專利名稱：生產(chǎn)纖維寡糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過酶分解纖維素類物質(zhì)獲得纖維寡糖的方法。本發(fā)明特別涉及將平均聚合度、平均粒徑、膠態(tài)纖維素成分含量和可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量均被控制在一定范圍內(nèi)的水不溶性天然纖維素類物質(zhì)用作基質(zhì)，并使用β-葡糖苷酶活性與結(jié)晶性纖維素分解活性的活性比(β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)被控制在一定范圍的纖維素酶進(jìn)行酶分解，由此在短時間內(nèi)提高纖維素的分解率，從而高收率地選擇性地生產(chǎn)纖維寡糖的方法。
背景技術(shù)：
纖維寡糖是纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖和纖維六糖的通稱，是1至6個吡喃型葡萄糖單元通過β-1，4鍵連接在一起的一種寡糖。
近年來，對纖維寡糖的生理學(xué)功能與其它寡糖一樣正在進(jìn)行闡明。因此，纖維寡糖有望成為保健食品的新型原料(非專利文獻(xiàn)1)。
纖維寡糖通過使用酶水解其聚合物、纖維素而獲得。但是，天然存在的纖維素極難溶于水并且高度結(jié)晶，因此難以通過纖維素酶進(jìn)行酶分解。所以這存在問題。
在纖維素的酶分解反應(yīng)中，作為分解產(chǎn)物獲得的纖維寡糖會被纖維素酶中的β-葡糖苷酶成分進(jìn)一步分解成葡萄糖單體，從而導(dǎo)致纖維寡糖收率降低。因此，這存在另一個問題(非專利文獻(xiàn)2)。
鑒于上述問題，為提高酶分解纖維素時纖維寡糖的收率，到目前為止已經(jīng)進(jìn)行了很多嘗試。
使用特定纖維素生產(chǎn)纖維寡糖的方法包括專利文獻(xiàn)1描述了一種生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中使用含有大量非結(jié)晶性纖維素的纖維素原料，在木質(zhì)素的存在下使用纖維素酶進(jìn)行水解反應(yīng)，同時，隨時從反應(yīng)溶液中至少收集由水解反應(yīng)生成的纖維寡糖中的纖維二糖。
專利文獻(xiàn)2描述了一種生產(chǎn)纖維寡糖的方法，在該方法中使用纖維素酶部分水解濕紙漿，以至少收集生成的纖維寡糖中的纖維二糖，其中所述濕紙漿是通過將含有天然木質(zhì)纖維素的原料煮過之后不進(jìn)行干燥而獲得的。在這些生產(chǎn)方法中，纖維素酶中所包含的纖維寡糖分解酶β-葡糖苷酶被吸附在木質(zhì)素中，并抑制了β-葡糖苷酶的作用，從而抑制了纖維寡糖分解成葡萄糖，從而提高了纖維寡糖的反應(yīng)選擇性。然而，在這些生產(chǎn)方法中，所得糖化液體中包含大量木質(zhì)素，結(jié)果降低了纖維寡糖的收率。此外，由于為獲得高純度的纖維寡糖需要將木質(zhì)素從糖化液體中除去的處理，因此復(fù)雜的提純步驟一直都是個問題。
專利文獻(xiàn)3描述了一種通過將含有1質(zhì)量％～20質(zhì)量％的木質(zhì)素的木質(zhì)纖維素與纖維素酶和諸如白腐菌等木質(zhì)素分解菌反應(yīng)的生產(chǎn)纖維二糖(一種纖維寡糖)的方法。該方法可以提高纖維素酶對基質(zhì)的作用，而無需用于除去纖維素中的木質(zhì)素的處理。然而，其分解產(chǎn)物不僅包含纖維二糖，還包含木質(zhì)素分解產(chǎn)物，因此會像上述方法一樣，導(dǎo)致纖維寡糖收率降低。此外，由于為獲得高純度的纖維二糖需要除去木質(zhì)素分解產(chǎn)物的步驟，因此復(fù)雜的提純步驟一直都是個問題。
專利文獻(xiàn)4描述了一種生產(chǎn)纖維寡糖的方法，在該方法中，在將纖維素酶加入通過將纖維素溶解在諸如氧化胺、氯化鋰/N，N-二甲基乙酰胺、銅銨和粘膠纖維等溶劑中而獲得的纖維素溶液中后，從所得溶液中獲得含有纖維素酶的再生纖維素，然后在緩沖劑的存在下通過再生纖維素中所包含的纖維素酶進(jìn)行酶反應(yīng)，以生產(chǎn)纖維寡糖。該方法不需要諸如對纖維素酶進(jìn)行提純等專門的預(yù)處理，并且能夠提高纖維寡糖的收率。然而，由于該方法需要溶解和再生纖維素的步驟，因此復(fù)雜的步驟一直都是個問題。在纖維素溶解中所用的化學(xué)物質(zhì)，如氧化胺、氯化鋰/N，N-二甲基乙酰胺、銅銨和粘膠纖維，對于纖維素酶均具有較大的作用。結(jié)果，在纖維素的分解反應(yīng)受到這些化學(xué)物質(zhì)的影響方面存在問題。
專利文獻(xiàn)5描述了一種生產(chǎn)纖維二糖的方法，該方法使用保水性為230％～280％、濾水度為550ml～640ml的漂白粥漿作為原料。此處所用粥漿是煮/漂白處理后未干燥的紙漿。雖然使用粥漿作為原料確實(shí)可以提高纖維二糖的生產(chǎn)量，但是由于未干燥的粥漿具有很高的保水性，所以在酶分解時其基質(zhì)濃度受到限制。因此，較低的纖維寡糖生產(chǎn)率一直都是個問題。
專利文獻(xiàn)6描述了一種方法，在該方法中使用超臨界水或亞臨界水由含有纖維素的物質(zhì)將纖維素成分溶液化后，向所得處理液中補(bǔ)充纖維素酶制劑，用纖維素酶制劑將纖維素和具有高聚合度的纖維寡糖(纖維素部分分解產(chǎn)物)水解，從而獲得葡萄糖和/或纖維寡糖。該方法能夠同時改善纖維寡糖，如纖維二糖和纖維三糖的生產(chǎn)量和收率。然而，該方法在關(guān)于纖維素預(yù)處理的安全性方面存在問題，例如在超臨界或亞臨界水處理所需的耐壓、耐酸設(shè)備的設(shè)備安全性和加壓和加熱的安全性方面存在問題。
專利文獻(xiàn)7描述了一種生產(chǎn)纖維寡糖的方法，該方法使用下述紙漿作為纖維素酶的反應(yīng)基質(zhì)，所述紙漿具有通過X射線衍射測定的10％～80％的纖維素I結(jié)晶度、200％～1000％的保水性，其中將所述紙漿進(jìn)行了選自原纖維化處理、機(jī)械化學(xué)處理和化學(xué)處理中的任意一種或多種處理。該方法能夠提高纖維二糖的生產(chǎn)量和纖維素分解率。然而，由于使用具有高保水性的纖維漿作為纖維素，該方法存在在諸如預(yù)處理(例如原纖維化處理、機(jī)械化學(xué)處理和化學(xué)處理)和隨后的酶分解以及寡糖提純等每一生產(chǎn)步驟中，發(fā)生阻塞或基質(zhì)濃度受到限制等纖維寡糖生產(chǎn)率較低的問題。該方法與本發(fā)明的方法具有本質(zhì)上的區(qū)別在本發(fā)明的方法中，平均聚合度、平均粒徑、膠態(tài)成分含量等被控制在較高水平，并且在包括酶分解在內(nèi)的每一步驟中的處理性質(zhì)均得到了提高。
通過使用特定纖維素酶來酶分解纖維素，從而提高纖維寡糖收率的方法包括以下專利文獻(xiàn)8至11專利文獻(xiàn)8描述了一種在纖維素酶的作用下，在水性反應(yīng)溶液中由纖維素類物質(zhì)生產(chǎn)纖維寡糖的方法，所述纖維素酶由屬于纖維弧菌屬的微生物生產(chǎn)，在該方法中組合使用了超濾反應(yīng)器，以便消除生成物阻害，從而生產(chǎn)并積累纖維寡糖。根據(jù)該方法，僅由纖維二糖和纖維三糖構(gòu)成的纖維寡糖可以作為酶分解纖維素類物質(zhì)的分解產(chǎn)物而獲得。然而，由于通過纖維弧菌屬微生物生產(chǎn)的酶不容易對結(jié)晶性纖維素起作用，因此需要非結(jié)晶性纖維素作為基質(zhì)來縮短反應(yīng)時間和提高收率。這樣，復(fù)雜的步驟一直成為問題。
專利文獻(xiàn)9描述了一種通過使用纖維素酶分解纖維素來生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中纖維素酶預(yù)先與pH被平衡為3.5～5.0的弱酸性陽離子交換樹脂接觸，從而選擇性地除去纖維素酶中的β-葡糖苷酶，然后使已除去β-葡糖苷酶的纖維素酶與纖維素接觸。按照該方法，通過酶分解纖維素減少葡萄糖，因此能夠獲得具有大于或等于60％的纖維寡糖的分解產(chǎn)物。然而，上述方法需要除去纖維素酶中的β-葡糖苷酶的步驟。這樣就存在生產(chǎn)纖維寡糖的步驟很復(fù)雜的問題。此外，因?yàn)樵撎峒兝w維素酶的步驟需要的陽離子交換樹脂的量要比未反應(yīng)的纖維素酶的量大75倍～1000倍，所以被處理的纖維素酶的量受到限制，并且纖維寡糖的生產(chǎn)率不足。因此，存在纖維素酶提純成本和陽離子交換樹脂的分離/提純劑成本很高的問題。
專利文獻(xiàn)10描述了一種纖維素酶提純方法，其中在將纖維素酶與纖維素酯和/或纖維素醚酯一起溶解并溫育固定的一段時間后，改變pH并將不溶的固體部分從溶液中分離出去，從而選擇性地除去纖維素酶中的β-葡糖苷酶；專利文獻(xiàn)10還描述了一種纖維二糖的生產(chǎn)方法，其中將纖維素與已除去β-葡糖苷酶的纖維素酶一起加入水性介質(zhì)中，以制造一種懸浮液，進(jìn)而將該懸浮液溫育固定的一段時間，以在該懸浮液中生產(chǎn)纖維二糖，然后收集所述纖維二糖。
專利文獻(xiàn)11描述了一種纖維素酶提純方法，其中在將殼聚糖和纖維素酶溶解到pH被調(diào)節(jié)為能使殼聚糖溶解的pH的水性介質(zhì)中并溫育固定的一段時間后，改變pH并將不溶的固體部分從溶液中分離出去，從而選擇性地除去纖維素酶中的β-葡糖苷酶；專利文獻(xiàn)11還描述了一種纖維二糖的生產(chǎn)方法，其中將纖維素與已除去β-葡糖苷酶的纖維素酶一起加入水性介質(zhì)中，以制造一種懸浮液，進(jìn)而將該懸浮液溫育固定的一段時間，以在該懸浮液中生產(chǎn)纖維二糖，然后收集所述纖維二糖。這些方法通過使用纖維素衍生物或殼聚糖對纖維素酶進(jìn)行吸附/分離處理，并使纖維素與仍吸附在纖維素衍生物或殼聚糖中的纖維素酶接觸，提高了纖維二糖的收率。然而，這些方法需要提純纖維素酶的處理，因此生產(chǎn)步驟復(fù)雜。由于纖維素酶提純中使用的纖維素衍生物和殼聚糖很昂貴，因此存在需要很高成本的問題。此外，由于在酶分解纖維素中纖維素酶與纖維素衍生物和殼聚糖一起使用，因此還存在這樣的問題，即需要將它們從分解反應(yīng)溶液中除去的步驟。
迄今為止，尚未有下述方法問世將平均聚合度、平均粒徑、膠態(tài)纖維素成分含量和可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量通過預(yù)處理被控制在一定范圍內(nèi)的水不溶性天然纖維素類物質(zhì)用作基質(zhì)，并使用β-葡糖苷酶活性與結(jié)晶性纖維素分解活性的活性比(β-纖維素酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)被控制在一定范圍的纖維素酶進(jìn)行酶分解，因此在短時間內(nèi)提高纖維素的分解率，從而高收率地選擇性地生產(chǎn)纖維寡糖。
Cellulose Communications，5，No 2，91-97(1998)[非專利文獻(xiàn)2]《Cellulase》Kodansha Scientific出版，97-104(1987)[專利文獻(xiàn)1]特開平5-317073號公報(bào)[專利文獻(xiàn)2]特開平7-184678號公報(bào)[專利文獻(xiàn)3]特開平8-89274號公報(bào)[專利文獻(xiàn)4]特開平8-308589號公報(bào)[專利文獻(xiàn)5]特開平9-107087號公報(bào)[專利文獻(xiàn)6]特開2001-95594號公報(bào)[專利文獻(xiàn)7]特開2005-68140號公報(bào)[專利文獻(xiàn)8]特開平01-256394號公報(bào)[專利文獻(xiàn)9]特開平05-115293號公報(bào)[專利文獻(xiàn)10]特開平05-227957號公報(bào)[專利文獻(xiàn)11]特開平05-227958號公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目標(biāo)是通過在特定纖維素酶的存在下，酶分解用作原料的水不溶性天然纖維類物質(zhì)來高收率地選擇性地生產(chǎn)纖維寡糖，從而在短時間內(nèi)提高纖維素的分解率。
本發(fā)明人通過以下發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明為解決上述問題，將平均聚合度、平均粒徑、膠態(tài)纖維素成分含量和可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量均被控制在一定范圍內(nèi)的水不溶性天然纖維素類物質(zhì)用作原料，并使用具有特定活性的纖維素酶對其進(jìn)行酶分解，從而在短時間內(nèi)提高纖維素的分解率，從而以高收率選擇性地得到纖維寡糖。
因此，本發(fā)明為如下(1)一種生產(chǎn)纖維寡糖的方法，所述方法包括在纖維素酶的存在下酶分解水不溶性天然纖維素類物質(zhì)，所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)具有小于或等于700的平均聚合度、小于或等于100μm的平均粒徑并且可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量小于1質(zhì)量％；(2)一種生產(chǎn)纖維寡糖的方法，所述方法包括在纖維素酶的存在下酶分解水不溶性天然纖維素類物質(zhì)，所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)具有小于或等于700的平均聚合度，含有大于或等于10質(zhì)量％的膠態(tài)纖維素成分，并且可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量小于1質(zhì)量％；(3)如(1)或(2)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)的平均粒徑小于或等于100μm，并包含大于或等于10質(zhì)量％的膠態(tài)纖維素成分；(4)如(1)至(3)任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)的平均聚合度小于或等于500，并且平均粒徑小于或等于50μm；(5)如(1)至(4)任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)的平均聚合度小于或等于400，并且平均粒徑小于或等于30μm；(6)如(1)至(5)任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)包含大于或等于15重量％的膠態(tài)纖維素成分；(7)如(1)至(6)任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述纖維素酶的活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)小于或等于0.7；(8)如(7)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述纖維素酶的活性比小于或等于0.5；(9)如(8)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述纖維素酶的活性比小于或等于0.35；(10)如(1)至(9)任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述可溶于二乙醚的物質(zhì)為木質(zhì)素；(11)如(1)至(10)任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)包含纖維素I型晶體；(12)如(1)至11任一項(xiàng)所述的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其中，在通過培養(yǎng)生產(chǎn)纖維素酶的微生物而獲得的培養(yǎng)液中，β-葡糖苷酶活性與結(jié)晶性纖維素分解活性的活性比(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)小于或等于0.5；(13)如(12)所述的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其中β-葡糖苷酶活性與結(jié)晶性纖維素分解活性的活性比小于或等于0.35；(14)如(12)或(13)任一項(xiàng)所述的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其中所述生產(chǎn)纖維素酶的微生物是作為生產(chǎn)β-葡糖苷酶少的菌株而選擇得到的菌株；(15)如(12)至(14)任一項(xiàng)所述的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其中在培養(yǎng)所述生產(chǎn)纖維素酶的微生物時，將培養(yǎng)期間的pH控制為小于3.5；(16)如(12)至(15)任一項(xiàng)所述的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其中所述生產(chǎn)纖維素酶的微生物是屬于木霉菌屬的菌株；(17)一種纖維寡糖，其特征在于，所述纖維寡糖可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量小于或等于2000ppm；(18)通過如(1)至(11)任一項(xiàng)所述的方法獲得的纖維寡糖，其特征在于可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量小于或等于2000ppm；
(19)如(18)所述的纖維寡糖，其中所述可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量小于或等于1000ppm；(20)一種食品、化妝品或藥用制劑，其特征在于包含通過如(1)至(11)任一項(xiàng)所述的方法獲得的纖維寡糖；和(21)一種食品、化妝品或藥用制劑，其特征在于包含如(17)或(18)所述的纖維寡糖。
根據(jù)本發(fā)明的通過酶分解水不溶性天然纖維素類物質(zhì)來生產(chǎn)纖維寡糖的方法，可以在短時間內(nèi)提高纖維的分解率，并且以高收率選擇性地生產(chǎn)纖維寡糖。


圖1是顯示在實(shí)施例13和14以及比較例6中的培養(yǎng)期間內(nèi)pH隨時間變化的圖；圖2是顯示在實(shí)施例15中的培養(yǎng)期間內(nèi)pH隨時間變化的圖；和圖3是顯示在實(shí)施例16和比較例7中結(jié)晶性纖維素分解產(chǎn)物的濃度變化的圖。在該圖中，反應(yīng)溶液中分解產(chǎn)物累積量(％)由反應(yīng)溶液中葡萄糖和纖維寡糖的總濃度表示，而纖維二糖純度由纖維寡糖與反應(yīng)溶液中累積的分解產(chǎn)物的量之比(百分比)表示。通過使用突變株和減小培養(yǎng)溶液中的pH，可以提高相對于分解產(chǎn)物累積量的纖維二糖的純度。
具體實(shí)施例方式
下面將詳細(xì)描述本發(fā)明，特別是其優(yōu)選方面。
本發(fā)明中使用的天然纖維素類物質(zhì)是含有纖維素的天然存在的水不溶性纖維物質(zhì)。天然纖維素類物質(zhì)可以來自于植物或動物。可以生產(chǎn)天然纖維素類物質(zhì)的動物和植物的實(shí)例包括樹木、竹子、麥稈、稻草、棉花、苧麻、甘蔗渣、洋麻、甜菜、海鞘和細(xì)菌纖維素。可以單獨(dú)使用這些天然纖維素類物質(zhì)中的一種作為原料，也可以混合使用它們中的兩種或兩種以上作為原料。
本發(fā)明中使用的纖維素類物質(zhì)需要是天然纖維素類物質(zhì)。天然纖維素和再生纖維素可以通過其晶形而區(qū)分。本發(fā)明的天然纖維素類物質(zhì)需要包含纖維素I晶體，并且其含量需大于或等于1％。纖維素I晶體含量更優(yōu)選大于或等于50％。此處所用的纖維素I晶形可以通過使用廣角粉末X射線衍射儀(理學(xué)電機(jī)(株)制造，商品名Rotaflex RU300)獲得的X射線衍射圖案來辨別。其含量由纖維素I晶體的峰面積占通過X射線衍射獲得的衍射圖像的總峰面積的百分比來表示?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的方法，將要進(jìn)行廣角粉末X射線衍射測量的干燥狀態(tài)的纖維素類物質(zhì)粉末化，然后用于測量，而濕潤狀態(tài)的纖維素類物質(zhì)，可以使用本領(lǐng)域中已知的方法將其干燥，然后粉末化，并用于測量。優(yōu)選較高的纖維素I晶體含量，因?yàn)檫@樣接近于天然纖維素的纖維素類物質(zhì)會用在酶分解中，從而使人工化學(xué)處理步驟，如纖維素再生處理得到簡化。纖維素I晶體的最高含量不受特別限制，然而，考慮到目前已知的天然纖維素組成，其最高含量小于99％。
本發(fā)明中使用的天然纖維素類物質(zhì)是水不溶性的。此處所用的“水不溶性”是指天然纖維素類物質(zhì)中含有大于或等于90質(zhì)量％的水不溶性成分。該水不溶性成分通過下述方法獲得在25℃下將纖維素類物質(zhì)分散在純水中，并通過超濾(截流分子量10000)除去水溶性成分，然后定量分析水不溶性殘余物。
本發(fā)明中的水不溶性天然纖維素類物質(zhì)具有小于或等于700的平均聚合度。此處所用的平均聚合度可以通過使用如“the JapanesePharmacopoeia(日本藥典)，第14版”(廣川書店出版)中的結(jié)晶性纖維素確認(rèn)試驗(yàn)(3)所規(guī)定的銅乙二胺溶液的還原比粘度法測量。由于平均聚合度小于或等于700的纖維素類物質(zhì)更容易進(jìn)行諸如攪拌、粉碎和研磨等物理處理，因此可以容易地控制其膠態(tài)成分的量。當(dāng)水不溶性天然纖維素類物質(zhì)的平均聚合度被控制在上述范圍內(nèi)時，可以為纖維素類物質(zhì)中的纖維賦予多孔性。因此，酶-基質(zhì)接觸的可能性增大，當(dāng)酶分解纖維素類物質(zhì)時纖維素的分解速率會提高。平均聚合度優(yōu)選小于或等于500，更優(yōu)選小于或等于400。較小的平均聚合度可以更容易地控制膠態(tài)成分的量和分解速率。因此，最小平均聚合度不受特別限制，然而，考慮到通過簡便步驟所獲得的平均聚合度的范圍，優(yōu)選最小平均聚合度大于10。
本發(fā)明中使用的水不溶性天然纖維素類物質(zhì)具有小于或等于100μm的平均粒徑。此處所用的平均粒徑是指通過下述方法獲得的體積頻度粒徑分布中的50％累積粒徑將纖維素類物質(zhì)制成濃度為0.2質(zhì)量％的水性乳液，使用高剪切均化器(日本精機(jī)(株)制造，商品名Excel AutoHomogenizer ED-7，處理?xiàng)l件以5000rpm的速度處理3分鐘)將其分散，將分散液的pH調(diào)整為7.5～8.5以后，進(jìn)行離心分離(久保田商事(株)制造，商品名6930 Centrifuge，處理?xiàng)l件以2000G的離心力處理5分鐘)，然后分離出分散液的上清液成分和沉淀成分，并測量各成分的重量比。各成分的體積頻度粒徑分布是使用水作為介質(zhì)，通過激光衍射儀(堀場制作所(株)制造，商品名LA-910，超聲波處理1分鐘)獲得的，并且乘以上清液成分和沉淀成分的重量比以獲得體積頻度粒徑分布中的50％累積粒徑。優(yōu)選平均粒徑小于或等于100μm，因?yàn)檫@樣在酶分解纖維素時，纖維素與纖維素酶的接觸面積(可及度，accessibility)會增大，使得可以改善纖維寡糖的生產(chǎn)速率和收率。平均粒徑更優(yōu)選小于或等于50μm，特別優(yōu)選小于或等于30μm，進(jìn)一步更優(yōu)選小于或等于10μm。較小的平均粒徑可以更好地改善纖維寡糖的生產(chǎn)速率、生產(chǎn)選擇性和收率。因此，最小平均粒徑不受特別限制，然而，考慮到通過簡便步驟所獲得的平均粒徑的范圍，優(yōu)選最小平均粒徑大于或等于0.01μm。
本發(fā)明中使用的水不溶性天然纖維素類物質(zhì)需要包含大于或等于10質(zhì)量％的膠態(tài)纖維素成分。此處所用的膠態(tài)纖維素成分由離心分離后留在上清液中的纖維素固體含量的百分比表示，所述上清液如下獲得通過使用高剪切均化器(日本精機(jī)(株)制造，商品名Excel AutoHomogenizer ED-7，處理?xiàng)l件以5000rpm的速度處理3分鐘)分散天然纖維素類物質(zhì)濃度為0.2質(zhì)量％的水懸浮液，并將pH調(diào)整為7.5～8.5，然后離心分離(久保田商事(株)制造，商品名Centrifuge Model 6930，處理?xiàng)l件以2000G的離心力處理5分鐘)。膠態(tài)纖維素成分含量大于或等于10質(zhì)量％使得可以改善纖維寡糖的生產(chǎn)速率、生產(chǎn)選擇性和收率。膠態(tài)纖維素成分含量更優(yōu)選大于或等于15質(zhì)量％，特別優(yōu)選大于或等于40質(zhì)量％。該膠態(tài)纖維素成分的量是影響與纖維素類物質(zhì)的平均粒徑無關(guān)的酶分解性的一個因素。盡管膠態(tài)纖維素成分的量對于改善纖維寡糖的生產(chǎn)速率、選擇性和收率的機(jī)理尚不清楚，但可能的機(jī)理在于，膠態(tài)纖維素成分量的增加允許穩(wěn)定的纖維素懸浮液作為基質(zhì)，并且允許酶與基質(zhì)均勻接觸，從而改善上述酶分解性。較高的膠態(tài)纖維素成分含量可以更好地改善酶分解性。因此，膠態(tài)纖維素成分的最高含量不受特別限制，然而，考慮到通過簡便預(yù)處理所達(dá)到的范圍，最高含量小于或等于99.9質(zhì)量％。
本發(fā)明中使用的水不溶性天然纖維素類物質(zhì)具有小于1質(zhì)量％的可溶于二乙醚的物質(zhì)。此處所用的可溶于二乙醚的物質(zhì)是指纖維素類物質(zhì)中可溶于二乙醚的雜質(zhì)，例如木質(zhì)素和木質(zhì)素分解產(chǎn)物，并且所述可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量可以通過如“the Japanese Pharmacopoeia(日本藥典)，第14版”(廣川書店出版)中的結(jié)晶性纖維素純度試驗(yàn)(2)中所規(guī)定的可溶于二乙醚的物質(zhì)的定量分析方法測量。使用木質(zhì)素含量小于1質(zhì)量％的高純度纖維素可以更好地改善通過酶分解獲得的纖維寡糖的純度。纖維寡糖純度的提高導(dǎo)致生產(chǎn)收率的提高，從而有助于酶分解后纖維寡糖的提純和纖維素酶的收集?？扇苡诙颐训奈镔|(zhì)的含量更優(yōu)選小于或等于0.5質(zhì)量％，進(jìn)一步更優(yōu)選小于或等于0.3質(zhì)量％。較低的可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量可以更好地改善上述纖維寡糖的純度。因此，可溶于二乙醚的物質(zhì)的最低含量不受特別限制，然而，考慮到通過簡便預(yù)處理所實(shí)現(xiàn)的木質(zhì)素的含量范圍，最低含量大于或等于0.0005質(zhì)量％。
能夠使天然纖維素類物質(zhì)的平均聚合度、平均粒徑、膠態(tài)纖維素成分含量和可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量滿足本發(fā)明范圍的優(yōu)選處理方法包括以下方法對于控制平均聚合度和可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量的方法不加特別限制，只要是本領(lǐng)域中已知的方法即可。其一個實(shí)例包括水解處理。優(yōu)選該水解處理是因?yàn)檫@樣可以除去纖維素纖維內(nèi)的非結(jié)晶性纖維素和半纖維素以及雜質(zhì)(例如木質(zhì)素)，從而為纖維內(nèi)部賦予多孔性，因此酶分解時纖維素酶更易于滲透到纖維內(nèi)部，從而改善纖維素的分解速率和纖維寡糖的收率。
此外，優(yōu)選水解還因?yàn)楫?dāng)使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法進(jìn)一步處理水解的纖維素類物質(zhì)時，纖維素類物質(zhì)因具有多孔的纖維內(nèi)部而更易于進(jìn)行機(jī)械處理，并且可以更容易地控制纖維素類物質(zhì)的平均粒徑和膠態(tài)成分含量。
水解的方法不受特別限制，然而可以例舉出加酸水解、堿氧化分解、熱水分解、蒸汽噴發(fā)和微波分解。可以單獨(dú)使用這些方法中的任意一種方法，也可以組合使用它們中的兩種或兩種以上的方法。當(dāng)進(jìn)行上述方法中的加酸水解時，通過向保持分散在水性介質(zhì)中的纖維素類物質(zhì)中加入適量質(zhì)子酸、羧酸、路易斯酸、雜多酸等，并在攪拌下加熱所得混合物，可以容易地控制平均聚合度。在此情況下，諸如溫度、壓力和時間等反應(yīng)條件根據(jù)纖維素的種類和濃度，以及酸的種類和濃度而有所不同，但是，應(yīng)該適當(dāng)調(diào)整這些反應(yīng)條件，以達(dá)到理想的平均聚合度。例如，對于上述加酸水解，優(yōu)選的反應(yīng)條件是在大于或等于100℃并加壓的條件下使用小于或等于1質(zhì)量％的礦物酸溶液處理纖維素10分鐘以上。這是因?yàn)橹T如酸等催化成分會滲透到纖維素纖維的內(nèi)部，從而促進(jìn)水解，因此可以減少催化成分的用量。
控制平均粒徑和膠態(tài)纖維素成分含量的方法不受特別限制，只要該方法為本領(lǐng)域中已知的方法即可。其實(shí)例包括研磨、粉碎、篩分、氣旋分離和使用離心分離機(jī)的離心分離。這些方法可以單獨(dú)使用，也可以組合使用它們中的兩種或兩種以上的方法。這些方法都可以作為濕法和干法來進(jìn)行。通過濕法單獨(dú)獲得的纖維素類物質(zhì)可以在酶分解前混合在一起，而通過干法單獨(dú)獲得的纖維素類物質(zhì)也可以在酶分解前混合在一起。另外，也可以將通過濕法獲得的纖維素類物質(zhì)與通過干法獲得纖維素類物質(zhì)混合在一起。
例如，當(dāng)通過濕法處理纖維素時，通過對含有1％～99％的纖維素類物質(zhì)和介質(zhì)的纖維素分散液進(jìn)行研磨、粉碎等本領(lǐng)域內(nèi)已知的處理，可以容易地調(diào)整纖維素類物質(zhì)的平均粒徑或膠態(tài)纖維素成分含量。在該情況下，所使用的介質(zhì)不受特別限制，可以包括水、諸如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇、2-甲基丁醇和苯甲醇等醇類、諸如戊烷、己烷、庚烷和環(huán)己烷等烴類，以及諸如丙酮和乙基甲基酮等酮類。特別是，優(yōu)選的有機(jī)溶劑為在藥品、食品和其添加劑的生產(chǎn)步驟中所用的任意溶劑，并且包括在《醫(yī)藥品添加物事典》(Dictionary of Pharmaceutical Additives)(藥事日報(bào)社出版)、《日本藥典》和《食品添加物公定書》(Official Methodfor Food Additives)(廣川書店出版)中分類為溶劑的那些溶劑?？梢詥为?dú)使用水和有機(jī)溶劑，也可以組合使用它們中的兩種或兩種以上溶劑?？蛇x地是，在將一種介質(zhì)用在分散液中然后將其除去后，可以將纖維素類物質(zhì)再次分散到不同介質(zhì)中。
研磨方法包括使用諸如單向旋轉(zhuǎn)式攪拌槳葉、多軸旋轉(zhuǎn)式攪拌槳葉、往復(fù)反轉(zhuǎn)式攪拌槳葉、上下運(yùn)動式攪拌槳葉、旋轉(zhuǎn)并上下運(yùn)動式攪拌槳葉和管路式攪拌槳葉等攪拌槳葉的研磨方法，例如便攜式混合器、固體混合器和側(cè)面混合器；噴射式攪拌研磨方法，如管線混合器；使用高剪切均化器、高壓均化器、超聲波均化器等的方法；使用捏合機(jī)的旋轉(zhuǎn)擠出式研磨方法；以及壓密與剪切相結(jié)合的研磨方法，例如輥磨機(jī)、球磨機(jī)、振動球磨機(jī)和珠磨機(jī)，上述任何方法都可以單獨(dú)使用或組合使用。
粉碎方法包括篩網(wǎng)式粉碎方法，例如篩磨機(jī)和錘磨機(jī)；槳葉旋轉(zhuǎn)剪切篩網(wǎng)式粉碎法，例如速磨機(jī)(flash mill)；噴氣式粉碎法，例如噴射磨；壓密與剪切相結(jié)合的粉碎法，例如輥磨機(jī)、球磨機(jī)、振動球磨機(jī)和珠磨機(jī)；以及攪拌槳葉式粉碎法，上述任何方法都可以單獨(dú)使用或組合使用。
本發(fā)明的纖維素酶是纖維素分解酶的通稱。具有分解纖維素活性的任何纖維素酶均包含在根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶中。纖維素酶的酶源的實(shí)例包括生產(chǎn)纖維素酶的活微生物本身或其培養(yǎng)上清液、從生產(chǎn)纖維素酶的活微生物生產(chǎn)的酶中提純的酶，或者由提純的酶與諸如賦形劑、穩(wěn)定劑等添加劑一起制備的制劑。當(dāng)將纖維素酶制劑用在酶分解中時，向該制劑中加入的添加劑不受特別限制。其劑型可以是粉末、顆粒、液體等任意形式。
纖維素酶的來源不受特別限制，可以包括由本領(lǐng)域中已知的生產(chǎn)纖維素酶的微生物生產(chǎn)的纖維素酶，所述生產(chǎn)纖維素酶的微生物包括如《Cellulase(纖維素酶)》(Kodansha Scientific出版(1987))和《Dictionaryof Cellulose(纖維素辭典)》(朝倉書店出版(2000))中所述的木霉素屬、枝頂孢屬、曲霉屬、桿菌屬、假單胞菌屬、青霉菌屬、氣單孢菌屬、耙齒菌屬(Irpex)、側(cè)孢霉屬和腐殖菌屬微生物。然而，本發(fā)明的纖維素酶不僅限于本領(lǐng)域中已知的來源于上述微生物的酶，它還包括能夠分解纖維素的任意酶，其中包括來源于新發(fā)現(xiàn)的微生物的酶。
優(yōu)選地是，本發(fā)明中使用的纖維素酶的β-葡糖苷酶活性與結(jié)晶性纖維素分解活性之比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)小于或等于0.7。此處所用的活性比通過纖維寡糖的分解能力(β-葡糖苷酶活性)與纖維素酶分解纖維素的能力(結(jié)晶性纖維素分解活性)之比來獲得。優(yōu)選較小的活性比，因?yàn)檫@樣可以獲得較高的分解纖維素的能力和較低的分解寡糖的能力，從而提高寡糖的生產(chǎn)率。活性比更優(yōu)選小于或等于0.5，進(jìn)一步優(yōu)選小于或等于0.4，特別優(yōu)選小于或等于0.35，最優(yōu)選小于或等于0.30。由于較小的活性比可以更好地改善纖維寡糖的收率，因此最小活性比不受特別限制，但是，考慮到容易實(shí)現(xiàn)的活性比的范圍，最小活性比大于或等于0.01。
此處所用的β-葡糖苷酶活性是指在將纖維二糖(一種纖維寡糖)用作基質(zhì)從而使纖維素酶可以在水性介質(zhì)中對其發(fā)揮作用時，由纖維二糖生產(chǎn)葡萄糖的酶活性。該活性通過在1mL反應(yīng)溶液中1分鐘內(nèi)產(chǎn)生的葡萄糖的摩爾數(shù)(μmol/mL*min)來測量，并由單位U(單位)/mL表示。該β-葡糖苷酶活性可以通過以下方法測量將2質(zhì)量％的纖維二糖(Aldrich制造，特級)和纖維素酶溶解在pH為4.5的50mM的乙酸/乙酸鈉緩沖液中，在密封條件下將其在55℃的水浴中反應(yīng)1小時后，定量測量反應(yīng)溶液中葡萄糖的濃度。
此處所用的結(jié)晶性纖維素分解活性是指在將結(jié)晶性纖維素用作基質(zhì)，從而使纖維素酶可以在水性介質(zhì)中對其發(fā)揮作用時，生產(chǎn)諸如纖維二糖和纖維三糖等纖維寡糖以及葡萄糖的酶活性。該活性通過在1mL反應(yīng)溶液中1分鐘內(nèi)產(chǎn)生的纖維寡糖和葡萄糖的總摩爾數(shù)(μmol/mL*min)來測量，并由單位U(單位)/mL表示。該結(jié)晶性纖維素分解活性可以通過上述β-葡糖苷酶活性測量方法來測量，即，使用5質(zhì)量％的結(jié)晶性纖維素(通過使用轉(zhuǎn)速為126rpm的萬能攪拌混合機(jī)(商品名，三英制作所制造)的鉤狀槳葉(hook blade)捏合并攪拌含水量被調(diào)整為60％的Ceolus PH-101(商品名，旭化成化學(xué)株式會社制造)90分鐘而獲得)代替纖維二糖，并使用與上述相同的方法進(jìn)行酶分解，以定量測量反應(yīng)溶液中分解和生成的諸如纖維寡糖和葡萄糖等糖的總量。
在上述各種活性測量方法中，反應(yīng)溶液中的纖維寡糖和葡萄糖可以通過高效液相色譜(柱Asahipak NH2P-50(商品名，島津制作所制造)，高效液相色譜SCL-10A型(商品名，島津制作所制造)，移動床乙腈/水＝75/25(體積比)，循環(huán)量1mL/min，樣品溶液10μL)進(jìn)行定量測定。
獲得具有滿足本發(fā)明范圍的β-葡糖苷酶活性與結(jié)晶性纖維素分解活性的活性比(β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)的纖維素酶的方法包括以下方法優(yōu)選將能夠生產(chǎn)活性比(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)小于或等于0.5的纖維素酶的菌株用作生產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌?？梢允褂萌魏尉?，只要其活性比滿足上述范圍即可。任何通過菌株的人工誘變方法(例如紫外線照射、X射線照射、使用突變誘導(dǎo)劑處理)獲得的突變株、天然存在的突變株或者通過基因操作或細(xì)胞融合獲得的突變株均可以用在本發(fā)明中，只要這些突變株能夠生產(chǎn)具有小于或等于0.5的活性比(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)的纖維素酶即可。該比例(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)優(yōu)選小于或等于0.35，更優(yōu)選小于或等于0.2。由于較小的活性比可以更好地改善纖維寡糖的收率，因此最小活性比不受特別限制，但是，考慮到容易實(shí)現(xiàn)的活性比的范圍，最小活性比大于或等于0.01。
溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性與結(jié)晶性纖維素分解活性比通過以下方法測量。
(1)結(jié)晶性纖維素分解活性向懸浮在50mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5)中的0.4ml的5質(zhì)量％結(jié)晶性纖維素(通過使用轉(zhuǎn)速為126rpm的萬能攪拌混合機(jī)(商品名，三英制作所制造)的鉤狀槳葉捏合并攪拌含水量被調(diào)整為60％的CeolusPH-101(商品名，旭化成化學(xué)株式會社制造)90分鐘而獲得)的基質(zhì)溶液中加入0.1ml適當(dāng)稀釋的酶溶液后，使該混合物在40℃的水浴中反應(yīng)4小時，接下來，將其在95℃加熱10分鐘，結(jié)束反應(yīng)，然后通過HPLC法(高效液相色譜法)定量測量反應(yīng)溶液中的葡萄糖濃度。將在1分鐘內(nèi)釋放葡萄糖和纖維寡糖的總量為1μmol的酶的量定義為1酶單位(1U)。
(2)β-葡糖苷酶活性向溶解在50mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5)中的0.4ml的2.5質(zhì)量％纖維二糖(Aldrich制造，特級)的基質(zhì)溶液中加入0.1ml酶溶液后，使該混合物在40℃的水浴中反應(yīng)4小時，接下來，將其在100℃加熱10分鐘，結(jié)束反應(yīng)，然后通過HPLC法定量測量反應(yīng)溶液中的葡萄糖濃度。將在1分鐘內(nèi)釋放1μmol葡萄糖的酶的量定義為1酶單位(1U)。
在上述各種活性測量方法中，反應(yīng)溶液中的纖維寡糖和葡萄糖可以通過上述高效液相色譜來定量測量。
此處，所用的典型菌株的實(shí)例包括里氏木霉(Trichoderma reesei)NBRC31329菌株。
另外，活性比(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)較小的菌株可以通過例如下述方法獲得。如果需要，可以對能夠生產(chǎn)纖維素酶的微生物進(jìn)行本領(lǐng)域中已知的誘變處理，例如紫外線照射或者使用突變誘導(dǎo)劑(例如亞硝基胍)，然后從其菌株中選擇活性比(β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)較小的菌株。例如，可以將里氏木霉NBRC31329用作誘變處理中使用的微生物(母株)，在28℃下將其在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)3至10天。生成的孢子以105個孢子/mL～108個孢子/mL懸浮在鹽水中，使用EMS(甲磺酸乙酯)(100μg/ml～500μg/ml，pH7.0，28℃，5～24小時)進(jìn)行誘變處理?；钚员?溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)較小的菌株的選擇可以通過下述方法實(shí)現(xiàn)通過離心分離從經(jīng)誘變處理的孢子的懸浮液中收集孢子，洗滌孢子，再使用葡萄糖作為碳源培養(yǎng)這些孢子，然后使用本領(lǐng)域中已知的方法測量所得培養(yǎng)物的酶活性。通過使用得自各經(jīng)誘變處理的菌株的培養(yǎng)物并酶分解用作基質(zhì)的纖維二糖或結(jié)晶性纖維素以定量測量生成的還原糖可以定量地選擇感興趣的菌株，或者另外也可以通過使用本領(lǐng)域中已知的與培養(yǎng)物發(fā)生酶反應(yīng)的比色基質(zhì)來定性地選擇感興趣的菌株。
纖維素酶可以由通過培養(yǎng)生產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌菌株獲得的培養(yǎng)上清液獲得。培養(yǎng)基中使用的碳源的實(shí)例有纖維素粉末、纖維二糖、濾紙、普通紙、鋸末、麩皮、谷殼、甘蔗渣、豆餅、咖啡渣、淀粉和乳糖。諸如硝酸銨和硫酸銨等無機(jī)銨鹽以及諸如尿素、氨基酸、肉汁、酵母膏、多聚蛋白胨和蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物等含氮有機(jī)物可以用作氮源。KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、Fe2Cl3·6H2O、MnCl3·4H2O、ZnSO4·7H2O、等可以用作無機(jī)鹽?？梢赃x擇性地使用含有有機(jī)微量養(yǎng)料的培養(yǎng)基。對于培養(yǎng)物，可以使用常用通氣攪拌培養(yǎng)裝置，且可以使用上述培養(yǎng)基，并將溫度和pH控制到能使生產(chǎn)菌株生長的溫度和pH附近。然后，使用本領(lǐng)域中已知的方法，例如離心分離和過濾，從所得培養(yǎng)溶液中除去菌株體，以獲得上清液。該上清液可以直接用作粗酶溶液。
可以進(jìn)一步降低活性比(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)的培養(yǎng)方法的實(shí)例包括將培養(yǎng)期間的培養(yǎng)溶液的pH控制在小于3.5并大于或等于能使生產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌生長的pH值的方法。具體是，在25℃～35℃下，將上述里氏木霉NBRC31329菌株或其突變株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面上培養(yǎng)3至10天。將所得培養(yǎng)物在下述培養(yǎng)基中在28℃接種并預(yù)培養(yǎng)2至4天，其中將100mL包含纖維素作為懸浮并溶解的碳源的培養(yǎng)基分散到500mL的錐形瓶中并高壓消毒。將預(yù)培養(yǎng)溶液接種到將3L具有與上述培養(yǎng)基相同組成的培養(yǎng)基放到5L的廣口發(fā)酵罐(jar fermentor)中并高壓消毒的培養(yǎng)基中，在溫度為28℃、攪拌速率為200rpm～400rpm、通氣速率為0.3vvm～1vvm的條件下培養(yǎng)。使用NaOH或氨水將培養(yǎng)期間的pH控制為2～3.5，優(yōu)選為2.5～3.0。經(jīng)過4至7天的培養(yǎng)后，使用本領(lǐng)域中已知的方法，例如離心分離和過濾，從培養(yǎng)溶液中除去菌株體，以獲得上清液。該上清液可以直接用作粗酶溶液。
這樣獲得的粗酶溶液可以通過常用蛋白質(zhì)提純方法，例如硫酸銨分離、利用溶劑的沉淀分離或柱色譜進(jìn)行進(jìn)一步提純。
可選地是，當(dāng)纖維素酶是來自可商業(yè)獲得的酶時，該酶可以通過常用蛋白質(zhì)提純方法，例如硫酸銨分離、利用溶劑的沉淀分離或柱色譜來提純，以獲得活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)小于或等于0.7的部分。
下面將描述本發(fā)明的生產(chǎn)纖維寡糖的方法。
本發(fā)明的生產(chǎn)纖維寡糖的方法是在纖維素酶的存在下酶分解本發(fā)明的天然纖維素類物質(zhì)的方法。優(yōu)選該方法中使用的纖維素酶的β-葡糖苷酶活性與結(jié)晶性纖維素分解活性之比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)小于或等于0.7。本發(fā)明中獲得的主要由纖維寡糖構(gòu)成的水溶液通過本領(lǐng)域中已知的方法提純和/或干燥。
本領(lǐng)域中任何已知的方法都可以被用作酶分解的方法，而不受特別限制。該方法的實(shí)例包括下述方法將作為基質(zhì)的本發(fā)明的纖維素類物質(zhì)懸浮在水性介質(zhì)中，然后加入本發(fā)明的纖維素酶，并在攪拌或振動下加熱以進(jìn)行糖化反應(yīng)。
在上述方法中，需要適當(dāng)調(diào)整諸如懸浮和攪拌方法、加入纖維素酶/基質(zhì)的方法和順序以其濃度等反應(yīng)條件，以便高收率地生產(chǎn)纖維寡糖。在該情況下，反應(yīng)溶液的pH和溫度可以落在不會使酶失活的范圍內(nèi)，當(dāng)反應(yīng)在常壓下進(jìn)行時，它們通常會落在5℃～95℃的溫度范圍內(nèi)和1～11的pH范圍內(nèi)。此時，如上所述，壓力、溫度和pH都得到了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，從而能夠以較高收率生產(chǎn)纖維寡糖。然而，當(dāng)使用通過將上述里氏木霉NBRC31329菌株或其突變株作為生產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌獲得的纖維素酶時，優(yōu)選將纖維素在常壓、溫度為50℃～60℃、pH為3.0～5.5的條件在乙酸鹽或磷酸鹽緩沖液中酶分解。
該酶反應(yīng)可以在分批系統(tǒng)和連續(xù)系統(tǒng)中進(jìn)行。為避免在酶分解反應(yīng)中纖維二糖成為生產(chǎn)障礙，反應(yīng)系統(tǒng)中的纖維二糖濃度應(yīng)保持在一定范圍內(nèi)，這對于改善纖維寡糖的生產(chǎn)率是很重要的。將反應(yīng)系統(tǒng)中纖維二糖的濃度保持在一定范圍內(nèi)的方法可以是下述方法通過諸如超濾或反向滲透過濾等薄膜過濾從反應(yīng)系統(tǒng)中提出生成的纖維二糖的方法；將諸如干燥的植物粉末(例如活性炭、竹子和木頭)等多孔的有機(jī)基材、諸如二氧化硅等多孔的無機(jī)基材引入反應(yīng)系統(tǒng)中并使纖維二糖吸附于其上的方法；將纖維素基質(zhì)固定在柱等之中的方法，在所述柱中使含有纖維素酶的反應(yīng)溶液循環(huán)；或者將纖維素酶固定在聚合物等之中的方法，在所述聚合物中使含有纖維素的反應(yīng)溶液循環(huán)。
可以選擇性地對通過上述酶分解獲得的主要由纖維寡糖構(gòu)成的水溶液進(jìn)行諸如脫色、脫鹽和除酶等提純處理。提純方法不受特別限制，只要是本領(lǐng)域中已知的方法即可。但是，例如可以使用活性炭處理、離子交換樹脂處理、色譜處理、諸如微濾、超濾和反向滲透過濾等過濾處理、以及結(jié)晶處理。這些方法可以單獨(dú)使用，也可以兩種或兩種以上組合使用。
經(jīng)上述方法提純的主要由纖維寡糖構(gòu)成的水溶液可以不進(jìn)行其它處理而使用，但是，如果需要，也可以通過干燥而固化。干燥方法不受特別限制，只要是本領(lǐng)域中已知的方法即可。但是，例如，可以使用噴霧干燥、冷凍干燥、滾筒干燥、薄膜干燥、板式干燥(plate drying)、閃速干燥和真空干燥。這些方法可以單獨(dú)使用，也可以兩種或兩種以上組合使用。
在上述提純和干燥處理中，例如，除水以外還可以選擇性地使用有機(jī)溶劑作為纖維寡糖的介質(zhì)。對于該處理中所使用的有機(jī)溶劑不作特別限制。優(yōu)選的有機(jī)溶劑為在例如藥品、食品和其添加劑的生產(chǎn)步驟中所用的任意溶劑，并且包括在《醫(yī)藥品添加物事典》(Dictionary ofPharmaceutical Additives)(藥事日報(bào)社出版)、《日本藥典》和《食品添加物公定書》(Official Method for Food Additives)(廣川書店出版)中分類為溶劑的那些溶劑。可以單獨(dú)使用水和有機(jī)溶劑，也可以組合使用它們中的兩種或兩種以上溶劑。可選地是，在將一種介質(zhì)用在分散液中然后將其除去后，可以將纖維寡糖再次分散到不同介質(zhì)中。
進(jìn)行了上述步驟后的纖維寡糖在常溫下的使用形態(tài)包括但不特別限于固體、懸浮液、乳液、糖漿或溶液。固體纖維寡糖的實(shí)例包括粉末、顆粒、丸狀、成型物、層壓體和固態(tài)分散體。
下面將介紹通過本發(fā)明的方法獲得的纖維寡糖。
本發(fā)明的纖維寡糖中的可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量優(yōu)選小于或等于2000ppm，更優(yōu)選小于或等于1000ppm。此處所用的可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量是指諸如纖維素類物質(zhì)中的木質(zhì)素或木質(zhì)素分解產(chǎn)物等可溶于二乙醚的雜質(zhì)的含量，并且可以通過如“Japanese Pharmacopoeia(日本藥典)，第14版”(廣川書店出版)中的結(jié)晶性纖維素純度試驗(yàn)(2)中所規(guī)定的可溶于二乙醚的物質(zhì)的定量分析方法測量。優(yōu)選纖維寡糖中具有小于或等于2000ppm的可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量，原因在于其包含較少的雜質(zhì)，從而呈現(xiàn)較高的白色，在將其應(yīng)用于食品、化妝品和藥用制劑時可以容易地進(jìn)行提純。特別是，當(dāng)將纖維寡糖與諸如藥劑等活性成分結(jié)合使用時是優(yōu)選的，因?yàn)樗梢砸种苹钚猿煞值姆纸狻．?dāng)將纖維寡糖用作用于化學(xué)轉(zhuǎn)化的原料時是優(yōu)選的，因?yàn)橛捎谒碾s質(zhì)較少，因此不容易引發(fā)副反應(yīng)，并能提高化學(xué)轉(zhuǎn)化收率?？扇苡诙颐训奈镔|(zhì)的含量更優(yōu)選小于或等于1000ppm，進(jìn)而優(yōu)選小于或等于500ppm，更進(jìn)而優(yōu)選小于或等于300ppm，最優(yōu)選小于或等于100ppm?？扇苡诙颐训奈镔|(zhì)的含量越低，上述效果就會變得越好。因此，雖然其下限不受特別限制，但是通過簡便方法能夠?qū)崿F(xiàn)的木質(zhì)素含量的范圍大于或等于0.1ppm。
通過本發(fā)明獲得的纖維寡糖的應(yīng)用不受特別限制，例如可以用作食品、化妝品、藥物和一般工業(yè)制品等領(lǐng)域中的食品成分、化妝品成分、顏料成分、香料成分、藥物活性成分、農(nóng)藥成分、飼料成分、化肥成分、培養(yǎng)基成分和分析試劑成分、以及添加劑、中間原料和發(fā)酵原料。
通過本發(fā)明獲得的纖維寡糖在食品中的應(yīng)用包括凝膠，如果凍、布丁和酸乳酪；調(diào)料，如蛋黃醬、調(diào)味品、沙司、肉汁、湯和經(jīng)加工的蔬菜；殺菌罐頭和冷藏食品，如咖喱、碎肉、肉羹、燉品和湯；經(jīng)加工的畜牧制品，如漢堡包、熏肉、香腸、意大利香腸和火腿；魚醬制品，如清煮魚醬、管狀魚醬餅、魚火腿/香腸和炸魚醬；經(jīng)加工的麥類制品，如面包、濕面條、干面條、通心粉、意大利面條、中國饅頭皮、蛋糕粉、預(yù)混合料、白汁沙司、餃子皮和春卷皮；罐裝或瓶裝食品，例如咖喱、沙司、湯、用醬油煮的食品和果醬；糖果點(diǎn)心，如糖果、糖錠、糖片、巧克力、餅干、甜餅、米餅、日本/西方糖果點(diǎn)心、未烤制的蛋糕、小吃、蜜餞和布丁；熟食和經(jīng)處理的食品，如油炸食品、油炸丸子、餃子和中國饅頭；以及糊狀食品，如蔬菜醬、肉餡、果醬、魚醬和其它海產(chǎn)品醬。還包括奶制品，如冰淇淋、牛奶凍、乳冰(lact ice)、生奶油、煉乳、黃油、酸乳酪、乳酪和白汁沙司，以及經(jīng)加工的油類和脂肪類制品，如人造黃油、涂抹人造奶油(fat spread)和起酥油。另外，纖維寡糖還可以用于諸如可樂等碳酸飲料；諸如碳酸水果飲料、酒精水果飲料、混有奶制品的水果飲料、混有果汁或果肉的飲料和牛奶飲料等飲料；諸如咖啡、牛奶、豆奶、可可奶、果奶和酸乳酪等乳酸/牛奶飲料；和諸如煎茶、烏龍茶、綠茶和紅茶等茶飲品。
在本發(fā)明中獲得的纖維寡糖預(yù)計(jì)可以獲得多種生理活性，如激活有益的腸道菌落(例如激活乳酸菌和乳桿菌)、降低血糖濃度和血胰島素濃度、降低血液中的膽固醇、降低體內(nèi)脂肪比例、促進(jìn)脂類/糖類代謝機(jī)能、通便/改善便臭和防齲齒性。因此，除了上述在常見食品中的應(yīng)用之外，纖維寡糖還可以在保健食品、健康食品和膳食等應(yīng)用中用作具有生理活性的物質(zhì)。
此外，因?yàn)樵诒景l(fā)明中獲得的纖維寡糖具有高純度，所以該纖維寡糖還可以用作化學(xué)轉(zhuǎn)化為各種纖維寡糖衍生物的原料。
雖然將參考實(shí)施例來描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
(實(shí)施例1)向低速攪拌器(30-L反應(yīng)器)中加入2kg可商業(yè)獲得的源于針葉樹的溶解漿(平均聚合度781，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量1.1％，平均粒徑174μm)和30L 3N的鹽酸溶液，在105℃下攪拌水解30分鐘。使用吸濾器(Nutsche)過濾所得酸不溶性殘余物，并在70L純水中洗滌四次，獲得固體含量為40.1％的濕濾餅(平均聚合度220，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.03質(zhì)量％，平均粒徑69.1μm，膠態(tài)纖維素含量13.4質(zhì)量％，纖維素I晶體含量85％)。
將溶解在0.2N乙酸-乙酸鈉緩沖液(PH4.5)中的可商業(yè)獲得的源于木霉素的纖維素酶制劑(商品名T“Amano”4)加入濕濾餅中，以便將濕濾餅中的固體含量和蛋白質(zhì)濃度分別調(diào)整為5％和0.25％。將這樣獲得的混合物(共計(jì)25mL)放置在50mL的玻璃瓶中。將該玻璃瓶放置在48℃的恒溫振蕩水槽中，并在90rpm的振蕩速度下反應(yīng)如表1中所示的固定的一段時間。在開始反應(yīng)后如表1所示的固定的時間段中，分配300μL仍處于懸浮狀態(tài)的反應(yīng)溶液。使用超濾組件(截流分子量5000)除去酶后，通過高效液相色譜(島津制作所制造，柱TSK-GEL AMIDO-80(商品名，Tosoh制造)，移動床乙腈/水＝6/4)分析所得溶液。所得到的結(jié)果如表1中所示。表中的寡糖的選擇性是通過(纖維二糖濃度+纖維三糖濃度)/總糖濃度×100(％)計(jì)算的值。
(實(shí)施例2)使用與實(shí)施例1中相同的方法，對可商業(yè)獲得的源于針葉樹的溶解漿(平均聚合度781，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量1.1％，平均粒徑174μm)進(jìn)行加酸水解。將所得濕濾餅制成絮團(tuán)形態(tài)，然后放到60℃的快速干燥機(jī)中，干燥12小時。
使用家用混合器粉碎所得干燥物，將獲得的粉碎的纖維素物質(zhì)用噴氣粉碎機(jī)(Seishin Enterprise制造，商品名Jet Mill STJ-2000型)粉化，以獲得纖維素粉末(平均聚合度220，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.03質(zhì)量％，平均粒徑16.4μm，膠態(tài)纖維素含量17.5質(zhì)量％，纖維素I晶體含量86％)。將該纖維素粉末用作基質(zhì)，并使用與實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行酶分解。得到的結(jié)果如表1中所示。
實(shí)施例2使用的平均聚合度和可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量與實(shí)施例1中的相同，平均粒徑比實(shí)施例1中的小，膠態(tài)纖維素含量比實(shí)施例1中的大。由表1可以看出，在實(shí)施例2中，與實(shí)施例1相比，通過減小基質(zhì)的平均粒徑，使糖濃度達(dá)到10％和20％所需的反應(yīng)時間縮短，且對于每種糖濃度改善了寡糖的選擇性。
(實(shí)施例3)使用與實(shí)施例1中相同的方法，對可商業(yè)獲得的源于闊葉樹的溶解漿(平均聚合度1682，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.9％，平均粒徑91μm)進(jìn)行加酸水解。向所得濕濾餅中加入純水，以制成纖維素濃度為10％的分散液。使用高剪切均化器(特殊機(jī)化(株)制造，商品名TKHomogenizer)攪拌該分散液30分鐘，以獲得纖維素分散液(平均聚合度151，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.1質(zhì)量％，平均粒徑8.7μm，膠態(tài)纖維素含量55.5質(zhì)量％，纖維素I晶體含量85％)。將該纖維素分散液用作基質(zhì)，并使用與實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行酶分解。得到的結(jié)果如表1中所示。
實(shí)施例3使用的平均聚合度比實(shí)施例1和實(shí)施2中的小，使用的可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量比實(shí)施例1和實(shí)施例2中的大，使用的平均粒徑比實(shí)施例1和實(shí)施例2中的小，使用的膠態(tài)纖維素含量比實(shí)施例1和實(shí)施例2中的高。由表1中可以看出，在實(shí)施例3中，與實(shí)施例1和實(shí)施例2相比，反應(yīng)時間得到了進(jìn)一步的縮短，對應(yīng)每種糖濃度寡糖的選擇性也得到了改善。雖然在實(shí)施例1和實(shí)施例2中寡糖的選擇性隨糖濃度的升高而降低，但是在實(shí)施例3中寡糖的選擇性即使是糖濃度升高也沒有降低。
(實(shí)施例4)除了將水解條件改變?yōu)槭褂名}酸濃度為5N的鹽酸溶液在18℃下進(jìn)行12小時之外，使用與實(shí)施例1中相同的方法對可商業(yè)獲得的源于針葉樹的溶解漿(平均聚合度781，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量1.1質(zhì)量％，平均粒徑174μm)進(jìn)行水解。與實(shí)施例1相似，洗滌并過濾所得酸不溶性殘余物，以獲得濕濾餅(平均聚合度690，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.7％，平均粒徑49.8μm)。將該濕濾餅制成纖維素濃度為10％的水分散液。使用超高性能分散機(jī)/濕式粉磨機(jī)(Ashizawa制造，商品名Pearl Mill RL，氧化鋁珠直徑2mm，填充率80％)對該水分散液進(jìn)行壓密/研磨處理，以獲得纖維素微粒分散體(平均聚合度690，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.7質(zhì)量％，平均粒徑7.1μm，膠態(tài)纖維素含量87.5質(zhì)量％，纖維素I晶體含量77％)。將該纖維素微粒分散體用作基質(zhì)，并使用與實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行酶分解。得到的結(jié)果如表1中所示。
實(shí)施例4使用的平均聚合度和可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量比實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3中的大，使用的平均粒徑比實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3中的小，使用的膠態(tài)纖維素含量比實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3中的高。由表1中可以看出，在實(shí)施例4中，寡糖的選擇性與實(shí)施例3中的相同，但是反應(yīng)時間與實(shí)施例3相比得到了改善。此外，在實(shí)施例4中，寡糖的選擇性即使是升高糖濃度也很難降低。
(實(shí)施例5)除了使用可商業(yè)獲得的源于棉籽絨的紙漿(平均聚合度1853)，并在130℃的5N的鹽酸水溶液中水解12小時之外，使用與實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行水解，以獲得濕濾餅(平均聚合度49)。將該濕濾餅制成纖維素濃度為10％的水分散液。使用超高性能分散機(jī)/濕式粉磨機(jī)(Ashizawa制造，商品名Pearl Mill RL，氧化鋁珠直徑2mm，填充率80％)對該水分散液進(jìn)行壓密/研磨處理，以獲得纖維素微粒分散體(平均聚合度49，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.9質(zhì)量％，平均粒徑10.3μm，膠態(tài)纖維素含量94.1質(zhì)量％，纖維素I晶體含量75％)。將該纖維素微粒分散體用作基質(zhì)，除了將酶改變?yōu)樵从诤谇沟腃ELLULASENAGASE(Nagase & Co.，Ltd.制造，商品名)之外，使用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行酶分解。得到的結(jié)果如表1中所示。
實(shí)施例5使用的平均聚合度比實(shí)施例4中的低，使用的可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量比實(shí)施例4中的高，使用的平均粒徑比實(shí)施例4中的大，但是使用的膠態(tài)纖維素含量比實(shí)施例4中的高。由表1中可以看出，在實(shí)施例5中，與實(shí)施例4相比，反應(yīng)時間縮短了一半，寡糖的選擇性也得到了提高。
(比較例1)將實(shí)施例1中使用的可商業(yè)獲得的源于針葉樹的溶解漿加入3N鹽酸溶液中，以制造纖維素濃度為10％的分散液。使用高剪切均化器(特殊機(jī)化(株)制造，商品名TK Homogenizer)在常溫下將該分散液攪拌60分鐘，獲得纖維素分散液(平均聚合度723，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.9質(zhì)量％，平均粒徑49.3μm，膠態(tài)纖維素含量10.2質(zhì)量％，纖維素I晶體含量85％)。將未進(jìn)行加酸水解的該纖維素分散液用作基質(zhì)，并使用與實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行酶分解。得到的結(jié)果如表1中所示。
比較例1使用的平均粒徑和可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量在本發(fā)明的范圍內(nèi)，而平均聚合度超出了本發(fā)明的范圍。由表1中可以看出，在比較例1中，與各實(shí)施例相比，糖濃度達(dá)到10％和20％所需的反應(yīng)時間被延長，且酶分解變慢。另外，對于每種糖濃度寡糖的選擇性達(dá)不到各實(shí)施例所達(dá)到的水平。
(比較例2)將通過實(shí)施例4中的步驟所獲得的濕濾餅制成纖維素濃度為10％的水分散液。使用目徑為45μm的網(wǎng)篩對該水分散液進(jìn)行濕法分離。將殘存在網(wǎng)篩上的固體物質(zhì)(平均聚合度690，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.7質(zhì)量％，平均粒徑107.3μm，膠態(tài)纖維素含量5.2質(zhì)量％，纖維素I晶體含量85％)用作基質(zhì)，并使用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行酶分解。得到的結(jié)果如表1中所示。
比較例2使用的平均聚合度和可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量在本發(fā)明的范圍內(nèi)，而平均粒徑超出了本發(fā)明的范圍。由表1中可以看出，在比較例2中，與各實(shí)施例相比，反應(yīng)時間變慢，且寡糖的選擇性達(dá)不到各實(shí)施例所達(dá)到的水平。
(比較例3)除了將水解條件改變?yōu)槭褂名}酸濃度為4N的鹽酸溶液在35℃下進(jìn)行18小時之外，使用與實(shí)施例1中相同的方法對可商業(yè)獲得的源于針葉樹的未漂白的牛皮紙紙漿(平均聚合度1670，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量12質(zhì)量％，平均粒徑154μm)進(jìn)行水解。與實(shí)施例1相似，洗滌并過濾所得酸不溶性殘余物，以獲得濕濾餅(平均聚合度490，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量4.4質(zhì)量％，平均粒徑48.7μm，膠態(tài)纖維素含量12.8質(zhì)量％，纖維素I晶體含量86％)。
使用該濕濾餅并以與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行酶分解。得到的結(jié)果如表1中所示。
比較例3使用的平均聚合度和平均粒徑在本發(fā)明的范圍內(nèi)，而可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量超出了本發(fā)明的范圍。由表1中可以看出，在比較例3中，與比較例1和比較例2相比，纖維寡糖的收率略有提高，但是反應(yīng)時間和寡糖的選擇性均達(dá)不到實(shí)施例所達(dá)到的水平。


(制備例1)將里氏木霉NBRC31329接種到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(Difco制造)中，并在37℃下培養(yǎng)7天，然后，將取自該培養(yǎng)基表面的一鉑環(huán)量孢子在下述培養(yǎng)基中接種并在28℃下預(yù)培養(yǎng)3天，所述培養(yǎng)基為將1g多聚蛋白胨、0.5g酵母膏、2g磷酸一鉀、1.5g硫酸銨、0.3g硫酸鎂、0.3g氯化鈣、1mL痕量元素(通過將6mg硼酸、26mg四水合鉬酸銨、100mg六水合氯化鐵(III)、40mg五水合硫酸銅、8mg四水合硫酸錳和200mg七水合硫酸鋅溶解在總量為100mL的純水中獲得)、1mL AdecanolLG-109和10g結(jié)晶性纖維素(旭化成化學(xué)株式會社制造，商品名PH-101)懸浮、溶解在總量為1L的純水中，再將其中的100mL分配到500mL的錐形瓶中并進(jìn)行高壓消毒。此外，將10mL預(yù)培養(yǎng)溶液接種到5L廣口發(fā)酵罐中，該發(fā)酵罐中盛有與上述培養(yǎng)基組成相同的培養(yǎng)基，在溫度為28℃、攪拌速率為400rpm、通氣速率為0.5vvm的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)期間使用NaOH將pH控制為3。培養(yǎng)7天后，離心分離所得溶液。使用目徑為0.46μm的微孔濾膜，從獲得的上清液中除去菌株體。使用截流分子量為13000的超濾膜(旭化成化學(xué)株式會社制造，商品名Microza Pencil Module ACP-0013)，將濾液體積濃縮為原來的十分之一，以獲得粗酶。
表2列出了該粗酶活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)的測量結(jié)果。
(制備例2)將里氏木霉NBRC31329接種到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(Difco制造)中，并在37℃下培養(yǎng)7天，然后，將取自該培養(yǎng)基表面的一鉑環(huán)量孢子在下述培養(yǎng)基中接種并在28℃下培養(yǎng)3天，所述培養(yǎng)基為將1g多聚蛋白胨、0.5g酵母膏、2g磷酸一鉀、1.5g硫酸銨、0.3g硫酸鎂、0.3g氯化鈣、1mL痕量元素(通過將6mg硼酸、26mg四水合鉬酸銨、100mg六水合氯化鐵(III)、40mg五水合硫酸銅、8mg四水合硫酸錳和200mg七水合硫酸鋅溶解在總量為100mL的純水中獲得)、1mL AdecanolLG-109和10g結(jié)晶性纖維素(旭化成化學(xué)株式會社制造，商品名PH-101)懸浮、溶解在總量為1L的純水中，再將其中的100mL分配到500mL的錐形瓶中并進(jìn)行高壓消毒。此外，將10mL預(yù)培養(yǎng)溶液接種到5L廣口發(fā)酵罐中，該發(fā)酵罐中盛有1L與上述培養(yǎng)基組成相同的培養(yǎng)基，并在溫度為28℃、攪拌速率為400rpm、通氣速率為0.5vvm的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)期間使用NaOH將pH控制為4。培養(yǎng)7天后，離心分離所得溶液。使用目徑為0.46μm的微孔濾膜，從獲得的上清液中除去菌株體。使用截流分子量為13000的超濾膜(旭化成化學(xué)株式會社制造，商品名Microza Pencil Module ACP-0013)，將濾液體積濃縮為原來的十分之一，以獲得粗酶。
表2列出了該粗酶的活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)的測量結(jié)果。
(制備例3)將可商業(yè)獲得的纖維素酶(合同酒精制造，商品名GODO-TCD)溶解在50mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(PH4.8)中，使纖維素酶的濃度為500mg/mL。將該混合物引入陰離子交換柱(Amersham制造，商品名DEAE-Sepharose FF)中。通過線性梯度法，使50mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4.8)和溶解在50mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4.8)中的1摩爾％的氯化鈉在柱中循環(huán)，從而從可商業(yè)獲得的酶中獲得分離樣品。測量獲得的所有餾分的β-葡糖苷酶活性和結(jié)晶性纖維素分解活性，合并活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)小于或等于0.5的餾分。使用截流分子量為10000的超濾組件(Millipore制造，商品名Amicon Ultra-15離心過濾機(jī))，將獲得的纖維二糖餾分的體積濃縮為原來的五分之一，以獲得純化酶(提純的酶中的蛋白質(zhì)濃度15.4mg/mL)。
表2列出了該純化酶活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)的測量結(jié)果。
(實(shí)施例6)在低速攪拌器(30-L反應(yīng)器)中加入2kg可商業(yè)獲得的源于針葉樹的溶解漿(平均聚合度781，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量1.1％，平均粒徑174μm)，并在110℃下使用的3N鹽酸溶液的水解條件下水解30分鐘。洗滌并過濾所得酸不溶性殘余物，以獲得濕濾餅。將獲得的濕濾餅制成絮團(tuán)形態(tài)，并在60℃的烘箱內(nèi)通氣/干燥12小時。向所得干燥物中加入純水，以將其含水量調(diào)整為60％，并使用混合器(三英制作所制造，商品名萬能攪拌混合機(jī)，鉤狀槳葉轉(zhuǎn)速為126rpm，90分鐘)研磨，獲得磨碎的纖維素(平均聚合度220，平均粒徑9.1μm，膠態(tài)纖維素成分含量66.1質(zhì)量％，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.03質(zhì)量％，纖維素I結(jié)晶含量78％)。
然后，將5質(zhì)量％的該磨碎的纖維素懸浮并溶解在制備例1中獲得的粗酶的50mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4.8)中。將這樣獲得的混合物(共計(jì)25mL)放置在玻璃瓶中。將該玻璃瓶放置在55℃的恒溫振蕩水槽中，在90rpm的振蕩速度下反應(yīng)。在開始反應(yīng)后的固定的一段時間中，分配300μL仍處于懸浮狀態(tài)的反應(yīng)溶液。使用超濾組件(截流分子量10000)除去酶和未分解的纖維素后，通過高效液相色譜分析所得溶液的糖濃度。得到的結(jié)果如表2中所示。
反應(yīng)溶液中的纖維寡糖和葡萄糖通過高效液相色譜(柱AsahipakNH2P-50(商品名，島津制作所制造)，高效液相色譜SCL-10A型(商品名，島津制作所制造)，移動床乙腈/水＝75/25(體積比)，循環(huán)量1mL/min，樣品溶液10μL)進(jìn)行定量分析。
表中的反應(yīng)時間是生成的糖(纖維寡糖和葡萄糖)的總量與所用纖維素的量之間的比達(dá)到20質(zhì)量％時所需要的反應(yīng)時間。寡糖的選擇性通過用(纖維二糖濃度+纖維三糖濃度)/總糖濃度×100(％)計(jì)算的值表達(dá)。
(實(shí)施例7)除了將水解條件變?yōu)槭褂名}酸濃度為5N的鹽酸溶液在18℃下進(jìn)行12小時之外，使用與實(shí)施例1中相同的方法對可商業(yè)獲得的源于針葉樹的溶解漿(平均聚合度781，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量1.1％，平均粒徑174μm)進(jìn)行水解。與實(shí)施例1相似，洗滌并過濾所得酸不溶性殘余物，以獲得濕濾餅(平均聚合度690，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.7質(zhì)量％，平均粒徑49.8μm)。將該濕濾餅制成纖維素濃度為10％的水分散液。使用超高性能分散機(jī)/濕式粉磨機(jī)(Ashizawa制造，商品名Pearl Mill RL，氧化鋁珠直徑2mm，填充率80％)對該水分散液進(jìn)行壓密/研磨處理，以獲得纖維素微粒分散體(平均聚合度690，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.7質(zhì)量％，平均粒徑7.1μm，膠態(tài)成分含量87.5質(zhì)量％，纖維素I晶體含量77％)。此外，使用與實(shí)施例6相似的方式酶分解獲得的濕濾餅。得到的結(jié)果如表2中所示。
在實(shí)施例7中，對與實(shí)施例6中的纖維素相比具有較小平均粒徑和較高的膠態(tài)成分含量的纖維素進(jìn)行酶分解。與實(shí)施例6相比，縮短了反應(yīng)時間，改善了寡糖的選擇性。
(實(shí)施例8)以與實(shí)施例1中相同的方法使用實(shí)施例6中獲得的纖維素濕濾餅并使用制備例3中獲得的純化酶進(jìn)行酶分解。得到的結(jié)果如表2中所示。
實(shí)施例8使用的酶具有比實(shí)施例6中使用的酶小的活性比(β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)。雖然通過改變酶延長了反應(yīng)時間，但是選擇性得到了改善。
(實(shí)施例9)將可商業(yè)獲得的源于針葉樹的溶解漿(平均聚合度781，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量1.1質(zhì)量％，平均粒徑174μm)在105℃下攪拌水解30分鐘。使用吸濾器過濾所得酸不溶性殘余物，并在70L純水中洗滌四次，以獲得固體含量為40.1％的濕濾餅(平均聚合度220，平均粒徑69.1μm，膠態(tài)成分含量13.4質(zhì)量％，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.03質(zhì)量％，纖維素I晶體含量85％)。使用該纖維素濕濾餅并以與實(shí)施例6中相同的方法使用制備例3中獲得的純化酶進(jìn)行酶分解。得到的結(jié)果如表2中所示。
實(shí)施例9使用的酶具有比實(shí)施例6使用的酶小的活性比(β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)，并且與實(shí)施例6相比，實(shí)施例9使用的纖維素具有更大的平均粒徑和更小的膠態(tài)成分含量。雖然通過改變酶和基質(zhì)延長了反應(yīng)時間，但是選擇性得到了改善。
(實(shí)施例10)使用實(shí)施例6中獲得的纖維素濕濾餅并以與實(shí)施例6中相同的方法使用制備例2中獲得的酶進(jìn)行酶分解。得到的結(jié)果如表2中所示。
實(shí)施例10使用的酶具有比實(shí)施例6中使用的酶大的活性比(β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)。雖然改變酶后反應(yīng)時間與實(shí)施例6中的相等，但是降低了選擇性。
(比較例4)使用實(shí)施例6至實(shí)施例9中使用的可商業(yè)獲得的紙漿(平均聚合度781)，而進(jìn)行水解。向該紙漿中加入純水(固體含量40質(zhì)量％)，并使用與實(shí)施例6相同的方法進(jìn)行研磨處理，以獲得濕濾餅(平均聚合度781，平均粒徑49.3μm，膠態(tài)纖維素成分含量10.2質(zhì)量％，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.9質(zhì)量％，纖維素I晶體含量85％)。使用該濕濾餅并以與實(shí)施例6相同的方法進(jìn)行酶分解。得到的結(jié)果如表2中所示。
比較例4使用的纖維素的平均聚合度超出了本發(fā)明的范圍，而平均粒徑和膠態(tài)纖維素成分含量在本發(fā)明的范圍內(nèi)。與各實(shí)施例相比，延長了反應(yīng)時間并降低了纖維寡糖的選擇性。
(比較例5)將通過實(shí)施例6中的步驟獲得的濕濾餅制成纖維素濃度為10％的水分散液。使用目徑為45μm的網(wǎng)篩對該水分散液進(jìn)行濕法分離。將殘存在網(wǎng)篩上的固體物質(zhì)(平均聚合度220，平均粒徑103.4μm，膠態(tài)成分含量9.7質(zhì)量％，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.03質(zhì)量％，纖維素I晶體含量85％)用作基質(zhì)，并使用與實(shí)施例6相同的方法進(jìn)行酶分解。得到的結(jié)果如表2中所示。
比較例5使用的平均聚合度和可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量在本發(fā)明的范圍內(nèi)，而平均粒徑超出了本發(fā)明的范圍，膠態(tài)成分含量小于本發(fā)明的范圍。與各實(shí)施例相比，在比較例5中，反應(yīng)時間變慢，纖維寡糖的選擇性達(dá)不到各實(shí)施例所達(dá)到的水平。


(實(shí)施例11)在28℃下將里氏木霉NBRC31329在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天。生成的孢子以106個孢子/mL懸浮在2ml 100mM的磷酸鈣緩沖液(pH7)中，并加入24μl的EMS(甲磺酸乙酯)。在28℃下振蕩該混合物16小時，從而對該混合物施加誘變處理。通過離心分離從該孢子懸浮液中收集孢子，然后在100mM的磷酸鈣緩沖液(pH7)中充分洗滌，并稀釋為100～300個孢子/板。在28℃下將該稀釋液在下述培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，所述培養(yǎng)基為將1g葡萄糖、1g酵母膏、2g(NH4)2SO4、4g KH2PO4、2g Na2HPO4、200mg MgSO4·7H2O、1mg CaCl2·2H2O、TritonX-100、1mL痕量元素(通過將6mg硼酸、26mg四水合鉬酸銨、100mg六水合氯化鐵(III)、40mg五水合硫酸銅、8mg四水合硫酸錳和200mg七水合硫酸鋅溶解在總量為100mL的純水中獲得)和20g瓊脂溶解并懸浮在1L純水中，再進(jìn)行高壓消毒，并通過使用薄膜過濾器過濾進(jìn)行消毒。測量所得培養(yǎng)溶液的B-葡糖苷酶活性和結(jié)晶性纖維素分解活性，以選擇突變株里氏木霉GL-1。該突變株根據(jù)布達(dá)佩斯條約從2005年4月15日起保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏所(International Patent Organism Depositary National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan)，保藏登記號為FERMBP-10323。
(實(shí)施例12)在25℃下將里氏木霉NBRC31329和在實(shí)施例11中獲得的突變株GL-1各自在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，以充分形成孢子。將1鉑環(huán)量孢子接種在下述培養(yǎng)基中，并在28℃、攪拌下培養(yǎng)5天，所述培養(yǎng)基為將1.0g多聚蛋白胨、0.5酵母膏、2.0g KH2PO4、1.5g(NH4)2SO4、0.3g MgSO4·7H2O、0.3g CaCl2·2H2O、1.0ml Tween 80(半井化學(xué)藥品(株)制造)、1.0ml痕量元素溶液(通過將6mg H3BO4、26mg(NH4)6Mo7O24·4H2O、100mg FeCl3·6H2O、40mg CuSO4·5H2O、8mg MnSO4·4H2O和200mg ZnSO4·7H2O溶解并懸浮在100ml水中獲得)和7.5g酒石酸溶解并懸浮在1L水中，然后將pH調(diào)整為4.0，將其中100mL分配到500mL的錐形瓶中，再加入1g結(jié)晶性纖維素(旭化成化學(xué)株式會社制造，商品名PH-101)，并進(jìn)行高壓消毒。在第五天，離心分離該培養(yǎng)溶液。測量所得上清液在40℃下的纖維素酶活性和β-葡糖苷酶活性。得到的結(jié)果如表3中所示。
(實(shí)施例13)將里氏木霉NBRC31329接種到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(Difco制造)中，并在37℃下培養(yǎng)7天。將取自該培養(yǎng)基表面的一鉑環(huán)量孢子接種在下述培養(yǎng)基中，并在28℃下預(yù)培養(yǎng)3天，所述培養(yǎng)基為將1g多聚蛋白胨、0.5g酵母膏、2g磷酸一鉀、1.5g硫酸銨、0.3g硫酸鎂、0.3g氯化鈣、1mL痕量元素(通過將6mg硼酸、26mg四水合鉬酸銨、100mg六水合氯化鐵(III)、40mg五水合硫酸銅、8mg四水合硫酸錳和200mg七水合硫酸鋅溶解在總量為100mL的純水中獲得)和1mL AdecanolLG-109懸浮并溶解在總量為1L的純水中，再將其中的100mL分配到500mL的錐形瓶中，二者中均加入1g結(jié)晶性纖維素(旭化成化學(xué)株式會社制造，商品名PH-101)，并進(jìn)行高壓消毒。此外，將30mL預(yù)培養(yǎng)溶液接種到5L廣口發(fā)酵罐中，該發(fā)酵罐中盛有與上述培養(yǎng)基組成相同的培養(yǎng)基，在溫度為28℃、攪拌速率為400rpm、通氣速率為0.5vvm的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)期間使用NaOH溶液將最小pH控制為3.0。培養(yǎng)5天后，離心分離所得溶液，獲得作為粗酶的上清液。通過上述方法，測量獲得的酶溶液的結(jié)晶性纖維素分解活性和β-葡糖苷酶活性。培養(yǎng)期間pH隨時間的變化如圖1所示，活性測量的結(jié)果如表4中所示。
(實(shí)施例14)當(dāng)使用與實(shí)施例13相同的方法對里氏木霉NBRC31329進(jìn)行培養(yǎng)時，使用NaOH將培養(yǎng)期間的最低pH控制為2.5，獲得粗酶溶液。通過上述方法測量獲得的酶溶液的結(jié)晶性纖維素分解活性和β-葡糖苷酶活性。培養(yǎng)期間pH隨時間的變化如圖1所示，活性測量的結(jié)果如表4中所示。
(比較例6)當(dāng)使用與實(shí)施例13相同的方法對里氏木霉NBRC31329進(jìn)行培養(yǎng)時，使用NaOH將培養(yǎng)期間的最低pH控制為3.5或4或5，獲得粗酶溶液。通過上述方法測量獲得的酶溶液的結(jié)晶性纖維素分解活性和β-葡糖苷酶活性。培養(yǎng)期間pH隨時間的變化如圖1所示，活性測量的結(jié)果如表4中所示。
(實(shí)施例15)使用與實(shí)施例13相同的方法培養(yǎng)實(shí)施例11中獲得的GL-1菌株。當(dāng)培養(yǎng)該菌株時，使用NaOH將培養(yǎng)期間的最低pH控制為3或4，獲得粗酶溶液。培養(yǎng)期間pH隨時間的變化如圖2所示。
(實(shí)施例16)向8ml 5質(zhì)量％的結(jié)晶性纖維素(通過使用126rpm的萬能攪拌混合機(jī)(商品名，三英制作所制造)的鉤狀槳葉捏合并攪拌含水量被調(diào)整為60％的Ceolus PH-101(商品名，旭化成化學(xué)株式會社制造)90分鐘而獲得)中分別加入2mL在實(shí)施例13和實(shí)施例15中獲得的纖維素酶粗酶溶液，并在55℃、攪拌的條件下進(jìn)行水解。反應(yīng)2小時、4小時、6小時、8小時后，將該混合物在95℃加熱15分鐘，以結(jié)束酶反應(yīng)。通過離心分離得到清液，使用上述HPLC法測量該上清液的纖維寡糖濃度和葡萄糖濃度。得到的結(jié)果如圖3中所示。
(比較例7)當(dāng)使用與實(shí)施例16相同的方法酶分解結(jié)晶性纖維素時，將比較例6中獲得的纖維素酶用作粗酶溶液。結(jié)果如圖3中所示。



(實(shí)施例17)將可商業(yè)獲得的結(jié)晶性纖維素(旭化成化學(xué)株式會社制造，商品名PH-101)制成固體含量為10質(zhì)量％的水分散液，并使用珠磨機(jī)(AshizawaFinetech制造，商品名Pearl Mill RL5，容積5L，研磨介質(zhì)直徑為1mm的氧化鋯珠，轉(zhuǎn)速1800rpm，在容器內(nèi)的停留時間70分鐘)進(jìn)行濕磨。然后，向100ml所獲磨碎的纖維素水分散液(平均聚合度220，平均粒徑0.7μm，膠態(tài)纖維素含量54質(zhì)量％，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量0.03質(zhì)量％，纖維素I晶體含量75％)中加入200mL粗酶溶液，所述粗酶溶液是通過利用超濾(截流分子量13000)濃縮實(shí)施例15中pH為3時培養(yǎng)的上清液(體積濃縮為原來的五分之一)而獲得的。通過加入50mM的乙酸/乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)將其總體積調(diào)整為500mL。將該混合物放到1L玻璃可分燒瓶中，在使用3-1 Motor(商品名)進(jìn)行內(nèi)部攪拌下，使其在55℃的溫浴中反應(yīng)。在反應(yīng)開始兩小時后，分配300μm仍處于懸浮狀態(tài)的反應(yīng)溶液。使用超濾組件(截流分子量10000)除去酶和未分解的纖維素后，通過高效液相色譜分析所得溶液的糖濃度，從而定量分析反應(yīng)溶液中存在的纖維素殘余物。結(jié)果，在反應(yīng)兩小時后，纖維素分解速率為82％，寡糖的選擇性為81％。
(實(shí)施例18)將實(shí)施例17中獲得的磨碎的纖維素水分散液放在與實(shí)施例17相同的燒瓶中，并在與實(shí)施例17相同的條件下，使用反應(yīng)槽來進(jìn)行反應(yīng)，在所述反應(yīng)槽中安裝了截流分子量為13000的聚丙烯腈制中空超濾組件(旭化成化學(xué)株式會社制造，商品名Microza ACP-0013)。在使反應(yīng)溶液在壓力為0.1MPa、循環(huán)流速為4L/小時下在超濾組件中循環(huán)的同時，使反應(yīng)進(jìn)行2小時。測量通過超濾獲得的透過液的糖濃度，從而定量分析反應(yīng)溶液中存在的纖維素殘余物。
結(jié)果，纖維素的分解率為95質(zhì)量％，寡糖的選擇性為85％。
(實(shí)施例19)除了將反應(yīng)溶液中纖維素濃度設(shè)定為2.5質(zhì)量％之外，使用與實(shí)施例18相同的設(shè)備進(jìn)行酶分解。在酶分解期間，纖維素的分解率通過對透過液的分析來測量。將該反應(yīng)進(jìn)行24小時，同時加入磨碎的纖維素水分散液，以便將反應(yīng)溶液中的纖維素濃度恒定保持為2.5質(zhì)量％。使用與實(shí)施例18相同的方法測量透過液中的糖濃度，從而定量分析反應(yīng)溶液中存在的纖維素殘余物。
結(jié)果，纖維素的分解率為98質(zhì)量％，寡糖的選擇性為92％。
(實(shí)施例20)通過離子交換樹脂(三菱化學(xué)制造，商品名DIAION WA30和SK1B)除去實(shí)施例19中獲得的纖維寡糖水溶液中的乙酸，然后在60℃下干燥8小時，并在研缽中粉碎，以獲得纖維寡糖粉末。按照《日本藥典》(第14版，廣川書店出版)的結(jié)晶性纖維素純度試驗(yàn)(2)中所規(guī)定的可溶于二乙醚的物質(zhì)的定量分析方法，測量該粉末中可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量。獲得的可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量為200ppm。
(比較例8)使用家用混合器粉碎可商業(yè)獲得的未漂白的溶解漿(源于Spuruce，平均聚合度1680，平均粒徑128μm，膠態(tài)纖維素含量4質(zhì)量％，可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量1.5質(zhì)量％，纖維素I晶體含量85％)。向作為基質(zhì)的所獲得的經(jīng)粉碎的纖維素中加入pH為5.5的乙酸緩沖液，以制備纖維素含量為2質(zhì)量％的水分散液。在上述纖維素水分散液中，以基于所述水分散液為0.1質(zhì)量％的濃度溶解可商業(yè)獲得的纖維素酶(合同酒精制造，商品名GODO-TCD)，并使用與實(shí)施例17中相同的方法，在pH為5.0下進(jìn)行酶分解24小時。結(jié)果，纖維素的分解率為29質(zhì)量％，寡糖的選擇性為55％。使用與實(shí)施例20相同的方法粉碎該纖維寡糖水溶液，并測量其可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量。可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量為3200ppm。
工業(yè)實(shí)用性通過本發(fā)明的方法獲得的纖維寡糖不僅優(yōu)選用作普通食品的原料，還優(yōu)選用作保健食品的原料、化學(xué)轉(zhuǎn)化的原料如用于合成醫(yī)藥中間體和其它化學(xué)品的材料，以及食品、藥物和一般工業(yè)制品領(lǐng)域中用于發(fā)酵的原料。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)纖維寡糖的方法，所述方法包括在纖維素酶的存在下酶分解水不溶性天然纖維素類物質(zhì)，所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)具有小于或等于700的平均聚合度、小于或等于100μm的平均粒徑并且可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量小于1質(zhì)量％。
2.一種生產(chǎn)纖維寡糖的方法，所述方法包括在纖維素酶的存在下酶分解水不溶性天然纖維素類物質(zhì)，所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)具有小于或等于700的平均聚合度，含有大于或等于10質(zhì)量％的膠態(tài)纖維素成分，并且可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量小于1質(zhì)量％。
3.如權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)的平均粒徑小于或等于100μm，并包含大于或等于10質(zhì)量％的膠態(tài)纖維素成分。
4.如權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)的平均聚合度小于或等于500，并且平均粒徑小于或等于50μm。
5.如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)的平均聚合度小于或等于400，并且平均粒徑小于或等于30μm。
6.如權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)包含大于或等于15重量％的膠態(tài)纖維素成分。
7.如權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述纖維素酶的活性比(溫度為55℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)小于或等于0.7。
8.如權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述纖維素酶的活性比小于或等于0.5。
9.如權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述纖維素酶的活性比小于或等于0.35。
10.如權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述可溶于二乙醚的物質(zhì)為木質(zhì)素。
11.如權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)纖維寡糖的方法，其中所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)包含纖維素I型晶體。
12.一種如權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其中，在通過培養(yǎng)生產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌而獲得的培養(yǎng)液中，β-葡糖苷酶活性與結(jié)晶性纖維素分解活性的活性比(溫度為40℃時的β-葡糖苷酶活性/結(jié)晶性纖維素分解活性)小于或等于0.5。
13.如權(quán)利要求12所述的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其中β-葡糖苷酶活性與結(jié)晶性纖維素分解活性的活性比小于或等于0.35。
14.如權(quán)利要求12或13所述的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其中所述生產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌是作為生產(chǎn)β-葡糖苷酶少的菌株而選擇得到的菌株。
15.如權(quán)利要求12至14任一項(xiàng)所述的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其中在培養(yǎng)所述生產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌時，將培養(yǎng)期間的pH控制為小于3.5。
16.如權(quán)利要求12至15任一項(xiàng)所述的纖維素酶的生產(chǎn)方法，其中所述生產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌是屬于木霉菌屬的菌株。
17.一種纖維寡糖，其特征在于，所述纖維寡糖可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量小于或等于2000ppm。
18.通過如權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的方法獲得的纖維寡糖，其特征在于可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量小于或等于2000ppm。
19.如權(quán)利要求18所述的纖維寡糖，其中所述可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量小于或等于1000ppm。
20.一種食品、化妝品或藥用制劑，其特征在于包含通過如權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的方法獲得的纖維寡糖。
21.一種食品、化妝品或藥用制劑，其特征在于包含如權(quán)利要求17或18所述的纖維寡糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)纖維寡糖的方法，所述方法包括在纖維素酶的存在下酶分解水不溶性天然纖維素類物質(zhì)，所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)具有小于或等于700的平均聚合度、小于或等于100μm的平均粒徑并且可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量小于1質(zhì)量％。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)纖維寡糖的方法，所述方法包括在纖維素酶的存在下酶分解水不溶性天然纖維素類物質(zhì)，所述水不溶性天然纖維素類物質(zhì)具有小于或等于700的平均聚合度，含有大于或等于10質(zhì)量％的膠態(tài)纖維素成分，并且可溶于二乙醚的物質(zhì)的含量小于1質(zhì)量％。
文檔編號C12N9/42GK1989254SQ20058002535
公開日2007年6月27日 申請日期2005年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月27日
發(fā)明者山崎有亮, 伊吹一郎, 井阪光二 申請人:旭化成化學(xué)株式會社