專利名稱：使對于核酸擴增有用的試劑穩(wěn)定的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種使試劑穩(wěn)定的方法，所述試劑尤其是將在核酸擴增反應中使用的試劑。本發(fā)明還涉及被穩(wěn)定的試劑、含有所述試劑的反應容器和所述試劑的用途。
背景技術：
一些試劑在室內(nèi)的溫度、壓力和濕度條件下不穩(wěn)定。在實驗室的受控制環(huán)境中，可容易地控制其穩(wěn)定性，例如通過將試劑保存在降低的溫度下或?qū)⒃噭┍４嬖跓o氧氣氛中，但穩(wěn)定保存在實驗室環(huán)境外使用的所述試劑更加困難。另外，許多操作需要試劑的復雜混合物。再次，在實驗室中，所述試劑可單獨保存到需要的時候，以防止降解或副反應。但在開發(fā)用于由具有很少或者沒有科學訓練的工作者在實驗室環(huán)境外進行的操作時，優(yōu)選開發(fā)出的方法使得試劑可被預先混合并在沒有降解或副反應的情況下保存以簡化所需操作。這樣，需要新方案以使不同類型的試劑和其混合物穩(wěn)定，從而容許它們能被成功保存以及廣泛應用于多種環(huán)境和儀器平臺。
目前正開發(fā)的用于實驗室外的實驗室操作的一個實例是核酸擴增反應。擴增多種不同核酸目標物的這些反應已廣為人知并是實驗室中進行的常規(guī)反應。所述擴增反應的一個實例是聚合酶鏈式反應(PCR)。該反應在診斷疾病狀態(tài)、鑒定環(huán)境或食品中的污染物方面的有用性和作為法醫(yī)科學、臨床微生物學、腫瘤學、血液儲存的工具是廣泛已知的。然而，直到現(xiàn)在，因為所述反應的復雜性、試劑的固有穩(wěn)定性、當首次混合時發(fā)生副反應的可能性、所需的專業(yè)技術和儀器，所述反應仍然必需使用基于實驗室的程序進行。目前，在開發(fā)可用于由具有很少或者沒有科學訓練的工作者在實驗室外(例如在現(xiàn)場或在臨床)進行核酸擴增反應的儀器和操作方面已取得進展。這樣的系統(tǒng)將使得在采集后很快完成個體測試以提供快速的樣品鑒定。
核酸擴增反應需要許多不同的試劑。核心試劑包括諸如多核苷酸聚合酶(例如熱穩(wěn)定聚合酶)等擴增酶、核苷三磷酸、與目標材料互補的寡核苷酸引物、鎂離子和其他緩沖劑。另外，在實時PCR或qPCR中使用的分析制劑也將使用以下試劑，該試劑可包括染料標記的寡核苷酸探針、諸如Sybr Gold等DNA結(jié)合染料和內(nèi)部對照DNA。
需要開發(fā)新方法以生產(chǎn)以下試劑制劑，該試劑制劑具有良好保存期和用于基于非實驗室的核酸擴增系統(tǒng)的優(yōu)異性能。這將確保所述試劑具有足夠的保存期并將可導致測試失敗或獲得假陽性結(jié)果的降解減小到最低。為進一步簡化操作，適宜在保存前按照所需量混合盡可能多的所需試劑。然而，重要的是在已將所述試劑混合后并在保存過程中，將副反應減小到最少。具體地說，即使在低溫(0℃～4℃)制備制劑，由于在加入目標材料前引物的非特異性退火，核酸擴增試劑的預先組合可導致在混合物里的核苷酸序列發(fā)生過早的錯誤引發(fā)的擴增。這將導致目標擴增的失敗，這是因為產(chǎn)生了不需要的人為構造(artefact)，該人為構造將妨礙擴增和/或目標檢測，尤其是在進行低拷貝數(shù)的擴增時更是如此。另外，將所述試劑預先組合和在溶液中保存可導致試劑隨時間而降解。雖然通過將試劑以干燥粉末形式，例如凍干進行保存可部分解決上述問題，但并沒有完全避免該問題。這是因為在配制過程中或者在凍干前，可能發(fā)生一些試劑的降解/錯誤引發(fā)的擴增，并且如果儀器在潮濕條件下保存或使用可發(fā)生試劑的再水化。另外，在從液體轉(zhuǎn)換為玻璃態(tài)的轉(zhuǎn)變過程中隨著試劑濃度的增加，凍干方法本身可促使反應組分間發(fā)生不需要的相互作用。這樣，需要新穎和改進的以下制劑和穩(wěn)定系統(tǒng)，該制劑和穩(wěn)定系統(tǒng)使得可長期保存預先混合的試劑(包括那些在核酸擴增反應中使用的試劑)，理想地為在室溫至少3個月。
已進行了一些工作用于在核酸擴增前使試劑穩(wěn)定。例如Setterquist等(Nucleic Acids Research 1996，vol 24 pp 1580-1581)公開了一種用于將PCR反應的組分封裝在含有0.5％瓊脂糖/50％甘油的基質(zhì)中的方法，所述基質(zhì)易于運輸(甚至可在室溫)，并可在-20℃保存許多月。可通過加入溶液中的目標DNA和熱循環(huán)所述混合物而簡單地引發(fā)PCR反應。然而，這些混合物并不適合在室溫保存。作為另外一種選擇，US 5,599,660公開了一種用于保存和運輸可任選用于PCR反應的試劑的方法，其中包括將第一試劑封裝在蠟載體中并將其與可任選地以玻璃態(tài)或脫水形式保存的第二試劑組合。然后通過用合適的溶劑或?qū)⑾灱訜嶂疗淙刍瓜炄芙?，而使得兩種試劑混合。
現(xiàn)有技術還包括許多通過去除關鍵擴增試劑中的一種并在擴增前立即將其加入而使反應混合物穩(wěn)定的建議。例如Kaijalainen等(NucleicAcids Research 1993，vol 21 pp 2959-2960)公開了一種通過將引物干燥并嵌入蠟珠中而使PCR反應混合物穩(wěn)定的方法，因此隨著加熱和蠟熔化，所述引物釋放到擴增混合物的其他部分中。Blair等(PCR Methods andApplications 1994，vol 4 pp 191-194)公開了將包括非熱穩(wěn)定性試劑的PCR試劑與蠟共固化，但其中不包括或者引物或者熱穩(wěn)定酶，隨后在即將擴增前將所述引物或者熱穩(wěn)定酶以溶液形式加入。然而在每一種這些情況下，如果反應是在非實驗室環(huán)境下進行，仍然需要不熟練的工作者在擴增前加入正確量的關鍵試劑。另外，在一些這些混合物中，仍可發(fā)生錯誤引發(fā)事件而導致副反應和不需要的人為構造。
也已公開了通過從反應混合物中去除鎂離子而使擴增試劑穩(wěn)定。這具有的優(yōu)勢在于當缺少鎂時聚合酶是無活性的。US 5,411,876公開了配制作為兩個亞組的試劑，第一亞組含有鎂而第二亞組含有所有其他試劑，并通過一層可任選含有表面活性劑的蠟/油脂在反應容器中將兩個亞組分開。US 6,403,341公開了螯合鎂(可任選地使用磷酸根離子源)，其作為一種能在升溫下溶解的沉淀，并在熱循環(huán)開始時加入試劑的其他部分并使試劑混合?，F(xiàn)有技術教導由于在引物和三磷酸酯存在下保存聚合酶，所以反應混合物不含有任何鎂是重要的，否則仍可發(fā)生錯誤引發(fā)。為確保沒有游離鎂存在，加入螯合劑等鎂螯合材料。然而，現(xiàn)在已觀察到在一些所述系統(tǒng)中，試劑在保存過程中并沒有被完全穩(wěn)定并仍觀察到形成了不需要的人為構造。仍需要發(fā)展進一步改進的在保存中穩(wěn)定試劑的方法，所述試劑尤其是那些在核酸擴增反應中使用的試劑。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在已開發(fā)出一種新穎和改進的使適合在核酸擴增反應中使用的試劑穩(wěn)定的方法。所述方法包括(i)制備含有適合在核酸擴增反應中使用的試劑的試劑混合物，其中所述混合物含有多核苷酸聚合酶；和(ii)干燥所述試劑；其特征在于，所述試劑混合物含有的鎂離子的濃度為激活擴增反應所需的鎂離子終濃度的約0.1％～約50％。
鎂的存在據(jù)認為是通過如下機理影響擴增反應激活多核苷酸聚合酶，與寡核苷酸反應，與dNTP絡合并緩沖反應混合物。
激活擴增反應所需的鎂離子終濃度在本領域里已知需要試錯法進行確定，對于特定多核苷酸聚合酶，所述終濃度具有其中反應將以所需的特異性進行的最優(yōu)范圍，。激活所需擴增反應所需的鎂離子終濃度的通常范圍可為1mM～5mM。
當選擇使擴增不能進行的鎂水平時，錯誤引發(fā)事件被減少到最小或者被阻止。還據(jù)認為通過配制反應混合物使得其中含有一些鎂離子，可使在凍干過程中可發(fā)生的反應組分間，特別是寡核苷酸引物、探針和DNA結(jié)合染料間的不利的相互作用被減少到最小，因此保證了引物和探針可用于結(jié)合目標物。這提高了擴增反應的效率并減少了保存或擴增過程中副產(chǎn)物或不需要的人為構造的生成。
干燥試劑混合物的步驟使室溫保存的制劑穩(wěn)定，并使試劑降解減少到最小。如此被穩(wěn)定的試劑混合物可通過加入合適的含有所需鎂離子的剩余部分和將被擴增的目標物而用于核酸擴增中。
通過使用蠟層或油脂層將已干燥的試劑混合物與空氣隔絕的附加步驟使所述方法可任選地得以改進。當已干燥的試劑通過加入溶劑而復原時，加入目標材料和剩余部分的鎂離子(其最初通過蠟層或油脂層與干燥試劑保持隔離)。這確保了直到蠟或油脂的開始熔化(由于加熱反應混合物的結(jié)果)，沒有發(fā)生目標材料或鎂離子與聚合酶的混合。這進一步使導致副反應或不需要的人為構造的錯誤引發(fā)反應減少到最小。如果熔化后蠟或油脂具有比水小的密度，其將在反應混合物上面形成頂層。這具有防止熱循環(huán)過程中溶劑蒸發(fā)的額外益處，這是非常重要的，原因在于通常以非常小的量進行這些反應。另外，在擴增反應完成后，隨著冷卻，蠟/油脂將在反應混合物頂部固化。這密封了試劑和已擴增的目標物使得可安全地進行處理而不用擔心已擴增的目標物污染使用者或進一步反應。
本發(fā)明方法具有多個優(yōu)點，包括它提供了改進的使適合在核酸擴增反應中使用的試劑穩(wěn)定的方法。它使得預先混合的試劑得到充分的穩(wěn)定而使得可以在室溫下在非實驗室環(huán)境中保存一段時間，理想地為在25℃保存至少3個月。另外，所述穩(wěn)定方法使擴增前或擴增過程中的反應人為構造的生成減少到最小，因此提高了擴增效率和目標材料的檢測。這在目標材料以低濃度得到時或具有低拷貝數(shù)時是非常有用的。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明方法穩(wěn)定的試劑以及還涉及含有根據(jù)本發(fā)明穩(wěn)定的試劑的反應容器。根據(jù)本發(fā)明使所述溶劑穩(wěn)定并將其直接導入適用于直接用在核酸擴增反應中的反應容器具有的優(yōu)勢在于所述試劑不需要在使用前轉(zhuǎn)移到反應容器中。在非實驗室環(huán)境中，這去掉了需要稱量所需量試劑的要求，因此簡化了過程。同時也降低了試劑或反應容器在使用過程中受污染的可能性。
本發(fā)明也涉及一種用于使適合在核酸擴增反應中使用的試劑穩(wěn)定的方法，該方法包括(i)制備含有適合在核酸擴增反應中使用的試劑的試劑混合物，其中所述混合物含有多核苷酸聚合酶；(ii)干燥所述試劑；和(iii)用蠟層或油脂層覆蓋已干燥的試劑；其特征在于，所述試劑混合物含有不足以激活擴增反應的鎂離子。
該方法具有多個優(yōu)點，包括它提供了改進的使適合在核酸擴增反應中使用的試劑穩(wěn)定的方法。它使得預先混合的試劑得到充分的穩(wěn)定而使得可以在室溫下在非實驗室環(huán)境中保存一段時間，理想地為在25℃保存至少3個月。在已干燥的試劑上覆蓋蠟或油脂的增加步驟使得在試劑保存過程中可發(fā)生的試劑的任何再水化減少到最小。如果將試劑保存在潮濕或濕潤的環(huán)境中這將特別有用。另外通過確保反應混合物含有不足以激活擴增反應的鎂離子，因此確保了多核苷酸聚合酶的最小活性，擴增前或擴增過程中反應混合物中的人為構造的生成減少到最小，因此提高了擴增效率和改善了目標材料的后續(xù)檢測。本發(fā)明還涉及如此得以穩(wěn)定的試劑和包含如此得以穩(wěn)定的試劑的適合在核酸擴增反應中使用的反應容器。
本發(fā)明的目的是開發(fā)一種使適合在核酸擴增反應中使用的試劑在室溫得以穩(wěn)定保存的方法。該方法應當將擴增反應前或擴增反應過程中可能發(fā)生的副反應減少到最小，因此減少不需要的人為構造以及提高擴增反應的效率。本方法進而進一步地應當使在干燥過程中反應組分間的不利相互作用減少到最小，因此進一步使不需要的人為構造的生成減少到最小。本發(fā)明的另一個目的在于開發(fā)如此得以穩(wěn)定的試劑和含有如此得以穩(wěn)定的試劑的反應容器。根據(jù)以下公開內(nèi)容，本發(fā)明的這些和其它目的將會變得顯而易見。


圖1顯示當擴增反應進行時熒光隨著循環(huán)數(shù)增加。
圖2顯示每個不同試樣擴增后形成的產(chǎn)物的解鏈峰。
圖3顯示了在基于探針的試樣擴增后形成的產(chǎn)物的解鏈峰，其中試劑已在缺少氯化鎂的情況下保存。
圖4顯示了染料結(jié)合試樣擴增后形成的產(chǎn)物的解鏈峰，其中試劑已在300μM氯化鎂存在的情況下保存。
圖5顯示了染料結(jié)合試樣擴增后形成的產(chǎn)物的解鏈峰，其中試劑已在3mM氯化鎂存在的情況下保存。
圖6顯示了在基于探針的試樣擴增后形成的產(chǎn)物的解鏈峰，其中試劑已在缺少氯化鎂的情況下保存。
圖7顯示了在基于探針的試樣擴增后形成的產(chǎn)物的解鏈峰，其中試劑已在300μM氯化鎂存在的情況下保存。
具體實施例方式
根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及一種現(xiàn)已開發(fā)的用于使適合在核酸擴增反應中使用的試劑穩(wěn)定的方法，該方法包括(i)制備含有適合在核酸擴增反應中使用的試劑的試劑混合物，其中所述混合物含有多核苷酸聚合酶；和(ii)干燥所述試劑；其特征在于，所述試劑混合物含有的鎂離子的濃度為激活擴增反應所需的鎂離子終濃度的約0.1％～約50％。
根據(jù)第二方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明被穩(wěn)定的適合在核酸擴增反應中使用的試劑。
根據(jù)第三方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明被穩(wěn)定的試劑的適合在核酸擴增反應中使用的反應容器。
根據(jù)第四方面，本發(fā)明涉及如此得以穩(wěn)定的試劑在核酸擴增反應中的用途。
根據(jù)第五方面，本發(fā)明涉及一種進行核酸擴增反應的方法，該方法包括(i)根據(jù)本發(fā)明制備試劑混合物；(ii)將待擴增的目標材料、進一步加入后足以激活擴增反應的另外的鎂離子以及合適的溶劑加入到所述試劑混合物中；以及(iii)加熱和冷卻如此形成的反應混合物。
根據(jù)第六方面，本發(fā)明涉及一種用于使適合在核酸擴增反應中使用的試劑穩(wěn)定的方法，該方法包括(i)制備含有適合在核酸擴增反應中使用的試劑的試劑混合物，其中所述混合物含有多核苷酸聚合酶；(ii)干燥所述試劑；和(iii)用蠟層或油脂層覆蓋已干燥的試劑；
其特征在于，所述試劑混合物含有不足以激活擴增反應的鎂離子。
說明除非另外指明，否則此處引用的所有出版物特此以參考的方式整體引入。
此處使用的術語“試劑”指任何可以成為在化學或生化反應中，特別在核酸擴增反應中的組分的物質(zhì)，例如酶、肽激素、結(jié)構蛋白、氨基酸、抗體、含有蛋白基的分子、RNA、DNA、核酸、引物、探針、緩沖劑和與核酸結(jié)合的蛋白。試劑也可以是檢測物質(zhì)，包括已連接熒光團的探針、核酸嵌入染料例如DNA結(jié)合染料(例如溴化乙啶、Sybr Gold等)等。
此處使用的術語“鎂離子”指任何如下形式的含有鎂的物質(zhì)，所述形式的含有鎂的物質(zhì)將釋放二價鎂到任何優(yōu)選具有從約6～約9的pH值的水性溶劑中。能釋放鎂離子的可能物質(zhì)包括但不局限于氯化鎂、氫氧化鎂、碳酸鎂和硫酸鎂。
此處使用的術語“核酸反應容器”指在擴增過程中適合盛裝核酸擴增試劑的任何容器并因此不應由抑制所述反應的材料制成。通常所述容器由聚丙烯制造。制造反應容器的材料應當選擇這樣的材料，該材料能夠耐受約20℃～約100℃范圍的溫度并保持基本相同的大小/形狀，以及在受到不超過約4分鐘的時間段的影響時，能夠完成所含物的約40℃的溫度變化。
此處使用的術語“油”指不與水混溶的有機物質(zhì)，在低于約40℃的溫度時為液體并具有比水小的密度。“礦物油”也稱為液體石油或石蠟油，其是任何具有接近0.84g/ml密度的高分子烴類的無色、光學清澈的混合物，可廣泛商購獲得并通常用作核酸擴增反應上的蒸汽屏障。
此處使用的術語“蠟”指任何類別的由在室溫為固體的烴、醇、脂肪酸和酯構成的物質(zhì)。這些物質(zhì)可以是源于植物或動物，并主要含有高級脂肪酸和高級醇的酯、游離脂肪酸和醇和飽和烴。合適的載體蠟應當在某溫度為液體和在更低溫則為固體。另外，合適的蠟在水溶液中不能溶解或溶脹。優(yōu)選為所述載體蠟選自具有高于室溫的熔點的材料。最優(yōu)選的是，所述載體蠟選自具有高于37℃的熔點的材料因此在室溫的正常變動范圍里所述共固化材料保持為固體。當熔化時所述蠟優(yōu)選形成密度比水小的液體。通?？捎玫南灥募兓衔锇ǘ?、二十八烷、棕櫚酸十六烷基酯和季戊四醇、四山崳酸酯。典型的蠟混合物包括但不局限于石蠟、paraplast、ultraflex和Besquare 175、Ampliwax(Perkin Elmer Cetus)和Polyfin(Polysciences)。可通過以大體上保持蠟的特征的任何比例將純蠟或混合蠟彼此混合或者將純蠟或混合蠟與油脂或油混合來制備蠟。這些技術對于本領域技術人員來說是熟知的。
此處使用的術語“油脂”指任何有機物質(zhì)，其在低于約40℃的溫度時為固體或半固體但非常柔軟，并在約40℃～約80℃的范圍里熔化而形成密度比水低的液體。典型的油脂是白石油，其為一種高分子量烴的混合物。
此處使用的是術語“表面活性劑”指能減少水或水溶液與諸如聚烯烴塑料、油、油脂和蠟等疏水固體或液體間界面張力的物質(zhì)。表面活性劑結(jié)構上包括共價連接的親水和疏水部分?！胺请x子表面活性劑”不含有帶正電的部分或帶負電的部分。典型的非離子表面活性劑包括如下結(jié)構同系物族司盤、吐溫、芐澤(Brij)、賣澤(Myrj)和曲通。
脫水和凍干的生物和化學試劑可根據(jù)在如下資料等中描述的方法制備在Develop.Biol.Standard 3619-27，1977(S.Karger，Basel)中的1976年Washington DC的關于生物產(chǎn)品凍干的國際論壇中的L.R.Rey“Glimpses into the Fundamental Aspects of Freeze Drying”。作為另外一種選擇，例如由US 5,250,429和US 5,098,893所描述，所述材料可以保存在由多糖制成的“玻璃”中。在兩種情況中，通常加入水或水溶液以再水化所述被穩(wěn)定的試劑。
本發(fā)明涉及一種現(xiàn)已開發(fā)的用于使適合在核酸擴增反應中使用的試劑穩(wěn)定的方法，該方法包括(i)制備含有適合在核酸擴增反應中使用的試劑的試劑混合物，其中所述混合物含有多核苷酸聚合酶；和
(ii)干燥所述試劑；其特征在于，所述試劑混合物含有的鎂離子的濃度為激活擴增反應所需的鎂離子終濃度的約0.1％～約50％。
通?；旌虾笥迷诤怂釘U增反應中的試劑包括選自如下的試劑在約1×10-5M～約1×10-3M濃度范圍里的所有四種核苷三磷酸化合物(例如對于DNA聚合酶，四種常見dNTP為dATP、dGTP、dTTP、dCTP)；適當物質(zhì)形式的鎂離子，通常為MgCl2，通常濃度為約1mM～5mM；多核苷酸聚合酶，優(yōu)選為熱穩(wěn)定聚合酶，更優(yōu)選為熱穩(wěn)定DNA聚合酶、最優(yōu)選為來自棲熱水生菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶I(Taq聚合酶，如US 4,889,818所描述)，通常濃度為約1×10-10M～約1×10-8M；以及單鏈寡核苷酸引物，通常以約1×10-7M～約1×10-5M的濃度存在，該引物含有與目標核酸序列兩條鏈上的序列互補的堿基序列。所述引物通常通過核酸化學領域里廣泛已知的固相法合成。
當將待擴增的目標核酸加入到含有上述試劑的溶液中時發(fā)生核酸擴增反應。所述混合物隨后被循環(huán)加熱，在加熱過程中可發(fā)生擴增。所述擴增反應通常在約5μl～200μl的溶劑中進行，所述溶劑優(yōu)選為緩沖到具有在約6～約9的pH值范圍的水溶液。
可任選的是，所述擴增反應混合物也可含有標記的寡核苷酸探針；牛血清白蛋白；內(nèi)部對照核酸和它們的混合物，所述標記的寡核苷酸探針可以可任選地使用染料進行標記，所述染料包括熒光染料；可任選具有熒光的并包括DNA結(jié)合熒光染料(諸如溴化乙錠、SYBR Gold等)的核酸嵌合染料。
在本發(fā)明中，將所需試劑混合在一起。優(yōu)選所述試劑為核酸擴增反應必需的試劑，更優(yōu)選所述試劑含有熱穩(wěn)定聚合酶和甚至更優(yōu)選不含有欲在反應過程中被擴增的目標核酸。為在混合過程中使試劑間反應減少到最小，優(yōu)選在低于約15℃的溫度，更優(yōu)選在低于約10℃的溫度和最優(yōu)選在低于約5℃溫度將試劑混合。
在試劑已混合在一起后，它們經(jīng)干燥移除任何溶劑，所述試劑通常為水性溶劑。溶劑的移除提供了穩(wěn)定化過程的第一方面使得試劑以該形式在室溫下保存一段時間。試劑混合物可通過本領域已知的任何方法干燥。優(yōu)選選擇能防止試劑混合物中發(fā)生副反應或使所述副反應減少到最小的方法，且因此理想為其中不包括將試劑混合物加熱到高溫。所述試劑混合物優(yōu)選使用凍干(freeze drying)法干燥，或者作為另外一種選擇，使用空氣干燥法，例如對于本領域技術人員已知的冷凍干燥(lyophilisation)法。當進行所述的干燥方法時，可任選地向試劑混合物中加入例如海藻糖等糖類以穩(wěn)定蛋白質(zhì)組分。
所述試劑混合物含有的鎂離子的濃度為激活擴增反應所需的鎂離子終濃度的約0.1％～約50％，優(yōu)選為約3％～約30％，并更優(yōu)選為約5％～約15％。所選擇的鎂離子水平可任選地為激活多核苷酸聚合酶所需的鎂離子終濃度的約0.1％～約50％，優(yōu)選為約3％～約30％，并更優(yōu)選為約5％～約15％。
鎂離子被認為在擴增反應中具有多個關鍵作用。其中包括激活多核苷酸聚合酶，與寡核苷酸相互作用，與dNTP絡合和緩沖反應混合物。因此鎂離子的可利用性受許多本領域技術人員熟知的許多因素的影響，所述因素包括所用的dNTP的濃度，所用的寡核苷酸的濃度等。鎂離子的可利用性也受其他因素影響，這些因素包括制造反應容器所用的材料。然而，如果不能獲得足夠的鎂離子，擴增反應將不會進行。因此必需優(yōu)化最終擴增反應混合物以確定所需鎂的量從而使擴增得以進行。這可由本領域普通技術人員容易地進行操作。所述優(yōu)化將包括對激活多核苷酸聚合酶所需的鎂水平進行測定。
重要的是當在添加目標物之前開始制備混合物時，鎂離子水平不足以激活擴增反應或者多核苷酸聚合物酶使得能防止錯誤引發(fā)事件。然而，目前已顯示含有一些鎂可進一步使當所述試劑混合物隨后復原而用在核酸擴增反應中時不需要的人為構造的生成減少到最小。不希望受理論束縛，據(jù)信這是因為在試劑混合物中含有少量鎂能在凍干過程中使反應組分間的不利相互作用減少到最小。可認為結(jié)果是寡核苷酸引物/探針和酶之間非常接近的相互作用的形成減少到最小。這帶來的結(jié)果是在隨后擴增過程中觀察到不希望的人為構造的減少?？偠灾?，在干燥前含有少量鎂具有進一步穩(wěn)定制劑的作用并使其優(yōu)化以便進一步用在擴增反應中。
根據(jù)特定的多核苷酸聚合酶，所述試劑混合物可含有約0.1mM～約10mM、約0.5mM～約5mM或約1mM～約2.5mM濃度的鎂離子。然而，優(yōu)選為所述試劑混合物含有低于500μM濃度的鎂離子。具體地說，特別是當使用Taq聚合酶時，鎂離子濃度范圍可以在10μM～300μM，并優(yōu)選在10μM～100μM。
術語“激活擴增反應”意思是當使用給定水平的鎂離子，利用標準擴增熱循環(huán)條件進行擴增反應時檢測到擴增產(chǎn)物。所述產(chǎn)物可以是或者可以不是所希望的目標材料的擴增物。作為另外一種選擇，它們可涉及反應混合物的其他組分的擴增物，例如寡核苷酸引物等的不需要的擴增物。所述擴增產(chǎn)物可通過本領域技術人員已知的大量適當方法中的任一種進行檢測。當擴增反應沒有被激活時，觀察到僅為最低水平的擴增產(chǎn)物，和優(yōu)選為沒有觀察到擴增產(chǎn)物。標準擴增熱循環(huán)條件和檢測條件根據(jù)進行的擴增反應的類型而變化但對于本領域技術人員來說將是熟知的。如果使用熒光檢測擴增產(chǎn)物，則當擴增反應沒有被激活時，將檢測到僅為最低水平的擴增產(chǎn)物的熒光指示，或優(yōu)選為沒有檢測到擴增產(chǎn)物的熒光指示。
術語“激活多核苷酸聚合酶”意思是當使用選定的鎂水平，利用標準擴增熱循環(huán)條件完成擴增反應時檢測到擴增產(chǎn)物。所述擴增產(chǎn)物可通過本領域技術人員已知的大量適當方法中的任一種進行檢測。當多核苷酸聚合酶沒有活性時，觀察到僅為最低水平的擴增產(chǎn)物，和優(yōu)選為沒有觀察到擴增產(chǎn)物。標準擴增熱循環(huán)條件和檢測條件根據(jù)進行的擴增反應的類型而變化但對于本領域技術人員來說將是熟知的。如果使用熒光檢測擴增產(chǎn)物，則當多核苷酸聚合酶沒有活性時，檢測到僅為最低水平的擴增產(chǎn)物的熒光指示，或優(yōu)選為沒有檢測到擴增產(chǎn)物的熒光指示。
可任選的是，本發(fā)明的方法可包括用蠟層或油脂層覆蓋已干燥的試劑的附加步驟。如果試劑保存在容器中，這指在容器里在干燥試劑上提供密封層。作為另外一種選擇，這指將已干燥試劑封裝在由蠟或油脂制造的小囊里。所使用的蠟或油脂的量優(yōu)選為足以形成已干燥的試劑混合物和空氣之間的屏障。該屏障進一步提高所述干燥試劑混合物的穩(wěn)定性，因此延長了所述干燥試劑在室溫條件下的保存期?？扇绱酥苽渌鰧邮沟孟灮蛴椭c試劑接觸。作為另外一種選擇，可如此制備所述層使得蠟或油脂在干燥試劑保存其中的容器里形成塞子。其他合適的應用蠟層或油脂層的方式也可由本領域技術人員確定，例如形成其中保存所述干燥試劑的小囊等。
可使用任何在本領域里已知的蠟、油脂或油或它們的混合物。優(yōu)選為蠟、油脂或油在室溫是固體或粘性的，因此形成保護層而將試劑與空氣隔開并且即使在運輸過程中也不從任何容器中漏出。最優(yōu)選為使用蠟，因為蠟能最有效地形成屏障。優(yōu)選為所述材料在約40℃～約90℃的范圍里熔化。優(yōu)選為當熔化時，所述材料具有比水小的密度而使得當用水性溶劑使干燥試劑復原時所述材料浮在反應混合物的頂部。
可任選的是所述蠟或油脂可含有表面活性劑，該表面活性劑減少所述蠟或油脂與水之間的彎月面的深度因此減少在擴增過程中完全覆蓋溶液化的反應混合物所需要的蠟或油脂的質(zhì)量。
如果必需，所述蠟層或油脂層可通過在其中摻入聚合物顆?；蛳鄬毜乃芰暇W(wǎng)而變薄。合適的塑料的實例包括但不局限于聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚酯、尼龍和各種碳氟化合物。優(yōu)選為選擇的任何塑料不能結(jié)合用于擴增反應的試劑，尤其是核酸序列。合適的聚合物顆粒的實例包括但不局限于聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯。它們可以是球形或不規(guī)則形狀。優(yōu)選非多孔性材料，因為它們提供更小的俘獲試劑的表面積。優(yōu)選為所述顆粒具有比水小或者非常接近水的密度使得它們在熔化為油時可能在水性層上形成層。在油脂或蠟中的聚合物顆粒的濃度可有相當大的變化范圍并可為本領域技術人員已知的混合物的多種功能性性質(zhì)中的任何一種進行優(yōu)化。
優(yōu)選為所述試劑放置在容器中，在其中它們將盡可能快地被干燥，優(yōu)選為所述試劑直接在它們將在其中被干燥的容器中混合。另外，優(yōu)選為所述試劑直接在它們將在其中最終用于反應的容器中干燥，所述容器例如核酸擴增反應容器。這將使試劑由于被轉(zhuǎn)移到反應容器中而在使用前被污染的機會減少到最小。另外，這意味著所需量的試劑可直接稱量裝入反應容器中因此簡化了在現(xiàn)場對容器的使用。
根據(jù)又一個方面，本發(fā)明涉及已根據(jù)本發(fā)明的方法被穩(wěn)定的試劑，特別是適用于核酸擴增反應的試劑。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種反應容器，尤其是適用于進行核酸擴增反應的容器，該容器包含根據(jù)本發(fā)明的方法已被穩(wěn)定的試劑。
本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明被穩(wěn)定的試劑用于進行核酸擴增反應的用途。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種進行核酸擴增反應的方法，該方法包括(i)根據(jù)本發(fā)明制備試劑混合物；(ii)將待擴增的目標材料、進一步加入后足以激活擴增反應的另外的鎂離子以及合適的溶劑加入到所述試劑混合物中；以及(iii)加熱和冷卻如此形成的反應混合物。
所述擴增反應優(yōu)選是聚合酶鏈式反應，并更優(yōu)選為實時聚合酶鏈式反應。本領域技術人員可根據(jù)實際使用的擴增反應確定必需的試劑。最優(yōu)選的核酸擴增反應是基于探針的實時PCR反應。
目標核酸可任選以水溶液加入到試劑混合物中，優(yōu)選以進行擴增反應所需的溶液體積加入。作為另外一種選擇，鎂離子也可以水溶液加入，優(yōu)選以進行擴增反應所需的溶液體積加入。優(yōu)選所述目標核酸和鎂離子在加到試劑混合物之前混合。如果目標材料和鎂離子都不是以溶液加入，或者對于發(fā)生擴增反應而言以不足的溶液體積加入，可能需要加入更多溶劑(優(yōu)選為水)，以使試劑以所期望的濃度進行反應。
可任選的是，在目標材料已經(jīng)作為樣品(例如臨床樣品或者環(huán)境樣品)采集后，可能需要純化或其它方式制備目標材料。這樣的制備或者純化可采用本領域里任何已知方式進行。這些步驟可包括將目標物濃縮在合適用于進行擴增反應的小量溶劑中。
在將溶劑加到試劑混合物中后，干燥的試劑將復原使得每一種必需的試劑都存在于溶劑中，并且以所需和優(yōu)化的濃度存在以使得擴增得以進行。
必須向反應混合物中加入額外的鎂離子以使可獲得足以激活擴增反應(包括激活多核苷酸聚合酶)的鎂離子。另外，鎂離子也可在緩沖反應溶液中發(fā)揮作用。鎂離子可通過任何合適的方式加入。優(yōu)選為目標物在添加到干燥試劑前溶解在已制備好的鎂溶液中。這是理想的，因為作為無機物，鎂鹽不需要為防止微生物污染而采用特殊措施來制備或者保存。作為另外一種選擇，如果目標材料是將從柱子上洗脫，則柱子被設計為同時洗脫鎂離子。作為另外一種選擇，如果當穩(wěn)定所述干燥試劑混合物時使用蠟層或油脂層，則鎂化合物可能包含于該蠟層或油脂層中。例如鎂的脂肪酸鹽可能溶在油/蠟/油脂中并當油/蠟/油脂接觸熱水時可萃取進入水中，因此鎂可保存在油/蠟/油脂層中。這意味著當加熱反應混合物時，油/蠟/油脂熔化并浮在含有目標物的水溶液頂部，存在的任何鎂將被釋放進入反應混合物。
根據(jù)又一個方面，本發(fā)明涉及一種用于使適合在核酸擴增反應中使用的試劑穩(wěn)定的方法，該方法包括(i)制備含有適合在核酸擴增反應中使用的試劑的試劑混合物，其中所述混合物含有多核苷酸聚合酶；(ii)干燥所述試劑；和(iii)用蠟層或油脂層覆蓋已干燥的試劑；其特征在于，所述試劑混合物含有不足以激活擴增反應的鎂離子。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點，即提供一種使試劑(尤其是適合在核酸擴增反應中使用的試劑)的混合物穩(wěn)定的改進方法，同時使得試劑混合物含有多種不同水平的鎂離子，包括非常低水平的鎂離子或者作為另外一種選擇，不含有鎂離子。
本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明已被穩(wěn)定的適合在核酸擴增反應中使用的試劑；包含根據(jù)本發(fā)明已被穩(wěn)定的適合在核酸擴增反應中使用的試劑的反應容器以及還涉及進行核酸擴增反應的方法，所述進行核酸擴增反應的方法包括獲得根據(jù)本發(fā)明的方法被穩(wěn)定的試劑，將目標核酸和足夠的鎂離子加入到所述試劑中，并加熱試劑混合物。
實施例下列實施例進一步描述本發(fā)明范圍內(nèi)的優(yōu)選實施方式。由于在不偏離本發(fā)明的精神或范圍內(nèi)本發(fā)明的許多變化都是可能的，所以給出這些實施例僅僅是為了描述的目的而不是解釋為限制本發(fā)明。
實施例1使用不同濃度的鎂離子進行實時PCR反應以確定能加到PCR試劑混合物中而不刺激熱穩(wěn)定聚合酶活性的鎂水平，其中鎂離子以氯化鎂形式提供。
將下列PCR試劑混合以制備“2×主混合物”，當用蒸餾水稀釋到工作濃度時其含有如下成分50mM TRIZMA pH8.8、200μM dNTP(包括dUTP)、250ng/μL BSA、8％(v/v)甘油、0.02 U/μL尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)、0.04 U/μLTaq聚合酶、0.03μM TaqStart抗體。
向上述混合物中加入各種不同濃度的氯化鎂(0mM；0.3mM；0.6mM；1mM；3mM)。另外也加入寡核苷酸引物(1μM終濃度)和Sybr Gold染料(儲存液以1∶20000稀釋)。向半數(shù)試樣中加入目標DNA到濃度為約1×104拷貝/μL每個試樣(t)。其余試樣在沒有目標DNA材料存在的情況下進行試驗(ntc)。這使得可清晰鑒定不需要的人為構造。使所有情況下最終試樣體積達到20μL。每個試驗重復進行兩次。
在Roche LightCycler中的玻璃毛細管容器中進行擴增，并貫穿每一次擴增，在F1通道中采集熒光數(shù)據(jù)。在所有試驗中采用如下熱循環(huán)條件50℃保持60s；95℃保持60s；95℃保持5s；60℃保持5s；74℃保持5s。在95℃加熱5s；60℃加熱5s；74℃加熱5s，然后重復50個循環(huán)。在第50個循環(huán)結(jié)束時，將PCR反應混合物從50℃加熱到95℃以生成產(chǎn)物的解鏈峰。
圖1顯示當擴增反應進行時熒光隨著循環(huán)數(shù)增加。
圖2顯示每個不同試樣擴增后形成的產(chǎn)物的解鏈峰。
圖1中所示的結(jié)果證明，當氯化鎂濃度范圍為0mM～1mM時，熒光沒有隨時間而增加，指示TAQ聚合酶沒有活性。然而，當反應在3mM氯化鎂濃度進行重復時，有熒光的增加，指示TAQ聚合酶是有活性的并正在形成擴增產(chǎn)物。即使在具有3mM氯化鎂而沒有目標DNA時進行的試驗中也觀察到熒光的增加。這是由引物引物相互作用和擴增生成的不需要的人為構造和副產(chǎn)品的結(jié)果。
圖2中顯示的結(jié)果提供了由所進行的擴增反應所形成的產(chǎn)物的解鏈峰分析。如預期所料，對于含有少于3mM氯化鎂濃度的試樣，沒有形成擴增產(chǎn)物因而沒有觀察到峰。在3mM氯化鎂時含有目標DNA的試樣在約83℃處顯示出清晰峰。該峰指示了通過對目標物進行擴增獲得了擴增產(chǎn)物。
然而這些結(jié)果也指示出，當沒有加入目標DNA時進行的試驗也形成了非特異性人為構造。這些通過具有相對于目標產(chǎn)物較高和較低熔點的寬峰得以證明。然而這些非特異性人為構造的存在進一步證明了聚合酶在氯化鎂濃度為3mM時的活性。
總體而言，這些結(jié)果證明了濃度低于PCR試驗所需的最適值的MgCl2可加入到液體制劑中而所得PCR將不能生成任何特異性或非特異性產(chǎn)物。這進一步支持了即使在保存前制備混合物過程中將較少量的鎂加入到所述試劑混合物中，也不大可能發(fā)生任何不需要的擴增，因為聚合酶沒有被充分激活。
實施例2使用經(jīng)制備含有不同濃度鎂離子、經(jīng)凍干并隨后保存的試劑進行了實時PCR反應。進行這些試驗以比較所制備的凍干試劑對核酸擴增反應的影響，所述凍干試劑不含有鎂或者作為另外一種選擇含有所選擇的低水平的鎂使得聚合酶不具有活性。
PCR試劑的液體制劑同前文制備，當復原成1×工作濃度時含有如下成分50mM TRIZMA pH8.8、200μM dNTP(包括dUTP)、250ng/μLBSA、0.02U/μL尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)、0.04U/μL Taq聚合酶、0.03μMTaqStart抗體和10％w/v海藻糖。
對這些儲存PCR試劑混合物進行如下修改使得它們能用于兩種不同類型的實時PCR擴增和檢測反應(i)染料結(jié)合試驗，其中試劑混合物額外包含寡核苷酸引物(1μM終濃度)和Sybr Gold(儲存液以1∶20000稀釋)，含有或不含有添加至濃度為300μM或3mM的MgCl2；或者(ii)基于探針的試驗，如在WO 99/28500中所公開的基于探針的試驗，其中反應混合物額外包含寡核苷酸引物(1μM終濃度)和Sybr Gold(儲存液以1∶20000稀釋)和Cy5.5標記的寡核苷酸探針，含有或不含有濃度為300μM的MgCl2。
隨后將所有試驗制劑按照如下熱處理方法凍干在聚丙烯PCR試管中(位于設置為-60℃和600mTorr的冷凝器中)(i)將樣品在-50℃保持2分鐘；(ii)將樣品在-50℃斜置超過58分鐘；(iii)將樣品在-50℃保持120分鐘；所述樣品然后經(jīng)如下主要干燥步驟(i)將樣品在-50℃、200mTorr保持360分鐘；(ii)將樣品在-20℃、200mTorr斜置超過60分鐘；(iii)將樣品在-20℃、100mTorr保持300分鐘；(iv)將樣品在20℃、50mTorr斜置超過80分鐘；(v)將樣品在20℃、50mTorr斜置超過400分鐘；(vi)將樣品在20℃、20mTorr保持360分鐘。
隨后將樣品保存在25℃直到需要使用。
含有干燥試劑的試管隨后通過加入凈化水而復原以使得試驗得以進行。在一半試管中加入復原的含有濃度為1×104拷貝/μL的目標DNA的混合物。在另外一半試管中沒有加入DNA。在那些凍干前已加入300μM濃度的鎂的試管中再加入2.7mM的MgCl2。在那些凍干前不含有鎂的試管中加入3mM的MgCl2。在所有情況下，含有或不含有目標DNA的試劑混合物的最終復原體積為20μL。準備了足夠的材料使得每個試驗可重復兩次。
每一個試樣隨后經(jīng)過如實施例1描述的擴增反應。在第50個循環(huán)結(jié)束時，將PCR反應混合物從50℃加熱到95℃以生成產(chǎn)物的解鏈峰。
圖3顯示了在基于探針的試樣擴增后形成的產(chǎn)物的解鏈峰，其中試劑已在缺少氯化鎂的情況下保存。
圖4顯示了染料結(jié)合試樣擴增后形成的產(chǎn)物的解鏈峰，其中試劑已在300μM氯化鎂存在的情況下保存。
圖5顯示了染料結(jié)合試樣擴增后形成的產(chǎn)物的解鏈峰，其中試劑已在3mM氯化鎂存在的情況下保存。
圖6顯示了在基于探針的試樣擴增后形成的產(chǎn)物的解鏈峰，其中試劑已在缺少氯化鎂的情況下保存。
圖7顯示了在基于探針的試樣擴增后形成的產(chǎn)物的解鏈峰，其中試劑已在300μM氯化鎂存在的情況下保存。
圖3中顯示的結(jié)果證明當使用已在缺少氯化鎂的情況下保存的試劑，在目標DNA存在下進行染料結(jié)合試驗時，僅觀察到所期望的擴增產(chǎn)物(在86℃處的峰)。當缺少任何目標DNA時進行相同試驗則得到大量不同的不需要的人為構造，這由73℃～86℃之間的寬峰所指示。
圖4中顯示的結(jié)果證明當使用在低濃度鎂(300μM)存在的情況下保存的試劑，在目標DNA存在下進行染料結(jié)合試驗時，唯一形成的產(chǎn)物是具有85℃處峰的所期望的擴增產(chǎn)物。當缺少任何目標DNA時進行相同試驗則得到少量不需要的人為構造，這由72℃～80℃之間的寬峰所指示。
圖5中顯示的結(jié)果證明當使用已在高濃度鎂(3mM)存在的情況下保存的試劑，在目標DNA存在下進行染料結(jié)合試驗時，再次觀察到具有85℃處峰的所期望的擴增產(chǎn)物。當缺少目標DNA時進行相同試驗則得到不需要的產(chǎn)物，這由72℃～84℃之間的寬峰所指示。
比較圖3、4和5的結(jié)果說明在干燥試劑中的氯化鎂濃度影響在復原的染料結(jié)合試樣中生成的產(chǎn)物質(zhì)量。在所有情況中，當存在過量目標DNA時，無論試劑是如何保存的，擴增反應看上去都干凈地進行。然而，當不存在目標DNA時，對反應的不同影響則非常令人感興趣，因為這很可能指示出如果存在很低濃度的目標材料時反應可如何進行，而這正是通常臨床或環(huán)境樣品所遇到的情況。不希望受理論的束縛，據(jù)信這些結(jié)果可進行如下解釋。當干燥試劑中的鎂濃度為0時，形成不需要的人為構造的大量復雜混合物，所述不需要的人為構造可認為是凍干過程中發(fā)生的引物引物相互作用所導致并在反應復原后作為聚合酶的模板。當干燥試劑中的鎂濃度較低(300μM)時，當進行復原的試驗時所觀察到的不需要的人為構造量顯著減少，指示了不需要的副反應的顯著減少。據(jù)認為這是因為一些鎂的存在使任何引物引物相互作用減少到最小，因此使不需要的聚合酶模板的形成減少到最小。然而，當干燥試劑中的鎂濃度足以提供聚合酶活性(此處3mM)時，不需要的人為構造的水平再次增加，指示了一些副反應(但應當注意不需要的人為構造的量仍保持較低，并且比完全不存在鎂的情況下觀察到的更干凈)。另外，據(jù)認為生成這些人為構造是在試劑本身干燥過程出現(xiàn)的聚合酶活性的結(jié)果?？傮w而言，這些結(jié)果說明為了實現(xiàn)減少不需要的副反應以及不需要的人為構造，理想地為在一些鎂存在的情況下保存所述試劑，但選擇的鎂濃度應當足夠低以致于試劑混合物中存在的聚合酶不具有活性。尤其是當目標物僅僅以很低濃度存在時，這將提高擴增的效率和測試的靈敏度。
圖6和7涉及基于探針的試驗。
圖6顯示的結(jié)果證明了當使用已在缺少鎂的情況下保存的試劑進行基于探針的試驗而不向試樣中加入目標材料時，生成非常大量的不同的不需要的人為構造，這由73℃～90℃間的大而非常寬的峰所指示。作為另外一種選擇，當在存在目標DNA時重復相同試驗，雖然在圖表中沒有觀察到不需要的人為構造，但擴增的效率非常低且僅生成非常少量的擴增目標物，這由85℃處的非常小的峰所指示。
圖7顯示的結(jié)果證明了當使用已在低濃度氯化鎂(300μM)存在的情況下保存的試劑，在目標DNA存在下進行基于探針的試驗時，試驗非常干凈且唯一形成的產(chǎn)物是具有85℃處峰的所期望的擴增產(chǎn)物。當在缺少任何目標DNA的情況下進行相同試驗時則再次觀察到不需要的人為構造，這由74℃～82℃之間的峰所指示。然而，生成的不需要的人為構造的量明顯少于在從不含有氯化鎂的干燥試劑復原的試樣中觀察到的量。
對比圖6和7的結(jié)果，可以看出當使用含鎂試劑，在目標DNA存在下進行試驗時，生成了顯著更多的所需產(chǎn)物。另外，當在缺少目標DNA的情況下進行基于探針的試驗時，相對于在缺少鎂的情況下制備和保存的試劑，使用在含鎂的情況下制備的試劑時生成的不需要的人為構造的量顯著降低。另外，非常重要的是降低了不需要的人為構造的水平使得對于僅僅含有非常低濃度目標材料的樣品(通常是臨床或環(huán)境樣品所遇到的情況)而言，反應效率和靈敏度都得到提高。不希望受理論束縛，據(jù)認為發(fā)生不需要的人為構造的減少是因為低水平的鎂離子的存在起到如下作用使在干燥過程中寡核苷酸間的相互作用減少到最小從而減少或消除了它們在隨后擴增中的相互作用。
對所進行的兩類不同PCR試驗結(jié)果進行比較，可以看出當所使用的試劑是那些使用低濃度鎂制備的試劑時，兩類均積極響應，即生成的不需要的人為構造的量減少。還可以看出對于目標物的擴增，基于探針的試驗也積極響應(所獲得的所需目標物的制備量增加)。這些結(jié)果清楚地證明在存在鎂離子情況下制備和保存試劑不僅提供了一種用于使合適試劑穩(wěn)定的穩(wěn)定方法，而且優(yōu)化了試劑使得擴增反應更加靈敏和更加有效。
權利要求
1.一種使適合在核酸擴增反應中使用的試劑穩(wěn)定的方法，該方法包括(i)制備含有適合在核酸擴增反應中使用的試劑的試劑混合物，其中所述混合物含有多核苷酸聚合酶；和(ii)干燥所述試劑；其特征在于，所述試劑混合物含有的鎂離子的濃度為激活擴增反應所需的鎂離子終濃度的約0.1％～約50％。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述核酸擴增試劑混合物含有選自由寡核苷酸引物、脫氧核糖核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸、寡核苷酸探針、嵌入熒光染料、牛血清白蛋白、內(nèi)部對照核酸和它們的混合物組成的組中的一種或多種試劑。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述核酸擴增試劑混合物含有寡核苷酸引物、脫氧核糖核苷三磷酸和緩沖劑。
4.如權利要求1～3任一項所述的方法，其中用凍干法或者冷凍干燥法干燥所述試劑混合物。
5.如權利要求1～4任一項所述的方法，其中所述試劑混合物含有的鎂離子的濃度為所述鎂離子終濃度的約3％～約30％，并更優(yōu)選為約5％～約15％。
6.如權利要求1～5任一項所述的方法，其中在將所述試劑混合物干燥后附加蠟或油脂覆蓋物。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述蠟或油脂與試劑相接觸。
8.如權利要求6所述的方法，其中所述蠟或油脂在容器里在試劑上方形成塞子。
9.如權利要求6所述的方法，其中所述蠟或油脂具有的熔點范圍為約40℃～約90℃。
10.由根據(jù)權利要求1所述的方法穩(wěn)定的適合在核酸擴增反應中使用的試劑。
11.一種適合在核酸擴增反應中使用的反應容器，該反應容器含有根據(jù)權利要求1所述的方法穩(wěn)定的試劑。
12.根據(jù)權利要求1制備的試劑在核酸擴增反應中的用途。
13.一種進行核酸擴增反應的方法，該方法包括(i)根據(jù)權利要求1制備試劑混合物；(ii)將待擴增的目標材料、進一步加入后足以激活擴增反應的另外的鎂離子以及合適的溶劑加入到所述試劑混合物中；以及(iii)加熱和冷卻如此形成的反應混合物。
14.如權利要求13所述的方法，其中所述目標材料作為水溶液加入。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述另外的鎂離子與目標材料聯(lián)合加入。
16.如權利要求13所述的方法，其中在將所述試劑混合物干燥后，用蠟層或油脂層覆蓋所述已干燥的試劑。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述另外的鎂離子包含在所述蠟層或油脂層中。
18.一種用于使適合在核酸擴增反應中使用的試劑穩(wěn)定的方法，該方法包括(i)制備含有適合在核酸擴增反應中使用的試劑的試劑混合物，其中所述混合物含有多核苷酸聚合酶；(ii)干燥所述試劑；和(iii)用蠟層或油脂層覆蓋所述已干燥的試劑；其特征在于，所述試劑混合物含有不足以激活擴增反應的鎂離子。
全文摘要
本發(fā)明公開了現(xiàn)已開發(fā)的用于使適合在核酸擴增反應中使用的試劑穩(wěn)定的方法，該方法包括(i)制備含有適合在核酸擴增反應中使用的試劑的試劑混合物，其中所述混合物含有多核苷酸聚合酶；和(ii)干燥所述試劑；其特征在于，所述試劑混合物含有的鎂離子濃度為激活擴增反應所需的鎂離子終濃度的約0.1％～約50％。本發(fā)明中還公開了試劑、反應容器、所述試劑在核酸擴增反應中的用途以及使用如此制備的試劑進行擴增反應的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1981055SQ200580022674
公開日2007年6月13日 申請日期2005年7月4日 優(yōu)先權日2004年7月2日
發(fā)明者彼得·約翰·懷特, 馬克·巴舍 申請人:英國國防部