專利名稱：高密度脂蛋白膽固醇的定量測(cè)定方法、試劑及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的定量測(cè)定方法、試劑及試劑盒。
背景技術(shù)：
膽固醇等脂質(zhì)在血清中與脫輔蛋白質(zhì)配合生成脂蛋白。根據(jù)其物理性質(zhì)的差異，脂蛋白被分為乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等。1977年Frammingham大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查表明，血漿高密度脂蛋白膽固醇(血漿HDL-C)下降是缺血性心臟病的主要危險(xiǎn)因素，自此以后，HDL-C的測(cè)定日益受到臨床上的普遍重視。高密度脂蛋白(HDL)可以通過酶和受體的作用，將周圍組織的膽固醇移至肝臟降解處理，同時(shí)抑止細(xì)胞結(jié)合和攝取低密度脂蛋白膽固醇，阻止膽固醇在動(dòng)脈壁的沉積。因此，HDL-C被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防因子。也就是因?yàn)檫@一原因，HDL-C的測(cè)定在動(dòng)脈硬化癥發(fā)病方面有重要的預(yù)測(cè)作用。
臨床上，實(shí)驗(yàn)室直接分離、測(cè)定HDL-C含量的常規(guī)方法包括化學(xué)沉淀法、磁珠DS-Mg2+分離法和勻相測(cè)定法。
其中，化學(xué)沉淀法常用的沉淀劑為多聚陰離子，如磷鎢酸(PTA)、硫酸葡聚糖(DS)、肝素，或去污劑如SDS、聚乙二醇與某些二價(jià)陽離子(如鎂、鈣、錳的二價(jià)陽離子)合用。
化學(xué)沉淀法測(cè)定HDL-C含量的具體步驟是，向待測(cè)血清樣品中加入沉淀劑以凝集除HDL外的脂蛋白，離心分離除去凝集物，然后測(cè)量通過該分離所獲得的僅含有HDL的血清膽固醇。由于該方法使用沉淀劑，同時(shí)需進(jìn)行沉淀分離等操作，因此樣本用量大，易產(chǎn)生誤差的環(huán)節(jié)相對(duì)較多，尤其是無法實(shí)現(xiàn)整個(gè)分析步驟的完全自動(dòng)化，因而限制了該項(xiàng)技術(shù)的使用。
磁珠DS-Mg2+分離法省去了化學(xué)沉淀法所必需的離心步驟，但需要使用特殊裝置，而且該方法所使用的試劑不適于推廣應(yīng)用，因此其使用范圍也受到相當(dāng)?shù)南拗啤?br> 勻相測(cè)定法包括選擇性抑制法、PEG修飾酶法、清除法、免疫分離法等。勻相測(cè)定法因其標(biāo)本用量少，不需沉淀處理，可用自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定，以及精確度和準(zhǔn)確度適當(dāng)而被臨床廣為采用。
勻相測(cè)定法中的選擇性抑制法是通過應(yīng)用兩種不同的表面活性劑及多聚陰離子，根據(jù)脂蛋白的酶反應(yīng)選擇性，直接測(cè)定待測(cè)血清樣品中的HDL-C。該方法所使用的試劑通常包括試劑I及試劑II兩種。在進(jìn)行測(cè)定時(shí)，首先加入試劑I。其中，試劑I含有多聚陰離子化合物、二價(jià)金屬鹽和分散型表面活性劑(亦稱反應(yīng)抑制劑)。待測(cè)血清樣品中的CM、VLDL、LDL在多聚陰離子和二價(jià)金屬鹽的存在下發(fā)生凝聚。由于反應(yīng)抑制劑與CM、VLDL、LDL的疏水性基團(tuán)具有高度親和力，故其吸附在凝聚的脂蛋白顆粒表面形成遮蔽圈，抑制該表面游離膽固醇的反應(yīng)，與除HDL外的其他脂蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物。
與此同時(shí)，游離的HDL表面也吸附有少量的反應(yīng)抑制劑，但由于二者的親和力較弱，其結(jié)合是可逆的。隨后加入的試劑II中含有對(duì)于HDL顆粒中親水性基團(tuán)具有高親和力的可溶性表面活性劑(亦稱反應(yīng)促進(jìn)劑)、膽固醇脂酶(ChER)、膽固醇氧化酶(ChoD)及反應(yīng)顯色劑。該促進(jìn)劑對(duì)HDL表面的吸附不僅可以置換出HDL表面吸附的反應(yīng)抑制劑，而且使全部HDL形成可溶性復(fù)合體，從而使HDL-C可直接與酶試劑反應(yīng)，并繼而在顯色劑的作用下發(fā)色。而CM、VLDL、LDL在與反應(yīng)抑制劑反應(yīng)發(fā)生凝聚和結(jié)合后，不再與膽固醇脂酶和膽固醇氧化酶發(fā)生作用，因此對(duì)于經(jīng)過上述處理的待測(cè)血清樣品可以不進(jìn)行分離而直接測(cè)定HDL-C的含量。
中國專利申請(qǐng)1268185A中公開了上述選擇性抑制法直接測(cè)定HDL-C含量的方法和試劑。
但是，目前用于直接測(cè)定HDL-C含量的市售試劑均為進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格偏高。因此，研制適用于上述直接測(cè)定HDL-C含量的選擇性抑制法，以及性能更為優(yōu)良、價(jià)格更為低廉的試劑一直是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員努力的方向。

發(fā)明內(nèi)容
我們?cè)趯?duì)血清脂蛋白中膽固醇的選擇性直接測(cè)定方法進(jìn)行多年研究以及反復(fù)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，一種特殊表面活性劑，苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚作為反應(yīng)促進(jìn)劑，可以充分置換HDL表面吸附的反應(yīng)抑制劑，該反應(yīng)促進(jìn)劑可與HDL結(jié)合形成溶解性和反應(yīng)性良好的可溶性復(fù)合體，保證HDL-C與所述酶試劑的反應(yīng)，進(jìn)而保證HDL-C含量的準(zhǔn)確測(cè)定。
本發(fā)明的目的之一是，提供一種用于直接測(cè)定血清樣品中HDL-C含量的試劑。所述試劑由分別放置的試劑I和試劑II組成，其中，所述試劑I含有多聚陰離子化合物、二價(jià)金屬陽離子鹽和分散型表面活性劑；所述試劑II含有苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一種定量測(cè)定血清樣品中HDL-C含量的試劑盒，其特征在于其中裝有分別放置有前述試劑I及試劑II。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種定量測(cè)定血清樣品中HDL-C含量的方法。
具體實(shí)施例方式
具體而言，本發(fā)明用于直接測(cè)定血清樣品中HDL-C含量的試劑由分別放置的試劑I和試劑II組成。
其中，所述試劑I含有多聚陰離子化合物、二價(jià)金屬陽離子鹽和分散型表面活性劑；所述試劑II含有苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚。
所述試劑I的作用在于抑制待測(cè)血清樣品中的CM、VLDL、LDL與第二反應(yīng)試劑中的膽固醇脂酶和膽固醇氧化酶反應(yīng)。所述試劑I含有多聚陰離子表面活性劑、二價(jià)金屬陽離子鹽和分散型表面活性劑。
所述多聚陰離子表面活性劑的具體實(shí)例可以包括環(huán)糊精硫酸鹽、肝素硫酸鹽、硫酸葡聚糖、磷鎢酸鈉、聚乙烯硫酸鹽。所述多聚陰離子表面活性劑的濃度沒有特別的限制，優(yōu)選的濃度范圍為0.1mmol/L-10mmol/L。
所述二價(jià)陽離子鹽中的陽離子選自Mn2+、Mg2+和/或Ca2+。所述二價(jià)陽離子鹽優(yōu)選的濃度范圍為0.1mmol/L-100mmol/L。
所述分散型表面活性劑選自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯縮合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽和烷基苯磺酸鹽。所述分散型表面活性劑優(yōu)選的濃度范圍為0.1g/L-50g/L。
所述試劑I還可以含有下述物質(zhì)，這些物質(zhì)包括pH緩沖液，如GOOD’S系列的2-嗎啉代乙磺酸(MES)、3-嗎啉代丙磺酸(MPOS)等；去干擾劑，如亞鐵氰化鉀、抗壞血酸氧化酶等；防腐劑，如迭氮鈉等；4-氨基安替吡啉和/或顯色劑。優(yōu)選4-氨基安替吡啉與顯色劑不同時(shí)存于試劑I中。
可用于本發(fā)明的顯色劑包括苯酚、4-氯苯酚、N-乙基-N-(-2羥基-3-磺丙基-)-間甲苯胺鈉(TOOS)、N-(-2羥基-3-磺丙基-)-3、5-二甲氧基苯胺鈉(HDAOS)等苯酚類衍生物顯色劑，優(yōu)選的濃度范圍為0.01g/L-10g/L；本發(fā)明所述試劑II含有反應(yīng)促進(jìn)劑。
所述反應(yīng)促進(jìn)劑為苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚，所述苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚為已知的市售表面活性劑，例如，可以以農(nóng)乳601號(hào)(Pesticide Emulsifier 601#)的商品名(江蘇金陵石化公司化工二廠生產(chǎn))從市場(chǎng)上購得。該表面活性劑的使用濃度可以根據(jù)使用該試劑的分析儀的特性，以及完成HDL-C檢測(cè)的需要而定。通常情況下，其使用濃度范圍為1g/L-20g/L，優(yōu)選的濃度范圍為2g/L-8g/L。
所述試劑II還可以含有下述物質(zhì)，這些物質(zhì)包括pH緩沖液，如GOOD’S系列的2-嗎啉代乙磺酸(MES)、3-嗎啉代丙磺酸(MPOS)等；去干擾劑，如亞鐵氰化鉀、抗壞血酸氧化酶等；防腐劑，如迭氮鈉等；4-氨基安替吡啉和/或顯色劑。優(yōu)選4-氨基安替吡啉與顯色劑不同時(shí)存于試劑II中。
本發(fā)明的試劑I和試劑II中還需含有下述定量酶試劑，這些酶試劑包括膽固醇脂酶、膽固醇氧化酶和過氧化物酶。上述三種酶可以全部包含在試劑I中，也可以全部包含在試劑II中，或分別包含在試劑I或II中。其優(yōu)選的濃度范圍分別為0.1ku/L-100ku/L。
所述4-氨基安替吡啉在試劑I和II中應(yīng)擇一使用。其優(yōu)選的濃度范圍為0.01g/L-1g/L。
本發(fā)明所述定量測(cè)定HDL-C試劑盒中裝有分別放置的上述試劑I和試劑II。
本發(fā)明所述直接測(cè)定血清樣品中HDL-C含量的方法包括首先向待測(cè)血清樣品中加入試劑I，恒溫定時(shí)孵育，測(cè)定一定波長下的吸光度A1。然后向樣品中加入試劑II，繼續(xù)孵育，在上述波長下測(cè)定吸光度A2。用同樣的方法測(cè)定校準(zhǔn)液的吸光度值A(chǔ)1’值與A2’值。血清樣品中的HDL-C含量可通過下式計(jì)算得到HDL-C含量＝(A1-A2)÷(A1’-A2’)×(校準(zhǔn)液HDL-C濃度)(mmol/L或mg/dL)本發(fā)明所述校準(zhǔn)液是與試劑盒或試劑配套使用的、以血請(qǐng)為基質(zhì)的次級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(也可稱為定標(biāo)物或校正物Calibrator)，校準(zhǔn)液的濃度與吸光度(OD)的關(guān)系可用于待測(cè)樣品濃度的計(jì)算。
本發(fā)明的方法只需幾微升血清，無需離心或電泳等分離處理，操作簡便，可滿足全自動(dòng)分析的要求。
下面實(shí)施例是對(duì)本專利申請(qǐng)的具體描述，但是，本專利申請(qǐng)不限于這些實(shí)施例，這些實(shí)施例也不能解釋為對(duì)本專利申請(qǐng)的限制。
實(shí)施例1一、按照下述成分和比例配制下述本發(fā)明試劑I及試劑II試劑IMOPS緩沖液，pH7.0 30mM硫酸葡聚糖鈉 1g/LMgCl2·6H2O 2mM顯色劑TOOS 0.2g/LNaN31g/L環(huán)糊精硫酸鹽 0.5g/L試劑IIMOPS緩沖液，pH7.0 30mM4-氨基安替吡啉 0.1g/L膽固醇酯酶(CEH)1520u/L膽固醇氧化酶(COD) 1070u/L過氧化物酶(POD)8000u/L農(nóng)乳劑601號(hào)5g/LNaN31g/L
二、在樣品管中將300μl試劑I和3μl血清樣品混合，在37℃下孵育5分鐘，使用HITACHI7060全自動(dòng)生化分析儀，在主波長600nm，副波長700nm處測(cè)定吸光度A1，然后向樣品中加入100μl試劑II，混勻，在37℃下孵育5分鐘后，測(cè)定同一波長下的吸光度A2。用同樣的方法和條件測(cè)定校準(zhǔn)液的吸光度值A(chǔ)1’值與A2’值，然后按下述公式計(jì)算樣品的HDL-C含量HDL-C含量＝(A1-A2)÷(A1’-A2’)×(校準(zhǔn)液HDL-C濃度)(mmol/L或mg/dL)對(duì)低、中、高HDL-C含量的血清樣品進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)測(cè)定20次，按照下述公式計(jì)算測(cè)定值的平均值(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)x＝∑x/ns=Σ(x-x‾)2/(n-1)]]>然后按下述公式計(jì)算變異系數(shù)CV*CV％＝s/x×100％其中，所述校準(zhǔn)液為市售“直接高密度脂蛋白膽固醇校準(zhǔn)液”(批號(hào)中生230401，中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn))結(jié)果列于下表1。
表1

*變異系數(shù)(CV)通常用于衡量一項(xiàng)方法的精密度，變異系數(shù)越小，說明該方法越精密。CV小于5％的方法的精密度被認(rèn)為是可以接受的。
表1中所有的CV均小于1％，表明本發(fā)明方法具有優(yōu)良的精密度。
實(shí)施例2使用本發(fā)明實(shí)施例1試劑，按照實(shí)施例1所述方法和條件對(duì)11份健康人血清樣品中的HDL-C含量進(jìn)行測(cè)定。對(duì)同一樣品同時(shí)使用市售沉淀法試劑盒(高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)磷鎢酸-鎂沉淀法試劑盒，批號(hào)中生19051，中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn))進(jìn)行對(duì)照性定量測(cè)定，結(jié)果如下表2所示表2

通過與沉淀法(對(duì)照方法)的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)來衡量本方法的準(zhǔn)確性。相關(guān)系數(shù)r表示兩組數(shù)值的相關(guān)程度，r越接近1表明兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性越好。通常認(rèn)為r大于0.9時(shí)的相關(guān)性為良好。本方法與市售試劑盒沉淀法對(duì)于HDL-C含量的測(cè)定值的相關(guān)系數(shù)r＝0.9878，表明本方法的準(zhǔn)確性優(yōu)良。
所述相關(guān)系數(shù)的計(jì)算方法如下
γ=Σ(X-X‾)(Y-Y‾)Σ(X-X‾)2·Σ(Y-Y‾)2]]>其中，X為使用本發(fā)明方法測(cè)得的HDL-C含量濃度值；X為上述測(cè)得的X值的平均數(shù)；Y為使用沉淀法測(cè)得的HDL-C含量濃度值；Y為上述測(cè)得的Y值的平均數(shù)。
根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果我們可以得出這樣的結(jié)論本發(fā)明試劑在穩(wěn)定性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性、線性等方面，均滿足臨床HDL-C含量分析要求，適用于直接測(cè)定新鮮血清或血漿中的HDL-C含量。
權(quán)利要求
1.一種定量測(cè)定血清樣品中高密度脂蛋白膽固醇含量的試劑，該試劑由分別放置的試劑I和試劑II組成，其中，所述試劑I含有多聚陰離子化合物、二價(jià)金屬陽離子鹽和分散型表面活性劑；所述試劑II含有苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述多聚陰離子化合物選自環(huán)糊精硫酸鹽、肝素硫酸鹽、硫酸葡聚糖、磷鎢酸鈉、聚乙烯硫酸鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述二價(jià)陽離子鹽的陽離子選自Mn2+、Mg2+和/或Ca2+。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述分散型表面活性劑選自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯縮合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽和烷基苯磺酸鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4之一所述的試劑，其特征在于，所述多聚陰離子化合物的濃度范圍為0.1mmol/L-10mmol/L；二價(jià)陽離子鹽的濃度范圍為0.1mmol/L-100mmol/L；分散型表面活性劑的濃度范圍為0.1g/L-50g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚的濃度范圍為1g/L-20g/L，優(yōu)選2g/L-8g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述試劑I和試劑II還可以含有pH緩沖液、去干擾劑、防腐劑、4-氨基安替吡啉和/或顯色劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑，其特征在于，所述pH緩沖液選自2-嗎啉代乙磺酸、3-嗎啉代丙磺酸；去干擾劑選自亞鐵氰化鉀、抗壞血酸氧化酶；防腐劑選自迭氮鈉；顯色劑選自苯酚、4-氯苯酚、N-乙基-N-(-2羥基-3-磺丙基-)-間甲苯胺鈉、N-(-2羥基-3-磺丙基-)-3、5-二甲氧基苯胺鈉；且4-氨基安替吡啉與顯色劑不同時(shí)存于試劑I或試劑II中。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑，其特征在于，所述4-氨基安替吡啉的濃度范圍為0.01g/L-1g/L；顯色劑的濃度范圍為0.01g/L-10g/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述試劑I和試劑II中還含有選自膽固醇脂酶、膽固醇氧化酶和過氧化物酶的定量酶試劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑，其特征在于，所述三種酶可以全部包含在所述試劑I中，也可以全部包含在所述試劑II中，或分別包含在所述試劑I或所述試劑II中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑，其特征在于，所述三種酶各自的濃度范圍分別為0.1ku/L-100ku/L。
13.一種定量測(cè)定血清樣品中高密度脂蛋白膽固醇含量的試劑盒，其特征在于其中裝有分別放置的權(quán)利要求1-12所述的試劑I及試劑II。
14.一種定量測(cè)定血清樣品中高密度脂蛋白膽固醇含量的方法，該方法包括首先向血清樣品中加入所述試劑I，恒溫定時(shí)孵育，測(cè)定一定波長下的吸光度A1；然后向樣品中加入所述試劑II，繼續(xù)孵育后，在上述波長下測(cè)定吸光度A2；用同樣的方法測(cè)定校準(zhǔn)液的吸光度值A(chǔ)1’值與A2’值；然后通過下式計(jì)算得到血清樣品的HDL-C含量HDL-C含量＝(A1-A2)÷(A1’-A2’)×(校準(zhǔn)液HDL-C濃度)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種定量測(cè)定血清樣品中高密度脂蛋白膽固醇含量的試劑，該試劑由分別放置的試劑I和試劑II組成，其中，所述試劑I含有多聚陰離子化合物、二價(jià)陽離子鹽及分散型表面活性劑；所述試劑II含有苯乙烯基苯酚聚氧乙烯(16)醚。此外，本發(fā)明還提供了一種裝有本發(fā)明試劑I和試劑II的試劑盒，以及一種測(cè)定高密度脂蛋白膽固醇含量的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1888863SQ20051008010
公開日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2005年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月29日
發(fā)明者張瑛, 王淑娟 申請(qǐng)人:中生北控生物科技股份有限公司