過本發(fā)明的方法，能夠從含有心肌細胞的細胞混合物中不伴隨心肌細胞的基因改變地選擇心肌細胞。此外，通過本發(fā)明的方法，能夠從含有心肌細胞的細胞混合物中不伴隨心肌細胞的基因改變地濃縮心肌細胞，并且還能不伴隨心肌細胞的基因改變地制備心肌細胞。此外，可以通過各種方法對制備的含有心肌細胞的細胞混合物中的心肌細胞比率進行評價。
通過本發(fā)明中記載的這些方法，能夠使含有心肌細胞的細胞混合物中的心肌細胞的比率提高，能夠降低在接受者的心臟移植時，由于擔心非心肌細胞的存在而造成的多種副作用。


圖1表示的是對從新生幼兒大鼠心臟提取的完整心臟構成細胞混合物通過的線粒體指示劑M7512進行標記的顯像。
圖2表示對來自小鼠胚胎干細胞的來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物，通過線粒體指示劑M7512進行標記的顯像。
圖3表示的是對從新生幼兒大鼠心臟提取的完整心臟構成細胞混合物用線粒體指示劑M7512進行標記，逐個檢測各細胞的熒光量的情況的細胞集團的分布。
圖4表示的是對小鼠胚胎干細胞來自的來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物用線粒體指示劑M7512進行標記，逐個檢測各細胞的熒光量的情況的細胞集團的分布。
圖5表示的是通過針對圖3所示的完整心臟構成細胞混合物的、心肌細胞標記物的抗體、抗肌節(jié)α-輔肌動蛋白抗體標記進行的顯像。
圖6表示的是通過針對圖4所示的來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物的、心肌細胞標記物的抗體、抗肌節(jié)α-輔肌動蛋白抗體標記進行的顯像。
圖7表示的是對從新生幼兒大鼠心臟提取的完整心臟構成細胞混合物用線粒體指示劑T3168進行標記，通過逐個檢測各細胞的熒光量的分布解析和進行針對細胞分選的集團的、心肌細胞標記物的抗體、抗肌節(jié)α-輔肌動蛋白抗體標記顯像。
圖8-1圖8表示對新生幼兒大鼠完整心臟細胞用T668進行標記，逐個檢測熒光量的分布解析和進行細胞分選的集團解析的結果以及、通過針對各細胞群的心肌細胞的標記物的抗體、抗肌節(jié)α-輔肌動蛋白抗體標記的顯像結果。此處，圖8-1表示來自新生幼兒大鼠胎生幼仔心臟的細胞集團根據(jù)T668熒光強度分成3個細胞集團的圖。
圖8-2表示幾乎全部T668熒光信號最強的細胞群都是心肌細胞、幾乎所有中熒光的細胞集團都不是心肌細胞的圖。
圖8-3是即使用R302也能夠得到與T668相同的細胞的圖。
圖9-1圖9表示的是通過線粒體指示劑T668對大鼠胎生幼仔完整心臟構成細胞的細胞集團解析、和對分選的細胞的輔肌動蛋白的免疫染色結果。此處，圖9-1表示來自出生13天的大鼠胎生幼仔心臟的細胞集團，根據(jù)T668的熒光強度分成3個細胞集團的圖。
圖9-2表示幾乎所有的來自T668的熒光信號最強的細胞群的細胞是心肌細胞，幾乎全部中熒光細胞集團都不是心肌細胞的圖。
圖10-1圖10表示用線粒體指示劑T668對胎生幼仔全細胞的染色和心肌細胞的純化。此處，圖10-1表示在來自出生9天的大鼠胎生幼仔的細胞集團中，通過熒光強度在細胞集團中觀測到主要的一個細胞集團的圖。
圖10-2表示的是用作為心肌細胞的標記的輔肌動蛋白進行免疫染色的時候，發(fā)現(xiàn)在T668中達到大約95％以上的是心肌細胞的圖。
圖11表示用線粒體指示劑T668對出生后8天到出生11天的大鼠完整心臟構成細胞的染色和細胞集團解析。
圖12表示用線粒體指示劑T668對來自小鼠胚胎干細胞的多種細胞群的染色和對分選的細胞集團的輔肌動蛋白進行免疫染色。
具體實施例方式
(1)含有心肌細胞的細胞混合物的制備首先，將含有心肌細胞的細胞混合物作為完整心臟構成細胞混合物、或者來自干細胞的細胞混合物而獲得。
完整心臟構成細胞混合物，首先從流產(chǎn)的胎兒或者新生幼兒的心臟分離出心室，將其用剪刀剪碎后，用膠原酶等酶進行處理，通過去除細胞間的連接，使細胞分散而制備。
來自干細胞的細胞混合物可以將胚胎干細胞或體干細胞等的干細胞通過懸滴培養(yǎng)法(Bader A，et al.，Differentiation，2001 68p.31-43)進行分化、誘導，由此制備心肌細胞。使用來自干細胞的細胞混合物的時候，期望對于分化、誘導的細胞混合物，進行提高心肌細胞的分化·成熟度的處理(例如添加全反式視黃酸)。
(2)通過細胞的線粒體指示劑進行標記在本發(fā)明中作為優(yōu)選的線粒體指示劑，使用熒光發(fā)光性的M7512、T3168、T668或者R302(全部由Molecular Probe公司制造)。對于完整心臟構成細胞混合物、或者來自干細胞的細胞混合物，通過將M7512、T3168、T668或者R302添加到培養(yǎng)液中，進行溫育，對細胞進行M7512、T3168、T668或者R302的標記。
對細胞用線粒體指示劑進行標記后，通過再進行數(shù)日的培養(yǎng)，能夠進一步加大心肌細胞的標記信號量與其他細胞的標記信號量的差異。
(3)心肌細胞的選擇對于用M7512、T3168、T668或者R302標記了的完整心臟構成細胞混合物、或者來自干細胞的細胞混合物，使用細胞分選儀對各細胞內(nèi)的線粒體含量進行測定，將具有相對高的線粒體含量的細胞集團作為心肌細胞分離。使用M7512、T3168、T668或者R302作為為了選擇心肌細胞而期望的細胞分選儀，使用熒光細胞分選儀(FluorescentActivated Cell Sorter；FACS(注冊商標))(BD，F(xiàn)ranklin Lakes，NJUSA)。
(4)心肌細胞的確認通過上述方法，分選標記強度強的細胞，培養(yǎng)該細胞。之后，使用能夠?qū)⑿募〖毎麖钠渌毎凶R別的其他的方法，計算選擇后的心肌細胞的含量、含有率，確認本發(fā)明的效果。在本發(fā)明中，作為能夠?qū)⑿募〖毎麖钠渌毎凶R別的其他的方法，可以通過使用針對心肌細胞特異性的標記物(例如肌球蛋白重鏈/輕鏈或者肌節(jié)α-輔肌動蛋白、Troponin I、ANP、GATA-4、Nkx 2.5、MEF-2c)的抗體的檢測方法。在本發(fā)明中，使用對其中的抗肌節(jié)α-輔肌動蛋白抗體(anti-Sarcomericα-Actrinin Antibody)進行標記的方法。
實施例本發(fā)明通過下述的實施例進一步加以詳細的說明。不過，下述的實施例是本發(fā)明的例示，本意不在于局限本發(fā)明。
實施例1通過線粒體指示劑對從新生幼兒大鼠心臟提取的完整心臟構成細胞混合物進行標記本實施例，為了確認本發(fā)明的方法是否能夠用于完整心臟構成細胞混合物中的心肌細胞檢測而進行。
將出生后1～3天的新生幼兒大鼠用乙醚麻醉，通過頸椎脫臼處死后，摘取心臟。分離出心室，在未添加血清的D-MEM(高葡萄糖)培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中，在0.025％(w/v)的膠原酶(WarthingtonBiomedical Corporation公司制造)的存在下，通過消化分離了的心室，使細胞分散，得到完整心臟構成細胞混合物。
培養(yǎng)液用混合了使胎牛血清(JRH Bioscience公司)的終濃度為10％的D-MEM(高葡萄糖)培養(yǎng)基(Invitrogen公司)取代。對于這樣制備的培養(yǎng)細胞，按照線粒體指示劑M7512(Molecular Probe公司制造)的終濃度為100nM向培養(yǎng)液中添加，在37℃溫育10分鐘。然后，使用培養(yǎng)基洗滌4次后，再在37℃培養(yǎng)24小時。
將這樣標記的細胞通過熒光顯微鏡進行觀察。結果如圖1所示。
在圖1中，在心肌細胞中，通過M7512清楚地觀察到熒光，表示心肌細胞在細胞內(nèi)含有大量的線粒體，框線包圍的非心肌細胞表示只含有很少的線粒體。
實施例2通過線粒體指示劑對來自小鼠胚胎干細胞的細胞混合物進行標記在本實施例中，為了確認本發(fā)明的方法是否能夠用于檢測來自干細胞的細胞混合物中的心肌細胞檢測而進行。
對于未分化的小鼠胚胎干細胞，使用懸滴培養(yǎng)法(Bader A，et al.，Differentiation，200168p.31-43)，引起了心肌細胞的分化、誘導。具體而言，培養(yǎng)皿的蓋上，制備由20μl的培養(yǎng)液構成的液滴，使在該液滴中含有數(shù)百個細胞，將該培養(yǎng)皿的蓋覆蓋在培養(yǎng)皿上，通過靜置使細胞在液滴的底面，即，在液滴的先端部分形成細胞塊的使心肌細胞分化、誘導的方法。在進行心肌細胞的分化、誘導的時候，作為培養(yǎng)液，使用使胎牛血清(EQUITECH-BIO公司)達到終濃度10％而混合的α-MEM培養(yǎng)基(SIGMA公司)。
分化、誘導后第14天，在培養(yǎng)容器內(nèi)確認生成了含有自律搏動性細胞的細胞塊，此外，為了提高心肌細胞的分化、成熟度，向培養(yǎng)液中添加全反式視黃酸，使終濃度達到10-8M。
分化、誘導第21天時，使含有自律搏動性的細胞的細胞塊分散，分散成單獨的細胞。將這樣制備的細胞混合物在與實施例1相同的條件下用M7512進行標記，在去除M7512后，再接著連續(xù)培養(yǎng)5天后，將在培養(yǎng)條件下形成的含有自律搏動性的細胞的細胞塊用熒光顯微鏡進行觀察。結果如圖2所示。
在圖2中，表示了細胞塊經(jīng)過1次搏動周期(即、松弛期1-收縮期-松弛期2)，細胞塊的相差顯像(上半部分)以及熒光顯像(下半部分)。由該結果可知，全部的自律搏動性心肌細胞與其他細胞相比較，用M7512可以進行強標記。即、表示在自律搏動性的細胞塊中，與清楚地看到M7512引起的熒光相對，在自律搏動性的細胞塊周圍存在的細胞中，幾乎看不到M7512引起的熒光。
實施例3用線粒體指示劑標記的完整心臟構成細胞混合物的細胞分布的解析在本實施例中以闡明實施例1的完整心臟構成細胞混合物中存在多少心肌細胞為目的進行。
首先，將完整心臟構成細胞混合物按照實施例1記載的方法制備，用M7512進行標記。將進行了該標記的完整心臟構成細胞混合物通過FACS(注冊商標)(BD，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ USA)以供細胞集團存在分布解析。結果如圖3所示。
圖3中，橫軸的FSC-A是表示細胞大小的指標。如圖示所示，完整心臟構成細胞混合物能夠被分為相對熒光強度強的P5區(qū)域存在的細胞、和相對熒光強度弱的P6區(qū)域。并且，在本實施例中，將在P5區(qū)域中存在的細胞作為心肌細胞進行分選，將P6區(qū)域中存在的細胞作為心肌細胞以外的細胞進行分選，加以培養(yǎng)。
實施例4用線粒體指示劑標記的來自小鼠胚胎干細胞的細胞混合物的細胞分布的解析。
本實施例以闡明在實施例2的來自小鼠胚胎干細胞的細胞混合物中存在多少心肌細胞為目的而進行。
首先，將來自小鼠胚胎干細胞的細胞混合物按照實施例2記載的方法進行制備，用M7512進行標記。將完成了該標記的來自小鼠胚胎干細胞的細胞混合物通過FACS(注冊商標)(BD，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ USA)供給細胞集團存在分布解析。結果如圖4所示。
圖4中，橫軸的FSC-A是表示細胞大小的指標。如圖所示，來自小鼠胚胎干細胞的細胞混合物能被分成在相對熒光強度強的P2區(qū)域中存在的細胞、和在相對熒光強度弱的其他以外的區(qū)域中存在的細胞。并且，在本實施例中將在P2區(qū)域中存在的細胞作為心肌細胞進行分選，加以培養(yǎng)。
實施例5通過心肌細胞標記物對從完整心臟構成細胞混合物選出的細胞進行標記本實施例的目的是闡明在完整心臟構成細胞混合物中存在的心肌細胞通過實施例3的方法能夠濃縮多少而進行的。
將用實施例3記載的方法分選的屬于P5區(qū)域以及P6區(qū)域細胞集團，在培養(yǎng)液添加胎牛血清(EQUITECH-BIO公司)至終濃度為10％而混合的α-MEM培養(yǎng)基(SIGMA公司)中培養(yǎng)12小時后，用低聚甲醛進行固定。
然后，將固定了的細胞用作為心肌細胞標記物的小鼠抗肌節(jié)α-輔肌動蛋白抗體(SIGMA公司)進行標記，用綠色熒光物質(zhì)標記的兔抗小鼠抗體(Molecular Probes公司)，使與細胞結合的小鼠抗肌節(jié)α-輔肌動蛋白抗體可視化。結果如圖5所示。在圖5中，分別將在完整心臟構成細胞混合物中的結果表示在上半部分，在實施例3中從P5區(qū)域回收的細胞的結果表示在中間部分，并且，在實施例3中從P6區(qū)域回收的細胞的結果表示在下半部分。
結果表明在用發(fā)明的方法進行選擇前的細胞混合物中，由抗肌節(jié)α-輔肌動蛋白抗體所識別的心肌細胞和其他的細胞混合在一起，全部細胞中的心肌細胞的比率為30％。與此相對，從P5區(qū)域回收的細胞中99％以上是心肌細胞。此外，從P6區(qū)域回收的細胞中殘存有很少的心肌細胞，只與通過本發(fā)明的方法選擇前具有相同的心肌細胞比率。
據(jù)此可以明確通過使用本發(fā)明的方法，能夠從完整心臟構成細胞混合物中以高純度選擇心肌細胞，進行濃縮。
實施例6通過心肌細胞標記物對選自小鼠胚胎干細胞的細胞混合物進行標記本實施例的目的是闡明在來自小鼠胚胎干細胞的細胞混合物中存在的心肌細胞通過實施例4的方法能夠濃縮到哪種程度而進行的。
將用實施例4記載的方法分選的屬于P2區(qū)域的細胞集團以及屬于以外區(qū)域的細胞集團，在作為培養(yǎng)液的使胎牛血清(EQUITECH-BIO公司)的終濃度達到10％而混合的α-MEM培養(yǎng)基(SIGMA公司)中培養(yǎng)12小時后，用低聚甲醛進行固定。
然后，將固定了的細胞用作為心肌細胞標記物的小鼠抗肌節(jié)α-輔肌動蛋白抗體(SIGMA公司)進行標記，用綠色熒光物質(zhì)標記的兔抗小鼠抗體(Molecular Probes公司)，使與細胞結合的小鼠抗肌節(jié)α-輔肌動蛋白抗體可視化。結果如圖6所示。在圖6中，分別將來自小鼠胚胎干細胞的細胞混合物中的結果表示在上半部分，將在實施例4中從P2區(qū)域回收的細胞的結果表示在下半部分。
結果表明，在通過本發(fā)明的方法進行選擇前的細胞混合物中，用抗肌節(jié)α-輔肌動蛋白抗體所識別的心肌細胞和其他以外的細胞混合在一起，在全部細胞中的心肌細胞的比率是10％。與此相對，用M7512標記的情況下，從熒光強度強的P2區(qū)域回收的細胞中有80％以上是心肌細胞。
據(jù)此可知，使用本發(fā)明的方法，從來自小鼠胚胎干細胞細胞混合物中也可以以高純度對心肌細胞進行選擇，進行濃縮。
實施例7用線粒體指示劑T3168進行標記本實施例是為了確認用線粒體指示劑T3168進行標記的情況下，也能得到與用M7512得到的結果相同的結果而進行的。
作為線粒體指示劑，除了使用T3168(Molecular Probe公司制造)以外，通過用與實施例1記載的方法相同的方法，制備從用線粒體指示劑標記的新生幼兒大鼠心臟提取的完整心臟構成細胞混合物。
對于這樣制備的標記了的完整心臟構成細胞混合物，通過用與實施例3記載的方法相同的方法，用FACS對細胞分布進行解析，并且，將表示相對強的熒光強度的細胞作為心肌細胞進行選擇、回收。將這樣得到的細胞用與實施例5記載的方法相同的方法，在培養(yǎng)后，用低聚甲醛固定，使用小鼠抗肌節(jié)α-輔肌動蛋白抗體(SIGMA公司)進行標記。結果如圖7所示。
結果表明，用本發(fā)明的方法選擇前的細胞混合物中，由抗肌節(jié)α-輔肌動蛋白抗體所識別的心肌細胞和其它細胞混合在一起，在全部細胞中心肌細胞的比率是30％。與此相對，表示出相對強的熒光強度的細胞95％以上是心肌細胞。
據(jù)此明確了使用本發(fā)明的方法，作為線粒體指示劑使用T3168的情況下，也能夠個從完整心臟構成細胞混合物中，以高純度選擇心肌細胞，進行濃縮。
實施例8用線粒體指示劑T668對新生幼兒大鼠完整心臟構成細胞染色和純化心肌細胞將新生幼兒大鼠胎生幼仔心臟用0.025％(w/v)膠原酶(SIGMA)和胰酶(GIBCO)進行處理，回收細胞集團。相對于細胞分散的培養(yǎng)液，使用終濃度1μM的線粒體指示劑T668(Molecular Probe公司制造)在37℃下，暴露15分鐘，洗滌3次后，直接進行FACS解析。結果，根據(jù)T668的熒光強度分成3個細胞集團(圖8-1)。分別分選熒光信號最強的高熒光細胞集團和中熒光強度細胞集團，進行培養(yǎng)。
然后，針對培養(yǎng)細胞，對輔肌動蛋白進行免疫染色，鑒定心肌細胞(圖8-2)。結果可知，來自T668的熒光信號最強的細胞群中的幾乎全部的細胞都是心肌細胞，中熒光細胞集團的幾乎全部細胞不是心肌細胞。同樣地即使用R302(Molecular Probe公司制造)進行解析也能得到相同的結果(圖8-3)。
實施例9用線粒體指示劑T668和M7514對新生幼兒大鼠完整心臟構成細胞進行染色和對每個單位線粒體的膜電位的比較解析使用與實施例8相同的材料以及方法，回收細胞集團。并且，用對心肌細胞進行線粒體特異性染色的膜電位非依賴性的線粒體指示劑M7514(Molecular Probe公司制造)、和對心肌細胞進行線粒體特異性染色的膜電位依賴性的線粒體指示劑T668進行染色。之后，立即進行FACS解析。因為T668產(chǎn)生的熒光和M7514產(chǎn)生的熒光波長不相同，所以，可以分別進行檢測。用T668熒光作為指標，檢測出3個細胞集團。根據(jù)實施例8所示的解析可知，表示出最高的熒光的高熒光細胞集團是心肌細胞群，中熒光細胞集團是非心肌細胞。
然后，將來自T668的熒光強度以來自M7514的熒光強度分割的比率將各個細胞群分開。在根據(jù)T668的信號而鑒定為心肌細胞的細胞群中，作為M7514與T668的熒光強度比，例如采用150％的情況下，150％以上的細胞占全部的90％，與此相對，根據(jù)T668的信號而鑒定為非心肌細胞的細胞中，M7514與T668的熒光強度比150％以上的只占全部的13％。這個差距的意思表示的是，在心肌細胞中，與非心肌細胞相比，不僅線粒體的含量高，而且每個線粒體的膜電位也高。
實施例10用線粒體指示劑T668對大鼠胎生幼仔完整心臟構成細胞進行染色和純化心肌細胞將出生13天的大鼠胎生幼仔心臟用膠原酶和胰酶進行處理，回收細胞集團。對于分散了細胞的培養(yǎng)液，使之維持終濃度1μM的線粒體指示劑T668，在37℃下暴露15分鐘，洗滌3次后，立即進行FACS解析。根據(jù)T668熒光強度分成3個細胞集團(圖9-1)。分別分選熒光信號最強的高熒光細胞集團和中熒光細胞集團進行培養(yǎng)。
針對培養(yǎng)細胞對輔肌動蛋白進行免疫染色，鑒定心肌細胞。結果可知，來自T668的熒光信號最強的細胞群的幾乎全部細胞都是心肌細胞，中熒光細胞集團的幾乎全部細胞不是心肌細胞(圖9-2)。
實施例11用線粒體指示劑T668和M7512對胎生幼仔全部細胞的染色和純化心肌細胞對出生9天的大鼠胎生幼仔用膠原酶和胰酶進行處理，回收細胞集團。對于分散了細胞的培養(yǎng)液，使用終濃度達到1μM的線粒體指示劑T668，在37℃下暴露15分鐘，洗滌3次后，立即進行FACS解析。根據(jù)熒光強度，觀測到在細胞集團中的主要的一個細胞集團，從使用發(fā)生后期的完整心臟樣品的解析可以知道，作為心肌細胞檢測并沒有發(fā)現(xiàn)預測為高熒光強度區(qū)域中明確的細胞集團(圖10-1)。不過，因為與主要的細胞集團相比具有高熒光的細胞以很少的比例存在，所以將其作為高熒光細胞集團分離回收。
培養(yǎng)該細胞，用作為心肌細胞標記物的輔肌動蛋白進行免疫染色的時候，發(fā)現(xiàn)在T668中有大約95％以上是心肌細胞(圖10-2)。在出生9天的胎生幼仔(初期胚)中，因為心肌細胞極其不成熟，所以認為不會充分地引起線粒體的量的變化。結果表明在這樣的時期中，通過使用線粒體膜電位這樣的指標，能夠有效地選擇心肌細胞。
實施例12用線粒體指示劑T668對出生后8天到出生11天的大鼠完整心臟構成細胞進行染色和FACS解析對出生后8天到出生11天的大鼠心臟用膠原酶和胰酶進行處理、回收細胞集團。對于分散了細胞的培養(yǎng)液，使用終濃度達到1μM的線粒體指示劑T668，在37℃下暴露15分鐘，進行3次洗滌后，立即進行FACS解析。根據(jù)T668熒光強度分離細胞集團可知，熒光強度最強的高熒光心肌細胞集團，隨著發(fā)生的進行，量增加，細胞群明確地分開(圖11)。該結果表明通過使用本說明書提供的方法，能夠推測心肌細胞的成熟度。
實施例13用線粒體指示劑T668對來自小鼠胚胎干細胞的多種細胞群進行染色和純化心肌細胞使用與實施例2相同的方法，使ES細胞分化成含有心肌細胞的細胞群。將該多種細胞塊用膠原酶和胰酶進行處理，得到分散的細胞。對于分散了細胞的培養(yǎng)液，使用終濃度達到1μM的線粒體指示劑T668，在37℃下暴露15分鐘，進行3次洗滌后，立即進行FACS解析。發(fā)現(xiàn)根據(jù)熒光強度觀測到在細胞集團中主要的一個細胞集團，從使用的發(fā)生后期的完整心臟樣品的解析中可知，作為心肌細胞檢測并沒有發(fā)現(xiàn)預測為高熒光強度區(qū)域中明確的細胞集團(圖12)。不過，與主要的細胞集團相比，因為存在顯示高熒光的細胞，所以將其作為高熒光細胞集團進行分離回收。
在將該細胞進行大量的培養(yǎng)，以作為心肌細胞標記物的輔肌動蛋白進行免疫染色的時候，可以判斷98％以上是心肌細胞。相反，回收主要的細胞集團，培養(yǎng)、進行免疫染色的時候，幾乎所有的細胞都不是心肌細胞。
實施例14用線粒體指示劑S7563對新生幼兒大鼠完整心臟構成細胞進行染色和純化心肌細胞對新生幼兒大鼠胎生幼仔心臟用膠原酶和胰酶進行處理，回收細胞集團。對于分散了細胞的培養(yǎng)液，使用終濃度達到1μM的線粒體指示劑S7563，在37℃下暴露15分鐘，進行3次洗滌后，立即進行FACS解析。根據(jù)S7563熒光強度分出3個細胞集團。分選出熒光信號最強的細胞集團進行培養(yǎng)。
針對培養(yǎng)細胞對輔肌動蛋白進行免疫染色，鑒定心肌細胞。結果可知來自S7563的熒光信號最強的高熒光細胞集團的幾乎全部細胞都是心肌細胞，中熒光細胞集團的幾乎全部不是心肌細胞。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性通過本發(fā)明的方法，能夠從含有心肌細胞的細胞混合物中不伴隨心肌細胞的基因改變地選擇心肌細胞。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠從含有心肌細胞的細胞混合物中不伴隨心肌細胞的基因改變地濃縮心肌細胞，并且，還可以不伴隨心肌細胞的基因改變地制備心肌細胞。此外，可以對通過各種方法制備的含有心肌細胞的細胞混合物中的心肌細胞比率進行評價。
根據(jù)本發(fā)明中記載的這些方法，能夠提高在含有心肌細胞的細胞混合物中的心肌細胞的比率，在接受者的心臟移植時能夠降低由于非心肌細胞的存在導致產(chǎn)生的各種副作用。
權利要求
1.選擇心肌細胞的方法，該方法是從含有心肌細胞的細胞混合物中，根據(jù)細胞的相對的線粒體含量以及/或者根據(jù)細胞的相對的線粒體膜電位，不伴隨心肌細胞的基因改變地進行選擇。
2.權利要求1記載的方法，其中，從含有心肌細胞的細胞混合物中，根據(jù)細胞的相對的線粒體含量，不伴隨心肌細胞的基因的改變地選擇心肌細胞。
3.權利要求1記載的方法，其中，從含有心肌細胞的細胞混合物中，根據(jù)細胞的相對的線粒體膜電位，不伴隨心肌細胞的基因的改變地選擇心肌細胞。
4.權利要求1記載的方法，其中，從含有心肌細胞的細胞混合物中，根據(jù)細胞的相對的線粒體含量以及膜電位，不伴隨心肌細胞的基因的改變地選擇心肌細胞。
5.權利要求1～4記載的方法，其特征在于，使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物，測定細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位。
6.權利要求1～5記載的方法，其中含有心肌細胞的細胞混合物是完整心臟構成細胞混合物或者來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物。
7.權利要求6記載的方法，其中可能分化成心肌細胞的細胞選自干細胞、前體細胞以及卵細胞構成的組。
8.權利要求5～7任一項記載的方法，其中，在使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物后，在測定細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位之前，還包括在無線粒體指示劑的存在下培養(yǎng)標記了的細胞的步驟。
9.權利要求5～8任一項記載的方法，其中，線粒體指示劑選自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168構成的組。
10.權利要求9記載的方法，其中，線粒體指示劑是M7512、T3168、T668或者R302。
11.從含有心肌細胞的細胞混合物中不伴隨心肌細胞的基因改變地濃縮心肌細胞的方法，其特征在于，所述方法包括(1)使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物的步驟；以及(2)根據(jù)細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位，選擇心肌細胞的步驟。
12.權利要求11記載的方法，其中，含有心肌細胞的細胞混合物是完整心臟構成細胞混合物或者來自可能分化成心肌細胞的細胞混合物。
13.權利要求12記載的方法，其中，可能分化成心肌細胞的細胞選自干細胞、前體細胞以及卵細胞構成的組。
14.權利要求11～13任一項記載的方法，其中，在上述(1)的步驟之后、(2)的步驟之前，還包括在無線粒體指示劑的存在下培養(yǎng)標記了的細胞的步驟。
15.權利要求11～14任一項記載的方法，其中線粒體指示劑選自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168構成的組。
16.權利要求15記載的方法，其中，線粒體指示劑是M7512、T3168、T668或者R302。
17.不伴隨心肌細胞的基因改變地制備心肌細胞的方法，其特征在于，該方法包括(1)從可能分化成心肌細胞的細胞分化、誘導心肌細胞，制備含有心肌細胞的細胞混合物的步驟；(2)使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物的步驟；以及(3)根據(jù)細胞的相對的線粒體含量以及/或者細胞的相對的線粒體膜電位，選擇心肌細胞的步驟。
18.權利要求17記載的方法，其中，可能分化成心肌細胞的細胞選自干細胞、前體細胞以及卵細胞構成的組。
19.權利要求17或者18記載的方法，其中，在上述(2)的步驟之后、(3)的步驟之前，還包括在無線粒體指示劑的存在下培養(yǎng)標記了的細胞的步驟。
20.權利要求17～19任一項記載的方法，其中線粒體指示劑選自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168構成的組。
21.權利要求20記載的方法，其中，線粒體指示劑是M7512、T3168、T668或者R302。
22.對含有心肌細胞的細胞混合物中的心肌細胞的比率進行評價的方法，其特征在于，該方法包括(1)使用線粒體指示劑標記含有心肌細胞的細胞混合物的步驟；以及(2)根據(jù)細胞的相對的線粒體含量以及/或者根據(jù)細胞的相對的線粒體膜電位，計算相對非心肌細胞的心肌細胞的比率的步驟。
23.權利要求22記載的方法，其中，含有心肌細胞的細胞混合物是完整心臟構成細胞混合物或者來自可能分化成心肌細胞的分化細胞混合物。
24.權利要求23記載的方法，其中，可能分化成心肌細胞的細胞選自干細胞、前體細胞以及卵細胞構成的組。
25.權利要求22～24任一項記載的方法，其中，線粒體指示劑選自A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669以及T3168構成的組。
26.權利要求25記載的方法，其中，線粒體指示劑是M7512、T3168、T668或者R302。
全文摘要
本發(fā)明的課題是開發(fā)從完整心臟構成細胞群或者來自干細胞的分化細胞群中，不伴隨基因的改變地選出心肌細胞的方法。本發(fā)明人等根據(jù)上述心肌細胞的多種性質(zhì)，建立了使用線粒體特異性標記試劑，不伴隨基因組的改變地選出心肌細胞的開創(chuàng)性方法。即、本發(fā)明人等提供了從含有心肌細胞的細胞混合物中，根據(jù)細胞的相對的線粒體含量以及/或者根據(jù)細胞的相對的線粒體膜電位，不伴隨心肌細胞的基因改變地選擇心肌細胞的方法；從含有心肌細胞的細胞混合物中、不伴隨心肌細胞的基因改變地濃縮心肌細胞的方法；不伴隨心肌細胞的基因改變地制備心肌細胞的方法；以及對含有心肌細胞的細胞混合物中的心肌細胞比率進行評價的方法。
文檔編號C12N5/07GK101056973SQ200580029000
公開日2007年10月17日 申請日期2005年8月26日 優(yōu)先權日2004年8月27日
發(fā)明者服部文幸, 福田惠一 申請人:阿斯比奧制藥株式會社, 學校法人慶應義塾