專(zhuān)利名稱(chēng)：微生物發(fā)酵直接生物合成細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，具體涉及微生物發(fā)酵直接 生物合成細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，特別涉及以木葡糖酸醋桿菌(^"co朋c"o/^"er 《^j'/7i/歷)CGMCC No. 1. 1812、具有氧滲透功能的材料為模具和培養(yǎng)基為原料通過(guò)菌種培養(yǎng)、 發(fā)酵、洗滌和干燥制備細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose)是某些細(xì)菌合成的高分子化合物，具有超精細(xì)網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)，雖然細(xì)菌纖維素和植物或海藻產(chǎn)生的纖維素具有相同的分子結(jié)構(gòu)單元，但細(xì)菌纖維素 卻具有很多獨(dú)特的性質(zhì)如高結(jié)晶度、高化學(xué)純度、高抗張強(qiáng)度、高彈性模量、高持水性、良
好的生物相容性、生物合成的可調(diào)控性等，這些性質(zhì)是其它來(lái)源的纖維無(wú)法比擬的。因此， 在食品、造紙、醫(yī)學(xué)材料、化妝品、化工、廢水處理、林業(yè)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，成為近年 來(lái)國(guó)際上生物醫(yī)學(xué)材料的研究熱點(diǎn)。
目前，生物合成的細(xì)菌纖維素產(chǎn)品形狀及性能較單一。為提高細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)效益， 我們申請(qǐng)了 "葡萄糖氧化桿菌發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法"專(zhuān)利，2004年2月4日獲得國(guó)家 授權(quán)，專(zhuān)利號(hào)ZL 99 1 09800.5。 2006年10月25日國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局公布了 "一種人造皮 膚用細(xì)菌纖維素濕膜的制備方法"，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00610026708. X。 2007年5月28日國(guó)家 知識(shí)產(chǎn)權(quán)局公布了 "一種相互粘連多層細(xì)菌纖維素膜的制備方法"，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?200610118317.0。由于膜狀或片狀的細(xì)菌纖維素拉伸性能較好，其應(yīng)用較廣，而其它形狀產(chǎn) 品拉伸性能較差(如細(xì)菌纖維素管的拉伸強(qiáng)度一般小于lMPa)，而且其生產(chǎn)工藝較復(fù)雜，有 些需要額外供純氧造價(jià)較高應(yīng)用受到限制。2007年10月17日國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局公布了 "一 種利用細(xì)菌纖維素制備人工硬腦膜的方法"的專(zhuān)利，專(zhuān)利號(hào)200710015537.5。以上制備細(xì)菌 纖維素材料時(shí)都需要將發(fā)酵獲得的細(xì)菌纖維素膜粉碎后，再次加工成一定的形狀的細(xì)菌纖維 素產(chǎn)品。這樣不僅工藝復(fù)雜，而且產(chǎn)品成本提高。2008年7月18日，我們申請(qǐng)了 "具有抑 菌性能的細(xì)菌纖維素管的制備方法":的專(zhuān)利，專(zhuān)利號(hào)200810053871.4，就是通過(guò)發(fā)酵技術(shù) 直接合成細(xì)菌纖維素管后，將細(xì)菌纖維素管與e-聚賴(lài)氨酸復(fù)合，制備出具有良好拉伸性能和 抑菌功能的細(xì)菌纖維素管，工藝簡(jiǎn)單，造價(jià)較低。在此基礎(chǔ)上，我們提供一種微生物發(fā)酵直 接生物合成任意形狀的細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，不僅簡(jiǎn)化了工藝、降低了生產(chǎn)成本， 并且可通過(guò)工藝條件的改變，控制其拉伸性能、形狀和厚度。該方法有助于豐富細(xì)菌纖維素 產(chǎn)品的品種，具有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
要解決的問(wèn)題
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種利用微生物發(fā)酵技術(shù)直接合成、拉伸性能、形
3狀和厚度等產(chǎn)品性能指標(biāo)可控的細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，為拓展細(xì)菌纖維素的應(yīng)用 領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。 技術(shù)方案
微生物發(fā)酵直接生物合成細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法是以木葡糖酸醋桿菌
(67i/co朋ce^^a"er《Wi/7娜)CGMCC No. 1. 1812、具有氧滲透功能的材料為模具和培養(yǎng)基 為原料通過(guò)菌種培養(yǎng)、發(fā)酵、洗滌和干燥制備細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的方法。具體步驟是
① 菌種培養(yǎng)將一環(huán)或兩環(huán)活化的木葡糖酸醋桿菌CGMCC No. 1. 1812斜面種子，接入HS 種子培養(yǎng)基中，3(TC條件下160r/min振蕩培養(yǎng)24h;
② 發(fā)酵如圖1所示，以具有氧滲透能力的材料作為封閉異型發(fā)酵模具(3)(同時(shí)作為 發(fā)酵容器，類(lèi)似注塑模具，留有培養(yǎng)基注入口)，即以5-20。/。(v/v)的接種量接入裝有HS發(fā)酵 培養(yǎng)基(4)的異型發(fā)酵模具(3)中，異型發(fā)酵模具(3)直接熱封口 (1)或用膠塞及其它 封口物密封后，經(jīng)3(TC靜置培養(yǎng)5-10d，細(xì)菌纖維素即附著在模具(3)的內(nèi)表面合成，經(jīng)分 離，得到細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品；或如圖2所示，將具有氧滲透能力的模具(2)置于發(fā)酵容器
(5)中，該發(fā)酵容器(5)選自三角瓶、燒杯、廣口瓶或發(fā)酵罐，發(fā)酵容器(5)中裝有HS 發(fā)酵培養(yǎng)基(3)，具有滲氧功能的模具(2)與空氣(1)相通，經(jīng)3(TC靜置培養(yǎng)5-10d，細(xì) 菌纖維素即附著在模具外表面合成，經(jīng)分離，從模具(2)外即可剝離細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品；
③ 洗滌和干燥將上述發(fā)酵制備的細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品，以流動(dòng)水浸泡洗滌處理l-2d 后，再經(jīng)O. lmol/L的Na0H溶液浸泡l-2d除去培養(yǎng)基及殘存菌體，洗滌至中性，冷凍干燥或 熱風(fēng)干燥，即可得細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品。
需要說(shuō)明的是
具有滲氧能力的管材，選自PVC材料或硅膠材料；異型發(fā)酵容器的形狀為正方形、圓形、
手形、V形等各種規(guī)則或不規(guī)則形狀；異型產(chǎn)品的形狀、大小和厚度可控；異型產(chǎn)品形狀可
為中空。
所述的HS培養(yǎng)基成分為1L水中含葡萄糖25g，酵母膏5g，蛋白胨5g， Na2HP04 2 . 7g， 檸檬酸1. 15g， pH 6. 0。
有益效果
本發(fā)明提供的微生物發(fā)酵直接生物合成細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，屬于生物領(lǐng)域， 涉及微生物發(fā)酵直接生物合成細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，特別涉及以木葡糖酸醋桿菌
(W〃co/7aceto&3"enj^ifl譜)CGMCC No. 1. 1812、具有氧滲透功能的材料為模具和培養(yǎng)基 為原料通過(guò)菌種培養(yǎng)、發(fā)酵、洗滌和干燥制備細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的方法。本發(fā)明的方法不 需要額外供給氧氣，工藝簡(jiǎn)單，造價(jià)較低。該方法制備的細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品其形狀和厚度 具有可控性，同時(shí)具有良好的拉伸性能和生物相容性，可作為食品包裝材料以及組織工程支 架材料，如肉制品腸衣、糖果或糕點(diǎn)的可食用包裝、人體不同部位皮膚敷料、腦膜、角膜、 耳膜、氣管、血管替代物等，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明使用的發(fā)酵裝置。 圖2是本發(fā)明使用的發(fā)酵裝置。 圖3為實(shí)施例1結(jié)果照片。 圖4為實(shí)施例3結(jié)果照片。
在圖l中l(wèi)為封口， 2為空氣，3為模具，4為培養(yǎng)基。在該發(fā)酵裝置中，模具3同時(shí)還 兼做發(fā)酵容器，即將培養(yǎng)基放入模具3中。
在圖2中1為空氣，2為模具(模具中空，與空氣相通)，3為培養(yǎng)基，4為封口塞，5 為發(fā)酵容器。在該發(fā)酵裝置中，將模具2放入裝滿培養(yǎng)基的發(fā)酵容器5中。
圖3為除去培養(yǎng)基和菌體后洗滌至中性的手形細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品。
圖4為冷凍干燥后的圓環(huán)形細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)闡述。
實(shí)施例1:
木葡糖酸醋桿菌CGMCC No. 1.1812，(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)斜面種子 接入裝有種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，3(TC下160r/min振蕩培養(yǎng)24h后，木葡糖酸醋桿菌種子以 5-20%(v/v)的接種量接入裝有500mLHS發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻后倒入手形發(fā)酵容器中， 熱封口后在3(TC下靜置培養(yǎng)10d，發(fā)酵結(jié)束后，細(xì)菌纖維素即附著在容器內(nèi)壁表面合成。從 內(nèi)壁表面剝離后，即可得到細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品。然后流動(dòng)水浸泡洗滌l-2d后再用 0. lmol/LNaOH溶液浸泡1-2d除去培養(yǎng)基和菌體，洗滌至中性(pH值約7.2)，如圖3所示， 然后冷凍干燥即得細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品。
不同尺寸的控制
選擇不同大小尺寸的異型發(fā)酵容器即可得到不同大小的細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品。 在其它培養(yǎng)條件不變的情況下，培養(yǎng)時(shí)間與產(chǎn)品厚度呈正比關(guān)系，分別培養(yǎng)至6天、7 天、8天、9天和10天時(shí)從容器內(nèi)壁表面剝離細(xì)菌纖維素產(chǎn)品后，測(cè)得的厚度為1. 6mm、 2. lmm、 2.6mm、 3.0鵬、3.2 mm，流動(dòng)水浸泡洗滌l_2d后再用0. lmol/LNa0H溶液浸泡1-2d，洗滌 至中性，冷凍干燥后測(cè)得的細(xì)菌纖維素產(chǎn)品的厚度分別為11.26nm、 13.45um、 14.81yra、 15. 17踐、15. 69um。
實(shí)施例2:
菌種及種子培養(yǎng)詞實(shí)施例l，木葡糖酸醋桿菌種子以5-20%(v/v)的接種量接入裝有300mL HS發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻后倒入W形發(fā)酵容器中，封口后在3(TC下靜置培養(yǎng)10d，發(fā) 酵結(jié)束后，細(xì)菌纖維素即附著在容器內(nèi)壁表面合成。從內(nèi)壁表面剝離后，將細(xì)菌纖維素異型 產(chǎn)品置于流動(dòng)水浸泡洗滌1-2d后，再用0. lmol/LNa0H溶液浸泡l-2d除去培養(yǎng)基和菌體，洗 滌至中性(pH值約7.2)后冷凍干燥。實(shí)施例3:
菌種及種子培養(yǎng)同實(shí)施例l，木葡糖酸醋桿菌種子以5-20%(v/v)的接種量接入裝有300mL HS發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻后倒入圓環(huán)形發(fā)酵容器中，封口后在3(TC下靜置培養(yǎng)10d， 發(fā)酵結(jié)束后，細(xì)菌纖維素即附著在容器內(nèi)壁表面合成。從內(nèi)壁表面剝離后，將細(xì)菌纖維素異 型產(chǎn)品置于流動(dòng)水浸泡洗滌1-2d后，再用0. lmol/LNaOH溶液浸泡l_2d除去培養(yǎng)基和菌體， 洗滌至中性(pH值約7.2)，然后冷凍干燥，結(jié)果如圖4所示。
實(shí)施例4:
菌種及種子培養(yǎng)同賣(mài)施:例l，木葡糖酸醋桿菌種子以5-20%(v/v)的接種量接入裝有300mL HS發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻后倒入V形發(fā)酵容器中，封口后在30。C下靜置培養(yǎng)10d，發(fā) 酵結(jié)束后，細(xì)菌纖維素即附著在容器內(nèi)壁表面合成。從內(nèi)壁表面剝離后，將細(xì)菌纖維素異型 產(chǎn)品置于流動(dòng)水浸泡洗滌1-2d后，再用0. lmol/LNaOH溶液浸泡1-2d除去培養(yǎng)基和菌體，洗 滌至中性(pH值約7.2)，然后冷凍干燥。
權(quán)利要求
1. 微生物發(fā)酵直接生物合成細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，其特征在于以木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.1812為生產(chǎn)菌株，具有氧滲透功能的材料為模具，培養(yǎng)基為原料，通過(guò)菌種培養(yǎng)、發(fā)酵、洗滌和干燥制備細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品，具體方法是①菌種培養(yǎng)將一環(huán)或兩環(huán)活化的木葡糖酸醋桿菌CGMCC No.1.1812斜面種子，接入HS種子培養(yǎng)基中，30℃條件下160r/min振蕩培養(yǎng)24h；②發(fā)酵以具有氧滲透能力的材料作為封閉異型發(fā)酵模具(3)(同時(shí)作為發(fā)酵容器，類(lèi)似注塑模具，留有培養(yǎng)基注入口，以手型為例)，即以5-20％(v/v)的接種量接入裝有HS發(fā)酵培養(yǎng)基(4)的異型發(fā)酵模具(3)中，異型發(fā)酵模具(3)直接熱封口(1)或用膠塞及其它封口物密封后，經(jīng)30℃靜置培養(yǎng)5-10d，細(xì)菌纖維素即附著在模具(3)的內(nèi)表面合成，經(jīng)分離，得到細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品；或?qū)⒕哂醒鯘B透能力的模具(2)(同樣以手型為例)置于發(fā)酵容器(5)中，該發(fā)酵容器(5)可以選自三角瓶、燒杯、廣口瓶或發(fā)酵罐等，發(fā)酵容器(5)中裝有HS發(fā)酵培養(yǎng)基(3)，具有滲氧功能的模具(2)與空氣(1)相通，經(jīng)30℃靜置培養(yǎng)5-10d，細(xì)菌纖維素即附著在模具外表面合成，經(jīng)分離，從模具(2)外即可剝離細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品；③洗滌和干燥為除去上述發(fā)酵法制備的細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品上的培養(yǎng)基和菌體，以流動(dòng)水浸泡洗滌處理1-2d后，再經(jīng)0.1mol/L的NaOH溶液浸泡1-2d后洗滌至中性，然后冷凍干燥或熱風(fēng)干燥，即可得細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品。
2. 按照權(quán)利要求l所述的微生物發(fā)酵直接生物合成細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，其特征在于模具為具有滲氧功能的管材，選自PVC材料或硅膠材料，從而不需要額外供給氧氣，工藝簡(jiǎn)單，造價(jià)較低。
3. 按照權(quán)利要求l所述的微生物發(fā)酵直接生物合成細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，其特征在于異型發(fā)酵容器的形狀為正方形、圓形、手形、V形等各種規(guī)則或不規(guī)則形狀。
4 拔昭擬宋ll亜步1斷汰的掛A-物^缺畝拔/ar4勿AR&細(xì)苗^P維妄旦刑;fe且的生ll夂卡、汰其特征在于異型產(chǎn)品的形狀、大小和厚度可控，可以根據(jù)目的產(chǎn)品的三維尺寸，即制作出相應(yīng)模具，從而制備相應(yīng)細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品。
5. 按照權(quán)利要求l所述的微生物發(fā)酵直接生物合成細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，其特征在于異型產(chǎn)品形狀可為中空。
6. 按照權(quán)利要求l所述的微生物發(fā)酵直接生物合成細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，其特征在于發(fā)酵時(shí)靜置培養(yǎng)5-10d。
7. 按照權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵直接生物合成細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，其特征在于洗滌和干燥時(shí)，以流動(dòng)水浸泡洗滌處理1-2d后，再經(jīng)0. lmol/L的Na0H溶液浸泡l-2d后洗滌至中性，然后干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了微生物發(fā)酵直接生物合成細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，屬于生物領(lǐng)域，涉及微生物發(fā)酵直接生物合成細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品的制備方法，特別涉及以木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.1812、具有氧滲透功能的材料為模具和培養(yǎng)基為原料通過(guò)菌種培養(yǎng)、發(fā)酵、洗滌和干燥制備細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品。本發(fā)明的方法工藝簡(jiǎn)單，利用微生物技術(shù)直接合成不同形狀的產(chǎn)品，造價(jià)較低。該方法制備的細(xì)菌纖維素異型產(chǎn)品其形狀和厚度具有可控性，同時(shí)具有良好的拉伸性能和生物相容性，不僅可作為食品包裝材料，還可作為組織工程支架材料，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101487033SQ20091006791
公開(kāi)日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2009年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月23日
發(fā)明者張桂才, 朱會(huì)霞, 飛 李, 楊洪江, 譚之磊, 賈原媛, 賈士儒 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)