專利名稱：海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的準(zhǔn)確定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物的定量方法，尤其是涉及一種采用基于時間序列觀察、自動成像和數(shù)字化分析的落式熒光顯微鏡法對海洋環(huán)境中獨特的含細(xì)菌葉綠素(Bchl.a)的微生物群的準(zhǔn)確定量方法。
背景技術(shù)：
含細(xì)菌葉綠素(Bchl.a)的微生物是海洋中一個特殊的功能類群，有著重要的生態(tài)學(xué)意義和資源環(huán)境意義(Kolber et al.，2000，2001)。至今，用于海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的計數(shù)方法主要有以下幾種紅外快速脈沖速率(IRFRR)誘導(dǎo)熒光瞬時動力學(xué)技術(shù)(Kolber etal.，2000)、紅外落式熒光顯微鏡技術(shù)(IREM)(Kolber et al.，2001)、高效液相色譜法(HPLC)(Goericke，2002)、雙重調(diào)節(jié)技術(shù)(dual modulation techniques)(Koblizek et al.，2005)和定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QPCR)(Schwalbach and Fuhrman，2005)等。IRFRR是一獨特的能監(jiān)測細(xì)菌光合作用過程中電子傳遞的技術(shù)(Kolber et al.，2000)，但尚無儀器上市，這項技術(shù)只能在個別專業(yè)實驗室可提供。HPLC能直接測定細(xì)菌葉綠素a和葉綠素a的含量及比值(BChl.a/Chl.a)，且能根據(jù)光合色素比例，比較海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物和浮游植物對能量循環(huán)的貢獻(xiàn)，但不適于生物量的估計。QPCR法是基于光合基因的定量方法，而并非對BChl.a的直接檢測，這個方法是有前景的，有助于海洋中所有含同樣基因序列的微生物的研究。但該法受限于已知的含細(xì)菌葉綠素的微生物，即沒有足夠的已知序列用于設(shè)計能覆蓋全部海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的引物。所有上述方法都不能提供海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的直接豐度，即微生物功能群的直接測量，且不同的方法所得的結(jié)果(如BChl.a/Chl.a)差異很大。
上述各種方法中，IREM是檢測海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物豐度的最簡便的方法，該方法以BChl.a所發(fā)的紅外熒光為檢測信號(Kolber et al.，2001；Schwalbach and Fuhrman，2005)。但是，我們發(fā)現(xiàn)自然海水樣品中豐富的藍(lán)細(xì)菌(海洋環(huán)境中常見的屬為原綠球藻和聚球藻)導(dǎo)致了IREM法的顯著陽性誤差(Zhang and Jiao 2004；Schwalbach and Fuhrman，2005)。因為在含細(xì)菌葉綠素的微生物檢測的顯微設(shè)置下能同時檢測到藍(lán)細(xì)菌發(fā)出的紅外熒光，且在自然海水樣中藍(lán)細(xì)菌豐度與海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物在同一個數(shù)量級上，因此這種陽性誤差是相當(dāng)可觀的。Zhang和Jiao(2004)報道在東海的淺水域中由聚球藻所引進(jìn)的正誤差可高達(dá)30％。而由另一組藍(lán)細(xì)菌——原綠球藻所引進(jìn)的誤差尚未計算入內(nèi)。因為原綠球藻所發(fā)出的熒光信號被海水樣中共存的具強熒光的較大細(xì)胞，如聚球藻(Synechococcus)所掩蓋，從而在最初的藍(lán)細(xì)菌視野下無法被觀察到。在經(jīng)典的落式熒光顯微鏡(EM)或IREM法中，快速觀察對防止熒光的焠滅是必要的，所以我們一般采用最初的藍(lán)細(xì)菌圖像進(jìn)行誤差校正，故原綠球藻的存在對海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物計數(shù)造成的嚴(yán)重誤差(Zhang andJiao 2004；Schwalbach and Fuhrman，2005)無法用普通的IREM法校正。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對紅外落式熒光顯微鏡(IREM)法不能解決的聚球藻和原綠球藻共存所引起的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物計數(shù)的誤差，提供一種新的能對海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物進(jìn)行準(zhǔn)確定量的方法，即“基于時間序列觀察的扣除藍(lán)細(xì)菌誤差的紅外落式熒光顯微鏡法”，該法能準(zhǔn)確計算出聚球藻和原綠球藻的總數(shù)，從而可對海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下1).將所采樣品預(yù)過濾、固定、雙鏈DNA熒光染料(4’6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色、過濾并制片；2).用配有紅敏的電子耦合組件(CCD)照相機(SPOT Diagnostic Instruments，Inc.)和汞燈(Carl Zeiss Light MicroscopyAXIOSKOP 4)的落式熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，以3組不同的熒光激發(fā)塊分別對同一視野的紅外(IR)、藍(lán)細(xì)菌(Cyano)和DAPI圖像進(jìn)行觀察和拍照；顯微聚焦后，進(jìn)行IR、Cyano和DAPI圖像時間序列上的獲取圖像；3).對圖像中的細(xì)胞進(jìn)行識別和分析，并獲得新的二元數(shù)字化圖像；4).計算；假設(shè)一個視野下，分別獲得IR圖像a、平臺期的Cyano圖像b(時間序列觀察中獲得的藍(lán)細(xì)菌數(shù)目最大的圖像，包括聚球藻和原綠球藻)和DAPI圖像c，并分別獲得相應(yīng)的二元數(shù)字化圖像d、e和f，那么海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的豐度＝Boolean AND[(d)，(f)]-Boolean AND[(d)，(e)](其中“Boolean AND”指“邏輯運算與”)。
在步驟1)中，所說的樣品預(yù)過濾的方法是將樣品用孔徑為20μm的篩絹預(yù)過濾，以除去大的有機生物體和無機物顆粒；所說的固定方法是將預(yù)過濾后的樣品用終濃度為2％的多聚甲醛在暗中固定15分鐘；所說的雙鏈DNA熒光染料的染色方法是用終濃度為5μg/ml的雙鏈DNA熒光染料在室溫下暗中染色30分鐘；所說的過濾并制片方法是將染色后的樣品用真空泵和濾器以小于0.03MPa的壓力抽濾到25mm直徑、0.2μm孔徑的黑色聚碳酸酯膜上，然后剪取1/4膜樣(過濾有樣品的聚碳酸酯膜)，在載玻片和蓋玻片上各滴一滴鏡油，將1/4膜樣(細(xì)胞面朝上)放在載玻片上，后蓋上蓋玻片壓平。
在步驟2)中，用配有紅敏的電子耦合組件照相機和50W汞燈的落式熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，以3組不同的熒光激發(fā)塊分別對同一視野的紅外、藍(lán)細(xì)菌和雙鏈DNA熒光染料圖像進(jìn)行觀察和拍照，所有的圖像均通過自動曝光獲得；顯微聚焦后，進(jìn)行紅外、藍(lán)細(xì)菌和雙鏈DNA熒光染料圖像時間序列上的獲取，每隔60秒獲取一張圖像，持續(xù)10-15分鐘。
在步驟3)中，對圖像中的細(xì)胞可用Image-Pro Plus(IPP)軟件(Media Cybernetics，Inc.)進(jìn)行識別和分析，并獲得新的二元數(shù)字化圖像。
與已有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于技術(shù)的普及性(落式熒光顯微鏡在一般實驗室均有提供)；容易操作且花費小；能夠在單細(xì)胞水平上將海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物、藍(lán)細(xì)菌與樣品中其它細(xì)菌區(qū)別開來，從而可對海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)。
具體實施例方式
1.將所采樣品先以20μm的篩絹預(yù)過濾以除去大的有機生物體和無機物顆粒，后用終濃度為2％的多聚甲醛(PFA)固定15分鐘，再以終濃度為5μg/ml的DAPI染色30分鐘，之后細(xì)胞被過濾到0.2μm孔徑的黑色聚碳酸酯(PC)膜(Whatman)上，剪取1/4膜樣，細(xì)胞面朝上制片。
2.用EM對制片進(jìn)行觀察，所用的熒光激發(fā)塊如下所示。含紅外熒光的細(xì)胞所用的熒光激發(fā)塊(Chroma Technology Corp)是350-550nm激發(fā)，LP 850nm發(fā)射，650nm分光(Kolberet al.，2001；Zhang and Jiao，2004)(IR-settings)。染DAPI的細(xì)胞用于對照，其所用的熒光激發(fā)塊是330-390nm激發(fā)，440-490nm發(fā)射，400-430nm分光(Zeiss Filter set 02)(Kolber er al.，2001；Zhang and Jiao，2004)(DAPI-settings)。藍(lán)細(xì)菌(主要包括聚球藻和原綠球藻)細(xì)胞所用的熒光激發(fā)塊是BP 546±12nm激發(fā)，LP 590nm發(fā)射(Li and Wood，1988；Sherry and Wood，2001)，F(xiàn)T 580nm分光(Zeiss Filter set 15)(Cyano-settings)。每個顯微鏡視野用×100的油鏡觀察，對同一個視野同時獲得紅外圖像、藍(lán)細(xì)菌圖像和DAPI圖像。所有的圖像均通過自動曝光獲得，其“gain limit”(增益限制，自動成像軟件中的一個設(shè)置參數(shù))是8。時間序列的IR、Cyano和DAPI圖像在初始約30秒的聚焦步驟后，連續(xù)被捕獲10-15分鐘，時間間隔是60秒。
3.對圖像中的細(xì)胞用Image-Pro Plus(IPP)軟件(Media Cybernetics，Inc.)進(jìn)行識別和分析。首先通過測定平均背景灰度值并以此重新生成灰度圖像，使原始圖像標(biāo)準(zhǔn)化。圖像中的細(xì)胞邊界以IPP的“Variance filter”(差異過濾，IPP軟件中的一個設(shè)置參數(shù))來測定并強化，“Variance filter”會以灰度值計算的標(biāo)準(zhǔn)偏差來替換周圍3×3相鄰像素點灰度值。生成的圖像以“3×3 neighborhood median filter”(3×3相鄰中值過濾，IPP軟件中的一個設(shè)置參數(shù))進(jìn)行弱化。最后軟件以一固定設(shè)置的灰度值自動識別細(xì)胞，從而獲得二元圖像。將CCD圖像中的點進(jìn)行二元數(shù)字化以產(chǎn)生一個新的圖像，可以獲得更可信的數(shù)據(jù)。在這個二元圖像中背景灰度值為“0”，而每個被識別的點不管大小都為“1”。最后，不同圖像之間的細(xì)胞定位可以通過邏輯運算“與”來進(jìn)行。
4.計算假設(shè)一個視野下，分別獲得IR圖像a、平臺期的藍(lán)細(xì)菌圖像b(時間序列觀察中獲得的藍(lán)細(xì)菌數(shù)目最大的圖像，包括聚球藻和原綠球藻)和DAPI圖像c，并分別獲得相應(yīng)的二元數(shù)字化分析結(jié)果圖像d、e和f，那么海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的豐度＝Boolean AND[(d)，(f)]-Boolean AND[(d)，(e)]。
權(quán)利要求
1.海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的準(zhǔn)確定量方法，其特征在于其步驟為1).將所采樣品預(yù)過濾、固定、雙鏈DNA熒光染料染色、過濾并制片；2).用配有紅敏的電子耦合組件照相機和汞燈的落式熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，以3組不同的熒光激發(fā)塊分別對同一視野的紅外、藍(lán)細(xì)菌和雙鏈DNA熒光染料圖像進(jìn)行觀察和拍照；顯微聚焦后，進(jìn)行紅外、藍(lán)細(xì)菌和雙鏈DNA熒光染料圖像時間序列上的獲取圖像；3).對圖像中的細(xì)胞進(jìn)行識別和分析，并獲得新的二元數(shù)字化圖像；4).計算假設(shè)一個視野下，分別獲得紅外圖像a、平臺期的藍(lán)細(xì)菌圖像b和雙鏈DNA熒光染料圖像c，并分別獲得相應(yīng)的二元數(shù)字化圖像d、e和f，那么海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的豐度＝Boolean AND[(d)，(f)]-Boolean AND[(d)，(e)]，其中“Boolean AND”指“邏輯運算與”。
2.如權(quán)利要求1所述的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的準(zhǔn)確定量方法，其特征在于在步驟1)中，所說的樣品預(yù)過濾的方法是將樣品用孔徑為20μm的篩絹預(yù)過濾，以除去大的有機生物體和無機物顆粒。
3.如權(quán)利要求1所述的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的準(zhǔn)確定量方法，其特征在于所說的固定方法是將預(yù)過濾后的樣品用終濃度為2％的多聚甲醛在暗中固定15分鐘。
4.如權(quán)利要求1所述的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的準(zhǔn)確定量方法，其特征在于所說的雙鏈DNA熒光染料的染色方法是用終濃度為5μg/ml的雙鏈DNA熒光染料在室溫下暗中染色30分鐘。
5.如權(quán)利要求1所述的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的準(zhǔn)確定量方法，其特征在于所說的過濾并制片方法是將染色后的樣品用真空泵和濾器以小于0.03MPa的壓力抽濾到25mm直徑、0.2μm孔徑的黑色聚碳酸酯膜上，然后剪取1/4膜樣，在載玻片和蓋玻片上各滴一滴鏡油，將1/4膜樣放在載玻片上，后蓋上蓋玻片壓平。
6.如權(quán)利要求5所述的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的準(zhǔn)確定量方法，其特征在于所說的膜樣為過濾有樣品的聚碳酸酯膜，將1/4膜樣細(xì)胞面朝上并放在載玻片上，后蓋上蓋玻片壓平。
7.如權(quán)利要求1所述的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的準(zhǔn)確定量方法，其特征在于在步驟2)中，用配有紅敏的電子耦合組件照相機和50W汞燈的落式熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，以3組不同的熒光激發(fā)塊分別對同一視野的紅外、藍(lán)細(xì)菌和雙鏈DNA熒光染料圖像進(jìn)行觀察和拍照，所有的圖像均通過自動曝光獲得。
8.如權(quán)利要求1所述的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的準(zhǔn)確定量方法，其特征在于在步驟2)中，顯微聚焦后，進(jìn)行紅外、藍(lán)細(xì)菌和雙鏈DNA熒光染料圖像時間序列上的獲取，每隔60秒獲取一張圖像，持續(xù)10-15分鐘。
9.如權(quán)利要求1所述的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的準(zhǔn)確定量方法，其特征在于在步驟3)中，對圖像中的細(xì)胞用Image-Pro Plus(IPP)軟件(Media Cybernetics，Inc.)進(jìn)行識別和分析，并獲得新的二元數(shù)字化圖像。
全文摘要
海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的準(zhǔn)確定量方法，涉及一種微生物的定量方法，提供一種新的能對海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物進(jìn)行準(zhǔn)確定量的方法，其步驟為樣品預(yù)過濾、固定、雙鏈DNA熒光染料染色、過濾并制片；用配有紅敏的電子耦合組件照相機和汞燈的落式熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，以3組不同的熒光激發(fā)塊分別對同一視野的紅外、藍(lán)細(xì)菌和雙鏈DNA熒光染料圖像進(jìn)行觀察和拍照；顯微聚焦后，進(jìn)行紅外、藍(lán)細(xì)菌和雙鏈DNA熒光染料圖像時間序列上的獲取圖像；對圖像中的細(xì)胞進(jìn)行識別和分析，并獲得新的二元數(shù)字化圖像；計算由紅外圖像、藍(lán)細(xì)菌圖像、染料圖像、二元數(shù)字化圖像，得海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的豐度。
文檔編號C12Q1/04GK1710096SQ200510078730
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
發(fā)明者焦念志, 張瑤, 陳瑤 申請人:廈門大學(xué)