專利名稱：一種生物微膠囊化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞固定化生物方法，尤指利用調(diào)解pH值控制的海藻酸鈉(Na·Alg)-殼聚糖(CS)-明膠(Gel)微膠囊化工藝，使微膠囊固定化微生物的活性保持和緩釋性能維持，具體地說是一種可提高生物微膠囊緩釋性能的生物微膠囊化的方法。
背景技術(shù)：
微膠囊化技術(shù)是將酶、輔酶、蛋白質(zhì)等生物大分子或微生物、動植物細(xì)胞包封在一層親水性的半透膜內(nèi)所形成的珠狀、橢桿狀或橢球狀微膠囊，使生物大分子和細(xì)胞被阻隔在微膠囊的膜內(nèi)或膜外，而氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)以及其它的小分子物質(zhì)則可以自由通過微膠囊膜進(jìn)行物質(zhì)傳遞，從而達(dá)到催化、培養(yǎng)或免疫隔離目的的技術(shù)。目前，生物微膠囊化技術(shù)已在細(xì)胞和酶的固定化、微生物和動植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)、藥物控制釋放、抗癌藥物篩選、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分離等領(lǐng)域中獲得了廣泛的應(yīng)用。
復(fù)凝聚法是較通用的微膠囊化技術(shù)之一，適用于對非水溶性的固體粉末或液體進(jìn)行包囊，實現(xiàn)復(fù)凝聚的必要條件是有關(guān)的兩種聚合物離子的電荷相反，且離子所帶電荷數(shù)恰好相等，此外，還必須調(diào)節(jié)體系的溫度和鹽的含量。利用復(fù)凝聚技術(shù)制備的微膠囊囊壁呈類似“三明治”的結(jié)構(gòu)，膠囊強度高，外形尺寸均一，傳質(zhì)性能好。但通常其緩釋性能較差，膠囊的半衰期短，不適合長時間使用，極大地限制了微膠囊的應(yīng)用前景。
采用海藻酸鈉-殼聚糖-明膠組合配方制備微膠囊，由于兩次凝聚反應(yīng)過程消耗的壁材溶液電荷數(shù)量不同，導(dǎo)致芯材酸堿度對微膠囊壁的滲透性能產(chǎn)生巨大影響。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明采用分別調(diào)節(jié)兩階段芯材溶液pH值的辦法，成功消除了因兩次復(fù)凝聚進(jìn)行時間不同造成的電荷不平衡，改善了微膠囊壁的結(jié)構(gòu)缺陷，提高了膠囊的緩釋性能，克服了生物微膠囊大規(guī)模實際應(yīng)用的障礙；本發(fā)明利用調(diào)節(jié)海藻酸鈉-明膠一次復(fù)凝聚和海藻酸鈉-殼聚糖二次復(fù)凝聚反應(yīng)體系的pH值，完善微膠囊“三明治”囊壁結(jié)構(gòu)，制備緩釋性能優(yōu)異的生物微膠囊。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為向海藻酸鈉水溶液里加入一株微生物菌體(例如菌齡為16-20h的微球菌Micrococcus sp.)液體種子(質(zhì)量比20％)，在40-45℃下，通過9#針頭注射器，控制下滴速度40-60滴/分鐘，滴加到預(yù)先調(diào)節(jié)pH值的明膠和氯化鈣混合液中，穩(wěn)定3.5-5h，形成微膠囊雛形，然后在氯化鈣溶液中二次鈣化10-15min，最后在預(yù)先調(diào)節(jié)pH值的殼聚糖溶液中二次復(fù)凝聚反應(yīng)2-3h，利用無菌生理鹽水水浸泡6-24h，增殖培養(yǎng)，備用。
一種生物微膠囊化的方法，可按如下步驟進(jìn)行具體操作1)壁材溶液配制配置質(zhì)量百分比2.0％海藻酸鈉的水溶液(用自來水浸潤24h)，滅菌冷卻(使用前于111℃下濕熱滅菌30min，冷卻到45℃，備用)，向其中加入其總質(zhì)量20％的微生物菌液體種子，攪拌均勻；2)一次復(fù)凝聚芯材溶液配制按質(zhì)量百分比配制含2.2％明膠和1.6％氯化鈣的水溶液，pH＝5.5-7.0(較好為pH＝6.0-6.5，最好為pH＝6.3)，滅菌冷卻(使用前于111℃下濕熱滅菌30min)，備用；3)二次鈣化溶液配制按質(zhì)量百分比配制0.5％氯化鈣的水溶液，滅菌冷卻(使用前于121℃下濕熱滅菌20min)，備用；4)二次復(fù)凝聚芯材溶液配制按質(zhì)量百分比配制0.5％殼聚糖的水溶液，pH＝3.0-5.0(較好為pH＝3.5-4.5，最好為pH＝4.0)，滅菌冷卻(使用前于111℃下濕熱滅菌30min)，備用；5)微膠囊制備在40-45℃下，將壁材溶液在無菌條件下按40-60滴/分鐘的速度滴入一次復(fù)凝聚芯材溶液中，不斷攪拌；膠珠成型后，穩(wěn)定3.5-5h；將膠珠轉(zhuǎn)移到二次鈣化液中，二次鈣化10-15min，然后將膠珠轉(zhuǎn)移到二次復(fù)凝聚芯材溶液中，進(jìn)行二級復(fù)凝聚反應(yīng)2-3h；利用無菌生理鹽水浸泡6-24h，置于增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后制得微膠囊。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1)通過調(diào)節(jié)兩次復(fù)凝聚反應(yīng)體系的pH值，平衡了復(fù)凝聚反應(yīng)的正負(fù)電荷量，制備得到的微膠囊形態(tài)均一，對微球菌Micrococcus sp.的固定效果優(yōu)良。
2)制得的生物微膠囊壁機械強度高，長期液體環(huán)境培養(yǎng)，微膠囊不發(fā)生溶解現(xiàn)象。
3)制得的生物微膠囊具有優(yōu)異的緩釋性能。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實施例1(1)微球菌Micrococcus sp.液體種子制備用接種環(huán)在固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基上接取2環(huán)Micrococcus sp.菌苔，接入到種子培養(yǎng)基中，在130rpm-140rpm、28℃-30℃條件下培養(yǎng)16-20小時，制得液體種子；[種子培養(yǎng)基]重量組成1.25％葡萄糖，0.25％酵母膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2；(2)壁材溶液配制(質(zhì)量百分比)配置2.0％的海藻酸鈉水溶液，于111℃下濕熱滅菌30min，無菌條件下冷卻到45℃，加入上述總質(zhì)量20％的Micrococcus sp.液體種子，攪拌均勻；(3)一次復(fù)凝聚芯材溶液配制(質(zhì)量百分比)配置2.5％的明膠和1.6％的氯化鈣混合水溶液，調(diào)節(jié)pH＝5.5，于111℃下濕熱滅菌30min；(4)二次鈣化溶液配制(質(zhì)量百分比)配置0.5％的氯化鈣水溶液，pH自然，于121℃下濕熱滅菌20min；(5)二次復(fù)凝聚芯材溶液配制(質(zhì)量百分比)配置0.5％的殼聚糖水溶液，調(diào)節(jié)pH＝3.0，于111℃下濕熱滅菌30min；(6)微膠囊制備將壁材溶液在無菌條件下注入注射器內(nèi)，利用9#針頭按照30滴/分鐘的速度滴入一次復(fù)凝聚芯材溶液中，不斷攪拌。膠珠成型后，穩(wěn)定3.5h，將膠珠轉(zhuǎn)移到二次鈣化液中，穩(wěn)定10min，然后將膠珠轉(zhuǎn)移到二次復(fù)凝聚芯材溶液中，穩(wěn)定2h，用無菌生理鹽水浸泡16h，置于增殖培養(yǎng)基中，增殖48h，制得微膠囊；[增殖培養(yǎng)基]重量組成3.0％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.1％牛肉膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2；增殖培養(yǎng)將制備的微膠囊按照4％的質(zhì)量濃度加入到增殖培養(yǎng)基中，在28-30℃、130rpm-140rpm培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48小時，檢測緩釋性能。
(7)微膠囊緩釋性檢測取3g微膠囊水漿，置于干凈的玻璃皿內(nèi)，在25℃環(huán)境溫度下放置，使之自然干燥，檢測其4周的重量變化；微膠囊失重率小于31.5％。
實施例2與實施例1不同之處在于配制一次復(fù)凝聚芯材溶液時，調(diào)節(jié)pH＝6.5；配制二次復(fù)凝聚芯材溶液時，調(diào)節(jié)pH＝4.5；經(jīng)上述步驟制得的微膠囊4周失重率小于25.1％。
實施例3與實施例1不同之處在于配制一次復(fù)凝聚芯材溶液時，調(diào)節(jié)pH＝6.3；配制二次復(fù)凝聚芯材溶液時，調(diào)節(jié)pH＝4.0；經(jīng)上述步驟制得的微膠囊4周失重率小于19.4％。
權(quán)利要求
1.一種生物微膠囊化的方法，其特征在于可按如下步驟操作，1)壁材溶液配制配置質(zhì)量百分比2.0％海藻酸鈉的水溶液，滅菌冷卻，向其中加入其總質(zhì)量20％的微生物菌液體種子，攪拌均勻；2)一次復(fù)凝聚芯材溶液配制按質(zhì)量百分比配制含2.2％明膠和1.6％氯化鈣的水溶液，pH＝5.5-7.0，滅菌冷卻，備用；3)二次鈣化溶液配制按質(zhì)量百分比配制0.5％氯化鈣的水溶液，滅菌冷卻，備用；4)二次復(fù)凝聚芯材溶液配制按質(zhì)量百分比配制0.5％殼聚糖的水溶液，pH＝3.0-5.0，滅菌冷卻，備用；5)微膠囊制備在40-45℃下，將壁材溶液在無菌條件下按40-60滴/分鐘的速度滴入一次復(fù)凝聚芯材溶液中，不斷攪拌；膠珠成型后，穩(wěn)定3.5-5h；將膠珠轉(zhuǎn)移到二次鈣化液中，二次鈣化10-15min，然后將膠珠轉(zhuǎn)移到二次復(fù)凝聚芯材溶液中，進(jìn)行二級復(fù)凝聚反應(yīng)2-3h；利用無菌生理鹽水浸泡6-24h，置于增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后制得微膠囊。
2.按照權(quán)利要求1所述生物微膠囊化的方法，其特征在于一次復(fù)凝聚芯材溶液的pH＝6.0-6.5；二次復(fù)凝聚芯材溶液的pH＝3.5-4.5。
3.按照權(quán)利要求1所述生物微膠囊化的方法，其特征在于一次復(fù)凝聚芯材溶液的pH＝6.3；二次復(fù)凝聚芯材溶液的pH＝4.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞固定化生物方法，具體地說是一種可提高生物微膠囊緩釋性能的生物微膠囊化的方法，向海藻酸鈉水溶液里加入一株微生物菌體液體種子，在40－45℃下，通過9#針頭注射器，控制下滴速度40－60滴/分鐘，滴加到預(yù)先調(diào)節(jié)pH值的明膠和氯化鈣混合液中，穩(wěn)定3.5－5h，形成微膠囊雛形，然后在氯化鈣溶液中二次鈣化10－15min，最后在預(yù)先調(diào)節(jié)pH值的殼聚糖溶液中二次復(fù)凝聚反應(yīng)2－3h，利用無菌生理鹽水水浸泡6－24h，增殖培養(yǎng)，備用。本發(fā)明優(yōu)點為制備得到的微膠囊形態(tài)均一，固定效果優(yōu)良；制得的生物微膠囊壁機械強度高，長期液體環(huán)境培養(yǎng)，微膠囊不發(fā)生溶解現(xiàn)象，具有優(yōu)異的緩釋性能。
文檔編號C12N11/04GK1854293SQ20051004632
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月27日
發(fā)明者李海波, 李培軍, 鞠京麗, 張海榮, 許華夏 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所