專利名稱：應(yīng)用順式作用核酶對(duì)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，提供了可以產(chǎn)生能夠自我切割以限制轉(zhuǎn)錄物的大小和內(nèi)容的重組DNA構(gòu)建物。因而，本發(fā)明提供了制備這種構(gòu)建物的方法以及應(yīng)用這種構(gòu)建物產(chǎn)生預(yù)定大小的轉(zhuǎn)錄物的方法。本發(fā)明特別有利于限制聚腺苷酸化信號(hào)后的轉(zhuǎn)錄連讀長(zhǎng)度。本發(fā)明可以被用于轉(zhuǎn)錄和/或翻譯任何已知的核苷酸序列。
背景技術(shù)：
由于DNA或RNA質(zhì)粒或載體的環(huán)狀性質(zhì)，以及在質(zhì)粒上通常存在一個(gè)以上包括啟動(dòng)子和待被轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄單位，任何一個(gè)啟動(dòng)子引起的轉(zhuǎn)錄可以潛在地產(chǎn)生比所期望的要長(zhǎng)的多順?lè)醋有攀筊NA。例如，如果啟動(dòng)子下游的核苷酸序列編碼蛋白質(zhì)，則該蛋白質(zhì)的表達(dá)水平會(huì)受到影響。此外，不正確的信息可能充當(dāng)產(chǎn)生可復(fù)制病毒的潛在底物，例如，在反轉(zhuǎn)錄期間通過(guò)基于RNA的重組事件所進(jìn)行的。
因此，利用其中轉(zhuǎn)錄連讀被防止或減弱的質(zhì)粒是有優(yōu)勢(shì)的。
在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，常常產(chǎn)生與轉(zhuǎn)錄連讀有關(guān)的問(wèn)題。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組中已經(jīng)插入了一個(gè)基因或幾個(gè)基因，其中意圖研究所述一個(gè)基因或幾個(gè)基因的影響。通常地，第一基因被表達(dá)，然后在不同的時(shí)間點(diǎn)，第二基因被表達(dá)，其對(duì)第一基因具有影響。為了幫助插入到動(dòng)物的細(xì)胞和基因組中，這些基因被放置在載體中。通常，在載體中，第一基因被放置在第二基因的下游。雖然第一基因中可以具有作為其核苷酸序列的一部分的切割信號(hào)，但是通常地，一旦第一基因被轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶閱讀通過(guò)切割信號(hào)并轉(zhuǎn)錄第二基因。如果發(fā)生了這種連讀轉(zhuǎn)錄，則第一基因和第二基因都可能被轉(zhuǎn)錄，這就阻礙了在不存在第二基因表達(dá)的情況下欲被研究的第一基因的效應(yīng)。
因此，創(chuàng)建其中第一基因和第二基因之間的連讀轉(zhuǎn)錄被防止的質(zhì)粒，將是有優(yōu)勢(shì)的。
最后，在試圖生產(chǎn)大量的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，以便利用這些載體作為研究工具和/或疾病預(yù)防和/或治療工具時(shí)，載體的產(chǎn)量常常低下。這些低下的產(chǎn)量可能歸因于含有包裝所述病毒所需的全部必須核苷酸序列的三種不同載體之間的競(jìng)爭(zhēng)/干擾。應(yīng)用三種不同的載體使反轉(zhuǎn)錄病毒“處于控制中(in check)”，這阻礙了任一載體獲得全部的必須組分，成為可復(fù)制型載體。此外，制備這三種不同的載體通常成本高且費(fèi)時(shí)。
因此，得到僅含有兩個(gè)載體的反轉(zhuǎn)錄病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)是有優(yōu)勢(shì)的，所述系統(tǒng)中的每個(gè)載體都不能成為可復(fù)制載體。此外，雙質(zhì)粒生產(chǎn)降低了質(zhì)粒生產(chǎn)成本，這可能在工業(yè)規(guī)模中是明顯的。為了得到雙載體系統(tǒng)，來(lái)自三個(gè)載體中的兩個(gè)載體的組分將必須合并在一個(gè)載體中。因此，為確保不存在從一組組分向先前隔離在不同載體上的另一組組分的轉(zhuǎn)錄連讀的一種方法是在兩組組分之間插入核酶，因而為實(shí)現(xiàn)所有功能目的，制備含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的單個(gè)質(zhì)粒，其在安全性方面如同兩個(gè)單獨(dú)的質(zhì)粒一樣有效運(yùn)轉(zhuǎn)，同時(shí)維持雙質(zhì)粒生產(chǎn)系統(tǒng)的成本優(yōu)勢(shì)和效率優(yōu)勢(shì)。因而，雙質(zhì)粒系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致反轉(zhuǎn)錄載體的產(chǎn)量較高，并例如降低維持三質(zhì)粒系統(tǒng)的總成本。
核酶是具有催化活性的小RNA。取決于核酶的性質(zhì)，這些小RNA的大小范圍是從40個(gè)核苷酸至2600個(gè)核苷酸。核酶是天然發(fā)生的，并被認(rèn)為它是在蛋白質(zhì)形成之前催化化學(xué)反應(yīng)的最早的酶。
存在順式作用核酶和反式作用核酶。順式作用核酶可以對(duì)鄰近、接近或遠(yuǎn)離其位置的目標(biāo)RNA起作用。錘頭型、丁型肝炎病毒(HDV)，發(fā)夾型、Varkud satellite(VS)、I組內(nèi)含子和II組內(nèi)含子是各種類型的順式作用核酶的例子(Doudna，J.and Cech，T.，Nature，418222-228(2002))。
核酶切割是位點(diǎn)特異性的，并且是由目標(biāo)區(qū)域的互補(bǔ)堿基之間的氫鍵介導(dǎo)的。核酶的催化單位通過(guò)促進(jìn)原子置換介導(dǎo)切割，這引起目標(biāo)RNA骨架斷裂。
根據(jù)現(xiàn)有的知識(shí)，在其天然環(huán)境中，核酶反應(yīng)是不可逆的。因此，核酶能夠引起獨(dú)特位置的永久切割。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了制備產(chǎn)生預(yù)定大小的RNA轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄單位的方法，這通過(guò)將編碼順式作用核酶的序列引入所述轉(zhuǎn)錄單位的非編碼區(qū)域?qū)嵤蚨鲛D(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄為RNA分子包括產(chǎn)生核酶。一旦核酶產(chǎn)生，其可以順式發(fā)揮作用，在用于切割的核酶識(shí)別位點(diǎn)切割RNA轉(zhuǎn)錄物，以限制RNA的大小。本發(fā)明因此提供了重組DNA構(gòu)建物，其可以被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生能夠自我切割以限制自身大小的RNA轉(zhuǎn)錄物。這提供了控制轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)容以使得能夠調(diào)節(jié)不期望的效應(yīng)如轉(zhuǎn)錄連讀的能力。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單位是重組DNA構(gòu)建物，其包括調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的序列，如一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子，以及可以在所述啟動(dòng)子的調(diào)控下被轉(zhuǎn)錄的序列?？梢员晦D(zhuǎn)錄的序列可以編碼感興趣的多肽或不編碼任何多肽。轉(zhuǎn)錄單位也可以含有非編碼序列，例如，如3’非翻譯序列、聚腺苷酸化信號(hào)、中止位點(diǎn)(pause site)、強(qiáng)中止位點(diǎn)(strong pause site)、或近端上游(NUE)序列(near upstream sequence)。
雖然本發(fā)明提供了通過(guò)將編碼順式作用核酶的序列引入編碼序列或非編碼序列中而將所述序列插入轉(zhuǎn)錄單位，這可以利用多種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括插入到已經(jīng)可操作地連接到調(diào)節(jié)序列的編碼序列或非編碼序列中，或者在編碼序列或非編碼序列可操作地連接到調(diào)節(jié)序列之前將其插入到編碼序列或非編碼序列中。編碼順式作用核酶的序列僅需要位于轉(zhuǎn)錄單位中調(diào)節(jié)序列的下游或3’端，因而一旦所述單位轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA，就可以產(chǎn)生核酶。編碼順式作用核酶的序列甚至可以位于切割信號(hào)下游，例如，在真核轉(zhuǎn)錄單位情況下存在的聚腺苷酸化信號(hào)的下游。然而，本發(fā)明也包括不含有聚腺苷酸化信號(hào)的原核轉(zhuǎn)錄單位。
本發(fā)明的構(gòu)建物可以被認(rèn)為是重組體，原因是它們不是自然界天然發(fā)生的。優(yōu)選地，編碼順式作用核酶的序列被導(dǎo)入核酶通常不是天然存在的異源編碼序列或非編碼序列中。
因此，本發(fā)明使得能夠應(yīng)用編碼順式作用核酶的序列來(lái)調(diào)節(jié)編碼各種多肽的RNA轉(zhuǎn)錄物的大小。在本發(fā)明的一個(gè)方面，多肽是病毒如慢病毒(lentivirus)或HIV的多肽。在本發(fā)明的另一方面，多肽對(duì)于病毒復(fù)制和/或傳播是必須的，如病毒包膜蛋白。然而，本發(fā)明不受被編碼的多肽的類型所限。事實(shí)上，如果需要，本發(fā)明可以在不編碼任何多肽的轉(zhuǎn)錄單位的情況下實(shí)施。
相似地，本發(fā)明不受所應(yīng)用的順式核酶的來(lái)源、身份或類型的限制。可以應(yīng)用各種這樣的核酶，非限制性例子包括錘頭型、丁型肝炎病毒、發(fā)夾型、Varkud satellite(VS)、I組內(nèi)含子和II組內(nèi)含子。D.B.McKay and J.E.Wedekind，The RNA World 265-286(R.F.Gesteland，T.R.Cech，J.F.Atkins，eds.，CSH Laboratory Press 1999)中描述了順式作用核酶。Burke，J.M.，Biochemical Soc.Trans.，301116-1119(2002)中描述了發(fā)夾型核酶和錘頭型核酶。實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選順式作用核酶是煙草環(huán)斑病毒(sTobRV)衛(wèi)星RNA的順式作用核酶。Haseloff，J.and Gerlach，W.L.，Gene，8243-52(1989)中描述了煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA。
本發(fā)明作為限制從轉(zhuǎn)錄單位產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物的大小的方法特別具有優(yōu)勢(shì)。同樣地，其在功能上與真核轉(zhuǎn)錄單位中的聚腺苷酸化信號(hào)略有相似，原因是如同聚腺苷酸化信號(hào)，核酶引起RNA轉(zhuǎn)錄物的切割，并因而限制其大小。當(dāng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單位處于其中編碼順式作用核酶的序列被轉(zhuǎn)錄的條件下時(shí)，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單位中發(fā)生上述情況。同樣地，可以應(yīng)用本發(fā)明在原核轉(zhuǎn)錄單位中提供類似聚腺苷酸化信號(hào)的切割功能。
在編碼順式作用核酶的序列位于切割信號(hào)，例如聚腺苷酸化信號(hào)的下游時(shí)，聚腺苷酸化信號(hào)指導(dǎo)的切割可能阻止編碼核酶的序列的轉(zhuǎn)錄。但是在這種情況下，可以將編碼順式作用核酶的序列考慮為轉(zhuǎn)錄單位中的第二切割信號(hào)，以便在不發(fā)生聚腺苷酸化信號(hào)指導(dǎo)的切割的情況下確保切割。
在不期望發(fā)生轉(zhuǎn)錄連讀的多順?lè)醋覦NA構(gòu)建物的情況下，限制RNA轉(zhuǎn)錄物大小的能力特別具有優(yōu)勢(shì)。在較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物增加與另一序列發(fā)生重組的可能性的情況下，限制RNA轉(zhuǎn)錄物大小的能力也具有優(yōu)勢(shì)。
在兩個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)錄單位之間存在有編碼核酶的核苷酸序列在防止轉(zhuǎn)錄連讀中將是有用的。此外，在單個(gè)轉(zhuǎn)錄單位末端存在編碼核酶的核苷酸序列也是有優(yōu)勢(shì)的，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)錄單位中存在的切割信號(hào)未完全起作用的情況下，核酶可以起備份(back up)的作用。
用于隔開(kāi)轉(zhuǎn)錄單位的順式作用核酶的一個(gè)益處是，通過(guò)降低產(chǎn)生可復(fù)制病毒的重組的概率來(lái)提高雙質(zhì)粒病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)的安全性。為了產(chǎn)生雙載體系統(tǒng)，來(lái)自三個(gè)載體中的兩個(gè)載體的組分必須合并到一個(gè)載體中。因而，確保不發(fā)生從一組組分到以前分隔在不同載體上的另一組組分的連讀轉(zhuǎn)錄的一個(gè)方法是，在兩組組分之間插入核酶。雙質(zhì)粒系統(tǒng)在載體之間具有較小的干擾，原因是其少了一個(gè)載體，這引起反轉(zhuǎn)錄病毒載體更有效地生產(chǎn)。
與應(yīng)用三質(zhì)粒病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)相比，大規(guī)模的雙質(zhì)粒病毒載體生產(chǎn)花費(fèi)較少并產(chǎn)生更高的載體滴度。因此，將順式作用核酶整合入雙質(zhì)粒病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)可以在生產(chǎn)中表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)。
在三質(zhì)粒病毒載體生產(chǎn)中，含有有效負(fù)載(payload)的載體被放置在一個(gè)質(zhì)粒(載體質(zhì)粒)上、結(jié)構(gòu)基因被放置在第二質(zhì)粒(輔助質(zhì)粒)上，非結(jié)構(gòu)基因被放置在第三質(zhì)粒(另一輔助質(zhì)粒)上?？蛇x地，結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因被放置在第二質(zhì)粒上，包膜基因被放置在第三質(zhì)粒上。在第二質(zhì)粒上并入順式作用核酶，在功能上允許單個(gè)質(zhì)粒合而為一起第二質(zhì)粒和第三質(zhì)粒的作用。因此，例如，通過(guò)將順式作用核酶插入結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因之間，不僅防止了連讀轉(zhuǎn)錄的風(fēng)險(xiǎn)，而且順式作用核酶的并入使得兩個(gè)輔助質(zhì)粒合并進(jìn)單個(gè)輔助質(zhì)粒中。
特別地，順式作用核酶的并入導(dǎo)致被該核酶隔開(kāi)的RNA轉(zhuǎn)錄物迅速切割。這確保從載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的RNA與從含有順式作用核酶的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的RNA之一之間的單個(gè)重組事件不形成可復(fù)制病毒。在反轉(zhuǎn)錄期間可能發(fā)生這樣的重組，此時(shí)聚合酶通常在包封在顆粒中的RNA之間跳躍，產(chǎn)生含有來(lái)自兩個(gè)RNA的基因的互補(bǔ)DNA序列。因此，在雙質(zhì)粒系統(tǒng)中，將順式作用核酶整合入?yún)^(qū)分結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因的單一質(zhì)粒中提供了與三質(zhì)粒系統(tǒng)相同的安全性，并使得在大規(guī)模水平具有滴度更高和生產(chǎn)成本更低的附加益處。
有效負(fù)載可以是，例如，反義分子、RNA誘餌(RNA decoy)、反式顯性突變體、毒素、針對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的單鏈抗體(scAb)、siRNA或核酶。
結(jié)構(gòu)基因可以是，例如，gag、gag-pol前體、pro、反轉(zhuǎn)錄酶(RT)、整合酶(In)或env。非結(jié)構(gòu)基因可以是，例如，tat、rev、nef、vpr、vpu或vif。
順式作用核酶的體內(nèi)治療應(yīng)用使得能夠用輔助質(zhì)粒和載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，以便輔助質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄是可誘導(dǎo)的并引起載體質(zhì)粒的表達(dá)和增殖，而沒(méi)有產(chǎn)生可復(fù)制病毒的高風(fēng)險(xiǎn)。例如，可以用輔助SIN載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，所述SIN載體自身不能復(fù)制，但是當(dāng)受到啟動(dòng)子的特異性活化時(shí)，可以使含有功能性LTRs的可移動(dòng)載體質(zhì)粒增殖。輔助SIN載體可以含有必要的結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因，它們由編碼順式作用核酶的序列分隔開(kāi)。這相對(duì)于應(yīng)用兩個(gè)輔助質(zhì)粒是一個(gè)改進(jìn)，原因有幾個(gè)。首先，應(yīng)用兩個(gè)質(zhì)粒而不是三個(gè)質(zhì)粒時(shí)，用輔助質(zhì)粒和載體的給定的目標(biāo)比率對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)更加容易實(shí)現(xiàn)。第二，如果輔助基因在相同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子之下各自表達(dá)，對(duì)輔助質(zhì)粒表達(dá)的控制更容易調(diào)節(jié)。
抗病毒劑(antiviral)、或抗載體劑(antivector)、反義分子或核酶也可以被保留在載體包裝系統(tǒng)的輔助質(zhì)粒組分上。這可以充當(dāng)用于載體包裝以降低可復(fù)制慢病毒(RCL)潛在產(chǎn)生的安全機(jī)制。抗病毒或抗載體序列將靶向于載體基因組中存在的序列，但是不表達(dá)為能夠阻滯細(xì)胞中的生產(chǎn)性載體包裝的單獨(dú)轉(zhuǎn)錄物?？共《净蚩馆d體序列將預(yù)期阻礙含有輔助質(zhì)粒的拷貝和載體基因組的拷貝的載體顆粒的繁殖，而不是通常見(jiàn)于載體顆粒中的載體基因組RNA雙鏈體。不含有包裝信號(hào)的合適大小核酸序列的非特異性包裝已經(jīng)被描述，并且已知其以低頻率發(fā)生。因此，這種設(shè)計(jì)對(duì)于反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)的安全性具有重要含意。
順式作用核酶也可以幫助產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如小鼠。與上述相似地，可以用順式作用核酶隔開(kāi)在欲導(dǎo)入小鼠的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物。例如，應(yīng)用插入在質(zhì)粒的第一基因末端和轉(zhuǎn)錄第二基因的啟動(dòng)子之間的核酶是有利的。作為非限制性例子，這在被表達(dá)用于研究的基因是顯性失活的感興趣基因時(shí)是有用的。在同一轉(zhuǎn)錄物上表達(dá)的是可以將顯性失活轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)變成功能基因的第二基因。轉(zhuǎn)錄物的有效分隔對(duì)于小鼠表型的成功分析是至關(guān)重要的，因?yàn)槿绻l(fā)生連讀將顯性失活轉(zhuǎn)變成功能基因，那么表型會(huì)被掩蓋。在歷史上，中止位點(diǎn)、強(qiáng)中止位點(diǎn)和聚腺苷酸信號(hào)已被用于實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。然而，如提供的例子的結(jié)果所示地，這些終止信號(hào)以低下的水平不充分地防止連讀發(fā)生。因此，在制備轉(zhuǎn)基因小鼠以確定基因功能時(shí)，在這些位點(diǎn)之外應(yīng)用順式作用核酶，或用順式作用核酶替換這些位點(diǎn)，可以確保獲得更大的成功。
本發(fā)明的一個(gè)方面是制備能夠產(chǎn)生預(yù)定大小RNA轉(zhuǎn)錄物的重組轉(zhuǎn)錄單位的方法，包括可操作地連接調(diào)節(jié)序列和含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述調(diào)節(jié)序列的調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼病毒序列的區(qū)域和位于編碼所述病毒序列的區(qū)域下游的非編碼區(qū)域，其中所述非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
非編碼區(qū)域還可以包括編碼切割信號(hào)的核苷酸序列，其位于編碼順式作用核酶的核苷酸序列的上游。
病毒序列可以是，例如，病毒蛋白。病毒蛋白可以是，例如，由慢病毒編碼的蛋白或病毒包膜蛋白。病毒蛋白可以是，例如，VSV-G、gag、pol、tat或rev，或VSV-G、gag、pol、tat和rev的任何組合。
病毒序列還可以包括編碼抗病毒劑的核苷酸序列，位于編碼病毒蛋白的核苷酸序列的上游或下游。抗病毒劑可以是，例如，反義分子或核酶。
本發(fā)明的另一方面是包括能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的RNA轉(zhuǎn)錄物的重組轉(zhuǎn)錄單位的宿主細(xì)胞，其中的轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的調(diào)節(jié)序列，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述調(diào)節(jié)序列的調(diào)控，其中的轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼病毒序列的區(qū)域和位于編碼所述病毒序列的區(qū)域下游的非編碼區(qū)域，其中所述非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。非編碼區(qū)域還可以包括編碼切割信號(hào)的核苷酸序列，其位于編碼順式作用核酶的核苷酸序列的上游。
本發(fā)明的又一方面是能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的RNA轉(zhuǎn)錄物的重組轉(zhuǎn)錄單位，其包括與核苷酸序列可操作連接的調(diào)節(jié)序列，所述核苷酸序列包括編碼病毒序列的轉(zhuǎn)錄區(qū)域和位于編碼所述病毒序列的區(qū)域下游的非編碼區(qū)域，其中所述非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。非編碼區(qū)域還可以包括編碼切割信號(hào)的核苷酸序列，其位于編碼順式作用核酶的核苷酸序列的上游。
轉(zhuǎn)錄單位中的病毒序列可以是，例如，病毒蛋白。病毒蛋白可以是，例如，由慢病毒編碼的蛋白或病毒包膜蛋白。病毒蛋白可以是，例如，VSV-G、gag、pol、tat或rev，或VSV-G、gag、pol、tat和rev的任何組合。
病毒序列還可以包括編碼抗病毒劑的核苷酸序列，位于編碼病毒蛋白的核苷酸序列的上游或下游?？共《緞┛梢允?，例如，反義分子或核酶。
本發(fā)明的另一方面是限制從轉(zhuǎn)錄單位產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物的大小的方法，所述方法包括誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄，所述轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的調(diào)節(jié)序列，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述調(diào)節(jié)序列的調(diào)控，其中的轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼病毒序列的區(qū)域和位于編碼所述病毒序列的區(qū)域下游的非編碼區(qū)域，其中所述非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列，其中的轉(zhuǎn)錄單位在編碼所述順式作用核酶的序列被轉(zhuǎn)錄并順式切割轉(zhuǎn)錄物的條件下產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物。非編碼區(qū)域還可以包括編碼切割信號(hào)的核苷酸序列，其位于編碼順式作用核酶的核苷酸序列的上游。
本方法的病毒序列可以是，例如，病毒蛋白。病毒蛋白可以是，例如，由慢病毒編碼的蛋白或病毒包膜蛋白。病毒蛋白可以是，例如，VSV-G、gag、pol、tat或rev，或VSV-G、gag、pol、tat和rev的任何組合。
病毒序列還可以包括編碼抗病毒劑的核苷酸序列，位于編碼病毒蛋白的核苷酸序列的上游或下游?？共《緞┛梢允牵?，反義分子或核酶。
本發(fā)明的又一方面是載體，其包括，能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第一RNA轉(zhuǎn)錄物的第一轉(zhuǎn)錄單位，其中第一轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第一啟動(dòng)子的調(diào)控，其中的轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第一基因的區(qū)域和位于編碼所述第一基因的區(qū)域下游的第一非編碼區(qū)域，其中所述第一非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；以及能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第二RNA轉(zhuǎn)錄物的第二轉(zhuǎn)錄單位，其中第二轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第二啟動(dòng)子的調(diào)控，其中的轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第二基因的區(qū)域和位于編碼所述第二基因的區(qū)域下游的第二非編碼區(qū)域，其中所述第二非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。此外，第一基因、第二基因或兩者在它們的羧基端可以有切割信號(hào)。
載體可以具有，例如，第一啟動(dòng)子和第二啟動(dòng)子，其中第一啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，第二啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。載體可以具有，例如，第一基因和第二基因，其中第一基因是顯性失活轉(zhuǎn)基因，第二基因是在其表達(dá)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物可以將所述顯性失活轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)變成功能基因的基因。第一基因例如可以是酶原，第二基因的表達(dá)產(chǎn)物將所述酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿浮＠?，第一基因可以編碼蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)中的至少一個(gè)氨基酸能夠被磷酸化，第二基因可以編碼激酶，所述激酶能夠使蛋白質(zhì)中的氨基酸磷酸化?？蛇x地，第一基因可以編碼第一蛋白質(zhì)，其包括至少一個(gè)磷酸化的氨基酸，第二基因可以編碼蛋白磷酸酶，其能夠使第一蛋白質(zhì)中的氨基酸去磷酸化。
本發(fā)明的又一方面是包括載體的宿主細(xì)胞，所述載體包括能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第一RNA轉(zhuǎn)錄物的第一轉(zhuǎn)錄單位，其中第一轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第一啟動(dòng)子的調(diào)控，其中的轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第一基因的區(qū)域和位于編碼所述第一基因的區(qū)域下游的第一非編碼區(qū)域，其中所述第一非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；以及能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第二RNA轉(zhuǎn)錄物的第二轉(zhuǎn)錄單位，其中第二轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第二啟動(dòng)子的調(diào)控，其中的轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第二基因的區(qū)域和位于編碼所述第二基因的區(qū)域下游的第二非編碼區(qū)域，其中所述第二非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。此外，第一基因、第二基因或兩者的羧基端可以有切割信號(hào)。
本發(fā)明的另一方面是制造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，該方法包括向動(dòng)物的基因組中插入載體，所述載體包括能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第一RNA轉(zhuǎn)錄物的第一轉(zhuǎn)錄單位，其中第一轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第一啟動(dòng)子的調(diào)控，其中的轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第一基因的區(qū)域和位于編碼所述第一基因的區(qū)域下游的第一非編碼區(qū)域，其中所述第一非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；以及能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第二RNA轉(zhuǎn)錄物的第二轉(zhuǎn)錄單位，其中第二轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第二啟動(dòng)子的調(diào)控，其中的轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第二基因的區(qū)域和位于編碼所述第二基因的區(qū)域下游的第二非編碼區(qū)域，其中所述第二非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。此外，第一基因、第二基因或兩者的羧基端可以有切割信號(hào)。
本方法的載體可以，例如，被插入動(dòng)物的生殖細(xì)胞的基因組中，被插入動(dòng)物的未受精卵或受精卵的基因組中，被插入動(dòng)物的胚胎的基因組中，或被插入位于所述動(dòng)物子宮中的細(xì)胞的基因組中。
本發(fā)明的另一方面是包括載體的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，所述載體包括能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第一RNA轉(zhuǎn)錄物的第一轉(zhuǎn)錄單位，其中第一轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第一啟動(dòng)子的調(diào)控，其中的轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第一基因的區(qū)域和位于編碼所述第一基因的區(qū)域下游的第一非編碼區(qū)域，其中所述第一非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；以及能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第二RNA轉(zhuǎn)錄物的第二轉(zhuǎn)錄單位，其中第二轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第二啟動(dòng)子的調(diào)控，其中的轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第二基因的區(qū)域和位于編碼所述第二基因的區(qū)域下游的第二非編碼區(qū)域，其中所述第二非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。此外，第一基因、第二基因或兩者的羧基端可以具有切割信號(hào)。
本發(fā)明的又一方面是雙載體反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，其包括第一載體和第二載體，第一載體包括編碼有效負(fù)載的核苷酸序列和調(diào)控所述有效負(fù)載轉(zhuǎn)錄的第一啟動(dòng)子，第二載體包括編碼結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第二啟動(dòng)子，以及編碼非結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述非結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第三啟動(dòng)子，其中編碼結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和編碼非結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列被編碼順式作用核酶的核苷酸序列隔開(kāi)。
本發(fā)明的另一方面是雙載體反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，包括第一載體和第二載體，其中第一載體包括編碼有效負(fù)載的核苷酸序列和調(diào)控所述有效負(fù)載轉(zhuǎn)錄的第一啟動(dòng)子，第二載體包括編碼結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第二啟動(dòng)子，編碼非結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述非結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第三啟動(dòng)子，以及編碼包膜基因的核苷酸序列和調(diào)控所述包膜基因轉(zhuǎn)錄的第四啟動(dòng)子，其中編碼三種基因的每一核苷酸序列被編碼順式核酶的核苷酸序列隔開(kāi)。
本發(fā)明的又一方面是產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒的方法，該方法包括使細(xì)胞與雙載體反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)接觸，所述系統(tǒng)包括第一載體和第二載體，其中第一載體包括編碼有效負(fù)載的核苷酸序列和調(diào)控所述有效負(fù)載轉(zhuǎn)錄的第一啟動(dòng)子，第二載體包括編碼結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第二啟動(dòng)子，以及編碼非結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述非結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第三啟動(dòng)子，其中編碼結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和編碼非結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列被編碼順式作用核酶的核苷酸序列隔開(kāi)。
本發(fā)明的另一方面是產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒的方法，該方法包括使細(xì)胞與雙載體反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)接觸，所述系統(tǒng)包括第一載體和第二載體，第一載體包括編碼有效負(fù)載的核苷酸序列和調(diào)控所述有效負(fù)載轉(zhuǎn)錄的第一啟動(dòng)子，第二載體包括編碼結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第二啟動(dòng)子，編碼非結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述非結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第三啟動(dòng)子，以及編碼包膜基因的核苷酸序列和調(diào)控所述包膜基因轉(zhuǎn)錄的第四啟動(dòng)子，其中編碼三種基因的每一核苷酸序列被編碼順式核酶的核苷酸序列隔開(kāi)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1針對(duì)兩個(gè)基于HIV載體的包裝質(zhì)粒的示意圖，其中一個(gè)(pVRX577)含有衍生自煙草環(huán)斑病毒衛(wèi)星RNA的核酶，另一個(gè)(pVRX170)不含有該核酶。在質(zhì)粒下放大了插入的核酶的序列，黑色箭頭表示切割位點(diǎn)。在質(zhì)粒中，聚腺苷酸和轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)位于核酶之前。這些位點(diǎn)的含納對(duì)于核酶的活性不是必需的。
圖2(A)示出了含有順式作用核酶的連讀病毒包裝質(zhì)粒(VIRPAC)RNA的示例和核酶功能的體外確認(rèn)。用含有T7啟動(dòng)子的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增不帶有天然順式作用核酶的VIRPAC(-cis-RZ)(圖2A的上圖)和帶有順式作用核酶的VIRPAC(+cis-Rz)(圖2A的下圖)的1300個(gè)堿基區(qū)域。隨后體外轉(zhuǎn)錄得到的DNA。(B)將濃度是約1μg/μl的2μl轉(zhuǎn)錄的RNA加入2μl RT-PCR緩沖液，隨后將2μl(2μg)上樣在凝膠上，使之可視。切割快速發(fā)生，因?yàn)樵谀z上樣之前，在緩沖液中溫育5、10、20和60分鐘之間沒(méi)有觀察到差異(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖3示出了含有順式作用核酶的輔助區(qū)域，和用于測(cè)定轉(zhuǎn)錄連讀的PCR引物A、B和D的位置。該圖下方示出的是證實(shí)用于確定試驗(yàn)敏感度的方案的示意圖。也示出了制備慢病毒載體的過(guò)程。
圖4顯現(xiàn)了獲自陽(yáng)性對(duì)照移取稀釋(spike dilution)系列的反轉(zhuǎn)錄(RT)PCR產(chǎn)物。每μg細(xì)胞RNA、DNA或每個(gè)細(xì)胞被移取的RNA對(duì)照的濃度表示在每一泳道上面。
圖5用于檢測(cè)輔助構(gòu)建物中的轉(zhuǎn)錄連讀的RT-PCR試驗(yàn)。引物對(duì)A/B檢測(cè)沒(méi)有連讀的質(zhì)粒RNA，而引物對(duì)A/D檢測(cè)僅在連讀情況下的質(zhì)粒RNA(參照?qǐng)D3中的示意圖)。此試驗(yàn)的敏感度是每μg細(xì)胞RNA為45個(gè)拷貝，應(yīng)用來(lái)自VRX170的體外轉(zhuǎn)錄的RNA作為陽(yáng)性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)。在所有13次試驗(yàn)中，當(dāng)對(duì)照RNA的45個(gè)移取的拷貝被加入反應(yīng)中時(shí)，檢測(cè)到信息。在13次試驗(yàn)中的8次中，加入15個(gè)拷貝時(shí)檢測(cè)到信息，在1次試驗(yàn)中，加入5個(gè)拷貝時(shí)檢測(cè)到信息。
圖6在含有順式作用核酶的輔助構(gòu)建物(VRX577)中，用RT-PCR檢測(cè)不到轉(zhuǎn)錄連讀。試驗(yàn)完全如上面圖5所示地進(jìn)行。每一試驗(yàn)表示用VRX577和VRX496對(duì)293F細(xì)胞獨(dú)立進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每一反應(yīng)進(jìn)行三次(a、b、c)。反應(yīng)的敏感度是45個(gè)拷貝/μg細(xì)胞RNA。
圖7包含順式作用核酶不影響產(chǎn)生的載體的滴度。通過(guò)在293F細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染載體和輔助質(zhì)粒，用含有(VRX577)和不含有(VRX170)分隔轉(zhuǎn)錄單位的順式作用核酶的輔助質(zhì)粒三次產(chǎn)生基于HIV的慢病毒載體(VRX496)。2-3天后，收集含載體的上清液，在HeLa-tat細(xì)胞上滴定。作為對(duì)照，細(xì)胞僅用載體轉(zhuǎn)染。滴度顯示在左側(cè)，用每ml培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)表示。
實(shí)施本發(fā)明的方式本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的調(diào)節(jié)序列，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述調(diào)節(jié)序列的調(diào)控。所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼病毒序列的區(qū)域和位于編碼所述病毒序列的區(qū)域下游的非編碼區(qū)域，其中所述非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
實(shí)施例1提供了轉(zhuǎn)錄單位的兩個(gè)非限制性例子。轉(zhuǎn)錄單位1包括巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，其含有HIV-1 GagPol和TatRev基因，在牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化(poly-A)信號(hào)末端終止。核酶被放置在載體中緊接聚腺苷酸信號(hào)之后的位置。轉(zhuǎn)錄單位2包括延伸因子(EF)啟動(dòng)子，其含有VSV-G基因，在SV40聚腺苷酸位點(diǎn)末端終止。如果需要，核酶可以被放置在載體中緊接聚腺苷酸位點(diǎn)之后的位置。
可以制備許多類型的轉(zhuǎn)錄單位。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠應(yīng)用公知方法容易地構(gòu)建多種類型的轉(zhuǎn)錄單位?？梢灾苽浒ɡ缛魏螁?dòng)子和任何序列或基因以及任何終止信號(hào)的轉(zhuǎn)錄單位。此外，可以隨后將核酶加入載體中緊接終止信號(hào)之后的位置。如果將要應(yīng)用轉(zhuǎn)錄單位，例如，在細(xì)菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生蛋白質(zhì)，所述單位將包括啟動(dòng)子、基因和順式核酶。
在本發(fā)明轉(zhuǎn)錄單位中可以應(yīng)用任何的肽，只要其活性獨(dú)立于順式核酶的功能即可。
許多核酶的切割位點(diǎn)是本領(lǐng)域公知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地選擇核酶并將其插入本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單位中。
除HIV之外，可以在其它病毒系統(tǒng)中應(yīng)用抑制連讀轉(zhuǎn)錄的能力。特別地，轉(zhuǎn)錄單位使得應(yīng)用三質(zhì)粒的任何載體生產(chǎn)減為雙質(zhì)粒。
病毒顆粒的產(chǎn)生 本發(fā)明的構(gòu)建物和細(xì)胞可以被設(shè)計(jì)為，提供產(chǎn)生含有感興趣的特定病毒核酸的任何病毒顆粒所需的因子。病毒核酸可以是復(fù)制缺陷型的，衍生于沒(méi)有去除或丟失內(nèi)源性“包裝信號(hào)”的天然發(fā)生病毒。此外，病毒核酸可以衍生自HIV-1。HIV-1衍生病毒核酸可以由pNL4-3HIV-1分子克隆產(chǎn)生，其為野生株，可以通過(guò)National Institutes of Health從AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog得到(也參見(jiàn)Adachi，et al，J.Virol.，59，284-291(1986))?？梢詫⒓?xì)胞看作和用作可被單獨(dú)導(dǎo)入細(xì)胞的病毒核酸的“包裝細(xì)胞”，這是因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生將病毒核酸包裝成感染性病毒顆粒所需的所有成分。
當(dāng)病毒核酸提供所有其它成分時(shí)，包裝細(xì)胞可以從感興趣的編碼序列表達(dá)出至少一種病毒包膜蛋白，或其等價(jià)物(如其突變體、融合物或截短形式)或其異源形式。包膜蛋白的例子是由與天然形式的病毒核酸具有內(nèi)源性的序列(即，通常用于包裝所述病毒核酸由之產(chǎn)生的病毒的序列)編碼的蛋白，或由與病毒核酸異源的序列編碼的那些蛋白。在本發(fā)明的本方面的實(shí)踐中，許多包膜蛋白可以被表達(dá)，包括改變包裝的病毒顆粒的目標(biāo)細(xì)胞特異性的蛋白或形成假型病毒顆粒的其它包膜蛋白。與HIV-1衍生病毒核酸一起應(yīng)用的異源包膜蛋白的例子包括VSV G蛋白、Mokola病毒G蛋白和HIV-2包膜蛋白。
可選地，細(xì)胞可以提供至少一種病毒包膜蛋白和用于從待被包裝的病毒核酸表達(dá)包裝成分所需的一種或多于一種的蛋白。非限制性例子是提供了包膜蛋白以及同源tat蛋白，或包裝反轉(zhuǎn)錄病毒核酸所反式需要的一種或多于一種其它蛋白的細(xì)胞(例如，提供了包裝HIV-1衍生載體的VSV G蛋白和HIV-1 tat蛋白的細(xì)胞)。反式需要的其它蛋白的例子包括由gag、pol和rev序列編碼的那些蛋白。
待被包裝的感興趣的病毒核酸可以缺少表達(dá)或編碼一種或多于一種的病毒附屬蛋白序列(例如但不限于Vif、Vpu、Vpr或Nef，或其組合或片段)的能力，所述附屬蛋白序列會(huì)使核酸具有致病性或可能具有致病性。通過(guò)去除相應(yīng)的編碼序列或使其突變以在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平防止其表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。這種蛋白，就它們是包裝所必需這一點(diǎn)上說(shuō)，將通過(guò)本發(fā)明的構(gòu)建物或通過(guò)附加核酸構(gòu)建物由包裝細(xì)胞提供。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生 Brinster，R.L.，et al，Cell，27223(1981)中描述了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的一般過(guò)程。
通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種不同方法，可以容易地產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單細(xì)胞生物、植物和動(dòng)物。這些修飾的生物含有一個(gè)或多個(gè)拷貝的整合入基因組的克隆基因。
可以用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將正常的基因拷貝引入突變體生物，從而鑒定出對(duì)應(yīng)于突變限定基因的克隆DNA。它也用于研究基因表達(dá)所必需的序列、用于開(kāi)發(fā)出顯性形式人類疾病的小鼠模型、用于修飾植物、和用于研究由基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其功能之間的關(guān)系。
外來(lái)基因或改變形式的內(nèi)源基因可以被插入生物。這些技術(shù)可以引起內(nèi)源性基因的置換，或整合內(nèi)源性基因的附加拷貝。這樣導(dǎo)入基因被稱為轉(zhuǎn)基因；攜帶它們的生物被稱為轉(zhuǎn)基因生物。以多種不同的方式，轉(zhuǎn)基因可以被用于研究生物功能和發(fā)育。例如，可以對(duì)通常在發(fā)育期間在特定時(shí)間和位置被表達(dá)的基因進(jìn)行體外遺傳改造，使其在不同時(shí)間、在不同組織中表達(dá)，隨后再導(dǎo)入動(dòng)物中，以評(píng)價(jià)細(xì)胞結(jié)果和生物學(xué)結(jié)果。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生利用體外誘變克降的基因并隨后將它們轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞中的技術(shù)。許多類型的細(xì)胞可以從培養(yǎng)基吸收DNA。例如，可以用酶處理酵母細(xì)胞以去除它們厚的外壁；得到的原生質(zhì)球會(huì)吸收加入到培養(yǎng)基中的DNA。植物細(xì)胞也可以被轉(zhuǎn)變?yōu)閺呐囵B(yǎng)基中吸收DNA的原生質(zhì)球。培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞直接吸收DNA，特別是在通過(guò)用鈣離子處理首先將其轉(zhuǎn)變?yōu)榫?xì)沉淀物時(shí)。將DNA導(dǎo)入酵母、植物和動(dòng)物細(xì)胞的另一流行方法稱作電穿孔。接受幾千伏短暫電擊的細(xì)胞瞬時(shí)變得可透過(guò)DNA。大概是電擊短暫地在細(xì)胞膜上開(kāi)孔，使得DNA在孔重新閉合之前進(jìn)入細(xì)胞。也可以將DNA直接注入培養(yǎng)細(xì)胞和發(fā)育胚胎的細(xì)胞核中。
一旦外來(lái)DNA位于宿主細(xì)胞內(nèi)，通?？赡茉贒NA修復(fù)和重組中起作用的酶將外來(lái)DNA片段與宿主細(xì)胞的染色體連接起來(lái)。由于僅相對(duì)小部分細(xì)胞吸收DNA，必須有可利用選擇技術(shù)來(lái)鑒定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。在大多數(shù)情況下，外源DNA包括編碼選擇性標(biāo)記如藥物抗性標(biāo)記的基因。導(dǎo)入的DNA可以以不表現(xiàn)出位點(diǎn)特異性的高度可變的方式插入宿主基因組，可以通過(guò)同源重組替換內(nèi)源性基因，或者可以保持為稱作附加體的獨(dú)立的染色體外DNA分子。
轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有許多試驗(yàn)用途和潛在的農(nóng)業(yè)價(jià)值和治療價(jià)值。例如，可以用引起腫瘤的基因的顯性作用等位基因產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，從而得到用于研究癌癥的動(dòng)物模型。在果蠅中，轉(zhuǎn)基因通常用于確定DNA的克隆片段是否相應(yīng)于突變所限定的基因。如果克隆的DNA確實(shí)是研究的基因，則將其作為轉(zhuǎn)基因?qū)胪蛔凅w蒼蠅會(huì)使突變體轉(zhuǎn)變?yōu)楸硇驼５膫€(gè)體。在農(nóng)業(yè)中，轉(zhuǎn)基因植物可能具有商業(yè)價(jià)值。例如，植物學(xué)家已經(jīng)開(kāi)發(fā)出轉(zhuǎn)基因番茄，其表現(xiàn)出乙烯的產(chǎn)生減少，乙烯能夠促進(jìn)果實(shí)成熟。這些轉(zhuǎn)基因番茄的成熟過(guò)程被延遲，因而延長(zhǎng)它們的貨架期。最后，在人類遺傳性疾病的基因治療的萌芽領(lǐng)域中，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是至關(guān)重要的組成部分。
外源DNA隨機(jī)整合入小鼠基因組非同源位點(diǎn)的頻率非常高。由于這一現(xiàn)象，轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生是高效的和簡(jiǎn)單的過(guò)程。
制備轉(zhuǎn)基因小鼠的一般過(guò)程如下將含有感興趣基因的外來(lái)DNA注入已受精小鼠卵的兩個(gè)前核(親代提供的雄性單倍體核和雌性單倍體核)中的其中一個(gè)，這在所述前核融合之前實(shí)施。注射的DNA具有被隨機(jī)整合進(jìn)二倍體受精卵染色體的很大的可能性。隨后將注射的卵轉(zhuǎn)移到代孕雌性動(dòng)物，在其中發(fā)生正常的細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。約10-30％的子代會(huì)在所有組織中含有等量的外來(lái)DNA(每個(gè)細(xì)胞多達(dá)100個(gè)拷貝)，包括生殖細(xì)胞。正常繁殖的這些小鼠中的10％-20％即刻繁殖和回交(親代-子代交配)可以產(chǎn)生對(duì)于轉(zhuǎn)基因純合的純轉(zhuǎn)基因品系。
有關(guān)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠研究正常哺乳動(dòng)物生物學(xué)各個(gè)方面的許多研究已被公開(kāi)。這些研究提供了對(duì)疾病過(guò)程更多了解的模型系統(tǒng)。例如，許多形式的癌癥由正常細(xì)胞基因引起，這些基因由于它們錯(cuò)誤調(diào)節(jié)的活性以顯性方式起作用。雖然攜帶這些基因之一、稱作myc的轉(zhuǎn)基因小鼠正常發(fā)育，但腫瘤形成的頻率高。表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞中僅少數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤的現(xiàn)象支持了這一模型，其中附加的遺傳變化對(duì)于腫瘤形成是必需的。這些小鼠為鑒定這些變化提供了重要工具。核酶的切割機(jī)制 對(duì)核酶的一般描述見(jiàn)于Fedor，MJ.and Westhof，E.，Mol.Cell.，10(4)703-704(2002)，多種類型核酶的作用機(jī)制在Takagi，Y.，et al，Nucleic Acids Res.，29(9)1815-1834(2001)中論述。
I組內(nèi)含子最初被鑒定為間插序列并根據(jù)保守序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)元件而限定。I組內(nèi)含子分布廣泛，在真核細(xì)胞的核、線粒體和葉綠體基因組、真細(xì)菌和噬菌體中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾乎1000種I組內(nèi)含子。II組內(nèi)含子也被鑒定為間插序列并根據(jù)保守序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)元件而限定。II組內(nèi)含子也分布廣泛，在真菌、原生生物和植物細(xì)胞器的rRNA、tRNA和mRNA中，以及在細(xì)菌的mRNA中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約100種II組內(nèi)含子(Bonen，L.，and Vogel，J.，TRENDS Genet.，17322(2001))。
I組內(nèi)含子折疊形成介導(dǎo)其自身RNA剪接的活性部位。對(duì)可得到的66個(gè)I組內(nèi)含子之間保守的序列元件進(jìn)行編輯。比較序列分析使得能夠預(yù)測(cè)一些保守結(jié)構(gòu)特征。Cech，T.R.，Gene，73(2)259-271(1988)中論述了這些保守特征的意義。此外，在Cech，T.R.，Annu.Rev.Biochem.，59543-568(1990)中示出了對(duì)I組內(nèi)含子的自我剪接性質(zhì)的綜述。
II組內(nèi)含子見(jiàn)于真細(xì)菌和來(lái)自真細(xì)菌的細(xì)胞器的基因組中。它們具有核酶活性，通過(guò)該活性，它們指導(dǎo)和催化其側(cè)翼的外顯子的剪接。II組內(nèi)含子的核酶組分的二級(jí)結(jié)構(gòu)和已知三級(jí)相互作用在Michel，F(xiàn).and Ferat，J.L.，Annu.Rev.Biochem.，64435-461(1995)中論述。
在I組內(nèi)含子和II組內(nèi)含子核酶的情況下，可能的切割機(jī)制包括但不限于，通過(guò)酯交換作用的自我切割或剪接，和水解。這種反應(yīng)可以通過(guò)簡(jiǎn)單的酸堿反應(yīng)或通過(guò)親核取代而驅(qū)動(dòng)。II組內(nèi)含子在Bonen，L.and Vogel，J.，Trends.Genet.，17(6)322-331(2001)中論述。
錘頭型和發(fā)夾型核酶都可以被改造，以便切割含有GUC序列的任何目標(biāo)RNA(Haseloff et al，Nature，334，585-591(1988)；Uhlenbeck，Nature，334，585(1987)；Hampel et al.，Nuc.Acids Res.，18，299-304(1990)；和Symons，Ann.Rev.Biochem.，61，641-671(1992))。一般而言，錘頭型核酶具有兩類功能域，保守催化結(jié)構(gòu)域，其側(cè)翼是兩個(gè)雜交結(jié)構(gòu)域。雜交結(jié)構(gòu)域與GUC序列周圍的序列結(jié)合，催化結(jié)構(gòu)域切割GUC序列3’端的RNA靶標(biāo)(Uhlenbeck(1 987)，supra；Haseloff et al.(1988)，supra；和Symons(1992)，supra)。
有關(guān)錘頭型核酶自我切割的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的其它信息可見(jiàn)于Murray，J.B.，et al，Cell，92(5)665-673(1998)。有關(guān)發(fā)夾型核酶的結(jié)構(gòu)和功能以及發(fā)夾型核酶的催化機(jī)制的進(jìn)一步信息可見(jiàn)于Fedor，M.J.，J.MoI.Biol.297(2)269-291(2000)，和Fedor，M.J.，Biochem.Soc.Trans.，301109-1115(2002)。
可以在本發(fā)明轉(zhuǎn)錄單位中應(yīng)用的一種核酶是衍生自煙草環(huán)斑病毒(sTobRV)衛(wèi)星RNA的錘頭型核酶。sTobRV在復(fù)制期間經(jīng)歷自我催化的切割。(+)鏈和(-)鏈切割所需的序列已經(jīng)確定(Haseloff，J.andGerlach，W.L.，Gene，8243-52(1989))。(+)鏈切割需要切割部位側(cè)翼的那些序列形成“錘頭型”結(jié)構(gòu)域，這與在其它衛(wèi)星RNA和類病毒RNA中所見(jiàn)的相似。具體地，(+)鏈的切割在序列GUC之后發(fā)生，并產(chǎn)生含5’羥基和2’，3’環(huán)磷酸二酯基團(tuán)的末端(Prody，G.A.，et al，Science，2311577-1580(1986))。公認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)基序成為sTobRV(+)鏈切割的基礎(chǔ)，有可能此高度保守的結(jié)構(gòu)直接參與催化。(-)鏈的切割僅需要切割部位的12個(gè)核苷酸的小區(qū)域，和位于分子中其它部位的55個(gè)核苷酸的序列。與sTobRV(-)鏈切割有關(guān)的RNA結(jié)構(gòu)可以相似地在催化中起作用，并包括將在其它催化性RNA中重復(fù)發(fā)現(xiàn)的新的結(jié)構(gòu)基序。
此外，與南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus)(ArMv)有關(guān)的300個(gè)核苷酸的衛(wèi)星RNA序列也已經(jīng)被報(bào)道(Kaper，J.M.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.154318-325(1988)。來(lái)自與ArMV有關(guān)的衛(wèi)星RNA的核酶也可以被用在本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單位中。ArMV是與TobRV及其衛(wèi)星RNA有關(guān)的線蟲(chóng)傳多面體病毒。sArMV與sTobRv有50％的序列相似性。保守序列和潛在堿基對(duì)的存在被用來(lái)鑒定可能與sArMV(+)鏈切割有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。涉及切割的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和核苷酸在上面由Kaper，J.M.，et al.論述。sTobRV、sArMV，和其它衛(wèi)星RNA和類病毒RNA，以及相似二級(jí)結(jié)構(gòu)之間存在保守區(qū)域。因此，衍生自其它衛(wèi)星RNA和類病毒RNA的核酶也可以用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單位中。
切割信號(hào) 能夠被插入轉(zhuǎn)錄單位非編碼區(qū)域的切割信號(hào)可以是，例如，聚腺苷酸化信號(hào)、中止位點(diǎn)、強(qiáng)中止位點(diǎn)、終止位點(diǎn)、近端上游序列(NUE)或3’非翻譯序列。
已知下列轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶可以在稱作暫停位點(diǎn)、中止位點(diǎn)、強(qiáng)中止位點(diǎn)和終止位點(diǎn)的幾個(gè)位置中止。此現(xiàn)象描述于，例如，Landick，R.，Cell，88741-744(1997)和Reeder，R.H.and Lang，W.，Mol.Microbiol，1211-15(1994)中。
調(diào)節(jié)序列和編碼序列 有用的調(diào)節(jié)序列可以包括，例如，病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)，如莫洛尼鼠白血病病毒的LTR、SV40的早期和晚期啟動(dòng)子、腺病毒或巨細(xì)胞病毒即時(shí)早期啟動(dòng)子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、表達(dá)受T7 RNA聚合酶指導(dǎo)的T7啟動(dòng)子、λ噬菌體的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)域、fd包被蛋白的調(diào)控區(qū)域、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子、酸性磷酸酶的啟動(dòng)子例如Pho5、酵母α交配因子的啟動(dòng)子、桿狀病毒系統(tǒng)的多角體啟動(dòng)子、和已知調(diào)控原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒的基因表達(dá)的其它序列、和它們的各種組合。合適的真核啟動(dòng)子包括CMV即時(shí)早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs啟動(dòng)子如勞斯肉瘤病毒(″RSV″)的啟動(dòng)子、和金屬硫蛋白啟動(dòng)子如小鼠金屬硫蛋白I啟動(dòng)子。
本發(fā)明的構(gòu)建物，特別是其調(diào)節(jié)序列和編碼序列部分，可以包括起源是病毒的序列。因此，病毒調(diào)節(jié)序列或區(qū)域(順式起作用)和編碼區(qū)域(反式起作用)可以被用在本發(fā)明實(shí)踐中。順式作用區(qū)域的例子是反轉(zhuǎn)錄病毒的TAR和RRE、INS(抑制序列或不穩(wěn)定序列，也稱作CRS)元件，而反式作用編碼區(qū)域的例子是tat和rev編碼序列。
例如，與感興趣的病毒核酸異源的RRE可以用于本發(fā)明的載體。合適的RRE的例子包括但不限于，針對(duì)HIV-1衍生核酸的HIV-2 RRE、CTE(組成型轉(zhuǎn)運(yùn)元件如來(lái)自Mason-Pfizer猴病毒和其它反轉(zhuǎn)錄病毒的那些)或PRE(翻譯后調(diào)節(jié)元件如來(lái)自土撥鼠肝炎病毒的那些)。RREs是控制RNA從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)進(jìn)行翻譯的RNA序列。
對(duì)用于在宿主細(xì)胞中繁殖或表達(dá)的合適載體和啟動(dòng)子的選擇是公知的過(guò)程。載體構(gòu)建、載體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入和在宿主細(xì)胞中的增殖或表達(dá)的必要技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是常規(guī)的。應(yīng)該理解，上面未提及的許多啟動(dòng)子和其它調(diào)控序列適用于本發(fā)明的本方面，這是眾所周知的，并且可以容易地被本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用。
載體 下面描述了可以在本發(fā)明中應(yīng)用的載體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠運(yùn)輸已與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是附加體，即，能夠在染色體外復(fù)制的核酸。其它載體能夠自我復(fù)制和/表達(dá)已與其連接的核酸。能夠指導(dǎo)已與其可操作連接的基因表達(dá)的載體在本文中稱作“表達(dá)載體”。一般而言，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體通常采取“質(zhì)?！钡男问剑侵腑h(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，其為載體形式不與染色體結(jié)合。在本說(shuō)明書(shū)中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以交換應(yīng)用。此外，本發(fā)明意圖于包括行使相同的功能并且在以后本領(lǐng)域中為人所知的其它形式的載體。
載體可以用于表達(dá)多核苷酸和多肽。一般而言，這種載體包括對(duì)在宿主細(xì)胞中的表達(dá)有效的順式作用調(diào)控區(qū)域，其與待被表達(dá)的多核苷酸可操作連接。合適的反式作用因子或是由宿主提供、由互補(bǔ)載體提供、或是在導(dǎo)入宿主時(shí)由載體本身提供。
多種載體可以用在本發(fā)明中。這樣的載體包括染色體，附加體，病毒衍生載體，衍生于細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒的載體，所述病毒如桿狀病毒、乳多空病毒，如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒，和衍生自其組合的載體，如衍生自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件如黏粒和噬菌粒的那些載體。一般而言，適于在宿主中維持、增殖或表達(dá)多核苷酸的任何載體都可以被應(yīng)用。
商業(yè)上可得到的下列載體通過(guò)示例的方式提供。用于細(xì)菌的載體是pQE70、pQE60和pQE-9，可以從Qiagen得到；pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，可以從Stratagene得到；和ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，可以從Pharmacia得到。可得到的真核載體是pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG，可以從Stratagene得到；和pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL，可以從Pharmacia得到。這些載體僅以許多商業(yè)上可得和公知載體的示例的方式列出，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得到這些載體，并根據(jù)本發(fā)明而應(yīng)用。應(yīng)該理解，適于例如在宿主中引入、維持、繁殖和/或表達(dá)本發(fā)明多核苷酸或多肽的任何其它質(zhì)?；蜉d體，都可以用在本發(fā)明的本方面中。
通過(guò)多種公知和常規(guī)技術(shù)中的任何技術(shù)，可以將合適的DNA序列插入載體中。一般而言，通過(guò)用一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶切割DNA序列和載體，并隨后用DNA連接酶將限制性片段連接在一起，使DNA序列與載體連接?？梢詰?yīng)用的限制性切割和連接的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知和常規(guī)的。在這方面的合適方法以及應(yīng)用可選技術(shù)構(gòu)建載體的合適方法在本文其它處引用的Sambrook et al.中有詳細(xì)闡述，所述可選技術(shù)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知和常規(guī)的。
載體中的序列可操作地與合適的表達(dá)調(diào)控序列連接，表達(dá)調(diào)控序列包括例如，指導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
應(yīng)該理解，對(duì)載體的選擇和/或設(shè)計(jì)可以取決于這樣的因素，如對(duì)待被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇和/或欲被表達(dá)的蛋白質(zhì)的類型。此外，也應(yīng)該考慮載體的拷貝數(shù)、控制該拷貝數(shù)的能力和該載體編碼的任何其它蛋白質(zhì)如抗生素標(biāo)記的表達(dá)。表達(dá)載體可以用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而復(fù)制調(diào)節(jié)序列和產(chǎn)生蛋白質(zhì)或肽，包括本文所述核酸編碼的那些蛋白質(zhì)和肽。
細(xì)胞的遺傳改造 本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單位可以被整合入載體和/或?qū)爰?xì)胞中，如但不限于哺乳動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人類細(xì)胞。本發(fā)明的構(gòu)建物可以被整合入細(xì)胞基因組或作為附加型構(gòu)建物而維持。本發(fā)明的構(gòu)建物可以以任何順序被導(dǎo)入細(xì)胞中。在導(dǎo)入之后，通過(guò)置于所述構(gòu)建物中的選擇性標(biāo)記或可檢測(cè)標(biāo)記檢測(cè)所述構(gòu)建物，可以確認(rèn)構(gòu)建物在所述細(xì)胞中的存在。
可以對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造，以導(dǎo)入多核苷酸和表達(dá)本發(fā)明的多肽。例如，可以用公知的感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染(例如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染和磷酸鈣沉淀)、移位和轉(zhuǎn)化技術(shù)，將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞。多核苷酸可以單獨(dú)導(dǎo)入或與其它多核苷酸共同導(dǎo)入。這些其它多核苷酸可以獨(dú)立導(dǎo)入、共同導(dǎo)入或與本發(fā)明的多核苷酸連接導(dǎo)入。
因此，例如，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的共轉(zhuǎn)染技術(shù)和在例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中選擇的技術(shù)，可以將本發(fā)明的多核苷酸和編碼選擇性標(biāo)記的另一單獨(dú)的多核苷酸轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。在這種情況下，多核苷酸通常會(huì)被穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞基因組中。
此外，可以將多核苷酸連接到含有選擇性標(biāo)記的載體中，用于在宿主中繁殖。通過(guò)前述技術(shù)可以將載體構(gòu)建物引入宿主細(xì)胞中。一般而言，質(zhì)粒載體作為DNA以沉淀法，如磷酸鈣沉淀法引入，或以與帶電脂質(zhì)形成復(fù)合物的方式引入。也可以用電穿孔將多核苷酸導(dǎo)入宿主。如果載體是病毒，它可以被體外包裝或?qū)氚b細(xì)胞，包裝的病毒可以被轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的本方面，適于制備多核苷酸和將多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞的多種技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知和常規(guī)的。這些技術(shù)在Sambrook et al.中有詳細(xì)綜述，其示例了詳述這些技術(shù)的許多試驗(yàn)指南。此外，載體可以是，例如，質(zhì)粒載體、單鏈或雙鏈?zhǔn)删w載體、單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體。應(yīng)用將DNA和RNA導(dǎo)入細(xì)胞的公知技術(shù)，可以將這樣的載體作為多核苷酸如DNA導(dǎo)入細(xì)胞。在載體是噬菌體和病毒載體的情況下，可以用公知的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將其作為包裝的病毒或殼內(nèi)病毒導(dǎo)入細(xì)胞。病毒載體可以是復(fù)制型的或復(fù)制缺陷型的。在后一情況下，病毒繁殖通常僅在互補(bǔ)宿主細(xì)胞中發(fā)生。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”意味著通過(guò)核酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，將核酸，例如表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞。如本文所用，“轉(zhuǎn)化”是指作為細(xì)胞吸收外源DNA或RNA的結(jié)果，細(xì)胞的基因型得以改變的過(guò)程。例如，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)重組形式的多肽，或當(dāng)從轉(zhuǎn)移的基因發(fā)生反義表達(dá)時(shí)，天然發(fā)生形式的蛋白的表達(dá)受到干擾。
轉(zhuǎn)染可以是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。構(gòu)建物導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中可以通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法完成。這些方法描述在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室指南中，如Davis，et al.，Basic Methods In Molecular Biology(1986)。
細(xì)胞或宿主 如本文所用，“細(xì)胞”或“宿主”是指相應(yīng)的活生物，在其中可以導(dǎo)入和表達(dá)本發(fā)明的核酸構(gòu)建物或表達(dá)系統(tǒng)?！凹?xì)胞”可以是任何細(xì)胞，優(yōu)選地，是真核細(xì)胞。細(xì)胞可以是新分離的或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系細(xì)胞或原代細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化是通過(guò)導(dǎo)入本發(fā)明的核酸構(gòu)建物或與導(dǎo)入本發(fā)明的核酸構(gòu)建物聯(lián)合而實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞系或培養(yǎng)物是指通過(guò)體外培養(yǎng)而維持的細(xì)胞，其可以和衍生出該細(xì)胞系或培養(yǎng)物的親代細(xì)胞不一樣。細(xì)胞的非限制性例子包括真核細(xì)胞系如HeLa、293、HT-1080、CV-1、TE671或其它人類細(xì)胞；非洲綠猴腎細(xì)胞株系(Vero)細(xì)胞；或D17細(xì)胞。其它細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞(如T細(xì)胞或B細(xì)胞)或巨噬細(xì)胞(如單核巨噬細(xì)胞)，或這些細(xì)胞中任一細(xì)胞的前體，如造血干細(xì)胞。用于實(shí)施本發(fā)明的其它細(xì)胞包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、單核細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞(如但不限于腦和眼神經(jīng)元細(xì)胞)、肝細(xì)胞、造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、產(chǎn)生精子或卵細(xì)胞的細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、粘膜細(xì)胞和類似細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是真核、多細(xì)胞物種的細(xì)胞(例如，與單細(xì)胞酵母細(xì)胞相對(duì))，甚至更優(yōu)選地，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人類細(xì)胞。
細(xì)胞可以作為單個(gè)實(shí)體存在，或者可以是較大細(xì)胞集合的一部分。這種“較大的細(xì)胞集合(larger collection of cells)”可以包括，例如，細(xì)胞培養(yǎng)物(或是混合的或是純的)、組織(例如，內(nèi)皮、上皮、粘膜或其它組織，包括含有上述CD 4缺失細(xì)胞的組織)、器官(例如，心臟、肺、肝臟、肌肉、膽囊、膀胱、性腺、眼和其它器官)、器官系統(tǒng)(例如，循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、皮被系統(tǒng)或其它器官系統(tǒng))或生物(例如鳥(niǎo)、哺乳動(dòng)物或類似生物)。優(yōu)選地，器官/組織/細(xì)胞是循環(huán)系統(tǒng)的(例如，包括但不限于心臟、脈管和血液，包括白細(xì)胞和紅細(xì)胞)、呼吸系統(tǒng)的(例如，鼻、咽、喉、氣管、支氣管、細(xì)支氣管、肺和類似器官)、胃腸系統(tǒng)的(例如，包括口、咽、食道、胃、腸、唾液腺、胰腺、肝臟、膽囊和其它器官)、泌尿系統(tǒng)的(例如，如腎臟、輸尿管、膀胱、尿道和類似器官)、神經(jīng)系統(tǒng)的(例如，包括但不限于腦和脊髓，和特殊感覺(jué)器官如眼)和皮被系統(tǒng)的(例如皮膚、表皮、和皮下或皮膚組織的細(xì)胞)。甚至更加優(yōu)選地，細(xì)胞選自心臟、血管、肺臟、肝臟、膽囊、膀胱、和眼細(xì)胞。細(xì)胞不必是正常細(xì)胞，可以是患病細(xì)胞。這樣的患病細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)胞、感染的細(xì)胞、遺傳異常細(xì)胞、或與異常組織接近或與其接觸的細(xì)胞如腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，但不限于這些細(xì)胞。
病毒 “病毒”是由蛋白質(zhì)和核酸組成并應(yīng)用宿主細(xì)胞的遺傳機(jī)制產(chǎn)生病毒核酸確定的病毒產(chǎn)物的感染劑。本發(fā)明包括這樣的方面如病毒編碼序列的表達(dá)，其可以應(yīng)用于RNA病毒和DNA病毒。RNA病毒是感染原核生物(例如噬菌體)以及包括哺乳動(dòng)物、特別是人類在內(nèi)的許多真核生物的多樣化群組。雖然至少一個(gè)家族以雙鏈RNA作為遺傳物質(zhì)，大多數(shù)RNA病毒以單鏈RNA作為它們的遺傳物質(zhì)。RNA病毒被分成三個(gè)主要的組正鏈病毒、負(fù)鏈病毒和雙鏈RNA病毒。涉及本發(fā)明的RNA病毒包括辛德比斯樣病毒(例如，披膜病毒科(Togaviridae)、雀麥花葉病毒、南瓜花葉病毒組、煙草花葉病毒、等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒組、煙草脆裂病毒組、和馬鈴薯X病毒組)，小RNA病毒樣病毒(例如，小RNA病毒科(Picomaviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)、豇豆花葉病毒組、線蟲(chóng)傳多面體病毒和馬鈴薯Y病毒組)，負(fù)鏈病毒(例如，副粘病毒科(Paramyxoviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、正黏病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼病毒科(Bunyaviridae)和沙粒病毒科(Arenaviridae))，雙鏈病毒(例如，呼腸病毒科(Reoviridae)和雙RNA病毒科(Birnaviridae))，黃病毒樣病毒(例如，黃病毒科(Flaviviridae)和瘟病毒)，反轉(zhuǎn)錄樣病毒(例如，反轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae))，冠狀病毒科(Coronaviridae)和其它病毒組，包括但不限于野田病毒科(Nodaviridae)。本發(fā)明優(yōu)選地應(yīng)用黃病毒科家族的RNA病毒，更優(yōu)選地線狀病毒屬的病毒，特別是馬爾堡病毒或依波拉病毒。黃病毒科家族的病毒是黃病毒屬的病毒，如黃熱病毒、登革病毒、西尼羅腦炎病毒、圣·路易斯腦炎病毒、日本腦炎病毒、Murray河谷腦炎病毒、羅西奧病毒(Rociovirus)、蜱媒腦炎病毒和類似病毒。本發(fā)明優(yōu)選地應(yīng)用小RNA病毒科家族的病毒，優(yōu)選甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HBC)、或非甲非乙型肝炎病毒。
本發(fā)明可以應(yīng)用的另一優(yōu)選RNA病毒是反轉(zhuǎn)錄病毒科家族的病毒(即，反轉(zhuǎn)錄病毒)，特別是屬或亞科腫瘤病毒亞科(Oncovirinae)、泡沫病毒亞科(Spumavirinae)、泡沫病毒、慢病毒亞科(Lentivirinae)和慢病毒的病毒。亞科腫瘤病毒亞科的RNA病毒理想地是人嗜T淋巴細(xì)胞病毒1型或2型(即，HTLV-1或HTLV-2)或牛白血病病毒(BLV)，禽類白血病-肉瘤病毒(avian leukosis-sarcoma virus)(例如，勞斯肉瘤病毒(RSV)，禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒(AMV)，禽類成紅細(xì)胞增生病毒(AEV)和勞斯相關(guān)病毒(RAV；RAV-0至RAV-50)，哺乳動(dòng)物C型病毒(例如，莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)，哈維鼠肉瘤病毒(Harvey murinesarcoma virus)(HaMSV)，埃布爾森鼠白血病病毒(A-MuLV)，AKR-MuLV，貓科動(dòng)物白血病病毒(FeLV)，猿猴肉瘤病毒，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(REV)，脾壞死病毒(SNV))，B型病毒(例如，小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV))，和D型病毒(例如，Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和“SAIDS”病毒)。慢病毒亞家族的RNA病毒理想地是人免疫缺陷病毒1型或2型(即，HIV-1或HIV-2，其中HIV-1以前稱作淋巴結(jié)病相關(guān)病毒3(HTLV-III)和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)相關(guān)病毒(ARV))，或已經(jīng)鑒定并與AIDS或AIDS樣疾病相關(guān)的、有關(guān)HIV-1或HIV-2的其它病毒。一般而言，首字母縮寫“HIV”或“人類免疫缺陷病毒”用于本文中指這些HIV病毒，以及HIV有關(guān)和相關(guān)病毒。而且，慢病毒亞家族中的RNA病毒優(yōu)選地是腦膜腦炎/進(jìn)行性間質(zhì)性肺炎病毒(Visna/maedivirus)(例如，如感染綿羊)、貓科動(dòng)物免疫缺陷病毒(FIV)、牛慢病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)和羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)。本發(fā)明也應(yīng)用DNA病毒。優(yōu)選地，DNA病毒是皰疹病毒(如EB病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒)，腺病毒，AAV，乳頭瘤病毒，牛痘病毒和類似病毒。
術(shù)語(yǔ)“3’”(3 prime)一般是指多核苷酸或寡核苷酸中的區(qū)域或位置，所述區(qū)域或位置位于同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一區(qū)域或位置的3’端(下游)。
術(shù)語(yǔ)“5’”(5 prime)一般是指多核苷酸或寡核苷酸中的區(qū)域或位置，所述區(qū)域或位置位于同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一區(qū)域或位置的5’端(上游)。
如果沒(méi)有另外規(guī)定，本文中應(yīng)用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科技術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍理解的相同意義。
必須指出，如本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)所用，單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“定冠詞(the)”包括相應(yīng)的復(fù)數(shù)形式，除非上下文另外明確地作出說(shuō)明。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包括”及其同源詞以其包含性意義應(yīng)用；即，等價(jià)于術(shù)語(yǔ)“包含”及其相應(yīng)的同源詞。
如果沒(méi)有另外的說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)踐將應(yīng)用傳統(tǒng)的細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中得到充分說(shuō)明。參見(jiàn)，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，由Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)；DNACloning，第I卷和第II卷(D.N.Glover ed.，1985)；OligonucleotideSynthesis (M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.美國(guó)專利號(hào)4,683,195Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney.Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cell And Enzymes(IRL，Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；論文Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154和155(Wu et al.eds.)，ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating theMouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
提供下列實(shí)施例以便為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供如何制備和應(yīng)用本發(fā)明的充分公開(kāi)和描述，并且其并不意圖限制發(fā)明人考慮的發(fā)明范圍，也并不意圖表明下面的試驗(yàn)是所進(jìn)行的所有試驗(yàn)和僅有的試驗(yàn)。已經(jīng)作了努力以確保所應(yīng)用的數(shù)字(例如，數(shù)量、溫度等)的精確性，但是一些試驗(yàn)誤差和偏差應(yīng)當(dāng)考慮。如果沒(méi)有其它規(guī)定，份數(shù)是重量份，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓。
實(shí)施例1包裝載體構(gòu)建物VRX577中的順式作用核酶的結(jié)構(gòu) 在包裝載體構(gòu)建物VIRPAC-也稱作VRX170中，有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位驅(qū)動(dòng)HIV-I GagPol和TatRev在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的調(diào)控下的表達(dá)，其在牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸(poly-A)信號(hào)末端處終止。另一轉(zhuǎn)錄單位編碼由延伸因子(EF)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的VSV-G，并在SV40聚腺苷酸位點(diǎn)末端終止。由于質(zhì)粒的環(huán)狀性質(zhì)，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位都能夠潛在地連讀聚腺苷酸位點(diǎn)并形成較長(zhǎng)的多順?lè)醋有攀筊NA，在反轉(zhuǎn)錄期間，所述信使RNA能夠充當(dāng)通過(guò)基于RNA的重組事件產(chǎn)生可復(fù)制慢病毒(RCL)的潛在底物。為了防止連讀，含有煙草環(huán)斑病毒(sTobRV)衛(wèi)星RNA的順式核酶(cis-Rz)的片段(Haseloff和Gerlach，1989)在緊接相應(yīng)聚腺苷酸位點(diǎn)的下游插入到這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位之間(圖1)。僅當(dāng)發(fā)生轉(zhuǎn)錄連讀的情況下才產(chǎn)生核酶，隨后核酶能夠在圖1中的黑色箭頭所指的位點(diǎn)處切割其自身。
實(shí)施例2順式核酶(cis-RZ)的體外活性 應(yīng)用含有T7啟動(dòng)子的引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增含有轉(zhuǎn)錄終止元件的VRX170(-cis-RZ)和VRX577(+cis-Rz)的1300個(gè)堿基的區(qū)域。隨后體外轉(zhuǎn)錄得到的DNA。將濃度約1μg/μl的2μl轉(zhuǎn)錄的RNA加入2μlRT-PCR緩沖液，隨后將2μl(2μg)上樣到凝膠中用于顯現(xiàn)(圖2)。切割迅速發(fā)生，原因是在凝膠上樣前在緩沖液中溫育5、10、20和60分鐘之間沒(méi)有觀察到差異。這一數(shù)據(jù)表明，cis-Rz非常有效地抑制連讀轉(zhuǎn)錄物。
實(shí)施例3應(yīng)用VRX577作為包裝載體，在生產(chǎn)細(xì)胞中沒(méi)有出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄連讀 在用病毒載體和含有cis-Rz(VRX577)的輔助構(gòu)建物以及不含有cis-Rz的輔助構(gòu)建物(VRX170)共轉(zhuǎn)染的293F細(xì)胞中，測(cè)定轉(zhuǎn)錄連讀。分離細(xì)胞RNA，用RT-PCR分析RNA轉(zhuǎn)錄物。能夠100％次測(cè)得轉(zhuǎn)錄物的試驗(yàn)敏感度是每μg細(xì)胞DNA中含有50個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)錄物，這等于每μg總細(xì)胞RNA中含有167個(gè)拷貝。除了對(duì)測(cè)定轉(zhuǎn)錄連讀的試驗(yàn)設(shè)計(jì)的概述之外，對(duì)PCR引物設(shè)計(jì)的概括也表示在圖3中。用從VRX170體外轉(zhuǎn)錄的RNA作為陽(yáng)性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品。在VRX170體外轉(zhuǎn)錄期間，預(yù)期出現(xiàn)連讀，原因是連接轉(zhuǎn)錄聚腺苷酸和中止位點(diǎn)所必需的細(xì)胞元件在反應(yīng)中不存在。為了在統(tǒng)計(jì)學(xué)上確定該分析的檢測(cè)極限，對(duì)已知量的陽(yáng)性對(duì)照RNA進(jìn)行以3倍連續(xù)稀釋(圖4)，該試驗(yàn)重復(fù)13次，以便獲得用于統(tǒng)計(jì)學(xué)確定敏感度的足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)。根據(jù)這些結(jié)果，如果在9次重復(fù)中沒(méi)有陽(yáng)性事件，則在每次重復(fù)或每μgRNA中存在23.12個(gè)拷貝以下的連讀RNA轉(zhuǎn)錄物，置信上限是95％。
在描述的敏感度試驗(yàn)中，用VRX170作為輔助構(gòu)建物，在293F細(xì)胞中檢測(cè)到連讀轉(zhuǎn)錄物，但是用VRX577作為輔助構(gòu)建物，沒(méi)有檢測(cè)到連讀轉(zhuǎn)錄物(圖5)。隨后對(duì)來(lái)自用載體和VRX577共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞RNA進(jìn)行的9次試驗(yàn)中，任何一次試驗(yàn)都沒(méi)有連讀轉(zhuǎn)錄物，這意味著每μg細(xì)胞RNA中存在23.12個(gè)拷貝以下的連讀RNA轉(zhuǎn)錄物(圖6)。由于VRX170和VRX577之間的唯一差異是順式作用核酶的加入(請(qǐng)參見(jiàn)圖1)，可以斷定，核酶獨(dú)自負(fù)起防止連讀轉(zhuǎn)錄物的任務(wù)。因此，順式作用核酶的加入是非常有效的轉(zhuǎn)錄分隔元件。
實(shí)施例4cis-Rz的加入不影響輔助構(gòu)建物的包裝功能 在包裝期間，cis-Rz的應(yīng)用不以任何方式影響最終病毒載體產(chǎn)物，原因是核酶并不位于病毒載體中或輔助構(gòu)建物(VRX577)的編碼序列中。為了證明這一點(diǎn)，對(duì)所得的在VRX170或VRX577存在下包裝的載體的滴度進(jìn)行比較。簡(jiǎn)言之，用載體和輔助構(gòu)建物對(duì)293F細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，用得到的載體產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)hela-tat細(xì)胞。從這些細(xì)胞分離DNA，通過(guò)對(duì)載體序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析載體的拷貝數(shù)(轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU))。沒(méi)有觀察到載體包裝效率之間的差異。數(shù)據(jù)代表至少3個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)，說(shuō)明了在兩個(gè)輔助構(gòu)建物(VRX577和VRX170)之間的滴度類似，在應(yīng)用VRX577時(shí)具有較高滴度的可重復(fù)趨勢(shì)(圖7)。
本文中引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利、專利申請(qǐng)和出版物，以整體并入本文作為參考，不論其之前明確并入的或未并入的。
對(duì)上述文件的引用不是意圖承認(rèn)前述文件是相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)。關(guān)于這些文件內(nèi)容以及日期或陳述的所有說(shuō)明都是基于申請(qǐng)人可以得到的信息，并且不構(gòu)成對(duì)這些文件的日期或內(nèi)容的正確性的任何承認(rèn)。
充分描述了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在不進(jìn)行過(guò)度的試驗(yàn)和不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以在寬范圍的等同參數(shù)、濃度和條件下進(jìn)行相同的操作。
雖然聯(lián)系具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，應(yīng)該理解，可以對(duì)其作進(jìn)一步修改。本申請(qǐng)意圖涵蓋對(duì)本發(fā)明的任何變化、用途或修改，所述變化、用途或修改一般而言遵循了本發(fā)明的原則并包括對(duì)本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的偏離，所述偏離在本發(fā)明所屬領(lǐng)域已知的或慣例的實(shí)踐范圍內(nèi)，并且可以應(yīng)用于上文列出的基本特征中。
權(quán)利要求
1.制備能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的RNA轉(zhuǎn)錄物的重組轉(zhuǎn)錄單位的方法，包括可操作地連接調(diào)節(jié)序列和包括轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述調(diào)節(jié)序列的調(diào)控，其中所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼病毒序列的區(qū)域和位于編碼所述病毒序列的所述區(qū)域下游的非編碼區(qū)域，其中所述非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述非編碼區(qū)域還包括編碼切割信號(hào)的核苷酸序列，其位于所述編碼順式作用核酶的核苷酸序列的上游。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述切割信號(hào)是聚腺苷酸化信號(hào)、暫停位點(diǎn)、強(qiáng)中止位點(diǎn)、終止位點(diǎn)、近端上游序列(NUE)或3’非翻譯序列。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述聚腺苷酸化信號(hào)是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸(poly-A)信號(hào)或SV40聚腺苷酸位點(diǎn)。
5.權(quán)利要求3的方法，其中應(yīng)用一個(gè)以上的切割信號(hào)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述調(diào)節(jié)序列是原核調(diào)節(jié)序列。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述調(diào)節(jié)序列是真核調(diào)節(jié)序列。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述調(diào)節(jié)序列是巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子或延伸因子(EF)啟動(dòng)子。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒序列編碼病毒蛋白。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述病毒蛋白是由慢病毒編碼的蛋白或病毒包膜蛋白。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述病毒蛋白是VSV-G、gag、pol、tat或rev，或VSV-G、gag、pol、tat和rev的任何組合。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述病毒序列還包括編碼抗病毒劑的核苷酸序列，其位于編碼所述病毒蛋白的核苷酸序列的上游或下游。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗病毒劑是反義分子或核酶。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述順式作用核酶衍生自衛(wèi)星RNA或類病毒RNA。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述順式作用核酶衍生自煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA或衍生自南芥菜花葉病毒的衛(wèi)星RNA。
16.宿主細(xì)胞，包括能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的RNA轉(zhuǎn)錄物的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中所述轉(zhuǎn)錄單位包括調(diào)節(jié)區(qū)域，其可操作地連接到含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述調(diào)節(jié)序列的調(diào)控，其中所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼病毒序列的區(qū)域和位于編碼所述病毒序列的所述區(qū)域下游的非編碼區(qū)域，其中所述非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
17.權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，其中所述非編碼區(qū)域還包括編碼切割信號(hào)的核苷酸序列，其位于編碼所述順式作用核酶的所述核苷酸序列的上游。
18.能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的RNA轉(zhuǎn)錄物的重組轉(zhuǎn)錄單位，包括可操作地連接到核苷酸序列的調(diào)節(jié)區(qū)域，所述核苷酸序列包括編碼病毒序列的轉(zhuǎn)錄區(qū)域和位于編碼所述病毒序列的所述區(qū)域下游的非編碼區(qū)域，其中所述非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
19.權(quán)利要求18的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中所述非編碼區(qū)域還包括編碼終止切割信號(hào)的核苷酸序列，其位于編碼所述順式作用核酶的所述核苷酸序列的上游。
20.權(quán)利要求19的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中所述切割信號(hào)是聚腺苷酸化信號(hào)、中止位點(diǎn)、強(qiáng)中止位點(diǎn)、近端上游序列(NUE)或3’非翻譯序列。
21.權(quán)利要求20的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中所述聚腺苷酸化信號(hào)是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸(poly-A)信號(hào)或SV40聚腺苷酸位點(diǎn)。
22.權(quán)利要求20的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中應(yīng)用一個(gè)以上的信號(hào)。
23.權(quán)利要求18的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中所述調(diào)節(jié)序列是原核調(diào)節(jié)序列。
24.權(quán)利要求18的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中所述調(diào)節(jié)序列是真核調(diào)節(jié)序列。
25.權(quán)利要求24的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中所述調(diào)節(jié)序列是巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子或延伸因子(EF)啟動(dòng)子。
26.權(quán)利要求18的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中所述病毒序列是病毒蛋白。
27.權(quán)利要求26的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中所述病毒蛋白是由慢病毒編碼的蛋白或病毒包膜蛋白。
28.權(quán)利要求26的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中所述病毒蛋白是VSV-G、gag、pol、tat或rev，或VSV-G、gag、pol、tat和rev的任何組合。
29.權(quán)利要求28的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中除了編碼病毒蛋白的核苷酸序列之外，所述病毒序列還包括編碼抗病毒劑的核苷酸序列，其位于編碼所述病毒蛋白的核苷酸序列的上游或下游。
30.權(quán)利要求29的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中所述抗病毒劑是反義分子或核酶。
31.權(quán)利要求18的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中所述順式作用核酶衍生自衛(wèi)星RNA或類病毒RNA。
32.權(quán)利要求31的重組轉(zhuǎn)錄單位，其中所述順式作用核酶衍生自煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA或衍生自南芥菜花葉病毒的衛(wèi)星RNA。
33.限制從轉(zhuǎn)錄單位產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物的大小的方法，所述方法包括誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄，所述轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的調(diào)節(jié)序列，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述調(diào)節(jié)序列的調(diào)控，其中所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼病毒序列的區(qū)域和位于編碼所述病毒序列的區(qū)域下游的非編碼區(qū)域，其中所述非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；和其中所述轉(zhuǎn)錄單位在編碼所述順式作用核酶的序列被轉(zhuǎn)錄的條件下產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物并順式切割所述轉(zhuǎn)錄物。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述非編碼區(qū)域還包括編碼切割信號(hào)的核苷酸序列，其位于所述編碼順式作用核酶的核苷酸序列的上游。
35.權(quán)利要求33的方法，所述切割信號(hào)是聚腺苷酸化信號(hào)、暫停位點(diǎn)、強(qiáng)中止位點(diǎn)、終止位點(diǎn)、近端上游序列(NUE)或3’非翻譯序列。
36.權(quán)利要求33的方法，其中所述聚腺苷酸化信號(hào)是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸(poly-A)信號(hào)或SV40聚腺苷酸位點(diǎn)。
37.權(quán)利要求35的方法，其中應(yīng)用一個(gè)以上的信號(hào)。
38.權(quán)利要求33的方法，其中所述調(diào)節(jié)序列是原核調(diào)節(jié)序列。
39.權(quán)利要求33的方法，其中所述調(diào)節(jié)序列是真核調(diào)節(jié)序列。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述調(diào)節(jié)序列是巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子或延伸因子(EF)啟動(dòng)子。
41.權(quán)利要求33的方法，其中所述病毒序列編碼病毒蛋白。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述病毒蛋白是由慢病毒編碼的蛋白或病毒包膜蛋白。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述病毒蛋白是VSV-G、gag、pol、tat或rev，或VSV-G、gag、pol、tat和rev的任何組合。
44.權(quán)利要求41的方法，其中除了編碼病毒蛋白的核苷酸序列之外，所述病毒序列還包括編碼抗病毒劑的核苷酸序列，其位于編碼所述病毒蛋白的核苷酸序列的上游或下游。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述抗病毒劑是反義分子或核酶。
46.權(quán)利要求33的方法，其中所述順式作用核酶衍生自衛(wèi)星RNA或類病毒RNA。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述順式作用核酶衍生自煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA或衍生自南芥菜花葉病毒的衛(wèi)星RNA。
48.載體，包括(a)能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第一RNA轉(zhuǎn)錄物的第一轉(zhuǎn)錄單位，其中所述第一轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第一啟動(dòng)子的調(diào)控，其中所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第一基因的區(qū)域和位于編碼所述第一基因的所述區(qū)域下游的第一非編碼區(qū)域，其中所述第一非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；和(b)能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第二RNA轉(zhuǎn)錄物的第二轉(zhuǎn)錄單位，其中所述第二轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第二啟動(dòng)子的調(diào)控，其中所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第二基因的區(qū)域和位于編碼所述第二基因的所述區(qū)域下游的第二非編碼區(qū)域，其中所述第二非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
49.權(quán)利要求48的載體，其中所述第一啟動(dòng)子和第二啟動(dòng)子是不同的。
50.權(quán)利要求48的載體，其中所述第一啟動(dòng)子和第二啟動(dòng)子非編碼區(qū)域包括編碼相同的或不同的順式作用核酶的核苷酸序列。
51.權(quán)利要求48的載體，其中所述第一基因、第二基因或兩者在其羧基端具有切割信號(hào)。
52.權(quán)利要求51的載體，其中所述切割信號(hào)是聚腺苷酸化信號(hào)、暫停位點(diǎn)、強(qiáng)中止位點(diǎn)、終止位點(diǎn)、近端上游序列(NUE)或3’非翻譯序列。
53.權(quán)利要求52的載體，其中應(yīng)用一個(gè)以上的信號(hào)。
54.權(quán)利要求48的載體，其中所述第一順式作用核酶或第二順式作用核酶或兩者衍生自衛(wèi)星RNA或類病毒RNA。
55.權(quán)利要求54的載體，其中所述順式作用核酶衍生自煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA或衍生自南芥菜花葉病毒的衛(wèi)星RNA。
56.權(quán)利要求48的載體，其中所述第一啟動(dòng)子是組成型的，所述第二啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的。
57.權(quán)利要求48的載體，其中所述第一基因與所述第二基因是不同的。
58.權(quán)利要求57的載體，其中所述第一基因是顯性失活轉(zhuǎn)基因，第二基因是在其被表達(dá)時(shí)，該表達(dá)產(chǎn)物可以將所述顯性失活轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)變成功能基因的基因。
59.權(quán)利要求57的載體，其中所述第一基因是是酶原，所述第二基因的表達(dá)產(chǎn)物將所述酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿浮?br> 60.權(quán)利要求57的載體，其中所述第一基因編碼蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)中的至少一個(gè)氨基酸能夠被磷酸化，所述第二基因編碼能夠使所述蛋白質(zhì)的所述氨基酸磷酸化的激酶。
61.權(quán)利要求57的載體，其中所述第一基因編碼第一蛋白，其包括至少一個(gè)磷酸化的氨基酸，所述第二基因編碼能夠使所述第一蛋白質(zhì)的所述氨基酸去磷酸化的蛋白磷酸酶。
62.宿主細(xì)胞，其包括載體，所述載體包括(a)能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第一RNA轉(zhuǎn)錄物的第一轉(zhuǎn)錄單位，其中所述第一轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第一啟動(dòng)子的調(diào)控，其中所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第一基因的區(qū)域和位于編碼所述第一基因的所述區(qū)域下游的第一非編碼區(qū)域，其中所述第一非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；和(b)能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第二RNA轉(zhuǎn)錄物的第二轉(zhuǎn)錄單位，其中所述第二轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第二啟動(dòng)子的調(diào)控，其中所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第二基因的區(qū)域和位于編碼所述第二基因的所述區(qū)域下游的第二非編碼區(qū)域，其中所述第二非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
63.權(quán)利要求62的宿主細(xì)胞，其中所述第一基因、第二基因或兩者在其羧基端具有切割信號(hào)。
64.制造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，包括向所述動(dòng)物的基因組中插入載體，所述載體包括(a)能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第一RNA轉(zhuǎn)錄物的第一轉(zhuǎn)錄單位，其中所述第一轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第一啟動(dòng)子的調(diào)控，其中所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第一基因的區(qū)域和位于編碼所述第一基因的所述區(qū)域下游的第一非編碼區(qū)域，其中所述第一非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；和(b)能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第二RNA轉(zhuǎn)錄物的第二轉(zhuǎn)錄單位，其中所述第二轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第二啟動(dòng)子的調(diào)控，其中所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第二基因的區(qū)域和位于編碼所述第二基因的所述區(qū)域下游的第二非編碼區(qū)域，其中所述第二非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述第一基因、第二基因或兩者在其羧基端具有切割信號(hào)。
66.權(quán)利要求64的方法，其中所述載體被插入所述動(dòng)物的生殖細(xì)胞的基因組中。
67.權(quán)利要求64的方法，其中所述載體被插入所述動(dòng)物的未受精卵或受精卵的基因組中。
68.權(quán)利要求64的方法，其中所述載體被插入所述動(dòng)物的胚胎的基因組中。
69.權(quán)利要求64的方法，其中所述載體被插入到位于所述動(dòng)物子宮中的細(xì)胞的基因組中。
70.轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其包括載體，所述載體包括(a)能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第一RNA轉(zhuǎn)錄物的第一轉(zhuǎn)錄單位，其中所述第一轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第一啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第一啟動(dòng)子的調(diào)控，其中所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第一基因的區(qū)域和位于編碼所述第一基因的所述區(qū)域下游的第一非編碼區(qū)域，其中所述第一非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列；和(b)能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的第二RNA轉(zhuǎn)錄物的第二轉(zhuǎn)錄單位，其中所述第二轉(zhuǎn)錄單位包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的第二啟動(dòng)子，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述第二啟動(dòng)子的調(diào)控，其中所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼第二基因的區(qū)域和位于編碼所述第二基因的所述區(qū)域下游的第二非編碼區(qū)域，其中所述第二非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。
71.權(quán)利要求70的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述第一基因、第二基因或兩者在它們的羧基端具有切割信號(hào)。
72.雙載體反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，包括(a)第一載體，包括編碼有效負(fù)載的核苷酸序列和調(diào)控所述有效負(fù)載轉(zhuǎn)錄的第一啟動(dòng)子；和(b)第二載體，包括(i)編碼結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第二啟動(dòng)子；和(ii)編碼非結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述非結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第三啟動(dòng)子，其中編碼所述結(jié)構(gòu)基因的所述核苷酸序列和編碼所述非結(jié)構(gòu)基因的所述核苷酸序列被編碼順式作用核酶的核苷酸序列隔開(kāi)。
73.權(quán)利要求72的反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述第一啟動(dòng)子、第二啟動(dòng)子和第三啟動(dòng)子是相同的或是不同的。
74.權(quán)利要求72的反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述有效負(fù)載選自反義分子、RNA誘餌、反式顯性突變體、毒素、針對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的單鏈抗體(scAb)、siRNA和核酶。
75.權(quán)利要求72的反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述結(jié)構(gòu)基因選自gag、gag-pol前體、pro、反轉(zhuǎn)錄酶(RT)、整合酶(In)和env。
76.權(quán)利要求72的反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述非結(jié)構(gòu)基因選自tat、rev、nef、vpr、vpu和vif。
77.雙載體反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，包括(a)第一載體，包括編碼有效負(fù)載的核苷酸序列和調(diào)控所述有效負(fù)載轉(zhuǎn)錄的第一啟動(dòng)子；和(b)第二載體，包括(i)編碼結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第二啟動(dòng)子，(ii)編碼非結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述非結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第三啟動(dòng)子，和(iii)編碼包膜基因的核苷酸序列和調(diào)控所述包膜基因轉(zhuǎn)錄的第四啟動(dòng)子，其中編碼所述三個(gè)基因的每一核苷酸序列被編碼順式核酶的核苷酸序列隔開(kāi)。
78.權(quán)利要求77的反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述第一啟動(dòng)子、第二啟動(dòng)子、第三啟動(dòng)子和第四啟動(dòng)子是相同的或是不同的。
79.權(quán)利要求77的反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述有效負(fù)載選自反義分子、RNA誘餌、反式顯性突變體、毒素、針對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的單鏈抗體(scAb)、siRNA和核酶。
80.權(quán)利要求77的反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述結(jié)構(gòu)基因選自gag、gag-pol前體、pro、反轉(zhuǎn)錄酶(RT)、整合酶(In)和env。
81.權(quán)利要求77的反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，其中所述非結(jié)構(gòu)基因選自tat、rev、nef、vpr、vpu和vif。
82.產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒的方法，包括使細(xì)胞與雙載體反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)接觸，所述雙載體反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)包括(a)第一載體，包括編碼有效負(fù)載的核苷酸序列和調(diào)控所述有效負(fù)載轉(zhuǎn)錄的第一啟動(dòng)子；和(b)第二載體，包括編碼結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第二啟動(dòng)子，編碼非結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述非結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第三啟動(dòng)子，其中編碼所述結(jié)構(gòu)基因的所述核苷酸序列和編碼所述非結(jié)構(gòu)基因的所述核苷酸序列被編碼順式作用核酶的核苷酸序列隔開(kāi)。
83.生產(chǎn)反轉(zhuǎn)錄病毒的方法，包括使細(xì)胞與雙載體反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)接觸，所述雙載體反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)包括(a)第一載體，包括編碼有效負(fù)載的核苷酸序列和調(diào)控所述有效負(fù)載轉(zhuǎn)錄的第一啟動(dòng)子；和(b)第二載體，包括編碼結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第二啟動(dòng)子，編碼非結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列和調(diào)控所述非結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的第三啟動(dòng)子，以及編碼包膜基因的核苷酸序列和調(diào)控所述包膜基因轉(zhuǎn)錄的第四啟動(dòng)子，其中編碼所述三個(gè)基因的每一核苷酸序列被編碼順式核酶的核苷酸序列隔開(kāi)。
全文摘要
本發(fā)明提供了能夠產(chǎn)生預(yù)定大小的RNA轉(zhuǎn)錄物的重組轉(zhuǎn)錄單位，其包括與含有轉(zhuǎn)錄區(qū)域的核苷酸序列可操作連接的調(diào)節(jié)序列，從而，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄受到所述調(diào)節(jié)序列的調(diào)控。所述轉(zhuǎn)錄區(qū)域包括編碼病毒序列的區(qū)域和位于編碼所述病毒序列的區(qū)域下游的非編碼區(qū)域，其中所述非編碼區(qū)域包括編碼順式作用核酶的核苷酸序列。也提供了應(yīng)用這種重組轉(zhuǎn)錄單位的方法和包括含有這種重組轉(zhuǎn)錄單位的載體的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/02GK101094920SQ200580022392
公開(kāi)日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2005年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月17日
發(fā)明者呂小賓, B·德羅普利奇, V·斯列普什金, G·賓德 申請(qǐng)人:維克西斯公司