專利名稱：利用同源重組的牛β－酪蛋白基因靶向載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過同源重組而實(shí)現(xiàn)其功能的牛β-酪蛋白基因靶向載體、利用該載體基因靶向的牛體細(xì)胞和用該牛體細(xì)胞進(jìn)行核移植的胚胎。本發(fā)明還涉及到，從植入上述胚胎而制備的轉(zhuǎn)基因牛的牛奶中生產(chǎn)大量目標(biāo)蛋白的方法。
背景技術(shù)：
我們?cè)阼b定動(dòng)物基因組的基因和其功能方面的不斷努力，使得產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成為可能。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已經(jīng)在工業(yè)生產(chǎn)中創(chuàng)造了巨大的市場(chǎng)價(jià)值，比如在生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等方面。還發(fā)展了各種制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或者所謂的遺傳改良動(dòng)物的技術(shù)，例如顯微注射、病毒轉(zhuǎn)染、精子載體、胚胎干細(xì)胞(ES)應(yīng)用和體細(xì)胞核移植(SNCT)。
顯微注射方法就是將一段DNA分子注射到雄性或者雌性受精卵原核(Harbers等人，Nature.，293(5833)；540-2，1981；Brinster等人，Cell.，27；223-231，1981；Gordon等人，Proc Natl Acad Sci USA.，77(12)；7380-7384；Costantini等人，Nature.，294(5836)；92-94)，該方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。(Hammer等人，Nature.，315(6021)；680-683，1985；van Berkel等人，Nat Biotechnol.，20(5)；484-487，2002；Damak等人，Biotechnology(NY)，14(2)；185-186，1996)。然而，該技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率卻很低，只有2-3％的被注射的卵細(xì)胞能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代(Clark等人，Transgenic Res.，9；263-275，2000)。使用顯微注射方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也是一種非常消耗勞力并且昂貴的生產(chǎn)程序，需要大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和生產(chǎn)設(shè)備(Brink等人，Theriogenology，53；139-148，2000)。該技術(shù)另一不足之處是，它不能控制轉(zhuǎn)入基因的整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)目，這種隨機(jī)的整合有時(shí)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的低效或者非特異性表達(dá)。甚至有報(bào)道說某些轉(zhuǎn)基因的這種非調(diào)控式表達(dá)有時(shí)會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育中致死現(xiàn)象(Wei等人，Annu Rev Pharmacol Toxicol.，37；119-141，1997)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)方法也廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的遺傳操作(Soriano等人，Genes Dev.，1(4)；366-375，1987；Hirata等人，Cloning Stem Cells.，6(1)；31-36，2004)。基于該技術(shù)，目標(biāo)基因序列通過病毒介導(dǎo)載體引進(jìn)動(dòng)物的基因組。雖然病毒轉(zhuǎn)化比原核注射的效率高，但是由于多重整合會(huì)導(dǎo)致外源基因的隨機(jī)插入和鑲嵌插入(Piedrahita等人，Theriogenology，53(1)；105-116，2000)。另外，轉(zhuǎn)入基因的最大長度通常限制在約7kb，還存在病毒編碼的蛋白引起的潛在干擾因素(Wei等人，Annu Rev Pharmacol Toxicol.，37；119-141，1997；Yanez等人，Gene Ther.，5(2)；149-159，1998)。
為了解決上面提到的問題，我們研發(fā)了一種基因靶向技術(shù)，該技術(shù)能夠在特異位點(diǎn)插入或者去除一段DNA片段?；虬邢蚣夹g(shù)首先應(yīng)用于老鼠的胚胎干細(xì)胞基因功能研究。老鼠胚胎干細(xì)胞目前正被用于進(jìn)行胚胎預(yù)定遺傳修飾。通過使用這種技術(shù)操作鼠胚胎干細(xì)胞，產(chǎn)生了很多特異基因靶向的老鼠(Brandon等人，Curr Biol.，5(6)；625-634，1995；Capecchi等人，Science，244(4910)；1288-1292，1989；Thompson等人，Cell，56(2)；313-321，1989；Hamanaka等人，Hum Mol Genet.，9(3)；353-361，2000；Thomas et al，Cell，51(3)；503-512，1987；te Riele等人，Proc Natl Acad Sci USA，89(11)；5182-5132，1992；Mansour等人，Nature，336(6197)，348-352，1988；Luo等人，Oncogene，20(3)；320-328，2001)。將這種基因靶向技術(shù)推廣到其它的哺乳動(dòng)物，尤其是牲畜，可能帶來巨大的生物醫(yī)學(xué)效益，例如大規(guī)模生產(chǎn)藥用蛋白質(zhì)和動(dòng)物疾病模型。
至今，大部分重組治療性蛋白質(zhì)是利用細(xì)胞，例如酵母、細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞，通過細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生的。然而，由于生產(chǎn)量和高成本限制，很難用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)大規(guī)模的生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)。而且，對(duì)于某些蛋白質(zhì)還需要額外的步驟進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆g后的修飾，例如糖基化、γ-羧基化作用、羥基化作用等等(Houdebine等人，Transgenic Res.，9(4-5)；305-320，2000；Lubo等人，Transgenic Res.，9(4-5)；301-304，2000)。
能生產(chǎn)有價(jià)值的或治療性的蛋白質(zhì)的動(dòng)物生物反應(yīng)器已經(jīng)被認(rèn)為是一種有效的、成本效益高的表達(dá)系統(tǒng)。尤其是從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)治療性重組蛋白質(zhì)，要比從細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)更劃算(van Berkel等人，Nat Biotechnol.，20(5)；484-487，2002)。大家公認(rèn)，在動(dòng)物乳液中產(chǎn)生的重組蛋白經(jīng)過了類似于人體內(nèi)相應(yīng)蛋白質(zhì)的翻譯后的修飾作用(Edmunds等人，Blood，91(12)；4561-4571，1998；Velander等人，Proc Natl Acad SciUSA.，89(24)；12003-12007，1992；van Berkel et al，Nat Biotechnol.，20(5)；484-487，2002)。
牛奶包含約88％的水、3.3％蛋白質(zhì)、其余為碳水化合物和脂肪。酪蛋白構(gòu)成了80％的牛奶蛋白質(zhì)，酪蛋白分成四類αS1、αS2、β和κ酪蛋白。牛奶中β-酪蛋白含量最高，用濃度表達(dá)，在牛奶中的含量達(dá)到10mg/ml(Brophy等人，Nat Biotechnology.，21(2)；157-162，2003)。
體細(xì)胞核移植技術(shù)(SCNT)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物比顯微注射方法更為有效，因?yàn)閹缀跛械脑从谵D(zhuǎn)化體細(xì)胞的克隆動(dòng)物都是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(Brink等人，Theriogenology，53；139-148，2000)。該技術(shù)還能夠預(yù)先確定動(dòng)物的性別并且形成遺傳純合的牧群來生產(chǎn)相同產(chǎn)物。(Lubo等人，Transgenic Res.，9(4-5)；301-304，2000；van Berkel等人，Nat Biotechnol.，20(5)；484-487，2002)。
至今，胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)和用于靶向特異基因的載體構(gòu)建體被認(rèn)識(shí)是產(chǎn)生基因靶向動(dòng)物的先決條件。盡管有些研究表明在豬和牛體內(nèi)能夠生成ES類似細(xì)胞，但是，來源于大的牲畜ES細(xì)胞的使用還是受到了限制(Doetschman等人，Dev Biol.，127(1)；224-227，1988；Stice等人，Biol Reprod.，54(1)；100-110，1996；Sukoyan等人，MolReprod Dev.，36(2)；148-158，1993；Iannaccone等人，Dev Biol.，163(1)；288-292，1994；Pain等人，Development，122(8)；2339-2348，1996；Thomson等人，Proc Natl Acad Sci USA.，92(17)；7844-7848，1995；Wheeler等人，Reprod Fertil Dev.，6(5)；563-568，1994)。
作為替代，利用正常體細(xì)胞作為核供體細(xì)胞被認(rèn)為是一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛的有效的、可行的方法(Brophy等人，Nat Biotechnol.，21(2)；157-162，2003；Cibelli等人，Science，280(5367)；1256-1258，1998；Campbell等人，Nature，380(6569)；64-66，1996；Wilmut等人，Experientia，47(9)；905-912，1997；Denning等人，Cloning stem cells，3(4)；221-231，2001)，這就暗示了體細(xì)胞取代胚胎干細(xì)胞被用于靶向特異基因的可能性。
運(yùn)用體細(xì)胞核移植(SCNT)技術(shù)，使用乳蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)指導(dǎo)重組蛋白在轉(zhuǎn)基因大型動(dòng)物乳液中進(jìn)行表達(dá)(Schnieke等人Science，278(5346)；2130-2133，1997；Baguisi等人，Nat Biotechnol.，17(5)；456-461，1999；Brophy等人，Nat Biotechnol.，21(2)；157-162，2003)。然而，將該技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物仍然不可行除非因基因隨機(jī)插入而導(dǎo)致的低表達(dá)和(或)異常表達(dá)問題得到了解決。外源基因的異常表達(dá)引起早期胚胎致死，這種情況在神經(jīng)系統(tǒng)尤其嚴(yán)重，因?yàn)榇蠖鄶?shù)神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)在胚胎晚期和出生后早期階段進(jìn)行發(fā)育(Gao等人，Neurochem Res.，24(9)；1181-1188，1999)。為了消除或者減少這些副效應(yīng)，發(fā)明了一種允許外源基因只在泌乳期并且嚴(yán)格控制在乳腺中表達(dá)的新方法(Houdebine等人，Transgenic Res.，9(4-5)；305-320，2000)。通過同源重組事件向基因組導(dǎo)入特異位點(diǎn)修飾的基因靶向是用于組織特異性表達(dá)重組蛋白的高效工具(Muller等人，Mech Dev.，82(1-2)；3-21，1999；Clark等人，J Mammary Gland Biol Neoplasia.，3(3)；337-350，1998)。
第一只基因敲入的綿羊的誕生，已經(jīng)打開了可能生產(chǎn)藥用外源蛋白靶向的大型動(dòng)物的大門(McCreath等人，Nature，405(6790)；1066-1069，2000)。開發(fā)了具有COL1A1基因同源區(qū)域的COLT-2靶向載體以富集基因靶向事件中的啟動(dòng)子-陷阱，其中COL1A1基因在纖維原細(xì)胞中高度表達(dá)。。在綿羊β乳球蛋白(BLG)表達(dá)載體中包含有與人類α1-胰蛋白酶(AAT)互補(bǔ)DNA的AATC2轉(zhuǎn)基因，被設(shè)計(jì)為在乳腺中直接表達(dá)，該轉(zhuǎn)基因具有獨(dú)自的轉(zhuǎn)錄單位。從靶向小羊體內(nèi)分泌出的AAT量比從用多重和隨機(jī)整合該基因的綿羊體內(nèi)分泌量的37倍還多(McCreath等人，Nature，405(6790)；1066-1069，2000)。所以，現(xiàn)在基因靶向技術(shù)被視為生產(chǎn)大量藥用蛋白的最有效方法。然而，應(yīng)用啟動(dòng)子-捕獲靶向載體限于體細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的基因。通常，轉(zhuǎn)錄活性基因比沉默基因更易于修正基因靶向作用，因?yàn)?，轉(zhuǎn)錄活性基因具有更高的同源重組頻率(Kuroiwa等人，NatGenet.，36(7)；775-780，2004)。
乳蛋白質(zhì)在乳腺中以組織特異方式進(jìn)行表達(dá)。通過操作乳蛋白編碼基因，使得在不引起胚胎期或者出生后的發(fā)育致死情況下過量表達(dá)外源基因成為可能。在這些蛋白中，β-酪蛋白由于其豐富的表達(dá)而成為最佳候選者之一。牛β-酪蛋白在整個(gè)基因組中以單拷貝形式存在，而且不知道在除了乳腺細(xì)胞的體細(xì)胞中表達(dá)。通過利用啟動(dòng)子-陷阱載體，還不能成功將外源基因靶向進(jìn)入不能在正常體細(xì)胞表達(dá)的β-酪蛋白基因中。
基于這種背景技術(shù)，本發(fā)明人發(fā)明了牛β-酪蛋白基因特異的靶向載體盒，利用該盒插入外源基因的載體，導(dǎo)入所述載體的牛體細(xì)胞，以及用所述的牛體細(xì)胞進(jìn)行核移植的胚胎。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)外源基因正確地靶向牛基因組DNA的β-酪蛋白基因中，并且確認(rèn)了利用所述的載體靶向事件是高效的。所以，利用所述的牛β-酪蛋白基因靶向載體盒，本發(fā)明人完成了可以產(chǎn)生大規(guī)模目的藥用蛋白的轉(zhuǎn)基因牛。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種牛β-酪蛋白質(zhì)基因靶向載體，該載體包括(1)具有5至12kb長度的第一區(qū)域，該區(qū)域和牛β-酪蛋白質(zhì)基因的啟動(dòng)子和側(cè)翼核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白質(zhì)基因的外顯子1、內(nèi)含子1和外顯子2；(2)用于克隆編碼目的蛋白質(zhì)的核酸的區(qū)域；(3)編碼正選擇標(biāo)記的區(qū)域；(4)具有2.8至3.5kb長度的第二區(qū)域，該區(qū)域和牛β-酪蛋白質(zhì)基因的核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白基因外顯子5、6、7和8，以及內(nèi)含子5、6和7；其中，按照β-酪蛋白質(zhì)基因5’-3’的排列方向，和第一區(qū)域相應(yīng)的核酸片段位于和第二區(qū)域相應(yīng)的核酸片段的上游。
本發(fā)明的另一目的是提供了一種利用上述靶向載體牛β-酪蛋白基因靶向的牛體細(xì)胞。
本發(fā)明的另一目的是提供了一種利用上述體細(xì)胞進(jìn)行核移植的胚胎。
本發(fā)明的另一目的是提供了一種制備牛β-酪蛋白質(zhì)基因靶向的體細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟(1)將上述載體導(dǎo)入牛體細(xì)胞；(2)在牛體細(xì)胞中發(fā)生同源重組事件；(3)篩選牛β-酪蛋白基因靶向的體細(xì)胞。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備轉(zhuǎn)基因牛的方法，該方法包括以下步驟(1)將上述載體導(dǎo)入牛體細(xì)胞；(2)在牛體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組事件；(3)篩選牛β-酪蛋白基因靶向的體細(xì)胞；(4)將上述基因靶向細(xì)胞導(dǎo)入去核的卵母細(xì)胞，產(chǎn)生核移植的胚胎；和(5)將上述胚胎植入一個(gè)代孕體以產(chǎn)生克隆的轉(zhuǎn)基因牛。
本發(fā)明還有另一目的是提供一種從上述方法產(chǎn)生的克隆牛的牛奶中制備大規(guī)模的目的藥用蛋白質(zhì)的方法。


圖1描述了源于質(zhì)粒pBluescriptII SK(+)靶向牛β-酪蛋白基因的18.8kbpBCKII載體盒。該載體還包括neo基因上游的SacII、NotI、和BamHI限制性酶切位點(diǎn)，以及短臂區(qū)下游的BamHI位點(diǎn)。
圖2描述了源于質(zhì)粒pGEM-7Zf(+)(Promega公司)的靶向牛β-酪蛋白基因的14.8kbpBCKIII載體。
圖3描述了源于質(zhì)粒pGEM-7Zf(+)的靶向牛β-酪蛋白基因的16.1kb pBCKIDTII載體。該載體也還包括neo基因上游的SacII、NotI、和BamHI限制性酶切位點(diǎn)，以及短臂區(qū)下游的BamHI位點(diǎn)。而且，還插入了1.3kb的白喉毒素(DT)基因作為負(fù)選擇標(biāo)記物。
圖4顯示了pBCKII載體和基因組中的β-酪蛋白基因之間的同源重組。雙交換導(dǎo)致內(nèi)源β-酪蛋白基因被載體盒中的序列取代。
圖5顯示了pBCKIII載體和基因組中的β-酪蛋白基因之間的同源重組。雙交換事件導(dǎo)致基因組中β-酪蛋白基因基因座部分序列被載體盒中的部分序列取代。
圖6顯示了pBCKIDTII載體和基因組中的β-酪蛋白基因之間的同源重組。雙交換導(dǎo)致內(nèi)源β-酪蛋白基因被載體盒中的序列取代。同源重組事件的結(jié)果是DT基因被刪除。
圖7顯示了用于鑒定發(fā)生在牛β-酪蛋白基因座、和跨越靶向β-酪蛋白基因座與pBCKII、pBCKIII靶向載體盒中限制性酶切位點(diǎn)連接的DNA序列的基因靶向事件的PCR篩選策略。上面部分顯示兩條引物的大概位置，這兩條引物是用于擴(kuò)增從β-酪蛋白基因靶向載體中特有的neo基因區(qū)域至載體盒中沒有使用的內(nèi)源性β-酪蛋白基因座之間的4kb片段。序列A顯示跨越長臂區(qū)和neo基因連接的部分DNA序列。序列B顯示跨越neo基因和短臂區(qū)連接的部分DNA序列。顯示了5’PCR引物的位置和方向。序列C顯示跨越短臂區(qū)和內(nèi)源性β-酪蛋白基因基因座之間連接的部分DNA序列，內(nèi)源性β-酪蛋白基因基因座不包括在BCKII和BCKIII載體中。顯示了3’PCR引物的位置和方向。
圖8顯示了用于鑒定發(fā)生在牛β-酪蛋白基因座、和跨越靶向β-酪蛋白基因座和pBCKIDTII靶向載體盒中限制性酶切位點(diǎn)連接DNA序列的基因靶向事件的PCR篩選策略。上面部分顯示兩對(duì)引物的大概位置，這兩對(duì)引物用于擴(kuò)增從β-酪蛋白基因靶向載體中特有的neo基因區(qū)至載體盒中沒有使用的內(nèi)源性β-酪蛋白基因座區(qū)之間的4kb和3.4kb片段。這里，使用第一對(duì)引物擴(kuò)增4kb PCR片段后，再用第二對(duì)引物擴(kuò)增3.4kbPCR片段以得到少量DNA樣品。序列A顯示跨越長臂區(qū)和neo基因之間連接的部分DNA序列。序列B顯示跨越neo基因和短臂區(qū)之間連接的部分DNA序列。顯示了5’PCR引物的位置和方向。序列C顯示跨越短臂區(qū)和內(nèi)源性β-酪蛋白基因基因座之間連接的部分DNA序列，內(nèi)源性β-酪蛋白基因基因座不包括在BCKII和BCKIII載體中。顯示了3’PCR引物的位置和方向。
圖9顯示了我們以前研究中構(gòu)建的pBC10載體(Kim等人，J Biochem(Tokyo).，126(2)；320-5，1999)。pBC10載體基于pBluescriptII SK載體骨架包括10kb長的牛β-酪蛋白啟動(dòng)子區(qū)。這個(gè)啟動(dòng)子區(qū)包括8kb的基因5’側(cè)翼序列、非翻譯的外顯子1和2(垂直空白框)、和2kb的牛β-酪蛋白基因內(nèi)含子1。啟動(dòng)子包含SacI、AatII和SacII限制性酶切位點(diǎn)，但是沒有其它諸如SmaI、BamHI、SalI、SpeI和ClaI限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列。
圖10顯示了用SacI和SacII限制性內(nèi)切酶消化的pBC10載體中分離的10kbDNA片段。該分離的10kbDNA片段用于構(gòu)建pBCKII載體盒的長臂。
圖11顯示了用AatII和SacII限制性內(nèi)切酶消化的pBC10載體中分離的6kbDNA片段。該分離的6kb DNA片段用于構(gòu)建pBCKIII載體盒的長臂。
圖12顯示了用于pBCKII和pBCKIII載體盒短臂的pBC3.1載體構(gòu)建過程。使用含有XhoI和SalI位點(diǎn)(黑體字母)的引物對(duì)從牛染色體DNA中通過PCR擴(kuò)增制備含有牛β-酪蛋白基因的5、6、7和8外顯子的3.2kb DNA片段。用限制性內(nèi)切酶XhoI和SalI消化所擴(kuò)增的PCR片段，然后連接到載體pGEM-T(Promega公司)的限制性內(nèi)切酶SalI位點(diǎn)。用限制性內(nèi)切酶HincII和SalI消化pGEM-T載體中的3.2kbDNA片段，然后連接到載體pBluescriptII SK(+)中的SalI位點(diǎn)。
圖13顯示了獲得neo基因的過程，neo基因包括來源于載體pMAMneo(CLONTECH公司)的SV40復(fù)制起始點(diǎn)、早期啟動(dòng)子、抗新霉素基因、SV40早期剪接區(qū)和多聚腺苷酸化位點(diǎn)。用限制性內(nèi)切酶BamHI消化的2.7kb neo基因片段，連接到載體pBluescriptII SK(+)的BamHI位點(diǎn)。用限制性內(nèi)切酶BglII和BamHI消化載體pBluescriptIISK(+)中neo基因的2kbDNA片段，連接到載體pSP73(Promega公司)中的BglII位點(diǎn)。用限制性內(nèi)切酶BglII和EcoRV消化載體pSP73中的2kb片段，然后再次連接到包含0.7kb neo基因的載體pBluescriptII SK(+)中的BglII和EcoRV酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生pneo2.7載體構(gòu)建體。
圖14顯示了pBCKII和pBCKIII載體盒構(gòu)建過程。用各自的限制性內(nèi)切酶消化pBluescript II SK(+)中的相當(dāng)于正選擇標(biāo)記和短臂區(qū)的DNA片段，然后連接到含有pBC10DNA片段的載體pBluescriptII SK(+)中的BamHI、EcoRV和SalI位點(diǎn)。所得到的pBCKII載體包括10kb的長臂區(qū)、選擇標(biāo)記基因和短臂區(qū)。為了縮短pBCKII的長臂長度，將用限制性內(nèi)切酶AatII和SalI消化的DNA片段連接到載體pGEM7Zf(+)的AatII和XhoI位點(diǎn)。所得到的載體pBCKIII包括6kb的長臂區(qū)、neo基因和短臂區(qū)。
圖15顯示了獲得DT基因的過程，將來源于pKO SelectDT(Lexicon Genetics公司)的DT基因插入pBCKIDTII載體。用限制性內(nèi)切酶RsrII分離包含SV40多聚腺苷酸和RNA聚合酶II啟動(dòng)子的白喉毒素A(DT)基因。使用klenow片段補(bǔ)平被分離的DT基因后，將其插進(jìn)載體pBluescriptII SK(+)(Stratagene公司)中的HindII位點(diǎn)，生成pSKDT載體。用限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRV消化pSKDT載體中的DT基因，然后連接到pSP73載體(Promega公司)中的XhoI和PvuII位點(diǎn)，生成pSP73DT載體構(gòu)建體。
圖16描述了pBCKIDTII載體盒的構(gòu)建過程。用限制性內(nèi)切酶XhoI和SalI消化pSP73DT載體中的DT基因，然后連接到pBCKII載體盒的SalI位點(diǎn)，生成pBCKIDTI載體。用AatII和SalI酶切所得到的pBCKIDTI載體，然后連接到pGEM-7Zf(+)載體(Promega公司)中的AatII和XhoI位點(diǎn)，生成pBCKIDTII載體盒。
圖17顯示了把一個(gè)有價(jià)值的基因?qū)雙BCKII載體。以藥用蛋白質(zhì)基因示例，將人類促血小板生成素(hTPO)cDNA插入本發(fā)明的pBCKII載體盒中。在我們先前實(shí)驗(yàn)中，以全長形式編碼的1.0kb的hTPO cDNA用PCR擴(kuò)增，和將300bp長的牛生長素(bGH)基因的多聚腺苷酸附加信號(hào)序列連接到hTPO cDNA片段下游的KpnI位點(diǎn)(Sohn，DNA Cell Biol.，18(11)；845-852，1999)。將包含hTPO cDNA和bGH基因的1.3kbDNA片段插入pBCKII載體中的SacII和NotI位點(diǎn)，生成20.1kb的pBCTPOKII載體構(gòu)建體。
圖18顯示了將hTPO cDNA導(dǎo)入pBCKIII載體盒。生成了16.1kb的pBCTPOKIII構(gòu)建體并且其構(gòu)建過程同圖17描述的一樣。
圖19顯示了將hTPO cDNA導(dǎo)入pBCKIDTII載體盒。結(jié)果，生成了17.4kb的pBCTPOKIDTII構(gòu)建體，并且其構(gòu)建過程同圖17描述的一樣圖20顯示了用SalI消化后，用于轉(zhuǎn)染的線性化pBCTPOKII載體。
圖21顯示了用AatII消化后，用于轉(zhuǎn)染的線性化pBCTPOKIII載體。
圖22顯示了用AatII和ClaI消化刪除質(zhì)粒載體后，用于轉(zhuǎn)染的線性化pBCTPOKIDTII載體。
圖23顯示了用AatII和ClaI消化刪除質(zhì)粒載體后，用于轉(zhuǎn)染的線性化pBCTPOKIII載體。然而，圖21描述的pBCTPOKIII載體僅僅是被線性化并利用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這里描述的是用兩種限制性內(nèi)切酶消化刪除質(zhì)粒載體后的pBCTPOKIII載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
圖24顯示了牛胚胎纖維原細(xì)胞(bEF)和牛耳皮纖維原細(xì)胞(bESF)的形態(tài)學(xué)照片。A和B分別是非轉(zhuǎn)染的(正常)bEF和bESF細(xì)胞，培養(yǎng)至匯合。C和D分別顯示了靶向載體轉(zhuǎn)染到bEF和bESF后形成的克隆。使用LipofectamineTM2000試劑(Invitrogen公司)方法，將具有neo耐抗生素基因的靶向載體導(dǎo)入bEF和bES后，用G418(Gibco，Invitrogen corporation公司)處理被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，然后，僅對(duì)存活的克隆細(xì)胞進(jìn)行關(guān)于插入外源基因的分析。
圖25顯示了pBCKIII轉(zhuǎn)染后存活的克隆細(xì)胞的PCR分析。箭頭所指的500bp PCR片段的陽性信號(hào)代表轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆，被表示為“+”，陰性信號(hào)被表示為“-”。將本發(fā)明的pBCTPOKIII載體用作陽性對(duì)照，并使用hTPO基因特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
圖26和圖27描述了pneoBC3.7載體構(gòu)建過程，pneoBC3.7載體將被用作長鏈PCR分析的對(duì)照。使用一對(duì)引物從牛染色體DNA中通過PCR擴(kuò)增單獨(dú)制備相當(dāng)于牛β-酪蛋白基因的從7888位至8479位堿基的包含內(nèi)含子8和外顯子9的591bp DNA片段。3’引物含有XhoI位點(diǎn)，用粗體符號(hào)(boldcharacter)描述。將擴(kuò)增的PCR片段連接到pGEM-T載體，生成pBC591載體構(gòu)建體。用限制性內(nèi)切酶SalI和XhoI消化pBC591載體，然后將生成的DNA片段連接到pBC3.1載體的SalI位點(diǎn)。同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRV消化pneo2.7載體，然后將生成的DNA片段連接到用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRV消化的pBC3.1載體，生成pneoBC3.7載體。箭頭顯示了用于4kb長鏈PCR分析的引物對(duì)。
圖28顯示了用pBCTPOKIII.轉(zhuǎn)染的bESF細(xì)胞克隆的長鏈PCR分析結(jié)果。箭頭所示的4kb陽性信號(hào)代表靶向細(xì)胞克隆，在“81”和“89”兩個(gè)克隆中被檢測(cè)到，其他的克隆顯示陰性信號(hào)(-)。將pneoBC3.7載體用作陽性對(duì)照。
圖29顯示了用pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII轉(zhuǎn)染的bESF細(xì)胞克隆的長鏈PCR分析結(jié)果。箭頭所示3.4kb陽性信號(hào)代表靶向細(xì)胞克隆。第一次是對(duì)約五個(gè)細(xì)胞進(jìn)行PCR分析，然后第二次對(duì)第一次的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR分析，顯示了得到了3.4kb的陽性信號(hào)(圖8)。A是用pBCTPOKIDTII載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆的長鏈PCR分析結(jié)果，編號(hào)5、30、17、18、20、21、和26細(xì)胞克隆確定為被基因靶向。B是用pBCTPOKIII載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆的長鏈PCR分析結(jié)果，編號(hào)16細(xì)胞克隆確定為被基因靶向。C是作為陰性對(duì)照(-)的野生型?；蚪MDNA的長鏈PCR結(jié)果，pneoBC3.7載體作為陽性對(duì)照(+)。
圖30顯示了確定靶向核酸序列的Southern印跡分析策略。用EcoRI消化BCTPOKIII載體和從轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆中純化的基因組DNA。用EcoRI限制性內(nèi)切酶消化后的BCTPOKIII載體(A)和基因組(B)的DNA片段長分別是9.2kb和9.9kb。hTPO基因下面的帶代表用于Southern分析的探針位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增hTPO cDNA的500bp片段用作探針。
圖31顯示了通過Southern印跡分析來確定靶向克隆。81和89號(hào)兩個(gè)克隆確定為本發(fā)明的pBCTPOKIII載體靶向的內(nèi)源性牛β-酪蛋白基因基因座。靶向克隆顯示出9.9kb片段，其它克隆97、47、43和34沒有顯示任何信號(hào)。不同濃度的牛基因組DNA作為陰性對(duì)照，不同濃度的來自于pBCTPOKIII載體的9.2kb片段作為陽性對(duì)照。
圖32顯示了對(duì)81號(hào)細(xì)胞克隆的核移植胚胎的PCR分析。356bp長度的陽性(+)信號(hào)暗示克隆胚胎來自于本發(fā)明pBCTPOKIII載體靶向的體細(xì)胞。pBCTPOKIII載體作為陽性對(duì)照。用嵌套PCR重新確定陽性信號(hào)。
圖33照片顯示了在懷孕36天收集的由89號(hào)細(xì)胞克隆(A)發(fā)育的胚胎膜包裹的胎兒(A)、除去胚胎膜的胎兒(B)、和從胚胎膜上得到的細(xì)胞(C)和對(duì)來自胚胎膜的細(xì)胞的長鏈PCR結(jié)果(D)。4kb的陽性信號(hào)說明本發(fā)明的pBCTPOKIII載體靶向與克隆的胚胎遺傳相同的細(xì)胞，。pneoBC3.7載體用作陽性對(duì)照。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及制備牛β-酪蛋白基因靶向載體以用于生產(chǎn)β-酪蛋白基因靶向牛，該靶向?？蓮呐Ｄ讨挟a(chǎn)生大量的目的治療性蛋白質(zhì)。牛一年最多產(chǎn)奶6,300升，而山羊和綿羊一年分別產(chǎn)奶300和200升。牛是被用作動(dòng)物生物反應(yīng)器的最佳物種，然而，還沒有關(guān)于把目的基因靶向牛體內(nèi)的牛奶蛋白質(zhì)基因的報(bào)告。本發(fā)明涉及能夠靶向牛奶蛋白質(zhì)基因中的牛β-酪蛋白基因的載體構(gòu)建體和制備β-酪蛋白基因靶向牛的方法，該靶向牛使用本發(fā)明的載體構(gòu)建體產(chǎn)生大量的治療性蛋白質(zhì)。
一方面，本發(fā)明涉及的牛β-酪蛋白基因靶向載體，該載體包括(1)具有5至12kb長度的第一區(qū)域，該區(qū)域和牛β-酪蛋白質(zhì)基因的啟動(dòng)子和其側(cè)翼核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白質(zhì)基因的外顯子1、內(nèi)含子1和外顯子2；(2)克隆編碼目的蛋白質(zhì)的核酸的區(qū)域；(3)編碼陽性選擇標(biāo)記物的區(qū)域；(4)具有2.8至3.5kb長度的的第二區(qū)域，該區(qū)域和牛β-酪蛋白質(zhì)基因的核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白基因外顯子5、6、7和8，以及內(nèi)含子5、6和7；其中，按照β-酪蛋白質(zhì)基因5’-3’的排列方向，與第一區(qū)域相應(yīng)的核酸片段位于與第二區(qū)域相應(yīng)的核酸片段的上游。
這里所用的“基因靶向載體”術(shù)語，是指一種能夠?qū)⒁粋€(gè)目的基因去除或者插入到一個(gè)特異基因基因座的載體，它包括一段與用于同源重組的特定基因同源的核酸序列。本發(fā)明的基因靶向載體是β-酪蛋白靶向載體，它將編碼目的蛋白質(zhì)的核酸序列按5’-3’排列插入基因組中的β-酪蛋白基因。術(shù)語載體和載體盒在此可以交替使用，載體可以是環(huán)形或者線性的。本發(fā)明的基因靶向載體是牛β-酪蛋白基因靶向載體。
本發(fā)明的β-酪蛋白靶向載體包括與β-酪蛋白基因序列同源的第一區(qū)域和第二區(qū)域，它們位于克隆位點(diǎn)的前后位置。第一區(qū)域?qū)?yīng)于長臂，第二區(qū)域?qū)?yīng)于短臂。
在發(fā)明的牛β-酪蛋白基因靶向載體組件中，特別是，“第一區(qū)域”和“第二區(qū)域”是決定基因靶向效率的重要參數(shù)。
這里的“第一區(qū)域”，特征是具有5至12kb的長度，該區(qū)域具有與牛β-酪蛋白基因啟動(dòng)子及其側(cè)翼序列同源的DNA序列，包括牛β-酪蛋白基因的外顯子1-2和內(nèi)含子1。牛β-酪蛋白基因啟動(dòng)子是已知的誘導(dǎo)外源蛋白質(zhì)高效表達(dá)的理想啟動(dòng)子(Kim等人，J Biochem(Tokyo).，126(2)；320-325，1999)，并且是用來表達(dá)大量目的外源蛋白質(zhì)的理想候選者。尤其是，5.5kb至10kb是優(yōu)選的長度。
這里的“第二區(qū)域”，特征是具有2.8至3.5kb長度的與牛β-酪蛋白基因DNA序列同源的序列，并且包括牛β-酪蛋白基因的外顯子5-8和內(nèi)含子5-7。3.0kb至3.2kb是優(yōu)選長度。
按牛β-酪蛋白基因5’-3’排列，所述第一區(qū)域位于所述第二區(qū)域的上游。
這里所用的“同源性”術(shù)語，是指第一區(qū)域或第二區(qū)域的核酸序列與對(duì)應(yīng)于這些第一和第二區(qū)域的內(nèi)源β-酪蛋白基因序列之間的相似程度。當(dāng)序列顯示至少90％的，優(yōu)選至少95％的序列相同性時(shí)，序列彼此同源。
這里所用的“(多)克隆位點(diǎn)”(MCS)術(shù)語，是指包含至少兩個(gè)能被限制性內(nèi)切酶特異識(shí)別并消化的不同核苷序列的核酸序列以允許插入編碼目的蛋白質(zhì)的核酸序列。
能夠插入本發(fā)明載體上的MCS的目的蛋白質(zhì)，可以包括所有應(yīng)用于醫(yī)藥的或者工業(yè)的蛋白質(zhì)，例如激素、細(xì)胞因子、酶、凝血因子、載體蛋白質(zhì)、受體、調(diào)控蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、抗體、抗原等。
目的蛋白質(zhì)具體的實(shí)例包括，但不限于，血小板生成素、人生長素、生長素釋放激素、生長素釋放多肽、干擾素、干擾素受體、集落刺激因子、胰高血糖素類多肽、G蛋白偶聯(lián)受體、白細(xì)胞介素、白細(xì)胞介素受體、酶、白細(xì)胞介素結(jié)合蛋白、細(xì)胞因子結(jié)合蛋白、巨噬細(xì)胞活化因子、巨噬細(xì)胞多肽、B細(xì)胞因子、T細(xì)胞因子、蛋白A、過敏反應(yīng)抑制因子、細(xì)胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制因子、轉(zhuǎn)化生長因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、載脂蛋白-E、紅細(xì)胞蛋白、高糖基化紅細(xì)胞蛋白、血管生成素、血色素、凝血酶、凝血酶受體激活肽、血栓調(diào)節(jié)蛋白、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX，因子X III、纖溶酶原激活物、纖維結(jié)合蛋白、尿激酶、鏈激酶、水蛭素、蛋白C、C-反應(yīng)蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制劑、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板衍生生長素、上皮生長因子、表皮生長因子、血管抑制素、血管緊張素、成骨生長因子、生骨刺激蛋白、降血鈣素、胰島素、心房肽激素、軟骨誘導(dǎo)因子、elcatonin、結(jié)締組織活化蛋白、組織因子通路抑制劑、促卵泡刺激素、促黃體素、促卵泡激素釋放激素、神經(jīng)生長素、甲狀腺激素、松弛肽、促胰液素、生長調(diào)節(jié)素、類胰島素生長因子、促腎上腺皮質(zhì)激素、胰高血糖素、縮膽囊素、胰多肽、胃泌素釋放多肽、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、甲狀腺刺激激素、生育酚(autotaxin)、乳鐵蛋白、肌肉生長抑制素、受體、受體拮抗劑、細(xì)胞表面抗原、病毒衍生疫苗抗原、單克隆抗體、多克隆抗體等等。
這里所用的“選擇標(biāo)記”術(shù)語，是篩選載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞所必需的。選擇標(biāo)記基因賦予了對(duì)藥物、營養(yǎng)需要和細(xì)胞毒素藥物的抗性，或者誘導(dǎo)了諸如熒光和色彩儲(chǔ)存等可選擇的表現(xiàn)型。有”陽性選擇標(biāo)記”和”陰性選擇標(biāo)記”?！瓣栃赃x擇標(biāo)記”使得細(xì)胞表達(dá)陽性選擇標(biāo)記以抵抗所選試劑而存活，所以，能夠賦予了表達(dá)那個(gè)標(biāo)記的細(xì)胞陽性選擇特征。陽性選擇標(biāo)記包括，但并不限于，新霉素、潮霉素、組氨醇脫氫酶、鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶等等。
本發(fā)明的載體包含了陰性選擇標(biāo)記作為附加組件?！瓣幮赃x擇標(biāo)記”去除隨機(jī)整合的細(xì)胞，從而使表達(dá)那個(gè)標(biāo)記的細(xì)胞具有陰性選擇特征。陰性選擇標(biāo)記包括，但并不限于，胸苷激酶(tk)、次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Hprt)、胞嘧啶脫氨酶、白喉毒素(DT)等等。陰性選擇標(biāo)記位于第一DNA序列的5’末端或者第二DNA序列的3’末端。在這些陰性選擇標(biāo)記中，tk和DT用得普遍。在本發(fā)明中，DT基因用作陰性選擇標(biāo)記。Tk要求丙氧鳥苷處理，然而，DT不需要任何其他的處理。據(jù)報(bào)道，用丙氧鳥苷處理攜帶tk的細(xì)胞，對(duì)共培養(yǎng)的非修飾細(xì)胞顯示了有效的“旁觀者效應(yīng)”，并且丙氧鳥苷抑制細(xì)胞生長(Yoshiyasu Kaneko等人，Cancer Letters，96；105-110，1995)。在那些方面，DT比tk更優(yōu)選。
本發(fā)明的陽性和陰性選擇標(biāo)記具有獨(dú)立的啟動(dòng)子和多聚腺苷酸(poly A)區(qū)域。啟動(dòng)子包括，但并不限于，猿病毒40(SV40)啟動(dòng)子、老鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、人免疫缺陷病毒長末端重復(fù)序列(HIV-LTR)啟動(dòng)子、莫洛尼氏病毒啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、埃-巴二氏病毒(EBV)啟動(dòng)子、呼吸合胞體病毒(RSV)啟動(dòng)子、RNA聚合酶II啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、人血色素啟動(dòng)子、人肌肉肌氨酸啟動(dòng)子等等。
編碼目的蛋白質(zhì)的核酸，通過同源重組被整合進(jìn)宿主細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞基因組DNA中的β-酪蛋白基因基因座，并且取代內(nèi)源性β-酪蛋白在細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)。
為了提高同源重組事件效率，本發(fā)明的牛β-酪蛋白基因靶向載體具有以下特征。
將編碼目的蛋白質(zhì)的核酸基因整合進(jìn)細(xì)胞基因組DNA的β-酪蛋白基因基因座的效率，顯示出與靶向載體系統(tǒng)，特別是與同源區(qū)域核酸序列的相似程度和長度有關(guān)(Scheerer等人，Mol Cell Biol.，14(10)6663-6673，1994；Thomas等人，Cell，51(3)；503-512，1987；Hasty等人，Mol Cell Biol.，11(11)；5586-5591，1991；Lu等人，Blood，102(4)；1531-1533，2003)。本發(fā)明通過優(yōu)化第一和第二區(qū)域的同源區(qū)位置和長度，使效率最大化。另外，為了使同源重組事件發(fā)生時(shí)位置干涉最小化，將本發(fā)明載體的陽性選擇標(biāo)記插入相應(yīng)于牛β-酪蛋白基因的外顯子3-4和內(nèi)含子2-4的區(qū)域基因座。另外，在本發(fā)明中，在“第一區(qū)域”后部設(shè)計(jì)多克隆位點(diǎn)(MCS)，以便于插入外源蛋白質(zhì)基因。另外，本發(fā)明最終載體設(shè)計(jì)有別于先前的載體(SHEN Wei等人，Chinese Journal ofBiotechnology，20(3)；361-365，2004)，本發(fā)明最終載體包含用于基因靶向的編碼目的蛋白質(zhì)的基因的。在先前報(bào)道的載體中存在3個(gè)用于同源重組事件的同源區(qū)域，是因?yàn)榫幋a目的蛋白質(zhì)的基因被隨機(jī)插入載體的第一區(qū)域(SHEN Wei等人，Chinese Journal ofBiotechnology，20(3)；361-365，2004)。然而，在本發(fā)明的載體中只存在兩段用于重組事件的同源區(qū)域，因?yàn)?，編碼目的蛋白質(zhì)的基因被插進(jìn)載體的MCS中。因此，當(dāng)使用本發(fā)明的載體盒時(shí)，基因靶向載體結(jié)構(gòu)簡單，且載體靶向效率比先前的載體高很多(SHEN Wei等人，Chinese Journal of Biotechnology，20(3)；361-365，2004)。
事實(shí)上，本發(fā)明載體系統(tǒng)甚至在轉(zhuǎn)錄沉默的體細(xì)胞中誘導(dǎo)同源重組事件發(fā)生，導(dǎo)致外源蛋白質(zhì)基因穩(wěn)定地整合到β-酪蛋白基因的基因座。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)先實(shí)施方案中，制備pBCKII和pBCKIII載體、和攜帶陰性選擇標(biāo)記的pBCKIDTI和pBCKIDTII載體用作靶向載體。
pBCKII載體，約18.8kb長，起源于pBluescriptII SK(+)質(zhì)粒。pBCKI I載體的第一區(qū)域大約10kb長，它包括8kb的攜帶牛β-酪蛋白啟動(dòng)子和牛β-酪蛋白基因的外顯子1、內(nèi)含子1和外顯子2的序列。pBCKII載體的第二區(qū)域大約3.1kb長，且它包括外顯子5-8、內(nèi)含子5-7和內(nèi)含子4和8的一部分，如圖2所示。pBCKII載體包括作為選擇標(biāo)記物的neo基因、SV40早期啟動(dòng)子和多聚腺苷酸序列。pBCKII載體包括3個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(SacII、NotI和BamHI)，用于插入編碼目的蛋白質(zhì)的核酸，如圖1所示。
pBCKII載體，約14.8kb長，源于pGEM7Zf(+)質(zhì)粒。pBCKIII載體的第一區(qū)域大約6kb長，它包括約4kb長的牛β-酪蛋白啟動(dòng)子和牛β-酪蛋白的外顯子1、內(nèi)含子1和外顯子2。pBCKIII載體的第二區(qū)域大約3.1kb長，它包括外顯子5-8、內(nèi)含子4-7和內(nèi)含子4和8的一部分，如圖2所示。pBCKIII載體包括作為選擇標(biāo)記的neo基因、SV40早期啟動(dòng)子和多聚腺苷酸序列。pBCKIII載體包括3個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(SacII、NotI和BamHI)，用于插入編碼目的蛋白質(zhì)的核酸，如圖2所示。
在pBCKII和pBCKIII載體的XhoI和SalI位點(diǎn)插入DT基因，產(chǎn)生pBCKIDTI和pBCKIDTII載體。
應(yīng)用普通的DNA重組技術(shù)能夠制備本發(fā)明的靶向載體。應(yīng)用本領(lǐng)域公知的酶能夠完成特殊位點(diǎn)的剪切和連接。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將人血小板生成素(TPO)基因插入BCKII和BCKIII(圖17、18和19)。構(gòu)建側(cè)翼為0.3kb牛生長素(bGH)基因片段的1kb人TPO cDNA片段(Sohn等人，DNA Cell Biol.，18(11)；845-852，1999)。被插入的bGH基因用于編碼穩(wěn)定的信使RNA。
人血小板生成素是主要的造血調(diào)控子之一，它參與一系列的巨核細(xì)胞生成過程，即誘導(dǎo)血小板生成的巨核細(xì)胞增殖和分化。作為血小板生成的主要生理調(diào)控子，它在促進(jìn)巨核細(xì)胞的增殖和成熟中扮演關(guān)鍵角色。對(duì)血液系統(tǒng)癌癥和實(shí)體腫瘤患者進(jìn)行侵襲性化療和骨髓移植時(shí)，可以觀察到嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥(Lok等人，StemCells，12(6)；586-598，1994；Kaushansky等人，Stem Cells，15(1)；97-102，102-103，1997；Kaushansky等人，Ann Intern Med.，126(9)；731-733，1997；Kaushansky等人，Leukemia，11(3)；426-427，1997；Kaushansky等人，Annu Rev Med.，48；1-11，1997)。已確認(rèn)，在動(dòng)物模型中，重組的TPO能夠改善血小板減少癥，因此顯示了潛在的治療用途。TPO的安全和功效在第一階段臨床試驗(yàn)中得到驗(yàn)證(Fanucchi等人，N Engl J Med.，336(6)；404-409，1997；Basser等人，Lancet.，348(9037)；1279-1281，1996；O′Malley等人，Blood，88(9)；3288-3298，1996)。還顯示，TPO能夠增強(qiáng)接受癌癥化療的骨髓抑制患者恢復(fù)血小板生成。
特別提到，在2005年10月17日，被pBCTPOKIDTII載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(Escherichia coli)細(xì)胞由國際保藏機(jī)構(gòu)以編號(hào)KCTC 10864BP保存在韓國典型菌種保藏中心(KCTC，韓國大田宇松區(qū)歐洞#52，(#52Oun-dong Yuseong-gu，Daejeon，SouthKorea))。
在上述兩個(gè)載體中，在靶向基因組中的β-酪蛋白基因時(shí)攜帶具有長6kb的第一區(qū)域的pBCKIII載體比pBCKII載體更為有效。而攜帶陰性選擇標(biāo)記DT基因的pBCKIDTII載體，顯示出比pBCKIII載體靶向效率要高4至5倍。在本發(fā)明中，36.6％的bEF和41.4％bESF細(xì)胞均被pBCKITPOKIDTII載體靶向，其靶向效率比先前靶向載體高3.3倍(41.4％/12.7％)，12.7％山羊胎兒成纖維細(xì)胞被先前的載體靶向(SHEN Wei等人，Chinese Journal of Biotechnology，20(3)；361-365，2004)。因此，我們確信本發(fā)明的載體是高效的牛β-酪蛋白基因靶向載體。
在另一方面，本發(fā)明涉及用上述載體基因靶向的牛體細(xì)胞。
用本發(fā)明的載體靶向的細(xì)胞來自于真核細(xì)胞，并是原代細(xì)胞、次生或永久細(xì)胞。優(yōu)選地，這些細(xì)胞來自于牛、綿羊、山羊、豬、馬、兔、狗、猴等等，但不限于這些。能夠分離或者激活細(xì)胞的有用組織是肝、腎、脾、骨、骨髓、胸腺、心臟、肌肉、肺、腦、生殖腺、卵巢、胰島、腸、耳、皮膚、胰腺組織、前列腺、膀胱、胚胎、免疫系統(tǒng)、造血細(xì)胞等等，但不止這些。細(xì)胞類型有纖維原細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、肝細(xì)胞、卵泡細(xì)胞等等，但不限于這些。
載體的轉(zhuǎn)染方法包括任何將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的方法，可以應(yīng)用本領(lǐng)域眾所公知的適當(dāng)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法包括電擊、磷酸鈣共沉淀、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、微注射、二乙胺乙基葡聚糖轉(zhuǎn)染法、陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等等，但不限于這些。在轉(zhuǎn)染的時(shí)候，用限制性內(nèi)切酶消化線形載體比環(huán)形載體更加優(yōu)選，可作為示例。
特別提到，應(yīng)用LipofectamineTM 2000試劑(Invitrogen公司)，將插入了人血小板生成素(hTPO)的β-酪蛋白靶向載體引入牛胚胎纖維原細(xì)胞(bEF)和牛耳皮纖維原細(xì)胞(bESF)。陽離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電的DNA有效地相互作用并且DNA脂質(zhì)體復(fù)合物和細(xì)胞膜結(jié)合，因而導(dǎo)致DNA的共有化(internationalization)。應(yīng)用長鏈PCR和Southern印跡分析從經(jīng)過抗生素處理后存活的克隆中檢測(cè)和確認(rèn)基因靶向載體插入特定的基因。使用這個(gè)程序，得到了hTPO靶向β-酪蛋白基因的bESF細(xì)胞克隆。81號(hào)細(xì)胞克隆命名為BCTPOKIbESF81，由韓國典型菌種保藏中心(KCTC)保存，編號(hào)為KCTC-10720BP，保藏日期為2004年11月10日，KCTC位于韓國大田宇松區(qū)歐洞#52。
在另一方面，本發(fā)明涉及用上述牛體細(xì)胞進(jìn)行核移植的胚胎。
術(shù)語“核移植”是將核供體細(xì)胞遺傳物質(zhì)移植到去核的卵母細(xì)胞中。因?yàn)橄嗤w細(xì)胞的遺傳物質(zhì)被移植到受體細(xì)胞質(zhì)中，所以，核移植技術(shù)使產(chǎn)生遺傳相同的動(dòng)物克隆成為可能。
在另一方面，本發(fā)明涉及制備牛β-酪蛋白基因靶向體細(xì)胞的方法，該方法包括的步驟是(1)將牛β-酪蛋白基因靶向載體導(dǎo)入牛體細(xì)胞；(2)在轉(zhuǎn)染體細(xì)胞中發(fā)生同源重組事件；和(3)選擇牛β-酪蛋白基因靶向的體細(xì)胞。
更加特別地，為了提高靶向效率，優(yōu)化了本發(fā)明的牛β-酪蛋白基因靶向載體pBCKII、pBCKIII、pBCKIDTI和pBCKIDTII。因此，使用上述載體，能夠提高牛β-酪蛋白基因靶向牛體細(xì)胞產(chǎn)生效率，牛β-酪蛋白基因攜帶編碼目的蛋白質(zhì)的基因。
而且，在步驟(1)中的載體以線性形式或者以缺失質(zhì)粒載體骨架的刪除形式導(dǎo)入細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種提供制備克隆轉(zhuǎn)基因牛的方法，該方法包括的步驟是(1)將上述載體導(dǎo)入牛體細(xì)胞；(2)在牛體細(xì)胞中發(fā)生同源重組事件；(3)選擇通過同源重組攜帶目的基因的牛β-酪蛋白基因靶向體細(xì)胞；(4)將上述基因靶向的細(xì)胞導(dǎo)入去核牛卵母細(xì)胞，產(chǎn)生核移植胚胎；和(5)將上述胚胎移植到代孕體，產(chǎn)生克隆的轉(zhuǎn)基因牛。
如上所述，本發(fā)明適于生產(chǎn)克隆的基因靶向牛，其中本發(fā)明的載體被優(yōu)化用于牛β-酪蛋白的基因靶向。
可以應(yīng)用各種方法，例如物理去核、化學(xué)處理和松胞菌素B離心處理以除去卵母細(xì)胞的遺傳物質(zhì)(Tatham等人，Hum Reprod.，11(7)；1499-1503，1996)。在本發(fā)明中，使用了玻璃微吸液管進(jìn)行物理去核的方法。
通過使用諸如細(xì)胞融合方法和卵胞漿內(nèi)單細(xì)胞注射(ICCI)等技術(shù)，將基因靶向的體細(xì)胞導(dǎo)入去核的動(dòng)物胚胎。對(duì)于大量生產(chǎn)胚胎，細(xì)胞融合方法簡潔而有用。ICCI方法允許從供體細(xì)胞分離的細(xì)胞核最大限度地暴露在受體細(xì)胞質(zhì)的胞液內(nèi)。
通過電脈沖改變細(xì)胞表面的電荷，使得體細(xì)胞和去核的卵母細(xì)胞完成融合。使用脈沖長度和電壓易于控制的電極細(xì)胞操作器(electro-cell manipulator)是很方便的。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種從牛奶中生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括如下步驟將本發(fā)明的載體導(dǎo)入動(dòng)物體細(xì)胞；選擇通過同源重組目的基因靶向的細(xì)胞；將基因靶向的細(xì)胞導(dǎo)入去核的動(dòng)物胚胎；將胚胎移植到產(chǎn)奶動(dòng)物以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；及從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)奶。
核移植的胚胎在體外激活并發(fā)育到胚泡階段，然后移植到受體中。
克隆胚胎的活化誘導(dǎo)臨時(shí)靜止的細(xì)胞周期的再啟動(dòng)，由此胚胎分裂成為可能。為了激活克隆的胚胎，應(yīng)該抑制細(xì)胞周期阻止因子，例如成熟促進(jìn)因子(MPF)、有絲分裂活化蛋白(MAP)激酶等的激活，其中為了抑制這種因子的激活，增加克隆胚胎胞內(nèi)鈣離子濃度是必要的。用電刺激法或者如離子霉素、6-二甲基氨基嘌吟(6-DMAP)化學(xué)處理方法等誘導(dǎo)鈣離子流入急劇增加，可完成細(xì)胞的激活，其中上面的方法可以單獨(dú)或者共同使用。在本發(fā)明中，用離子霉素+6-二甲基氨基嘌吟同時(shí)處理重構(gòu)的胚胎并在體外發(fā)育到胚泡階段。
結(jié)果，產(chǎn)生了能夠在泌乳期表達(dá)目的蛋白質(zhì)的克隆后代。使用本發(fā)明的靶向載體系統(tǒng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，能夠從乳液中獲得大量的目的蛋白質(zhì)，而在胚胎和出生之后的發(fā)育中不會(huì)引起嚴(yán)重的致死性。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種從克隆轉(zhuǎn)基因牛的牛奶中獲得目的蛋白質(zhì)的方法，所述克隆轉(zhuǎn)基因牛用上述方法生產(chǎn)。
牛奶中表達(dá)的目的蛋白質(zhì)能夠用傳統(tǒng)的方法純化出來，例如鹽析(例硫酸銨沉淀；磷酸鈉沉淀)、溶劑沉淀(例使用丙酮，乙醇等進(jìn)行蛋白質(zhì)分級(jí)沉淀)、透析、凝膠過濾、離子交換、色譜柱法如反向色譜柱法、超濾或其中方法相結(jié)合等等(Maniatis等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.(1982)；Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)；Deutscher，M.，Guide to Protein Purification MethodsEnzymology，vol.182.Academic Press.Inc.，San Diego，CA(1990))。
在下文中，本發(fā)明將參考下面的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。然而，依照本發(fā)明的實(shí)施例可以被修改成其它形式，并且本發(fā)明的范圍不受下面實(shí)施例的限制。
實(shí)施例1——?；虬邢蜉d體構(gòu)建1-1pBCKI I和pBCKIII載體構(gòu)建在本發(fā)明中，我們應(yīng)用了牛β-酪蛋白基因的啟動(dòng)子基因座，它指導(dǎo)外源治療性基因在牛奶中表達(dá)。
如先前所述(Sohn等人，J Biotechnol.，103(1)；11-19，2003)的pBC10載體構(gòu)建體(圖9)，包括了在pBluescriptII SK(+)質(zhì)粒(Stratagene公司)中的牛β-酪蛋白的一個(gè)5’側(cè)翼序列的8kb的啟動(dòng)子、整個(gè)外顯子1、2kb的內(nèi)含子1和外顯子2的5’-URT。pBC10載體的β-酪蛋白基因區(qū)用作本發(fā)明的兩個(gè)載體盒pBCKII和pBCKIII的長臂(第一DNA區(qū))。如圖10所示，用SacI和SacII限制性內(nèi)切酶消化10kb的β-酪蛋白基因，用作pBCKI I載體盒的長臂(第一DNA序列)(圖10和14)。用AatII和SacII限制性內(nèi)切酶消化6kb的β-酪蛋白啟動(dòng)子區(qū)用作pBCKIII載體的長臂(第一DNA序列)(圖11和14)，該區(qū)域包括牛β-酪蛋白基因4kb的啟動(dòng)子、不翻譯的外顯子1、2和內(nèi)含子1。
構(gòu)建載體pBC3.1(圖12)用作本發(fā)明載體盒的短臂。牛β-酪蛋白基因序列(4676至7898)的3.2kb DNA片段包括外顯子5、6、7、8和內(nèi)含子5、6、7和部分內(nèi)含子4與8，通過以牛基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用于PCR反應(yīng)的引物序列如下序列編號(hào)No1正向引物5’-attcagtcgagtggaacataaactttcagcc-3’序列編號(hào)No2反向引物5’-catatgtcgactgtgagattgtattttgact-3’引物序列的粗體字母表示為了生成XhoI和SalI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)而改變的一些堿基。
用XhoI和SalI限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物(圖12)，并連接到pGEM-T(Promega公司)的SalI位點(diǎn)。為了生成插入pBC10載體的酶切位點(diǎn)，用HincII和SalI限制性內(nèi)切酶消化pGEM-T中的3.2kb牛β-酪蛋白基因片段。將生成的3.1kb片段連接到pBluescriptII SK(+)的SalI位點(diǎn)，產(chǎn)生BC3.1載體。
用作選擇性標(biāo)記的neo基因片段也插進(jìn)pBC10載體中。為了得到包括SV40復(fù)制起始位點(diǎn)、早期啟動(dòng)子、SV40早期剪接區(qū)和多聚腺苷酸化區(qū)的neo基因片段，用BamHI限制性內(nèi)切酶消化pMAMneo載體(CLONTHECH公司)。首先，將所生成的2.7kb DNA片段連接到pBluescriptII SK(+)的BamHI位點(diǎn)。其次，用BglII和BamHI限制性內(nèi)切酶消化已連接載體中的2kb neo基因片段，然后連接到pSP73(Promega公司)的BglII位點(diǎn)。最后，用BglII和EcoRV限制性內(nèi)切酶消化pSP73中2kb的neo基因片段，然后，重新連接到攜帶0.7kb pMAMneo基因片段的pBluescriptII SK(+)中BglII和EcoRV位點(diǎn)。這些DNA消化和連接步驟是將2.7kb neo基因片段插入pBC10載體所必需的(圖14)。
如圖11所示，通過將pneo2.7和pBC3.1基因片段組裝到pBC10載體，制成了pBCKII和pBCKIII載體盒。用BamHI和EcoRV限制性內(nèi)切酶消化pBluescriptII SK(+)中的neo基因，然后，連接到pBC10載體的BamHI和EcoRV位點(diǎn)。用EcoRV和SalI限制性內(nèi)切酶消化pBC3.1載體，然后，連接到包含億連接pMAMneo基因片段的pBC10載體中的EcoRV和SalI位點(diǎn)，生成pBCKII載體盒。用AatII和SalI限制性內(nèi)切酶消化pBCKII載體盒，并連接到pGEM-7Zf(Promega公司)的AatII和XhoI位點(diǎn)，生成pBCKIII載體盒。因此，構(gòu)建了pBCKII和pBCKIII載體盒。
1-2pBCKIDTI和pBCKIDTII載體構(gòu)建將陰性選擇標(biāo)記DT基因插入上述載體中(圖3和16)。當(dāng)使用攜帶陰性選擇標(biāo)記的pBCKIDTI載體pBCKIDTII時(shí)，因?yàn)榇蟛糠衷陔S機(jī)位點(diǎn)整合到載體的細(xì)胞克隆被DT基因毒性殺死，所以減少了非靶向細(xì)胞克隆(圖3和16)。用于本發(fā)明的DT基因分離于pKO SelectDT載體(Lexicon Genetics，The Woodlands，Tex.)。用限制性內(nèi)切酶RsrII將攜帶SV40多聚腺苷酸和RNA聚合酶II啟動(dòng)子的白喉毒素A鏈(DT)基因分離。用Klenow片段補(bǔ)平被分離的DT基因后，插入pBluescriptII KS(+)(Stratagene公司)的HindII限制性位點(diǎn)，生成pKS DT載體。用XhoI和EcoRV消化pKS DT載體中的DT基因，并連接到pSP73載體(Promega公司)的XhoI和PvuII位點(diǎn)，生成pSP73 DT載體(圖15)。用XhoI和SalI消化pSP73DT載體中的DT基因，然后插入pBCKII載體盒的Sal I位點(diǎn)，生成pBCKIDTI載體。用AatII和SalI消化pBCKIDTI載體，并連接到pGEM-7Zf(+)(Promega公司)的AatII和XhoI位點(diǎn)，生成pBCKIDTII載體盒(圖16)。
通過對(duì)所有合成DNA區(qū)和所有連接DNA片段的接合處進(jìn)行DNA測(cè)序和酶切圖譜鑒定再次確認(rèn)目標(biāo)載體盒的保真度。
實(shí)施例2-pBCTPOKII和pBCTPOKIII的構(gòu)建如圖17、18和19所示，將1kb的人TPO cDNA加上300bp的牛生長素插入pBCKII、pBCKIII和pBCKIDTII載體盒。攜帶SacII和NotI位點(diǎn)的1.3kb外源基因分別連接到pBCKII、pBCKIII和pBCKIDTII載體中的SacII和NotI位點(diǎn)，從而產(chǎn)生靶向載體，命名為pBCTPOKII、pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII(圖17、18和19)。特別提到，用pBCTPOKIDTII載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(Escherichia coli)細(xì)胞保存在韓國典型菌種保藏中心(KCTC)，KCTC位于韓國大田305-333宇松區(qū)歐洞#52保存日期是2005年10月17日，保藏編號(hào)KCTC 10864BP。
實(shí)施例3-將pBCTPOKII、pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到牛胚胎纖維原細(xì)胞(bEF)和牛耳部皮膚纖維原細(xì)胞(bESF)3-1導(dǎo)入線性載體用“QIAfilter Plasmid Midi試劑盒”(Qiagen公司)純化質(zhì)粒DNA，pBCTPOKII和pBCTPOKIII，然后通過CsCl-溴化乙錠梯度平衡離心分離閉環(huán)的DNA。通過限制性內(nèi)切酶SalI(圖20)和AatII(圖21)消化使被分離的質(zhì)粒pBCTPOKII和pBCTPOKIII分別成為線性，然后用乙醇沉淀純化。最后，用分光光度計(jì)測(cè)定被純化的DNA濃度。
使用Lipofectamine2000試劑(Invitrogen公司)將線性的pBCTPOKII和pBCTPOKIII構(gòu)建體導(dǎo)入2或3代的bEF和bESF中。對(duì)于bEF，我們檢測(cè)了三個(gè)不同的轉(zhuǎn)染試劑體積，例如2、4和10μl的，和兩個(gè)不同的DNA濃度，例如2和4μg。對(duì)于bESF，檢測(cè)了2、4和10μl的轉(zhuǎn)染試劑體積，和1、2和4μg DNA濃度。體細(xì)胞暴露在轉(zhuǎn)染試劑-DNA復(fù)合物中24小時(shí)。
在添加10％胎牛血清(Hyclone公司)、0.001％慶大霉素(Gibco，Invitrogen公司)和1％的無必需氨基酸的基本培養(yǎng)基(Gibco，Invitrogen公司)的Dulbecco Modified Eagle培養(yǎng)基(Gibco，Invitrogen公司)中培養(yǎng)體細(xì)胞，培養(yǎng)基每天更換。細(xì)胞在37℃，5％CO2空氣中培養(yǎng)。根據(jù)下面顯示的平板類型，細(xì)胞培養(yǎng)基體積不同。

在37℃，用1x胰蛋白酶-EDTA(Gibco，Invitrogen公司)溶液處理生長至匯合的細(xì)胞3分鐘，然后用Dulbecco的磷酸生理緩沖液(Gibco，Invitrogen公司)清洗兩次。經(jīng)1x胰蛋白酶-EDTA處理分開的細(xì)胞克隆通過輕輕抽吸被解里，然后轉(zhuǎn)移到更寬的平板中增殖。1x胰蛋白酶-EDTA溶液的使用體積依賴于下面顯示的細(xì)胞培養(yǎng)平板類型

實(shí)驗(yàn)步驟顯示如下

將在96孔板生長至匯合的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到48孔培養(yǎng)板，然后逐漸地?cái)U(kuò)展到24孔、12孔、6孔和100毫米的培養(yǎng)板。
在6孔板中，挑取約一半的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行PCR反應(yīng)，其他的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到6孔培養(yǎng)板的兩孔中。
3-2刪除質(zhì)粒載體后導(dǎo)入線性載體用限制性內(nèi)切酶AatII和ClaI消化刪除pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII載體構(gòu)建體中的質(zhì)粒載體區(qū)域，然后參考上面(圖22和23)轉(zhuǎn)染bESF和bEF細(xì)胞。
實(shí)施例4-通過PCR分析鑒定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆為了篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，PCR分析G418抗性克隆細(xì)胞。使用“AccuPrep基因組DNA提取試劑盒”(Bioneer公司)從6孔板的一半細(xì)胞中純化基因組DNA，并使用“AccuPower PCR預(yù)混合料”(Bioneer公司)進(jìn)行PCR。用于人TPO cDNA的引物對(duì)和熱循環(huán)條件顯示如下SEQ ID No 3正向引物GGA GCT GAC TGA ATT GCT CCT CGTSEQ ID No 4反向引物CCT GAC GCA GAG GGT GGA CCC TCC

PCR結(jié)果顯示，大部分抗G418細(xì)胞克隆鑒定為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(圖17)。
實(shí)施例5-長鏈PCR檢測(cè)靶向細(xì)胞克隆應(yīng)用長鏈PCR確定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆中的基因靶向細(xì)胞克隆。使用“AccuPrep基因組DNA提取試劑盒”(Bioneer公司)或者通過3-4個(gè)液氮冷凍和沸水融化的循環(huán)暴露出來的方法來純化每個(gè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆的基因組DNA。使用“AccuPower PCR預(yù)混合料”(Bioneer公司)進(jìn)行長鏈PCR。
如圖5所示，5’引物設(shè)計(jì)為與所轉(zhuǎn)染的載體構(gòu)建體中neo基因的3’端結(jié)合，3’引物設(shè)計(jì)為與牛β-酪蛋白基因的內(nèi)含子8結(jié)合，所述的牛β-酪蛋白基因存在于內(nèi)源區(qū)域中而不在載體構(gòu)建體中。在1％瓊脂糖凝膠中，所示的基因靶向的細(xì)胞克隆代表4kb PCR產(chǎn)物。引物對(duì)序列和熱循環(huán)條件顯示如下SEQ ID No 5正向引物5’-ccacacaggcatagagtgtctgc-3’SEQ ID No 4反向引物5’-ccacagaattgactgcgactgg-3’

牛β-酪蛋白基因靶向效率在實(shí)施例3-1和3-2中進(jìn)行比較。
在實(shí)施例3-1中，兩個(gè)細(xì)胞克隆鑒定為被基因靶向的(圖28)。
如在實(shí)施例3-1中所示，pBCTPOKII載體轉(zhuǎn)染體細(xì)胞后，分離出41個(gè)單克隆細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，38個(gè)(93％)克隆細(xì)胞確定為轉(zhuǎn)基因的，但是沒有檢測(cè)到靶向克隆細(xì)胞(0％)。pBCTPOKIII載體轉(zhuǎn)染體細(xì)胞后，分離出31個(gè)單克隆細(xì)胞。其中，29個(gè)(94％)克隆細(xì)胞確定為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，2個(gè)克隆細(xì)胞(7％)確定為基因靶向的BCTPOKIII載體位于基因組中的內(nèi)源性牛β-酪蛋白基因的基因座(表1和圖28)。
表1BCTPOKII和BCTPOKIII載體的轉(zhuǎn)染和靶向效率

如實(shí)施例3-2所示，pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII載體轉(zhuǎn)染bEF和bESF細(xì)胞，靶向的細(xì)胞克隆用長鏈PCR分析確認(rèn)。這里，對(duì)于小量的DNA樣品，進(jìn)行二次PCR分析(圖27和29)。
二次PCR反應(yīng)的熱循環(huán)條件和實(shí)施例5中的一樣。在1％瓊脂糖凝膠中，所示的靶向細(xì)胞克隆代表3.4kbPCR產(chǎn)物。二次PCR反應(yīng)的引物對(duì)序列顯示如下SEQ ID No 8正向引物5’-ttcactgcattctagttgtggtttgtcca-3’SEQ ID No 9反向引物5’-tctaggaccaaacatcggcttactt-3’。
如圖29A所示，pBCTPOKIDTII載體轉(zhuǎn)染的編號(hào)5、30、17、18、20、21和26的bESF細(xì)胞克隆鑒定為被靶向。B顯示pBCTPOKIII載體轉(zhuǎn)染的編號(hào)16的bESF細(xì)胞克隆被靶向。C是用作陰性對(duì)照(-)的野生型?；蚪MDNA的和用作陽性對(duì)照(+)的pneoBC3.7載體的長鏈PCR分析結(jié)果。
pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII載體轉(zhuǎn)染bEF和bESF細(xì)胞和比較靶向效率。18.2％(10/55)的pBCTPOKIII載體轉(zhuǎn)染的bEF細(xì)胞克隆和41.4％(12/29)的pBCTPOKIDTII載體轉(zhuǎn)染的bEF細(xì)胞克隆為基因靶向，說明pBCTPOKIDTII載體的靶向效率比pBCTPOKIII載體的高2.3倍(41.4％/18.2％)。并且，5.7％(12/212)的pBCTPOKIII載體轉(zhuǎn)染的bESF細(xì)胞克隆，36.6％(63/172)的pBCTPOKIDTII載體轉(zhuǎn)染的bESF細(xì)胞克隆為基因靶向，說明pBCTPOKIDTII載體的靶向效率比pBCTPOKIII載體高6.4倍(36.6％/5.7％)。在這兩種細(xì)胞類型中，pBCTPOKIDTII載體的平均靶向效率比pBCTPOKIII載體高4.5倍(37.3％/8.3％)(表2)，表明pBCKIDTII載體盒是高效的牛β-酪蛋白基因靶向載體。另外，pBCTPOKIDTII載體在bEF細(xì)胞中的靶向效率比先前在山羊胚胎纖維原細(xì)胞的靶向載體(SHEN Wei等人，Chinese Journal of Biotechnology，20(3)；361-365，2004)靶向效率高3.3倍(41.4％/12.7％)，表明本發(fā)明的載體是高效的基因靶向載體。
表2.pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII載體的轉(zhuǎn)染和靶向效率

實(shí)施例6-Southern印跡分析重新確認(rèn)靶向的細(xì)胞克隆使用實(shí)施例1描述的載體，參考實(shí)施例3方法完成牛β-酪蛋白基因靶向。結(jié)果顯示，靶向效率是多變的，并依賴于載體和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的類型。
這里，使用實(shí)施例3-1方法，pBCTPOKIII載體靶向的兩個(gè)細(xì)胞克隆通過Southern印跡重新分析。
通過PCR反應(yīng)鑒定為基因靶向的兩個(gè)克隆細(xì)胞，用Southern印跡再一次分析。將這兩個(gè)細(xì)胞克隆分別轉(zhuǎn)移到兩個(gè)100毫米的培養(yǎng)皿中。從其中兩者之一收集細(xì)胞，從每個(gè)克隆中提取至少10毫克DNA，用EcoRI在37℃消化16小時(shí)。通過50V電壓1×TAE緩沖液0.75％瓊脂糖凝膠，電泳16小時(shí)分離EcoRI消化的DNA。將DNA轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜(Boehringer Mannheim公司)，用靶向載體構(gòu)建體中人TPO cDNA的探針雜交(看圖30)。根據(jù)指導(dǎo)(Roche公司)用SEQ ID No 3和4的引物制備Southern印跡探針。使用“PCR DIG標(biāo)記混合物”(Roche公司)和“Taq DNA聚合酶”(QIAGEN公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)。熱循環(huán)條件如下

用Southern印跡再次確認(rèn)先前確定為基因靶向的兩個(gè)克隆(圖31)。這這兩個(gè)靶向細(xì)胞克隆是編號(hào)81和89細(xì)胞系。
編號(hào)81細(xì)胞克隆命名為BCTPOKIbESF81，保藏于在韓國典型菌種保藏中心(KCTC)，KCTC位于韓國大田305-333宇松區(qū)歐洞#52保藏日期為2004年11月10日，保藏編號(hào)KCTC-10720BP。
實(shí)施例7-制備牛的體細(xì)胞根據(jù)韓國國家牲畜研究所動(dòng)物安全和使用委員會(huì)指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。從荷蘭斯坦因種(Holstein)母牛懷孕45天的胎兒中分離牛胚胎纖維原細(xì)胞(bEF)，Holstein母牛每年生產(chǎn)超過12,000公斤牛奶，制備如先前所述(Koo等人，Biol Reprod.，63(4)；986-992，2000)。用虹膜剪除去胎兒頭部，用兩把watchmarker鑷子舀出并除去肝和腸等軟組織。從每年生產(chǎn)超過12,000公斤牛奶的兩歲大荷蘭斯坦因種(Holstein)母牛耳部皮膚中分離牛耳部皮膚纖維原細(xì)胞(bESF)。用PBS(Gibco BRL公司)清洗兩遍后，bEF和bESF在100毫米培養(yǎng)皿中用外科手術(shù)刀切碎。在室溫下進(jìn)行操作。切碎的組織在盛有10毫升的0.05％(w/v)胰蛋白酶的0.53mM EDTA溶液的培養(yǎng)器皿中于38.5℃孵育30分鐘。通過添加含有10％胎牛血清的等體積的細(xì)胞培養(yǎng)基使胰蛋白酶失活。細(xì)胞培養(yǎng)基是含有10％FBS、1000單位的青霉素和1000微克每毫升的鏈霉素(Gibco BRL公司)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium)。劇烈抽吸后，150xg離心上清液5分鐘。懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)終濃度為2×106個(gè)細(xì)胞每毫升，然后在10毫升培養(yǎng)基37℃5％CO2空氣的175-cm2的組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(Nunc，Roskilde，丹麥)，直到匯合。bEF和bESF細(xì)胞在添加20％胎牛血清(FBS)和10％二甲基亞砜(DMSO)的冰Dulbecco磷酸鹽緩沖液中冷卻，在-70℃冷凍16小時(shí)。細(xì)胞儲(chǔ)藏在液氮中直到轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
為了得到基因靶向細(xì)胞系，DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該在體外培養(yǎng)中存活一長段時(shí)間，而沒有形態(tài)上的改變和凋亡。在本發(fā)明中，將BCTPOKII和BCTPOKIII載體導(dǎo)入兩種類型體細(xì)胞bEF和bESF。據(jù)報(bào)道，牛出生后的纖維原細(xì)胞比牛胎兒纖維原細(xì)胞在培養(yǎng)基中能維持更長時(shí)間的相對(duì)穩(wěn)定的染色體組型(Williams等人，Mol Reprod Dev.，66(2)；115-125，2003)。在本發(fā)明中，在體外培養(yǎng)物中bESF比bEF保持更長時(shí)間的正常的形態(tài)(表2)。
表2.4代和8代細(xì)胞存活率

4代304個(gè)bESF克隆中51個(gè)(17％)傳至8代，顯示正常的形態(tài)。然而，只有6％的bEF細(xì)胞克隆傳至8代。在本實(shí)驗(yàn)中，我們從bESF細(xì)胞中得到了兩個(gè)基因靶向克隆。
實(shí)施例8-凍融冷凍的基因靶向細(xì)胞當(dāng)基因靶向細(xì)胞在兩個(gè)100毫米的培養(yǎng)皿中生長至匯合時(shí)，對(duì)一個(gè)平板上的細(xì)胞進(jìn)行Southern印跡分析。另一平板的一半細(xì)胞進(jìn)一步傳代培養(yǎng)，其余的一半細(xì)胞在-70℃冷凍16小時(shí)后儲(chǔ)藏在液氮中。為了得到大量用作供體細(xì)胞的細(xì)胞，重復(fù)細(xì)胞亞培養(yǎng)和儲(chǔ)藏的過程。細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基包含添加20％胎牛血清(FBS)和10％二甲基亞砜(DMSO)的DMEM。
盡快融解一小瓶冷凍的基因靶向細(xì)胞后，將溶液轉(zhuǎn)移到含9毫升細(xì)胞培養(yǎng)基的15毫升試管中，1000轉(zhuǎn)每分鐘離心3分鐘。在3毫升培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞沉淀，涂布到含有3毫升培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板上，然后在細(xì)胞核轉(zhuǎn)移之前在37℃5％CO2空氣中培養(yǎng)。
實(shí)施例9-細(xì)胞核轉(zhuǎn)移從屠宰場(chǎng)的牛卵巢獲得牛卵母細(xì)胞，在38.57℃5％CO2濕潤空氣的成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)。成熟培養(yǎng)基包含了添加10％(V/V)牛胎血清(FBS)(Gibco BRL，Grand Island，NY公司)的含Eagle鹽和L-谷氨酸的TCM-199(Sigma Chemical公司)、1微克每毫升的雌二醇、1微克每毫升的FSH-P(Schering-Plough Animal Health Corp.，Kenilworth，NJ公司)和25mM NaHCO3。在體外成熟之后，卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到500微升含有0.1％透明質(zhì)酸酶的TL-Hepes，然后手動(dòng)吸取除去堆積的卵母細(xì)胞。使用一個(gè)精細(xì)的玻璃針部分切開裸露卵母細(xì)胞的透明帶(Tsunoda等人，J Exp Zool.，240(1)；119-125，1986)。應(yīng)用裝備反向顯微鏡的顯微操作器(Leitz，Ernst Leitz Wetzlar GmbH，德國)進(jìn)行卵母細(xì)胞的去核和細(xì)胞注射操作。用于操作的介質(zhì)是包含7.5微克每毫升細(xì)胞松弛素B的TL-Hepes。用內(nèi)徑20微米微移液器同時(shí)除去第一極體和部分可能包含中期II染色體的細(xì)胞質(zhì)。單基因靶向細(xì)胞分別轉(zhuǎn)到受體細(xì)胞質(zhì)的卵周隙。在50微升細(xì)胞融合培養(yǎng)基中小滴中平衡細(xì)胞-細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物10-20秒，然后轉(zhuǎn)移到具有間隔1毫米的兩個(gè)電極的融合杯中，上蓋融合培養(yǎng)基。細(xì)胞融合培養(yǎng)基包括0.3M甘露醇、0.5mM Hepes、0.01％牛血清白蛋白、0.1mM氯化鈣和0.1mM氯化鎂。使用Electro Cell Manipulator 2001(BTX，San Diego，CA)以1.6千伏每厘米的一次直流脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物融合20毫秒。在室溫下進(jìn)行操作。融合脈沖1小時(shí)后沒有可見體細(xì)胞的重組胚胎被確定為融合卵。電融合4小時(shí)后，用5μM離子霉素激活融合卵5分鐘，再用添加10％FBS的2.5mM 6-二甲基-氨基嘌呤的CR1aa培養(yǎng)液(Rosenkrans等人，Biol Reprod.，49(3)；459-462，1993)在38.5℃5％CO2空氣中處理3.5小時(shí)。
實(shí)施例10-重組胚胎的培養(yǎng)重組胚胎在添加1mM谷氨酸和1x Eagle必需氨基酸溶液(Gibco BRL)的CR1aa培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，分裂的胚胎在4孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中于38.5℃和含5％CO2空氣中進(jìn)一步培養(yǎng)4天，4孔培養(yǎng)板中包含在老鼠胚胎纖維原細(xì)胞單層(添加10％FBS)上的750微升CR1aa(Park等人，Anim Reprod Sci.，59(1-2)；13-22，2000)。培養(yǎng)7天之后，觀察到胚泡的形成。
實(shí)施例11-克隆胚胎的PCR分析將每個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移到20μl的裂解緩沖液中，裂解緩沖液包含50mM KCl、1.5mMMgCl2、10mM pH8.5的Tris-HCl、0.5％偌乃洗滌劑P40、0.5％吐溫和400微克每毫升蛋白酶K，65℃溫育30分鐘。95℃失活蛋白酶K 10分鐘(McCreath等人，Nature，405(6790)；1066-1069，2000)。使用“AccuPower PCR預(yù)混合液”(Bioneer公司)和SEQ IDNo 3、4的引物對(duì)對(duì)每個(gè)裂解的胚胎進(jìn)行首次PCR，然后，用1微升的首次PCR產(chǎn)物進(jìn)行嵌套PCR。使用SEQ ID No 3和7的引物和熱循環(huán)條件如下嵌套PCRSEQ ID No 7反向引物5’-gagacggacctgtccagaaagctg-3’

對(duì)各種不同的發(fā)育階段用PCR分析克隆的胚胎是否是轉(zhuǎn)基因的(表3)。
表3.各種不同發(fā)育階段的重組胚胎PCR分析

結(jié)果顯示，33個(gè)克隆胚胎中33個(gè)(100％)是轉(zhuǎn)基因的。這一結(jié)果表明，本發(fā)明能夠通過基因靶向的體細(xì)胞產(chǎn)生基因靶向的克隆動(dòng)物。
圖32顯示了來自于細(xì)胞克隆81的核移植胚胎的PCR分析結(jié)果(圖23)。
實(shí)施例12-來源于克隆胎兒的胚胎膜的長鏈PCR分析。
使用非外科方法將胚泡階段的重組胚胎轉(zhuǎn)移到受體。懷孕36天，用Foley導(dǎo)管(Agtech，Manhatan，KS)以非手術(shù)的方式從母牛子宮取出胎兒和胚胎膜。如實(shí)施例7所述在體外培養(yǎng)提取的胎兒和來源于胎兒的胚胎膜。長鏈PCR結(jié)果顯示了4kb的條帶，確認(rèn)本發(fā)明的載體精確地靶向于來源自胚胎膜的培養(yǎng)細(xì)胞基因組中的β-酪蛋白基因(圖33)?；蚪MDNA提取和長鏈PCR分析過程和實(shí)施例5所述相同。
工業(yè)實(shí)用性如這里所描述的，使用由牛β-酪蛋白基因靶向載體所靶向的細(xì)胞移植核移植胚胎而制備的轉(zhuǎn)基因牛能夠在它們的牛奶中生產(chǎn)大量的具有生物醫(yī)學(xué)或生物技術(shù)價(jià)值的蛋白質(zhì)，并且在胚胎階段或者出生后發(fā)育階段外源蛋白質(zhì)非調(diào)控的表達(dá)不會(huì)引起致死性。
關(guān)于國際承認(rèn)的用于專利目的的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約國際表格原始保藏事項(xiàng)的受理根據(jù)71條頒布的致韓龍萬韓國大田305-345宇松區(qū)星松洞漢那棟110-305

關(guān)于國際承認(rèn)的用于專利目的的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約國際表格原始保藏事項(xiàng)的受理根據(jù)71條頒布的致韓龍萬韓國大田305-345宇松區(qū)星松洞漢那棟110-305

序列表<110>韓國生命工學(xué)研究院<120>使用同源重組的牛β-酪蛋白基因靶向載體<150>PCT/KR2004003034<151>2004-11-23<160>9<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>牛酪蛋白基因擴(kuò)增的引物<400>1attcagtcga gtggaacata aactttcagc c 31<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>牛酪蛋白基因擴(kuò)增的引物<400>2catatgtcga ctgtgagatt gtattttgac t 31<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>hTPO擴(kuò)增的引物<400>3ggagctgact gaattgctcc tcgt 24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hTPO擴(kuò)增的引物<400>4cctgacgcag agggtggacc ctcc 24<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鑒定基因靶向的引物<400>5ccacacaggc atagagtgtc tgc 23<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鑒定基因靶向的引物<400>6ccacagaatt gactgcgact gg22
<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌套式PCR引物<400>7gagacggacc tgtccagaaa gctg 24<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鑒定基因靶向的引物<400>8ttcactgcat tctagttgtg gtttgtcca 29<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鑒定基因靶向的引物<400>9tctaggacca aacatcggct tactt 2權(quán)利要求
1.一種牛β-酪蛋白基因靶向載體，包括(1)具有5至12kb長度的第一區(qū)域，該區(qū)域與牛β-酪蛋白質(zhì)基因的啟動(dòng)子和其側(cè)翼核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白質(zhì)基因的外顯子1、內(nèi)含子1和外顯子2；(2)用于克隆編碼目的蛋白質(zhì)的核酸的區(qū)域；(3)編碼正選擇標(biāo)記的區(qū)域；(4)具有2.8至3.5kb長度的第二區(qū)域，該區(qū)域與牛β-酪蛋白質(zhì)基因的核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白基因外顯子5、6、7和8，以及內(nèi)含子5、6和7；其中，按照牛β-酪蛋白質(zhì)基因5’-3’的排列方向，與第一區(qū)域相應(yīng)的核酸序列位于與第二區(qū)域相應(yīng)的核酸序列的上游。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述第一區(qū)域長度是5.5至10kb。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述第二區(qū)域的長度是3.0至3.2kb。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述陽性選擇標(biāo)記選自包括新霉素(Neo)、潮霉素(Hyg)、組氨醇脫氫酶基因(hisD)和鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Gpt)的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述載體還包括陰性選擇標(biāo)記的區(qū)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于，所述陰性選擇標(biāo)記是白喉毒素(DT)基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的載體，其特征在于，所述載體是分別在圖1、圖2、圖16或者圖3中顯示的pBCKI I、pBCKI II、pBCKIDT I或者pBCKIDT II。
8.一種牛體細(xì)胞，所述的牛體細(xì)胞使用權(quán)利要求1或者5所述的載體進(jìn)行β-酪蛋白基因靶向。
9.一種胚胎，所述的胚胎利用權(quán)利要求8所述的牛體細(xì)胞進(jìn)行核移植。
10.一種產(chǎn)生牛β-酪蛋白基因靶向的體細(xì)胞的方法，包括以下步驟(1)將權(quán)利要求1或5所述的牛β-酪蛋白基因靶向載體導(dǎo)入牛體細(xì)胞；(2)在牛體細(xì)胞中發(fā)生同源重組事件；和(3)選擇通過同源重組攜帶目的基因的牛β-酪蛋白基因靶向的體細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的載體以線性或者缺失質(zhì)粒載體骨架的刪除形式導(dǎo)入細(xì)胞。
12.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因牛的方法，包括以下步驟(1)將權(quán)利要求1或5所述的牛β-酪蛋白基因靶向的載體導(dǎo)入牛體細(xì)胞；(2)在牛體細(xì)胞中發(fā)生同源重組事件；(3)選擇通過同源重組攜帶目的基因的牛β-酪蛋白基因靶向的體細(xì)胞；(4)將所述基因靶向的細(xì)胞導(dǎo)入去核牛胚胎以生產(chǎn)核移植胚胎；和(5)將胚胎移植進(jìn)受體。
13.一種從轉(zhuǎn)基因牛的牛奶中獲得大量目的蛋白質(zhì)的方法，所述的轉(zhuǎn)基因牛根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛β－酪蛋白基因靶向的載體，包括(1)具有5至12kb長度的第一區(qū)域，該區(qū)域和牛β－酪蛋白基因的啟動(dòng)子和側(cè)翼核酸序列同源，并包含牛β－酪蛋白基因的外顯子1、內(nèi)含子1和外顯子2；(2)用于克隆編碼目的蛋白質(zhì)的核酸的區(qū)域；(3)編碼正選擇標(biāo)記的區(qū)域；(4)具有2.8至3.5kb長度的第二區(qū)域，該區(qū)域和牛β－酪蛋白基因的核酸序列同源，并包含牛β－酪蛋白基因外顯子5、6、7和8，以及內(nèi)含子5、6和7；其中，按照牛β－酪蛋白基因5’－3’的排列方向，和第一區(qū)域相應(yīng)的核酸序列位于和第二區(qū)域相應(yīng)的核酸序列的上游。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛的方法，所述的轉(zhuǎn)基因牛使用上述攜帶編碼目的蛋白基因的載體進(jìn)行牛β－酪蛋白基因靶向，并從上述轉(zhuǎn)基因牛的牛奶中獲得大量的目的蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1914324SQ200580003660
公開日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2005年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月23日
發(fā)明者韓龍萬, 李景廣, 張米亞, 具德本 申請(qǐng)人:韓國生命工學(xué)研究院