專利名稱：來(lái)自甘薯的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種源于甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)并且能夠在植物中賦予高水平的蔗糖誘導(dǎo)型表達(dá)的植物蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列。此外，本發(fā)明還涉及含有該啟動(dòng)子序列的植物蔗糖誘導(dǎo)型表達(dá)載體，以及涉及應(yīng)用該啟動(dòng)子序列生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物分子育種技術(shù)使得采用所有物種的基因作為育種材料成為可能，也使得以基因水平替代原先的染色體組水平來(lái)精細(xì)地調(diào)節(jié)育種的作用成為可能。因此，它是引起下一代農(nóng)業(yè)的核心技術(shù)之一。
為了最大限度發(fā)揮所述農(nóng)作物分子育種技術(shù)的作用，必要的先決條件如下1)積累代表各種植物的基因的數(shù)據(jù)庫(kù)；2)建立用于各種農(nóng)作物的轉(zhuǎn)化體系；和3)發(fā)展調(diào)節(jié)插入到植物中的外源基因的表達(dá)的啟動(dòng)子。
從20世紀(jì)80年代早期起，外國(guó)就已經(jīng)開(kāi)始研究調(diào)節(jié)植物基因表達(dá)的啟動(dòng)子。據(jù)認(rèn)為，花椰菜花葉病毒的啟動(dòng)子能夠在各種植物組織中誘導(dǎo)高水平的基因表達(dá)(Hohn等，1982，Curr.Topics Microbiol.Immunol.96193-236)。
隨后，鑒定出了該啟動(dòng)子的序列(Odell等，1985，Nature 313810-812)。經(jīng)證明，該啟動(dòng)子能夠在植物中誘導(dǎo)高水平的基因表達(dá)(Sanders等，1987，Nucleic Acids Res.151543-1558)。其后，CaMV 35S啟動(dòng)子(專利號(hào)JP1993192172-A1)成為植物中使用最為普遍的啟動(dòng)子。
自CaMV 35S獲得鑒定以來(lái)，其活性在生物或非生物條件下提高的其它誘導(dǎo)型啟動(dòng)子得到了積極的研究。
尤其是，經(jīng)蔗糖處理后活性提高的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子得到了積極的研究。當(dāng)用于在植物貯藏器官組織(如含有由相對(duì)較大量的蔗糖合成的淀粉的貯藏根)中大量生產(chǎn)有用的醫(yī)藥和工業(yè)蛋白時(shí)，所述蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子具有優(yōu)勢(shì)。所述有用的蛋白包括非常有價(jià)值并且昂貴的醫(yī)藥或工業(yè)蛋白，例如干擾素、生長(zhǎng)激素、乳鐵蛋白和植酸酶。
有關(guān)蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究集中于編碼積累在貯藏器官組織中的貯藏蛋白的基因或者與淀粉合成有關(guān)的基因。
例如，patatin是馬鈴薯中的貯藏蛋白。據(jù)鑒定，蔗糖可以增強(qiáng)patatin基因啟動(dòng)子的活性(Rocha-Sosa等，1989，EMBO J8，23-31；Wenzler等，1989a，Plant Mol.Biol.12，41-50；Wenzler等，1989b，Plant Mol.Biol.13，347-354)。也有報(bào)道該啟動(dòng)子的-344區(qū)的特異核苷酸序列(B序列)在蔗糖誘導(dǎo)中起到必不可少的作用(Grierson等，1994，Plant J，5，815-826)。
同時(shí)，在馬鈴薯中有兩個(gè)蔗糖合成酶基因，即，Sus3和Sus4。據(jù)鑒定，在這兩個(gè)基因中，Sus4通過(guò)蔗糖來(lái)表達(dá)(Salanoubat和Belliard，1989，GENE 84，181-185)。此外，據(jù)報(bào)道，Sus4基因啟動(dòng)子的-1500～-267區(qū)、3’非翻譯區(qū)以及1612bp前導(dǎo)內(nèi)含子對(duì)于蔗糖誘導(dǎo)是必不可少的(Fu等，1995，Plant Cell 7，1387-1394)。
再者，據(jù)鑒定，蔗糖可以增強(qiáng)玉米中的淀粉分支酶I(SBE1)基因啟動(dòng)子的活性，并且在相對(duì)于該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-314和-145之間的序列對(duì)于蔗糖誘導(dǎo)是必要的(Kim和Guiltinan，1999，Plant Physiology 121，225-236)。
此外，據(jù)報(bào)道，蔗糖可以誘導(dǎo)甘薯中β-淀粉酶基因啟動(dòng)子的活性，并且相對(duì)于該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-901和-820之間的序列對(duì)于蔗糖誘導(dǎo)是必要的。而且，其中的TGGACGG序列作為調(diào)節(jié)子起著重要的作用(Maeo等，2001，Plant Mol.Biol.46，627-637)。
同時(shí)，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶被認(rèn)為是控制植物中的淀粉量的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)酶。據(jù)報(bào)道，番茄和擬南芥(Arabidopsis)中的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的啟動(dòng)子為蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Siedlecka等，2003，Planta 217，184-192；Li等，2002，Plant Science 162，239-244)。此外，據(jù)報(bào)道，岡田酸(okadaic acid)可以降低擬南芥中的該啟動(dòng)子的活性，所述岡田酸是蛋白磷酸酶I和2A的抑制劑。
同時(shí)，在甘薯中有兩個(gè)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，即，ibAGP1和ibAGP2。據(jù)報(bào)道，蔗糖可以增強(qiáng)ibAGP1基因(以前該基因被稱作ibAGP-sTL1)的表達(dá)(Bae和Liu，1997，Molecular Genetics and Genomics154，179-185)。已經(jīng)分析和比較了上述兩個(gè)基因的完整核苷酸序列，并鑒定了每一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Noh等，印刷中，GENE)。
但是，高效的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的核苷酸序列還沒(méi)有被報(bào)道過(guò)。因此，對(duì)于能夠在植物中廉價(jià)、有效而大量地生產(chǎn)有用的外源蛋白方面起重要作用的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的需求日益增加。

發(fā)明內(nèi)容
(技術(shù)問(wèn)題)為解決上述問(wèn)題以及滿足上述需要，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列能夠誘導(dǎo)目標(biāo)基因高水平表達(dá)，而且該啟動(dòng)子源自甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于植物轉(zhuǎn)化的蔗糖誘導(dǎo)型載體，該載體包含ibAGP1基因的指導(dǎo)高水平表達(dá)目標(biāo)基因的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和5’非翻譯區(qū)。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種經(jīng)所述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物能夠在植物貯藏器官組織(如在貯藏根中)大量產(chǎn)生有用物質(zhì)。
(技術(shù)方案)為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人克隆了甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子區(qū)，并構(gòu)建了用于植物轉(zhuǎn)化的載體和瞬時(shí)表達(dá)載體，所述載體包含帶有所述基因的5’非翻譯區(qū)的上述啟動(dòng)子。發(fā)明人隨后利用所述載體在貯藏根中誘導(dǎo)表達(dá)，并觀察到該啟動(dòng)子與蔗糖誘導(dǎo)性相關(guān)的高水平活性，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO1序列的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子區(qū)和5’非翻譯區(qū)的分離的DNA序列。
上述啟動(dòng)子的DNA序列源自相對(duì)于SEQ ID NO1中甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-1bp至-1908bp區(qū)(參見(jiàn)圖1)。蔗糖可以在植物中誘導(dǎo)本發(fā)明所述的啟動(dòng)子的高水平活性。
上述非翻譯區(qū)包含相對(duì)于SEQ ID NO1中甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+1bp至+68bp的非翻譯區(qū)(參見(jiàn)圖1)。與其它報(bào)道的植物的5’非翻譯區(qū)一樣，本發(fā)明所述的非翻譯區(qū)能夠通過(guò)增強(qiáng)導(dǎo)入植物中的目標(biāo)外源基因的翻譯效力而誘導(dǎo)目標(biāo)基因的高水平表達(dá)。
為實(shí)現(xiàn)另一個(gè)目的，本發(fā)明提供一種用于植物轉(zhuǎn)化的蔗糖誘導(dǎo)型載體(pSPagp1-101)和瞬時(shí)表達(dá)載體(pSPagp1-221)，所述載體包含甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的指導(dǎo)在植物中進(jìn)行高水平表達(dá)的植物蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)。
上述用于植物轉(zhuǎn)化的蔗糖誘導(dǎo)型載體是指能夠在轉(zhuǎn)基因植物中持久表達(dá)外源基因的二元載體。上述瞬時(shí)表達(dá)載體是指能夠在植物中瞬時(shí)表達(dá)外源基因的載體。
所述二元載體可以是任何包含T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)的RB(右邊界序列)和LB(左邊界序列)，能夠在根癌農(nóng)桿菌(Agrobaterium tumefaciens)Ti質(zhì)粒存在下轉(zhuǎn)化植物的二元載體。優(yōu)選地，該載體可以是經(jīng)常用于相關(guān)領(lǐng)域的二元載體，例如pBI101(編號(hào)6018-1，Clonetech，美國(guó))、pBIN(基因庫(kù)(Genbank)登錄號(hào)U09365)、pBI121、pBIN20或BIBAC載體。
關(guān)于本發(fā)明所述的用于植物的蔗糖誘導(dǎo)型載體(pSPagp1-101，pSPagp1-221)，本發(fā)明所述的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)在pBI101和pBI221中位于外源基因的前面。本發(fā)明提供通過(guò)插入本發(fā)明所述的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)至含有GUS報(bào)告基因的載體(pBI101和pBI221)中而制得的pSPagp1-101和pSPagp1-221(參見(jiàn)圖2和圖3)。但是，所述GUS報(bào)告基因是外源基因，并預(yù)期可以用任意其它有用的外源基因來(lái)替代。
本發(fā)明提供一種應(yīng)用本發(fā)明所述的蔗糖誘導(dǎo)型二元載體的轉(zhuǎn)基因植物。此外，本發(fā)明還提供一種應(yīng)用本發(fā)明所述的瞬時(shí)表達(dá)載體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的貯藏根。
植物能夠通過(guò)使用例如根癌農(nóng)桿菌(An，G.1987，Plant Physiology)或粒子轟擊方法(Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)由上述植物蔗糖誘導(dǎo)型二元載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明中，例如擬南芥可以通過(guò)花浸法(floraldip method)(Clough和Bent，1998，Plant J.)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明，植物貯藏根能夠通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)載體和粒子轟擊法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。不管農(nóng)作物的類(lèi)型如何，本發(fā)明的瞬時(shí)表達(dá)載體都能夠?qū)ζ滟A藏根進(jìn)行轉(zhuǎn)化。農(nóng)作物的例子包括胡蘿卜等。
上述外源基因可以是打算在植物貯藏器官組織中大量表達(dá)的任意基因，所述貯藏器官組織含有相對(duì)較大量的蔗糖以在植物中積累大量的淀粉。而且，在本發(fā)明所述的植物蔗糖誘導(dǎo)型載體中，外源基因的位置在緊接于甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)之后，并且如果需要，該外源基因可以以與報(bào)告基因融合的形式表達(dá)。
本發(fā)明提供適用于擴(kuò)增本發(fā)明所述的植物蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的DNA片段的SEQ ID NO2至SEQ ID NO5的PCR引物。
(有益效果)本發(fā)明提供來(lái)自甘薯(Iomoea batatas)的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)使得能夠在植物進(jìn)行蔗糖誘導(dǎo)型表達(dá)，尤其是使得能夠在含有相對(duì)較大量的蔗糖以在植物中積累大量淀粉的植物貯藏根中進(jìn)行高水平表達(dá)。
因此，本發(fā)明可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物以在植物貯藏根中大量生產(chǎn)有用蛋白。所述有用蛋白包括非常有價(jià)值并且昂貴的醫(yī)藥或工業(yè)蛋白，例如干擾素、生長(zhǎng)激素、乳鐵蛋白和植酸酶。


本發(fā)明的上述及其它目的、特征和其它優(yōu)點(diǎn)將會(huì)從下面結(jié)合有附圖的詳細(xì)描述中更清楚地得到理解，其中圖1顯示本發(fā)明所述的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的植物蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)的DNA序列；圖2顯示用于植物轉(zhuǎn)化的二元載體(下文中稱作‘pSPagp1-101’)的圖示，該二元載體包含本發(fā)明所述的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的植物蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)的序列；圖3顯示瞬時(shí)表達(dá)載體(下文稱作‘pSPagp1-221’)的圖示，該載體包含本發(fā)明所述的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的植物蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)的序列；圖4顯示由pSPagp1-101轉(zhuǎn)化的擬南芥經(jīng)組織化學(xué)染色后觀察到的各組織的GUS表達(dá)模式；圖5顯示由pSPagp1-101轉(zhuǎn)化的擬南芥經(jīng)蔗糖處理后的GUS定量分析結(jié)果；和圖6顯示使用本發(fā)明所述的pSPagp1-221對(duì)胡蘿卜主根進(jìn)行瞬時(shí)分析的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例將能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解如何實(shí)施本發(fā)明。應(yīng)該理解，盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選的具體實(shí)施方式
來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其它方面對(duì)于與本發(fā)明有關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
實(shí)施例1甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的啟動(dòng)子在甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1，Noh等，GENE，2004，339，173-180)的5’區(qū)序列中得到鑒定。
所克隆的1908bp序列的啟動(dòng)子登錄在NCBI GenBank(登錄號(hào)AY694185，圖1)中。圖1顯示本發(fā)明所述的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的植物蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)的DNA序列。在圖1中，蛋白合成的起始密碼子‘ATG’帶有下劃線，并以黑體顯示，而且翻譯起始位點(diǎn)的堿基‘A’用‘+1’示出。
實(shí)施例2植物蔗糖誘導(dǎo)型載體和瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建將在實(shí)施例1中所克隆的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的啟動(dòng)子和68bp的5’非翻譯區(qū)(SEQ ID NO1，圖1)插入到pBI101或pBI221(Clonetech)中，從而分別構(gòu)建植物蔗糖誘導(dǎo)型載體或瞬時(shí)表達(dá)載體。
更具體地說(shuō)，在構(gòu)建植物蔗糖誘導(dǎo)型載體的情況中，通過(guò)PCR擴(kuò)增在實(shí)施例1中所克隆的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的啟動(dòng)子和68bp的5’非翻譯區(qū)(SEQ ID NO1，圖1)，并用SalI和BamHI消化。然后將它們插入pBI101的SalI和BamHI位點(diǎn)。該載體被稱作pSPagp1-101(參見(jiàn)圖2)。上述PCR所用的引物詳細(xì)顯示在表1中。
對(duì)于PCR擴(kuò)增，在94℃孵育4min(分鐘)之后，使用以下的循環(huán)參數(shù)30個(gè)循環(huán)[94℃，1min；55℃，1min；和72℃，1.5min]。然后將該反應(yīng)在72℃孵育10min。
表1

在圖2中，GUS是編碼β-葡糖醛酸酶的報(bào)告基因，選擇標(biāo)記為卡那霉素。此外，Nos-pro代表NPTII的啟動(dòng)子，而Nos-ter代表它的終止子。該GUS報(bào)告基因通過(guò)植物中插入的Nos(胭脂堿合成酶)的啟動(dòng)子和終止子(Nos-ter)而表達(dá)。
在構(gòu)建植物蔗糖誘導(dǎo)型瞬時(shí)表達(dá)載體的情況中，通過(guò)PCR擴(kuò)增在實(shí)施例1所克隆的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的啟動(dòng)子和68bp的5’非翻譯區(qū)(SEQ ID NO1，圖1)，并用SphI和BamHI消化。然后將它們插入pBI221的SphI和BamHI位點(diǎn)。該載體被稱作pSPagp1-221(參見(jiàn)圖3)。上述PCR所用的引物詳細(xì)顯示在表2中。
對(duì)于PCR擴(kuò)增，在94℃孵育5min之后，使用以下的循環(huán)參數(shù)30個(gè)循環(huán)[94℃，1min；58℃，1min；和72℃，1.5min]。然后將該反應(yīng)在72℃孵育5min。
表2

實(shí)施例3使用在實(shí)施例2中所構(gòu)建的pSPagp1-101載體轉(zhuǎn)化擬南芥通過(guò)凍融法(An，G.1987，Methods in Enzymology)，將在實(shí)施例2中構(gòu)建的pSPagp1-101載體轉(zhuǎn)移到根癌農(nóng)桿菌C58C1中。
在28℃將經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌在振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，然后使用花浸法(Clough和bent，1998，The Plant Journal)接種到剛到開(kāi)花期之前的擬南芥哥倫比亞栽培變種(cv.Columbia)的雌蕊上以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的擬南芥植物。
實(shí)施例4轉(zhuǎn)化擬南芥的組織化學(xué)法染色和酶學(xué)分析收獲實(shí)施例3中擬南芥轉(zhuǎn)化體的種子并置于含有30mg/L卡那霉素的MS生長(zhǎng)培養(yǎng)基上以篩選抗性轉(zhuǎn)基因植物。
用組織化學(xué)染色方法和酶學(xué)方法定量檢測(cè)經(jīng)篩選的擬南芥轉(zhuǎn)化體的所有組織的GUS活性。為了對(duì)轉(zhuǎn)化植物的所有組織進(jìn)行染色，將各組織浸在含有1mM G-glu(5-溴-4-氯-3-吲哚-β葡糖苷酸)、100mM磷酸鈉(pH7.0)、10mM EDTA、0.5mM鐵氰化鉀、0.5mM亞鐵氰化鉀和0.1％TritonX-100的溶液中，并在37℃反應(yīng)12小時(shí)。除去溶液后，用一系列的乙醇(70％～100％)清洗以去除組織中含有的葉綠素。
如圖4所示，在用pSPagp1-101轉(zhuǎn)化的擬南芥的葉子、韌皮部、花柄、以及根部頂端分生組織中鑒定到高水平的GUS活性，在花粉中鑒定到低水平的GUS活性。
實(shí)施例5鑒定本發(fā)明所述的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(ibAGP1啟動(dòng)子)的活性為鑒定ibAGP1啟動(dòng)子的蔗糖誘導(dǎo)活性，利用Jefferson等(EMBO J.63901-3907，1987)的方法對(duì)蔗糖處理過(guò)的轉(zhuǎn)化擬南芥的GUS活性進(jìn)行定量測(cè)定。
更具體地說(shuō)，將擬南芥轉(zhuǎn)化體的種子播種在含有0.5％、3％和6％蔗糖的MS生長(zhǎng)培養(yǎng)基上并培養(yǎng)14天。
然后收獲所培養(yǎng)的幼苗，用含有50mM磷酸鈉(pH7.0)、10mMEDTA、0.1％Triton X-100、0.1％月桂酰肌氨酸鈉和10mM β-巰基乙醇的溶液進(jìn)行研磨，并以12,000×g離心，以獲得上清液。
將所得的上清液在37℃與1mM MUG(4-甲基傘形基葡糖苷酸(4-methylumbelliferyl glucuronide))進(jìn)行反應(yīng)。通過(guò)加入0.2M Na2CO3來(lái)終止反應(yīng)。用熒光計(jì)在365nm和455nm處檢測(cè)所得反應(yīng)溶液的熒光。通過(guò)將反應(yīng)溶液的熒光與MUG標(biāo)準(zhǔn)溶液的正態(tài)曲線進(jìn)行比較來(lái)分析擬南芥轉(zhuǎn)化體的GUS活性并顯示在圖5中。
通過(guò)分析12棵經(jīng)各蔗糖濃度處理的轉(zhuǎn)化體(T2系植物)而獲得了如圖5所示的GUS活性。為了比較，一起檢測(cè)了沒(méi)有啟動(dòng)子的pB101載體和帶有CaMV35S啟動(dòng)子的pB121(Clonethch，美國(guó))。結(jié)果表明，ibAGP1基因啟動(dòng)子的GUS活性在用3％蔗糖處理后提高了8倍，在用6％蔗糖處理后提高了11倍。此外，ibAGP1基因啟動(dòng)子的GUS活性相對(duì)于通用啟動(dòng)子CaMV35S，其活性增加了12～15倍。
實(shí)施例6鑒定胡蘿卜主根中蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(ibAGP1啟動(dòng)子)的活性為鑒定植物貯藏根中的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(ibAGP1啟動(dòng)子)的活性，用實(shí)施例2中構(gòu)建的pSPagp1-221進(jìn)行瞬時(shí)分析法。
更具體地說(shuō)，取生長(zhǎng)和增大階段的胡蘿卜主根并清洗。然后將主根橫切成5mm厚，并在4℃將其置于培養(yǎng)皿中充分潤(rùn)濕的3MM紙上4小時(shí)～5小時(shí)。
根據(jù)Sanford等(1993，Meth Enzymol 217485-509)的方法，混合DNA并將其包被在直徑為1.0的金粉粒子上。在這種情況中，使用以下的轟擊條件[1.0DNA/轟擊，1,350PSi(磅/平方英寸)的氦氣壓力和與胡蘿卜的距離為6cm]。
轟擊之后，將它們?cè)?5℃置于黑暗中24小時(shí)，并進(jìn)行組織化學(xué)染色以鑒定GUS活性。為了對(duì)切下的胡蘿卜主根進(jìn)行染色，將它們浸泡在含有1mM溶于DMSO(二甲亞砜)的X-glu(5-溴-4-氯-3-吲哚-β葡糖苷酸)、100mM磷酸鈉(pH7.0)、10mM EDTA、0.5mM鐵氰化鉀、0.5mM亞鐵氰化鉀和0.1％Triton X-100的溶液中，并在37℃反應(yīng)24小時(shí)。
除去溶液后，用70％乙醇沖洗切下的主根24小時(shí)，然后置于定期更換的100％乙醇中數(shù)天以除去組織中含有的花青苷色素。
如圖6所示，經(jīng)鑒定，pSPagp1-221在所有胡蘿卜主根組織中顯示高水平活性，尤其是該活性與主根直徑成比例地提高(隨蔗糖含量成比例地提高)。
如果綜合考慮上述結(jié)果，可以說(shuō)本發(fā)明所述的啟動(dòng)子在具有高蔗糖含量的植物貯藏器官組織中顯示出高水平的活性。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明提供甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)。
本發(fā)明提供通過(guò)分別將啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)插入至pBI101或pBI221中而制備的植物二元載體和瞬時(shí)表達(dá)載體。
經(jīng)使用所述的二元載體和瞬時(shí)表達(dá)載體進(jìn)行鑒定，本發(fā)明所述的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)使得能夠進(jìn)行蔗糖誘導(dǎo)型表達(dá)，尤其是使得能夠在含有相對(duì)較大量的蔗糖從而在植物中積累大量淀粉的植物貯藏根中進(jìn)行高水平表達(dá)。因此，本發(fā)明可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物以在植物貯藏根中大量生產(chǎn)有用的蛋白。本發(fā)明還可用于諸如使用轉(zhuǎn)化體的貯藏根代謝工程領(lǐng)域或功能性物質(zhì)生產(chǎn)領(lǐng)域等的研究。
序列表<110>高麗大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)<120>來(lái)自甘薯的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子<130>FCI06KR1525<150>KR 10-2004-0070820<151>2004-09-06<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1979<212>DNA<213>Ipomoea batatas cv Yumli<400>1actgatactt tggtgactgc attgtgtttg ggtcttgcca aatctattga gggaggggaa 60gaaagtagaa gtgtcaggga ttggtgtgtg gtggggtttc caaagtttcc ctcttttcct 120ttcttattct tagtttgctc gtcataagtg tcagggattg gtaaccaata gaaatctcat 180ctttaaccta tatgtatgtt ctagtatcat aattaagctc ttactcaaag gaatgttcca 240tttaggtcat ttttaatgtc tatcaattga tcatttcaag taaacaaaac tctggctcta 300atgctgggac tttggtttct ttattatgca gtnttatggg ataaaggttg gttatggtgg 360catcccgggg ccatcaatcg gaagagatgg agctcctgct ccaggagggg gttgctgcag 420ctgaaaatgg gacgtaattt cttttgagta aatgcttgtt tcattgtnaa ttcgtgacta 480attgttcttt gtttttcaat tgttcaaaag cttactatgt atacgtggtg tataatgtaa 540tacaacagcc agcattagga tgnaatagag gtttcaaatt aaactcaacc agaatcctgc 600ttatttcgag aattactacc attctcaaaa aataaataaa taaatcatga gatgtgttga 660tataaataaa taaatcatga gatgtgttga acgctcttca agtttttcac agttgtatga 720ataatgacga gcacatgata gttagagaac ttaggagcat tgaatctggt gcttgggctg 780
atcgatttat ggcatgatgc agtgcattca ctgtatagcg tgtgattgca ggcattagat 840cttggtttat ggtctgcatt tcacgtgggg tgaccatttt gtgccgtttc cgtcagccac 900ttaaatggac caacatcccc tgaggaagac ctgcaaattc agacttagac acactaatta 960taggggcata tgatattatg attggataat ggctgatgaa attttcagcc gttaattcta 1020aacaataaac agtatggcgg tctatgaatg ataacgatct ttaagctgaa gatgggcaaa 1080acaatatgga tcgtctacta gtatttgtct ctttccctat cctgcttgtc tacaccacaa 1140tactaaagac caaaacttga gtgactgaga gaaatatgca ttcattatcc gagtctgtat 1200catgtaaatt ttatcttgta attttaacta ataaaaaatc aggagaaaat cagcctaaat 1260tatttatagc tcataactta ctagttcaga ctaagaagac taataaaaca tccccgttac 1320aaaattaaca ttttgactaa cttgtaacgt ttgcatggtc agaaacagga tacaccaact 1380ttggttgtga tgatgatatc atatcataaa caaaccctcc aaaaagtcac ttgcaaggtg 1440gcactttgcg acagaccacc atgcttaatt gctcataatc agctaaacta ttattattac 1500tttataaaat attttcgccc catatcatat aatttggcca ataatatatc attttatctg 1560tcttacttat tatttattaa ttacataaaa tgaaacggaa tgaataacat aaataatata 1620aagatatact ccgtataagt aacggtgcaa aggagccgat tagatatttt cagtaatcac 1680aagtcacatg tgatcatatc atgtgtattt ttcatataaa ataaaactag tataccccac 1740cctgattttt gctctaaact tccaaatata cccttggtca cgcaaatgct agccgctggt 1800ttggaagggc aaaccgtaaa tgttgacaaa ttctttggca attaggtaat aggtgtcacc 1860tatttgaaca cttactataa aaggacgcct agtttctgtc caaatttcaa cagaatcact 1920cgcttccaca cactccaaag tccgcagaga gctcagagtg gtagcgcggc ttaaaaatg 1979<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>2cgagtcgaca ctgatacttt ggtgact 27<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>3tgcggatcct tttaagccgc gctacca 27<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>4cgcgcatgca ctgatacttt ggtgact 27<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5tgcggatcct tttaagccgc gctacca 2權(quán)利要求
1.一種分離的植物蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，所述啟動(dòng)子序列包含相對(duì)于SEQ ID NO1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-1bp至-1908bp區(qū)的DNA核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的植物蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其中所述啟動(dòng)子序列源自甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的ibAGP1基因。
3.一種分離的甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的5’非翻譯區(qū)，所述5’非翻譯區(qū)包含相對(duì)于SEQ ID NO1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+1bp至+68bp區(qū)的核苷酸序列。
4.一種用于植物轉(zhuǎn)化的蔗糖誘導(dǎo)型二元載體，所述二元載體包含權(quán)利要求1的植物蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和權(quán)利要求3的5’非翻譯區(qū)。
5.一種用于植物的蔗糖誘導(dǎo)型瞬時(shí)表達(dá)載體，所述瞬時(shí)表達(dá)載體包含權(quán)利要求1的植物蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和權(quán)利要求3的5’非翻譯區(qū)。
6.一種大腸桿菌，所述大腸桿菌攜帶有權(quán)利要求4的用于植物轉(zhuǎn)化的蔗糖誘導(dǎo)型二元載體。
7.一種大腸桿菌，所述大腸桿菌攜帶有權(quán)利要求5的瞬時(shí)表達(dá)載體。
8.一種用二元載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，所述二元載體包含權(quán)利要求1的植物蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和權(quán)利要求3的5’非翻譯區(qū)。
9.SEQ ID NO2和3的PCR引物，所述引物適于擴(kuò)增包含SEQ IDNO1的序列的DNA片段。
10.SEQ ID NO4和5的PCR引物，所述引物適于擴(kuò)增包含SEQ IDNO1的序列的DNA片段。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種新的源自甘薯ADP－葡萄糖焦磷酸化酶基因(ibAGP1)的蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和5’非翻譯區(qū)(SEQ ID NO1)。本發(fā)明還公開(kāi)一種使用所述序列的表達(dá)載體以及使用所述載體的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)使得能夠在植物中，尤其是在含有相對(duì)較大量的蔗糖從而能在植物中積累大量淀粉的植物貯藏根中進(jìn)行高水平的蔗糖誘導(dǎo)型表達(dá)。因此，本發(fā)明可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，以在植物貯藏根中大量生產(chǎn)有用的蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1914321SQ200580003363
公開(kāi)日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2005年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月6日
發(fā)明者裵貞明, 郭滿燮, 盧雪娥, 申正燮, 李信雨 申請(qǐng)人:高麗大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)