專利名稱：：一種pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種PCR方法。
背景技術(shù)：
：通過(guò)PCR步查法獲得插入位點(diǎn)的毗鄰序列較傳統(tǒng)的建庫(kù)篩選相比，操作簡(jiǎn)便、快捷且成本低廉，是分離與已知序列毗鄰的未知序列或新基因的首選實(shí)驗(yàn)方法?，F(xiàn)有的PCR步查法，如inversePCR、連接介導(dǎo)PCR、TAIL-PCR等存在著方法過(guò)于復(fù)雜、受酶切位點(diǎn)的限制、擴(kuò)增的片段小(達(dá)不到研究者所要求的長(zhǎng)度)、特異性差等弊端，常常擴(kuò)增不到研究者所需要的DNA片段。目前用于分離與已知序列毗鄰的未知序列的PCR方法已報(bào)道有幾十種，按其采用的原理，可歸納為三種1、反向PCR(InversePCR)將未知序列端反折回來(lái)，與已知序列相連接，再用已知序列上的兩引物作PCR。反向PCR主要有兩個(gè)技術(shù)問(wèn)題(1)要求在已知序列和未知序列端有相同的酶切位點(diǎn)，當(dāng)一端沒有或兩端皆沒有合適的酶切位點(diǎn)時(shí)，反向PCR不適用。(2)當(dāng)兩端皆存在合適的酶切位點(diǎn)時(shí)，反向PCR也不十分有效，因?yàn)檫B接反應(yīng)多發(fā)生于分子間，分子內(nèi)連接(環(huán)化)的幾率很小。2、連接介導(dǎo)的PCR。連接介導(dǎo)的PCR是在未知序列端連接上一個(gè)接頭，用已知序列端的特異引物和未知序列端的接頭引物作PCR擴(kuò)增。這類PCR方法的共同特點(diǎn)是特異性差。3、隨機(jī)退火的PCR(randomlyprimedPCR)這類PCR也有兩個(gè)技術(shù)問(wèn)題，1)這類PCR要求在未知序列端有簡(jiǎn)并引物(arbitrarydegenaratedprimer)的結(jié)合位點(diǎn)，而實(shí)際情況是在很多情況下在未知序列端缺乏簡(jiǎn)并引物的結(jié)合位點(diǎn)。2)非特異性擴(kuò)增問(wèn)題十分突出，在多數(shù)情況下非特異性擴(kuò)增掩蓋了特異性擴(kuò)增，從而得不到所需要的特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有較高特異性，并且操作簡(jiǎn)單的PCR方法。本發(fā)明所提供的PCR方法，稱為SiteFind-PCR，包括以下步驟1)用SiteFinder起始PCR反應(yīng)；所述SiteFinder包括46種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子，所述各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子的長(zhǎng)度相同，均為50-100nt；所述各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子的3′末端的4至6個(gè)脫氧核苷酸組成的序列均相同，緊密連接于該4至6個(gè)脫氧核苷酸的5′方向的6個(gè)脫氧核苷酸組成的序列均不同，緊密連接于該6個(gè)脫氧核苷酸的5′方向的38-90個(gè)脫氧核苷酸組成的序列均相同；2)進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)；所述巢式PCR反應(yīng)的引物由根據(jù)SiteFinder合成的SPF1和SPF2，和根據(jù)與待擴(kuò)增的目標(biāo)序列相鄰的已知序列合成的基因特異引物GSP1，GSP2和GSP3組成；所述SPF1和SPF2的序列均選自步驟1)的SiteFinder的所述各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子的38-90個(gè)脫氧核苷酸組成的序列；所述SPF1的3′末端序列和SPF2的5′末端序列相同，形成嵌套引物；所述GSP1，GSP2和GSP3中，所述GSP3最接近待擴(kuò)增的目標(biāo)序列，其次是GSP2，離待擴(kuò)增的目標(biāo)序列最遠(yuǎn)的是GSP1；所述GSP3的3′端第一個(gè)脫氧核苷酸與所述已知序列的結(jié)合位置，與所述已知序列的3′端最后一個(gè)脫氧核苷酸間至少相距5nt。其中，為了便于對(duì)待擴(kuò)增的目標(biāo)序列的PCR產(chǎn)物進(jìn)行選擇和將得到的PCR產(chǎn)物克隆入載體，所述38-90個(gè)脫氧核苷酸組成的序列中，緊密連接于所述6個(gè)脫氧核苷酸5′方向的脫氧核苷酸組成的序列為一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的5′→3′走向的單鏈序列；所述限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列大于等于八個(gè)核苷酸對(duì)。其中，任何大于等于八個(gè)核苷酸對(duì)組成的限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列均可實(shí)現(xiàn)該目的，使用大于等于八個(gè)核苷酸對(duì)組成的限制性核酸內(nèi)切酶的稀有識(shí)別序列的原因是避免將SiteFinder以外的目標(biāo)序列切斷。所述方法中還包括利用所述SiteFinder包含的各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子中的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列對(duì)應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶，對(duì)待擴(kuò)增的目標(biāo)序列的PCR產(chǎn)物進(jìn)行選擇的步驟。識(shí)別序列大于等于八個(gè)核苷酸對(duì)的限制性核酸內(nèi)切酶包括NotI(GCGGCCGC)，ASC(GGCGCGCC)，AsiSI(GCGATCGC)，F(xiàn)seI(GGCCGGCC)等。所述SPF1和SPF2的序列均選自所述40-90個(gè)脫氧核苷酸中，緊密連接于所述限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的5′方向的脫氧核苷酸組成的序列。所述起始PCR反應(yīng)包括模板變性、SiteFinder中的單鏈寡聚脫氧核苷酸分子與模板退火、單方向延伸；所述SiteFinder中的單鏈寡聚脫氧核苷酸分子與模板退火的溫度條件可為16-25℃1分鐘；所述起始PCR反應(yīng)的模板變性的溫度條件可為先92℃2分鐘，然后95℃1分鐘。所述起始PCR反應(yīng)的單方向延伸的溫度條件為在至少3分鐘內(nèi)升溫至68℃，然后68℃10分鐘。所述巢式PCR反應(yīng)包括第一輪和第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，所述第一輪擴(kuò)增反應(yīng)是由SPF1和GSP1組成的一對(duì)引物進(jìn)行的反應(yīng)，所述第二輪擴(kuò)增反應(yīng)包括由SPF2和GSP2組成的一對(duì)引物進(jìn)行的反應(yīng)。為了根據(jù)SPF2和GSP2、GSP3所擴(kuò)增DNA片段的大小差異來(lái)辨認(rèn)PCR產(chǎn)物是否為特異性分子，所述第二輪擴(kuò)增反應(yīng)還包括由SPF2和GSP3組成的一對(duì)引物進(jìn)行的反應(yīng)。所述第一輪擴(kuò)增反應(yīng)和第二輪擴(kuò)增反應(yīng)的溫度條件均為先94℃1分鐘；然后95℃10-15秒，68℃6分鐘，進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)；最后72℃5分鐘。本發(fā)明首先獨(dú)特設(shè)計(jì)了用來(lái)起始PCR反應(yīng)的由46種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子組成的SiteFinder。圖1示一種SiteFinder，其3’末端有4個(gè)特異的核苷酸，用來(lái)與DNA模板上相應(yīng)位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)，該4個(gè)特異的核苷酸上游有6個(gè)隨機(jī)核苷酸，用來(lái)輔助3’末端退火；緊接著有一個(gè)由8個(gè)核苷酸組成的NotI的識(shí)別序列的5′→3′走向的單鏈序列，用來(lái)選擇性地克隆目標(biāo)分子?；赟iteFinder包含的各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子序列的5′端序列，合成2個(gè)嵌套引物，即SFP1和SFP2。圖1示根據(jù)上述SiteFinder的5′端序列合成的SFP1和SFP2。根據(jù)與待擴(kuò)增的目標(biāo)序列相鄰的已知序列，合成基因特異引物GSP1，GSP2和GSP3。GSP1，GSP2和GSP3中，所述GSP3最接近待擴(kuò)增的目標(biāo)序列，其次是GSP2，離待擴(kuò)增的目標(biāo)序列最遠(yuǎn)的是GSP1。為了便于鑒定所擴(kuò)增得到的產(chǎn)物是否為目的序列，所述GSP3的3′端第一個(gè)脫氧核苷酸與所述已知序列的結(jié)合位置，與所述已知序列的3′端最后一個(gè)脫氧核苷酸間至少相距5nt。SiteFind-PCR的原理如圖2(粗線示已知序列，細(xì)線為未知序列)所示(1)基因組DNA；(2)通過(guò)模板變性、SiteFinder在低溫下與基因組模板退火、單方向延伸，將SiteFinder序列引入基因組序列之中；(3)通過(guò)巢式PCR指數(shù)倍擴(kuò)增目標(biāo)DNA分子，而非目標(biāo)分子因莖環(huán)結(jié)構(gòu)的抑制作用而無(wú)法完成指數(shù)擴(kuò)增，從而達(dá)到選擇性擴(kuò)增目標(biāo)分子的目的；(4)通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列(如NotI識(shí)別序列)選擇性地克隆目標(biāo)分子；(5)通過(guò)已知序列上GSP2下游的GSP3特異性地篩選目標(biāo)分子。一般來(lái)說(shuō)，為了保證PCR產(chǎn)物的特異性，在PCR過(guò)程中應(yīng)該盡量避免非特異起始發(fā)生。但是，這種非特異起始是相對(duì)于整個(gè)引物來(lái)說(shuō)的。對(duì)于引物的3’-末端的幾個(gè)堿基來(lái)說(shuō)，即使是錯(cuò)誤的起始，也必然是精確地與模板DNA分子配對(duì)的，否則將無(wú)法完成DNA分子的擴(kuò)增。利用這一特點(diǎn)，依靠SiteFinder的3’-末端的4-6個(gè)堿基尋找基因組上與其配對(duì)的位點(diǎn)，起動(dòng)整個(gè)基因組上相應(yīng)位點(diǎn)下游的DNA分子的擴(kuò)增(圖2)。隨后完成了對(duì)目標(biāo)分子的選擇第一次選擇(選擇性擴(kuò)增)，目標(biāo)分子在基因特異引物的作用下，將SiteFinder的互補(bǔ)鏈填充完整，從而得到只有一端有SiteFinder序列而另一端是已知序列的DNA分子。在PCR過(guò)程中這種分子可以被指數(shù)倍擴(kuò)增。然而，對(duì)于非目標(biāo)DNA分子來(lái)說(shuō)，絕大部分分子將只會(huì)在分子的一端具有SiteFinder序列，它們?cè)诤罄m(xù)的PCR過(guò)程中，只會(huì)被線性擴(kuò)增；即使有少數(shù)分子兩端都具有SiteFinder序列，因?yàn)樗鼈冊(cè)诜肿拥膬啥藰?gòu)成反向重復(fù)序列，在PCR的變性退火過(guò)程中將因?yàn)榭臻g距離接近而形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)阻止了引物和模板的退火。第二次選擇(選擇性克隆)，在SiteFinder上設(shè)計(jì)了一個(gè)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列(如NotI識(shí)別序列)，一方面極大的方便了對(duì)目標(biāo)分子的克隆，更重要的是又一次對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行了選擇。理論上只有目標(biāo)分子才滿足一端是該限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列(如NotI識(shí)別序列)，另外一端是平端，從而被連接到用該限制性內(nèi)切酶(如NotI)和另一個(gè)核酸內(nèi)切酶(如EcoRV酶切)線性化的載體(如pBlueScriptSK(+)質(zhì)粒)中。非目標(biāo)分子因兩端具有該限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列(如NotI識(shí)別序列)或者一端是該限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列(如NotI識(shí)別序列)另一端是環(huán)狀結(jié)構(gòu)(loop)，而不能被克隆。第三次選擇(選擇性篩選)，克隆GSP2/SFP2引物對(duì)的產(chǎn)物而不是GSP3/SFP2引物對(duì)的產(chǎn)物，目的在于確保使用載體引物和GSP3篩選的時(shí)候，只有目標(biāo)分子的特異擴(kuò)增的產(chǎn)物能被篩選到，而其他來(lái)源的分子都不能被篩選出來(lái)。只有GSP3/SFP2引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度小于GSP2/SFP2引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物，才是目標(biāo)分子的特異擴(kuò)增的產(chǎn)物。本發(fā)明的SiteFind-PCR具有以下優(yōu)點(diǎn)1.操作簡(jiǎn)單操作過(guò)程中沒有酶切、沉淀、回收和連接過(guò)程，大大簡(jiǎn)化了操作步驟，減小了受污染的幾率。2.高特異性在已有的步查PCR方法中只有反向PCR(InversePCR)和T-linkerPCR具有高特異性(Yan，Y.X.，An，C.C.，Li，L.，Gu，J.Y.，Tan，G.H.，andChen，Z.L.(2003).T-linker-specificligationPCR(T-linkerPCR)anadvancedPCRtechniqueforchromosomewalkingorforisolationoftaggedDNAends.NucleicAcidsRes.30，e68.)，但是它們都受酶切位點(diǎn)的限制，而且對(duì)于反向PCR來(lái)說(shuō)，基因組內(nèi)的目標(biāo)DNA分子在非選擇性的連接條件下環(huán)化困難，致使在有合適酶切位點(diǎn)的情況下也難擴(kuò)增到目標(biāo)DNA分子。其它步查PCR方法特異性差，擴(kuò)增到的往往是與研究目的不相干的非特異性分子。因?yàn)镾iteFind-PCR中莖環(huán)結(jié)構(gòu)的抑制效應(yīng)，以及后續(xù)的選擇性克隆和篩選，保證了結(jié)果的高特異性。3.高成功率所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，成功地從8個(gè)樣品中得到8陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明對(duì)于每一個(gè)樣品來(lái)說(shuō)都能夠被有效地步查。4.容易得到大的片斷因?yàn)椴挥孟拗菩詢?nèi)切酶處理模板，理論上其起始位點(diǎn)到已知序列的最大距離只受Taq酶的擴(kuò)增能力的制約，所以用SiteFind-PCR做染色體步查很容易得到較大的片斷。SiteFind-PCR與現(xiàn)有PCR方法相比，具有操作簡(jiǎn)單、快速、特異性高、通用性強(qiáng)、重復(fù)性好、一次擴(kuò)增片段較長(zhǎng)且成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。SiteFind-PCR可廣泛適用于分子生物學(xué)研究中多種目的的染色體步查，如轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物及微生物中外源基因插入位點(diǎn)的鑒定、基因未知區(qū)段新基因的分離等。圖1為SiteFinder示意圖及根據(jù)其合成的SFP1和SFP2的序列圖2為SiteFind-PCR的原理3為DL3、DL2和DL1的序列圖4為用SiteFind-PCR鑒定第一個(gè)擬南芥插入突變體的插入位點(diǎn)的第二輪PCR產(chǎn)物電泳圖譜及對(duì)克隆產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果圖5為用SiteFind-PCR同時(shí)鑒定7個(gè)擬南芥插入突變體的插入位點(diǎn)的第二輪PCR產(chǎn)物電泳圖譜具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施實(shí)例1、利用SiteFind-PCR對(duì)復(fù)雜基因組上的未知序列的步查一、擬南芥突變體的獲得以pSki015(WeigelWorld)為轉(zhuǎn)化擬南芥的載體，按照文獻(xiàn)(Chang，S.S.，Park，S.K.，Kim，B.C.，Kang，b.J.，Kim，D.U.，andNam，H.G.(1994).StablegenetictransformationofArabidopsisthalianabyAgrobacteriuminoculationinplanta.PlantJ.5，551-558.；Gelvin，S.B.(2003).Agrobacterium-mediatedplanttransformationthebiologybehindthe″gene-jockeying″tool.MicrobiolMolBiolRev67，16-37，tableofcontents；Tzfira，T.，Li，J.，Lacroix，B.，andCitovsky，V.(2004).AgrobacteriumT-DNAintegrationmoleculesandmodels.TrendsGenet20，375-383)的方法，用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥(哥倫比亞型生態(tài)種)，經(jīng)除草劑篩選，在子一代植株中得到8株抗除草劑的T-DNA插入突變體。二、用SiteFind-PCR鑒定1個(gè)擬南芥插入突變體的插入位點(diǎn)1、SiteFinder、SFP1和SFP2、GSP3，GSP2和GSP1的設(shè)計(jì)合成(1)設(shè)計(jì)合成SiteFinder所設(shè)計(jì)合成的SiteFinder包括46種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子SiteFinder，SiteFinder-4096。它們的大小均為61nt，它們的序列通式5’-CACGACACGCTACTCAACACACCACCTCGCACAGCGTCCTCAAGCGGCCGCNNNNNNGCCT-3’，其中，3’末端的4個(gè)特異的核苷酸GCCT用來(lái)與DNA模板上相應(yīng)位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)，該4個(gè)特異的核苷酸上游有6個(gè)隨機(jī)核苷酸NNNNNN(N為A或T或C或G)，用來(lái)輔助3’末端退火；緊接著有一個(gè)由8個(gè)核苷酸組成的NotI的識(shí)別序列5′→3′走向的單鏈序列GCGGCCGC，用來(lái)選擇性地克隆目標(biāo)分子。(2)設(shè)計(jì)合成SFP1和SFP2基于SiteFinder包含的各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子序列的5’端序列，合成2個(gè)嵌套引物SFP1和SFP2。SFP15’-CACGACACGCTACTCAACAC-3’，SFP25’-ACTCAACACACCACCTCGCACAGC-3’。(3)設(shè)計(jì)合成GSP3，GSP2和GSP1以穿梭載體pSki015的左邊界序列附近的核苷酸序列作為已知序列，合成基因特異引物GSP3(DL3)，GSP2(DL2)和GSP1(DL1)。DL3的序列為5’-GCTTTCGCCTATAAATACGACGG-3’，DL2的序列為5’-TGGACGTGAATGTAGACACGTCGA-3’，DL1的序列為5’-GACAACATGTCGAGGCTCAGCAGG-3’(圖3)。DL3與序列1的起始結(jié)合位置是序列1的自5′端第172-194位脫氧核苷酸，DL2與序列1的起始結(jié)合位置是序列1的自5′端第113-136位脫氧核苷酸，DL1與序列1的起始結(jié)合位置是序列1的自5′端第1-24位脫氧核苷酸。2、用SiteFinder起始PCR反應(yīng)以步驟一獲得的一株擬南芥突變體的基因組DNA為模板，用SiteFinder起始PCR反應(yīng)。其中，反應(yīng)體系為20μL，包括0.1μg基因組DNA(1μL)，1μL5μmol/L的SiteFinder，1單位的Taq酶，1μL2.5mM的dNTP。反應(yīng)的溫度條件為先92℃(2min)，然后95℃(1min)使模板變性；再25℃(1min)使SiteFinder與模板退火；在3分鐘內(nèi)升溫至68℃，然后在68℃(10min)，使SiteFinder向3′方向單方向延伸。3、用SFP1和SFP2，DL3，DL2和DL1進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)在完成步驟2的起始PCR反應(yīng)的20μL反應(yīng)體系中，加入3.5μL10μmol/L的SFP1，1μL10μmol/L的DL1，0.5μL10×Taq酶緩沖液，進(jìn)行第一輪擴(kuò)增反應(yīng)，溫度條件為先94℃1分鐘；然后95℃10秒，68℃6分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃5分鐘。在第一輪擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取1μL產(chǎn)物稀釋1000倍，再取1μL稀釋產(chǎn)物作模板，再向反應(yīng)體系中加入2μL10μmol/L的SFP2，2μL10μmol/L的DL2，0.5μL10mM的dNTP，1單位的Taq酶，用水補(bǔ)足到50μL，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增反應(yīng)。同時(shí)按上述體系設(shè)平行對(duì)照，所不同的是用DL3替換DL2。溫度條件為先94℃1分鐘；然后95℃10秒，68℃6分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃5分鐘。第二輪擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果如圖4A所示，泳道1和2分別是SFP2/DL2和SFP2/DL3引物對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物，泳道1中得到3條帶，泳道2中得到2條帶，泳道1中較大的兩條帶分別比泳道2中相應(yīng)的兩條帶大，說(shuō)明得到的PCR產(chǎn)物是目標(biāo)分子的特異擴(kuò)增產(chǎn)物。為了確保使用載體引物M13R和DL3篩選陽(yáng)性克隆的時(shí)候，只有目標(biāo)分子的特異擴(kuò)增的產(chǎn)物能被篩選到，而其他來(lái)源的分子都不能被篩選出來(lái)，將DL2/SFP2引物對(duì)的產(chǎn)物進(jìn)行克隆。回收泳道1中最大的條帶(2.2kb)對(duì)應(yīng)的DNA片段，用NotI酶切后，與經(jīng)NotI和EcoRV酶切的載體pBlueScriptSK(+)進(jìn)行連接，按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌、用M13R和DL3進(jìn)行菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示泳道1中最大的條帶對(duì)應(yīng)的DNA片段的長(zhǎng)度為2270bp，該片段中，在距DL3的783bp處有一個(gè)GCCT位點(diǎn)(圖4B)，這與電泳結(jié)果相吻合(圖4A中白色箭頭所指的條帶)。測(cè)序結(jié)果表明得到泳道1中最大的條帶為2.2kb。將所得到的序列與GeneBank中的序列比對(duì)分析T-DNA插入位點(diǎn)。結(jié)果表明在該擬南芥突變體中，外源片段的插入位置是擬南芥基因組的第三號(hào)染色體上。該插入位點(diǎn)的鑒定結(jié)果與按TAIL-PCR鑒定的插入位點(diǎn)相同，但是步查的片斷比通過(guò)TAIL-PCR步查的片斷長(zhǎng)1.6kb。實(shí)施例2、對(duì)7個(gè)擬南芥突變體插入位點(diǎn)序列的特異性擴(kuò)增為了驗(yàn)證SiteFind-PCR的廣泛的適用性，對(duì)實(shí)施例1步驟一中的其它7個(gè)突變體進(jìn)行插入位點(diǎn)的分析。除模板分別為該7個(gè)突變體的基因組DNA不同外，其它的反應(yīng)材料(如SiteFinder，GSP3，GSP2和GSP1，SFP1，SFP2)和反應(yīng)條件均與實(shí)施例1相同。結(jié)果如圖5所示，根據(jù)電泳條帶的差別判斷有7個(gè)樣品得到了特異擴(kuò)增產(chǎn)物，其中樣品4有3條特異擴(kuò)增的產(chǎn)物。圖5中，泳道II和III為每個(gè)突變體樣品的SFP2/DL2和SFP2/DL3引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物；1-7分別表示7個(gè)突變體的樣品。序列表<160><210>1<211>421<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1gacaacatgtcgaggctcagcaggacctgcaggcatgcaagcttatcgatatctagatct60cgagctcgagatctagatatcgatcgtgaagtttctcatctaagcccccatttggacgtg120aatgtagacacgtcgaaataaagatttccgaattagaataatttgtttattgctttcgcc180tataaatacgacggatcgtaatttgtcgttttatcaaaatgtactttcattttataataa240cgctgcggacatctacatttttgaattgaaaaaaaattggtaattactctttcttttcct300ccatattgaccatcatactcattgctgatccatgtagatttcccggacatgaagccattt360acaattgaatatatcctgccgccgctgccgctttgcacccggtggagcttgcatgttggt420t42權(quán)利要求1.一種PCR方法，包括以下步驟1)用SiteFinder起始PCR反應(yīng)；所述SiteFinder包括46種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子，所述各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子的長(zhǎng)度相同，均為50-100nt；所述各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子的3′末端的4至6個(gè)脫氧核苷酸組成的序列均相同，緊密連接于該4至6個(gè)脫氧核苷酸的5′方向的6個(gè)脫氧核苷酸組成的序列均不同，緊密連接于該6個(gè)脫氧核苷酸的5′方向的38-90個(gè)脫氧核苷酸組成的序列均相同；2)進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)；所述巢式PCR反應(yīng)的引物由根據(jù)SiteFinder合成的SPF1和SPF2，和根據(jù)與待擴(kuò)增的目標(biāo)序列相鄰的已知序列合成的基因特異引物GSP1，GSP2和GSP3組成；所述SPF1和SPF2的序列均選自步驟1)的SiteFinder的所述各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子的38-90個(gè)脫氧核苷酸組成的序列；所述SPF1的3′末端序列和SPF2的5′末端序列相同，形成嵌套引物；所述GSP1，GSP2和GSP3中，所述GSP3最接近待擴(kuò)增的目標(biāo)序列，其次是GSP2，離待擴(kuò)增的目標(biāo)序列最遠(yuǎn)的是GSP1；所述GSP3的3′端第一個(gè)脫氧核苷酸與所述已知序列的結(jié)合位置，與所述已知序列的3′端最后一個(gè)脫氧核苷酸間至少相距5nt。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述38-90個(gè)脫氧核苷酸組成的序列中，緊密連接于所述六個(gè)脫氧核苷酸5′方向的脫氧核苷酸組成的序列為一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的5′→3′走向的單鏈序列；所述限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列大于等于八個(gè)核苷酸對(duì)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中還包括利用所述SiteFinder包含的各種單鏈寡聚脫氧核苷酸分子中的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列對(duì)應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶，對(duì)待擴(kuò)增的目標(biāo)序列的PCR產(chǎn)物進(jìn)行選擇的步驟。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述SPF1和SPF2的序列均選自所述38-90個(gè)脫氧核苷酸中，緊密連接于所述限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的5′方向的脫氧核苷酸組成的序列。5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述起始PCR反應(yīng)包括模板變性、SiteFinder中的單鏈寡聚脫氧核苷酸分子與模板退火、單方向延伸；所述SiteFinder中的單鏈寡聚脫氧核苷酸分子與模板退火的溫度條件為16-25℃1分鐘。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所與模板退火的溫度條件為25℃1min；所述起始PCR反應(yīng)的模板變性的溫度條件為先92℃2分鐘，然后95℃1分鐘。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述起始PCR反應(yīng)的單方向延伸的溫度條件為在至少3分鐘內(nèi)升溫至68℃，然后68℃10分鐘。8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述巢式PCR反應(yīng)包括第一輪和第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，所述第一輪擴(kuò)增反應(yīng)是由SPF1和GSP1組成的一對(duì)引物進(jìn)行的反應(yīng)，所述第二輪擴(kuò)增反應(yīng)包括由SPF2和GSP2組成的一對(duì)引物進(jìn)行的反應(yīng)。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述第二輪擴(kuò)增反應(yīng)還包括由SPF2和GSP3組成的一對(duì)引物進(jìn)行的反應(yīng)。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述第一輪擴(kuò)增反應(yīng)和第二輪擴(kuò)增反應(yīng)的溫度條件均為先94℃1分鐘；然后95℃10-15秒，68℃6分鐘，進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)；最后72℃5分鐘。全文摘要本發(fā)明公開了一種具有較高特異性，并且操作簡(jiǎn)單的PCR方法。該P(yáng)CR方法，通過(guò)模板變性、SiteFinder在低溫下與基因組模板退火、單方向延伸，將SiteFinder序列引入基因組序列之中；通過(guò)2輪PCR指數(shù)倍擴(kuò)增目標(biāo)DNA分子，而非目標(biāo)分子因莖環(huán)結(jié)構(gòu)的抑制作用而無(wú)法完成指數(shù)擴(kuò)增，從而達(dá)到選擇性擴(kuò)增目標(biāo)分子的目的；通過(guò)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)選擇性地克隆目標(biāo)分子；最后，通過(guò)已知序列上GSP2下游的GSP3特異性的篩選目標(biāo)分子。本發(fā)明的PCR方法與現(xiàn)有PCR方法相比，具有簡(jiǎn)單快速、特異性高、通用性強(qiáng)、重復(fù)性好、一次擴(kuò)增片段較長(zhǎng)且成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，廣泛適用于分子生物學(xué)研究中多種目的染色體步查，如轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物及微生物中外源基因插入位點(diǎn)的鑒定、基因未知區(qū)段新基因的分離等。文檔編號(hào)C12P19/00GK1891832SQ200510080550公開日2007年1月10日申請(qǐng)日期2005年7月4日優(yōu)先權(quán)日2005年7月4日發(fā)明者安成才,譚桂紅,高音,石苗,張欣躍,何善平,陳章良申請(qǐng)人:北京大學(xué)