專利名稱：一種分離純化活性肽飼料添加劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于肽類技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多肽類活性肽飼料添加劑的分離、純化的方法，具體地說是涉及一種使用膜法分離純化活性肽飼料添加劑的方法。
背景技術(shù)：
多年來，由于抗生素、激素等添加劑的長期使用及濫用，導(dǎo)致了諸多弊端，因此，世界各國家都在紛紛禁用或限制抗生素的使用，并加速開發(fā)、推廣新型安全高效的綠色飼料添加劑，以減少或替代抗生素等藥物添加劑。近些年的研究成果表明，大豆肽(也稱大豆活性肽飼料添加劑)是一種新型安全的，并在動物的生長發(fā)育和產(chǎn)品形成方面發(fā)揮著重要作用的飼料添加劑，其理化特性及生理活性與本身分子質(zhì)量大小有關(guān)。但在飼料工業(yè)方面，目前國內(nèi)市場上常見的能提高動物的生產(chǎn)性能，降低腹瀉率的活性肽飼料添加劑產(chǎn)品多為小肽或肽蛋白飼料，其為不同分子量肽的混合物，因而產(chǎn)品功能不明確，功效不明顯。
因此，分離純化活性肽飼料添加劑是使其得以廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵?，F(xiàn)有的對蛋白質(zhì)、多肽類物質(zhì)的分離純化方法一般為鹽析法、凝膠過濾法、等電點沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、色譜法等。或是將這些方法組合到一起對特定的物質(zhì)進(jìn)行分離純化，它們對待測物的純度、鹽含量、分子量、雜質(zhì)的性質(zhì)等都有較高的要求，且尋找適宜的分離條件很困難，成本高、分析量小，不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
膜分離技術(shù)，尤其是超濾膜分離技術(shù)是世界上公認(rèn)的21世紀(jì)最有發(fā)展前途的一項重大生產(chǎn)技術(shù)，與傳統(tǒng)工藝相比較，超濾不僅可以提高產(chǎn)品的純度、節(jié)約溶劑或試劑的耗用量，而且它無相變、工藝設(shè)備簡單、操作方便可靠、能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)化分離純化、縮短生產(chǎn)周期，同時不會造成環(huán)境污染等，已廣泛應(yīng)用于制藥、生化、水處理等領(lǐng)域。近年來，科技工作者在把超濾膜應(yīng)用到制備大豆分離蛋白、大豆肽工藝方面進(jìn)行了些的研究，但是由于肽類很容易吸附在膜上，形成凝膠，膜污染嚴(yán)重，導(dǎo)致膜通量迅速下降，使得超濾效率下降；而且，由于很難選自適宜的膜截留率，從而影響了產(chǎn)品純度和產(chǎn)率。
膜截留率R％＝(原液濃度-透過液濃度)/原液濃度×100％膜通量J(m3/m2.h)＝透過液體積/(有效膜面積×?xí)r間)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有肽類分離、純化的生產(chǎn)成本高，不適合工業(yè)化大批量生產(chǎn)；而使用超濾膜分離技術(shù)時膜截留率和膜通量都不甚理想的缺陷，從而提供一種分離成本低、膜污染小、生產(chǎn)連續(xù)穩(wěn)定、產(chǎn)率和純度高、且膜截留率和膜通量都很高的分離純化活性肽飼料添加劑的方法。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供一種分離純化活性肽飼料添加劑的方法，其為將離心分離后的豆粕發(fā)酵液，使用不同截留分子量的超濾膜，采用錯流操作或垂直操作，進(jìn)行超濾；然后使用去離子水清洗超濾膜至膜通量恢復(fù)到初始通量的75～90％。
所述的超濾膜為聚醚砜、磺化聚砜或再生纖維素制得的膜。
所述的超濾膜的形狀為管式、板式、卷式或中空纖維式。
本發(fā)明提供的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，還包括在首次使用超濾膜之前，使用30～35℃的水浸泡超濾膜1～1.5h，期間換水3～4批，以洗去超濾膜表面的處理劑。
本發(fā)明提供的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，還包括在使用超濾膜之后的清洗步驟先用25～45℃的水沖洗，再用0.3～0.6wt％的堿性蛋白酶溶液清洗0.5～1.5h，使膜通量恢復(fù)到原來的70～90％。
本發(fā)明提供的分離純化活性肽飼料添加劑的方法具體包括如下的步驟1)將常規(guī)方法制備的豆粕發(fā)酵水解液離心分離，離心溫度為5～20℃，離心轉(zhuǎn)速為4000～7000rpm，時間為10～20min，分出上層清液，以去除沒有水解的豆粕和發(fā)酵液中的微生物，并保證后續(xù)超濾膜的正常運行；2)將步驟1)得到的上層清液先經(jīng)過截留分子量為80000Dal的聚醚砜板式超濾膜，采用錯流操作，運行工藝條件為壓力0.22MPa，溫度55℃，流速為6L/min，膜截留率為95％；
3)將步驟2)的透過液再經(jīng)過截留分子量為10000Dal的磺化聚砜板式超濾膜，采用錯流操作，運行工藝條件為壓力0.18MPa，溫度40℃，流速為4L/min，膜截留率為93％；得到含有固形物濃度為4.91％(W/V)，酸溶性大豆活性肽(以下簡稱“大豆肽”)含量為71.3％(W/V)，分子量為10000Dal～80000Dal的大豆活性肽的肽液；4)將步驟3)的透過液再經(jīng)過截留分子量為6000Dal的中空纖維板式超濾膜，采用錯流操作，運行工藝條件為壓力0.1MPa，溫度35℃，流速為5L/min，膜截留率為91％；得到還有固形物濃度為4.46％(W/V)，酸溶性大豆活性肽含量為65.8％(W/V)，分子量為6000Dal～10000Dal的大豆活性肽的肽液；5)將步驟4)的透過液再經(jīng)過截留分子量為3000Dal的中空纖維板式超濾膜，采用垂直操作，運行工藝條件為壓力0.02MPa，溫度30℃，流速為3L/min，膜截留率為90％；得到含有固形物濃度為2.36％(W/V)，酸溶性大豆活性肽含量為58.6％(W/V)，分子量為3000Dal～6000Dal的大豆活性肽的肽液；透過液為含有固形物濃度為1.91％(W/V)，酸溶性大豆活性肽含量為50.7％(W/V)，分子量＜3000Dal的大豆活性肽的肽液。
本發(fā)明提供的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，還包括將超濾膜分離的肽液進(jìn)一步濃縮6)將步驟3)的肽液在89Kpa的真空度下進(jìn)行濃縮，得到固形物濃度為11％，大豆活性肽含量為71.3％的大豆活性肽濃縮液；7)將步驟4)的肽液在85Kpa的真空度下進(jìn)行濃縮，得到固形物濃度為18％，大豆活性肽含量為65.8％的大豆活性肽濃縮液；8)將步驟5)的肽液在82Kpa的真空度下進(jìn)行濃縮，得到固形物濃度為20％，大豆活性肽含量為58.6％的大豆活性肽濃縮液；9)將步驟5)的透過液在80Kpa的真空度下進(jìn)行濃縮，得到固形物濃度為25％，大豆活性肽含量為50.7％的大豆活性肽濃縮液。
本發(fā)明提供的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，還包括將超濾膜分離的肽液進(jìn)一步濃縮10)將步驟6)得到的大豆活性肽濃縮液進(jìn)行常規(guī)噴霧干燥，噴霧時進(jìn)口溫度125～130℃，塔內(nèi)溫度75～78℃，排風(fēng)口溫度80～85℃，得到大豆活性肽含量為45％的大豆活性肽粉；
11)將步驟7)得到的大豆活性肽濃縮液進(jìn)行常規(guī)噴霧干燥，噴霧時進(jìn)口溫度125～130℃，塔內(nèi)溫度75～78℃，排風(fēng)口溫度80～85℃，得到大豆活性肽含量為56％的大豆活性肽粉；12)將步驟8)得到的大豆活性肽濃縮液進(jìn)行常規(guī)噴霧干燥，噴霧時進(jìn)口溫度125～130℃，塔內(nèi)溫度75～78℃，排風(fēng)口溫度80～85℃，得到大豆活性肽含量為64％的大豆活性肽粉；13)將步驟9)得到的大豆活性肽濃縮液進(jìn)行常規(guī)噴霧干燥，噴霧時進(jìn)口溫度125～130℃，塔內(nèi)溫度75～78℃，排風(fēng)口溫度80～85℃，得到大豆活性肽含量為78％的大豆活性肽粉。
本發(fā)明提供的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，還包括在連續(xù)分離過程中，截留分子量為80000Dal和3000Dal的膜每20h清洗一次，先用45℃溫水沖洗15min，再用0.5wt％的堿性蛋白酶清洗1.5h，分別使膜通量恢復(fù)到初始通量的75％和90％；截留分子量為10000Dal和6000Dal的膜每15h清洗一次，先用25℃溫水沖洗10min，再用0.4wt％的堿性蛋白酶清洗1h，使膜通量恢復(fù)到初始通量的80％和88％。
本發(fā)明中超濾膜的膜通量可用下述方法測定1)在超濾前，先使用去離子水閉路循環(huán)運轉(zhuǎn)1～2h以上，每隔10～15min測定濾出液的通量，作出水通量隨時間變化曲線，求出其漸進(jìn)的平衡通量，作為該膜片的起始純水通量，排出體系中的水；2)超濾后，關(guān)閉回流閥，返回液排放，使用去離子水不斷將管路中的料液置換出來，直至料液罐中液體的電導(dǎo)率與純水相同，可測得污染膜的純水通量；3)使用清洗液循環(huán)清洗1～1.5h后，可再次測得清洗后的純水通量。
與已有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的分離純化活性肽飼料添加劑的方法的優(yōu)點在于1、使用了超濾膜法，能夠節(jié)約溶劑或試劑的耗用量，而且其無相變、工藝簡潔、操作方便可靠、能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)化分離純化、縮短生產(chǎn)周期，同時不會造成環(huán)境污染；2、通過選擇了合適的膜材料、膜形式、操作方式、超濾參數(shù)，可有效減輕膜污染的程度，進(jìn)而保證了生產(chǎn)的長期穩(wěn)定性；并解決了膜截留率問題，使得大豆活性肽的截留率最高，從而提高了產(chǎn)品純度和產(chǎn)率。
3、采用多級膜分離的方法，可有效分離不同分子量的大豆活性肽，為深入研究不同分子量大豆活性肽的生物學(xué)功能提供技術(shù)支持。
4、通過使用高效的清洗方法，在每次清洗時都使得膜通量的恢復(fù)率較高，因而可以達(dá)到連續(xù)穩(wěn)定生產(chǎn)的要求。
5、主要工藝工程均采用膜技術(shù)，因此是一個物理過程，這樣就能充分保證大豆活性肽的活性，從而保護(hù)了大豆活性肽特有的功能和保健作用。
具體實施例方式
實施例1、按照本發(fā)明提供的方法分離純化活性肽飼料添加劑，首先將常規(guī)方法制備的豆粕發(fā)酵液離心分離，離心溫度為5℃，離心轉(zhuǎn)速為4000rpm，時間為10min，分出上層清液，以去除沒有水解的豆粕和發(fā)酵液中的微生物，并保證后續(xù)超濾膜的正常運行。將得到的上層清液先經(jīng)過截留分子量為80000Dal的聚醚砜板式超濾膜，采用錯流操作，運行工藝條件為壓力0.22MPa，溫度55℃，流速為6L/min，膜截留率為95％。將得到的透過液再經(jīng)過截留分子量為10000Dal的磺化聚砜板式超濾膜，采用錯流操作，運行工藝條件為壓力0.18MPa，溫度40℃，流速為4L/min，膜截留率為93％；得到含有固形物濃度為4.91％(W/V)，酸溶性大豆活性肽含量為71.3％(W/V)，分子量為10000Dal～80000Dal的大豆活性肽的肽液。將此透過液再經(jīng)過截留分子量為6000Dal的中空纖維板式超濾膜，采用錯流操作，運行工藝條件為壓力0.1MPa，溫度35℃，流速為5L/min，膜截留率為91％；得到還有固形物濃度為4.46％(W/V)，酸溶性大豆活性肽含量為65.8％(W/V)，分子量為6000Dal～10000Dal的大豆活性肽的肽液。將得到的透過液再經(jīng)過截留分子量為3000Dal的中空纖維板式超濾膜，采用垂直操作，運行工藝條件為壓力0.02MPa，溫度30℃，流速為3L/min，膜截留率為90％；得到含有固形物濃度為2.36％(W/V)，酸溶性大豆活性肽含量為58.6％(W/V)，分子量為3000Dal～6000Dal的大豆活性肽的肽液；透過液為含有固形物濃度為1.91％(W/V)，酸溶性大豆活性肽含量為50.7％(W/V)，分子量＜3000Dal的大豆活性肽的肽液。
實施例2、將實施例1中得到的4個肽段的肽液分別在89Kpa、85Kpa、82Kpa和80Kpa的壓力下進(jìn)行濃縮，得到的濃縮液的固形物濃度分別為11％、18％，20％、25％，且其中大豆活性肽含量分別為71.3％、65.8％、58.6％、50.7％。
實施例3、將實施例2中得到的不同分子量段的大豆活性肽進(jìn)行噴霧干燥，最后得到大豆活性肽含量分別為45％、56％、64％、78％，干燥塔的進(jìn)口溫度125℃，塔內(nèi)溫度78℃，排風(fēng)口溫度83℃。
在首次使用超濾膜之前，使用30～35℃的水浸泡超濾膜1～1.5h，期間換水3～4批，以洗去超濾膜表面的處理劑。
在使用超濾膜之后，先用25～45℃的水沖洗，再用0.3～0.6wt％的堿性蛋白酶溶液清洗0.5～1.5h，使膜通量恢復(fù)到原來的70～90％。
在連續(xù)分離過程中，截留分子量為80000Dal和3000Dal的膜20h清洗一次，包括先用45℃溫水沖洗15min，再用0.5％的堿性蛋白酶清洗1.5h，使膜通量恢復(fù)到初始通量的75％和90％；截留分子量為10000Dal和6000Dal的膜15h清洗一次，包括先用25℃溫水沖洗10min，再用0.4％的堿性蛋白酶清洗1h，使膜通量恢復(fù)到初始通量的80％和88％。
本發(fā)明通過選擇了合適的膜材料、膜形式、操作方式、超濾參數(shù)，可有效減輕膜污染的程度，進(jìn)而保證了生產(chǎn)的長期穩(wěn)定性；并解決了膜截留率問題，使得大豆活性肽的截留率最高，從而提高了產(chǎn)品純度和產(chǎn)率。而且使用本發(fā)明提供的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，能夠節(jié)約溶劑或試劑的耗用量，而且其無相變、工藝簡潔、操作方便可靠、能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)化分離純化、縮短生產(chǎn)周期，同時不會造成環(huán)境污染。
權(quán)利要求
1.一種分離純化活性肽飼料添加劑的方法，其為將離心分離后的豆粕發(fā)酵水解液，使用不同截留分子量的超濾膜，采用錯流操作或垂直操作，進(jìn)行超濾；然后使用去離子水清洗超濾膜至膜通量恢復(fù)到初始通量的75～90％。
2.如權(quán)利要求1所述的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，其特征在于所述的超濾膜為聚醚砜、磺化聚砜或再生纖維素制得的膜。
3.如權(quán)利要求1所述的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，其特征在于所述的超濾膜的形狀為管式、板式、卷式或中空纖維式。
4.如權(quán)利要求1所述的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，其特征在于還包括在首次使用超濾膜之前，使用30～35℃的水浸泡超濾膜1～1.5h，期間換水3～4批，以洗去超濾膜表面的處理劑。
5.如權(quán)利要求1所述的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，其特征在于還包括在使用超濾膜之后的清洗步驟先用25～45℃的水沖洗，再用0.3～0.6wt％的堿性蛋白酶溶液清洗0.5～1.5h，使膜通量恢復(fù)到原來的70～90％。
6.如權(quán)利要求1所述的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，其特征在于所述的分離方法具體包括如下的步驟1)將常規(guī)方法制備的豆粕發(fā)酵液離心分離，離心溫度為5～20℃，離心轉(zhuǎn)速為4000～7000rpm，時間為10～20min，分出上層清液，以去除沒有水解的豆粕和發(fā)酵液中的微生物，并保證后續(xù)超濾膜的正常運行；2)將步驟1)得到的上層清液先經(jīng)過截留分子量為80000Dal的聚醚砜板式超濾膜，采用錯流操作，運行工藝條件為壓力0.22MPa，溫度55℃，流速為6L/min，膜截留率為95％；3)將步驟2)的透過液再經(jīng)過截留分子量為10000Dal的磺化聚砜板式超濾膜，采用錯流操作，運行工藝條件為壓力0.18MPa，溫度40℃，流速為4L/min，膜截留率為93％；得到含有固形物濃度為4.91％(W/V)，酸溶性大豆活性肽含量為71.3％(W/V)，分子量為10000Dal～80000Dal的大豆活性肽的肽液；4)將步驟3)的透過液再經(jīng)過截留分子量為6000Dal的中空纖維板式超濾膜，采用錯流操作，運行工藝條件為壓力0.1MPa，溫度35℃，流速為5L/min，膜截留率為91％；得到還有固形物濃度為4.46％(W/V)，酸溶性大豆活性肽含量為65.8％(W/V)，分子量為6000Dal～10000Dal的大豆活性肽的肽液；5)將步驟4)的透過液再經(jīng)過截留分子量為3000Dal的中空纖維板式超濾膜，采用垂直操作，運行工藝條件為壓力0.02MPa，溫度30℃，流速為3L/min，膜截留率為90％；得到含有固形物濃度為2.36％(W/V)，酸溶性大豆活性肽含量為58.6％(W/V)，分子量為3000Dal～6000Dal的大豆活性肽的肽液；透過液為含有固形物濃度為1.91％(W/V)，酸溶性大豆活性肽含量為50.7％(W/V)，分子量＜3000Dal的大豆活性肽的肽液。
7.如權(quán)利要求6所述的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，其特征在于還包括將超濾膜分離的肽液進(jìn)一步濃縮6)將步驟3)的肽液在89Kpa的真空度下進(jìn)行濃縮，得到固形物濃度為11％，大豆活性肽含量為71.3％的大豆活性肽濃縮液；7)將步驟4)的肽液在85Kpa的真空度下進(jìn)行濃縮，得到固形物濃度為18％，大豆活性肽含量為65.8％的大豆活性肽濃縮液；8)將步驟5)的肽液在82Kpa的真空度下進(jìn)行濃縮，得到固形物濃度為20％，大豆活性肽含量為58.6％的大豆活性肽濃縮液；9)將步驟5)的透過液在80Kpa的真空度下進(jìn)行濃縮，得到固形物濃度為25％，大豆活性肽含量為50.7％的大豆活性肽濃縮液。
8.如權(quán)利要求6所述的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，其特征在于還包括將超濾膜分離的肽液進(jìn)一步濃縮10)將步驟6)得到的大豆活性肽濃縮液進(jìn)行常規(guī)噴霧干燥，噴霧時進(jìn)口溫度125～130℃，塔內(nèi)溫度75～78℃，排風(fēng)口溫度80～85℃，得到大豆活性肽含量為45％的大豆活性肽粉；11)將步驟7)得到的大豆活性肽濃縮液進(jìn)行常規(guī)噴霧干燥，噴霧時進(jìn)口溫度125～130℃，塔內(nèi)溫度75～78℃，排風(fēng)口溫度80～85℃，得到大豆活性肽含量為56％的大豆活性肽粉；12)將步驟8)得到的大豆活性肽濃縮液進(jìn)行常規(guī)噴霧干燥，噴霧時進(jìn)口溫度125～130℃，塔內(nèi)溫度75～78℃，排風(fēng)口溫度80～85℃，得到大豆活性肽含量為64％的大豆活性肽粉；13)將步驟9)得到的大豆活性肽濃縮液進(jìn)行常規(guī)噴霧干燥，噴霧時進(jìn)口溫度125～130℃，塔內(nèi)溫度75～78℃，排風(fēng)口溫度80～85℃，得到大豆活性肽含量為78％的大豆活性肽粉。
9.如權(quán)利要求1所述的分離純化活性肽飼料添加劑的方法，其特征在于還包括在連續(xù)分離過程中，截留分子量為80000Dal和3000Dal的膜每20h清洗一次，先用45℃溫水沖洗15min，再用0.5wt％的堿性蛋白酶清洗1.5h，分別使膜通量恢復(fù)到初始通量的75％和90％；截留分子量為10000Dal和6000Dal的膜每15h清洗一次，先用25℃溫水沖洗10min，再用0.4wt％的堿性蛋白酶清洗1h，使膜通量恢復(fù)到初始通量的80％和88％。
全文摘要
本發(fā)明一種分離純化活性肽飼料添加劑的方法，其為將離心分離后的豆粕發(fā)酵水解液，使用不同截留分子量的超濾膜，采用錯流操作或垂直操作，進(jìn)行超濾；然后使用去離子水清洗超濾膜至膜通量恢復(fù)到初始通量的75～90％。所述的超濾膜為聚醚砜、磺化聚砜或再生纖維素制得的膜。該方法通過選擇了合適的膜材料、膜形式、操作方式、超濾參數(shù)，可有效減輕膜污染的程度，進(jìn)而保證了生產(chǎn)的長期穩(wěn)定性；并解決了膜截留率問題，使得大豆活性肽的截留率最高，從而提高了產(chǎn)品純度和產(chǎn)率；而且該方法能夠節(jié)約溶劑或試劑的耗用量，而且其無相變、工藝簡潔、操作方便可靠、能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)化分離純化、縮短生產(chǎn)周期，同時不會造成環(huán)境污染。
文檔編號A23J3/00GK1895072SQ20051008386
公開日2007年1月17日 申請日期2005年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月14日
發(fā)明者張日俊, 于長青 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)