專(zhuān)利名稱(chēng)：歐文氏菌發(fā)酵生產(chǎn)門(mén)冬酰胺酶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種歐文氏菌(Erwinia carotovora)發(fā)酵生產(chǎn)門(mén)冬酰胺酶方法，它屬于抗癌藥物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
門(mén)冬酰胺酶是一種重要的抗癌藥物，臨床上主要用于急性白血病、慢性白血病的急性轉(zhuǎn)化例及惡性淋巴瘤等的治療。
曾有研究報(bào)導(dǎo)運(yùn)用歐文氏菌(Erwinia carotovora)能生產(chǎn)出門(mén)冬酰胺酶。不過(guò)產(chǎn)出量不大，成本較高。
經(jīng)試驗(yàn)，我們從土壤分離、純化培養(yǎng)、誘變育種中獲取歐文氏菌菌株。利用這些菌株，經(jīng)生物技術(shù)方法選定的發(fā)酵培養(yǎng)基配方及工藝條件能高效產(chǎn)出門(mén)冬酰胺酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明可以通過(guò)以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)高效低成本的目的。一種歐文氏菌(Erwiniacarotovora)發(fā)酵生產(chǎn)門(mén)冬酰胺酶方法，它包括發(fā)酵培養(yǎng)基配方和工藝條件。
A.發(fā)酵培養(yǎng)基配方，按重量百分比為玉米漿0.5～10％酵母膏0.1～10％谷胺酸0.1～10％K2HPO40.01～0.5％
Na2SO40.01～0.5％固體培養(yǎng)基時(shí)，上配方中須加入瓊脂1.0～2.0％。
B.發(fā)酵工藝條件(1)搖瓶培養(yǎng)試管菌種接入搖瓶中，每瓶接入菌種2環(huán)，培養(yǎng)溫度32～42℃，搖床轉(zhuǎn)速100～300rpm，培養(yǎng)時(shí)間5～48h，PH值5.0～9.0。
(2)種子罐培養(yǎng)接種量0.1～30％，培養(yǎng)溫度32～42℃，攪拌速度80～500rpm，罐壓0.02～0.14Mpa，通風(fēng)量1∶0.1～1∶2(V/V/min)，培養(yǎng)時(shí)間5～48h，PH值5.0～9.0。
(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)接種量1～30％，發(fā)酵溫度32～42℃，攪拌速度80～450rpm，罐壓0.015～0.14Mpa，通風(fēng)量1∶0.1～1∶2(V/V/min)，培養(yǎng)時(shí)間5～48h，發(fā)酵液PH值5.0～9.0。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)a.可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)門(mén)冬酰胺酶，生產(chǎn)成本低，具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。
b.能高效表達(dá)門(mén)冬酰胺酶，發(fā)酵效價(jià)≥40IU/ml，最高可達(dá)120IU/ml。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明下面將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述。
例1設(shè)定發(fā)酵罐500升、種子罐培養(yǎng)接種量為3.0％，發(fā)酵罐培養(yǎng)接種量為10％。
A.發(fā)酵培養(yǎng)基配方按重量百分比如下玉米漿4％
酵母膏0.2％谷胺酸0.4％K2HPO40.05％Na2SO40.02％B.發(fā)酵工藝條件(1)搖瓶培養(yǎng)設(shè)定500升發(fā)酵罐的裝量為300升，種子罐種量300×10％＝30升，搖瓶種量為30×3.0％＝0.9升。按上述配方配0.9升培養(yǎng)液，分裝在500ml三角瓶中，每瓶量為100ml，裝好后用蒸汽滅菌，冷卻至33℃，接入試管菌種，每瓶菌種為2環(huán)。搖床轉(zhuǎn)速150rpm，溫度控制在33℃，經(jīng)30h培養(yǎng)后，合并搖瓶種子。
(2)種子罐培養(yǎng)設(shè)定用50升的種子罐中，按上面配方配備30-0.9＝29.1升培養(yǎng)基(實(shí)際只加水至26升，因?yàn)轭A(yù)計(jì)滅菌時(shí)有3升的蒸汽冷凝水)，培養(yǎng)基滅菌后，待溫度降至33℃時(shí)，用火焰封口法接入已搖好的搖瓶種子于50升種子罐中，控制種子罐的溫度為33℃，攪拌速度為200rpm，通風(fēng)量為1∶0.5(V/V/min)，罐壓為0.03～0.05Mpa，培養(yǎng)24h。
(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)500升的發(fā)酵罐中，實(shí)際裝量為300-30＝270升。按上面的配方配270升的培養(yǎng)基于500升發(fā)酵罐中(實(shí)際只加水至250升，因?yàn)轭A(yù)計(jì)滅菌時(shí)有20升的蒸汽冷凝水)，蒸汽滅菌，待溫度降至33℃時(shí)，種子罐中已培養(yǎng)好的種子經(jīng)無(wú)菌管道接入發(fā)酵罐中，控制罐中溫度為33℃，攪拌轉(zhuǎn)度為120rpm，風(fēng)量為1∶0.4(V/V/min)，罐壓為0.03～0.06Mpa，培養(yǎng)46h后，離心收集菌體，菌體經(jīng)提取純化、凍干后即得門(mén)冬酰胺酶。
例2設(shè)定發(fā)酵罐5000升，種子罐培養(yǎng)接種量為0.3％，發(fā)酵罐培養(yǎng)接種量為2％。
A.發(fā)酵培養(yǎng)基配方按重量百分比如下玉米漿6％酵母膏8％谷胺酸9％K2HPO40.4％Na2SO40.08％B.發(fā)酵工藝條件(1)搖瓶培養(yǎng)設(shè)定5000升發(fā)酵罐的裝量為3500升，則種子罐種量3500×2％＝70升，搖瓶種量為70×0.3％＝0.21升。按上面配方配備0.21升培養(yǎng)基，分別裝在500ml三角瓶中，每瓶量為105ml，裝好后滅菌，冷卻至33℃，接入試管菌種，每瓶菌種為2環(huán)。搖床轉(zhuǎn)速250rpm，控制溫度為40℃，經(jīng)15h培養(yǎng)后，合并搖瓶種子。
(2)種子罐培養(yǎng)設(shè)定用100升種子罐，按上述配方配備70-0.21＝69.79升培養(yǎng)基(實(shí)際只加水至65升，預(yù)計(jì)滅菌時(shí)約有5升的蒸汽冷凝水)，培養(yǎng)基滅菌后，待溫度降至40℃時(shí)，用火焰封口法接入已搖好的搖瓶種子，控制種子罐的溫度為40℃，攪拌轉(zhuǎn)度為180rpm，通風(fēng)量為1∶0.8(V/V/min)，罐壓為0.06～0.09Mpa，培養(yǎng)12h。
(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)
5000升的發(fā)酵罐中，實(shí)際裝量為3500-70＝3430升。按上述配方配備3430升的培養(yǎng)基于5000升發(fā)酵罐中(實(shí)際只加水至3380升，預(yù)計(jì)滅菌時(shí)約有50升的蒸汽冷凝水)，滅菌，待溫度降至40℃時(shí)，把種子罐中已培養(yǎng)好的種子經(jīng)無(wú)菌管道接入發(fā)酵罐中，控制罐中溫度為40℃，攪拌轉(zhuǎn)度為100rpm，風(fēng)量為1∶0.3(V/V/min)，罐壓為0.03～0.04Mpa，培養(yǎng)18h后，離心收集菌體，菌體經(jīng)提取純化、凍干后即得門(mén)冬酰胺酶產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種歐文氏菌(Erwinia carotovora)發(fā)酵生產(chǎn)門(mén)冬酰胺酶方法，其特征在于A.發(fā)酵培養(yǎng)基配方，按重量百分比為玉米漿 0.5～10％酵母膏 0.1～10％谷胺酸 0.1～10％K2HPO40.01～0.5％Na2SO40.01～0.5％固體培養(yǎng)基時(shí)，上配方中須加入瓊脂1.0～2.0％；B.發(fā)酵工藝條件(1)搖瓶培養(yǎng)試管菌種接入搖瓶中，每瓶接入菌種2環(huán)，培養(yǎng)溫度32～42℃，搖床轉(zhuǎn)速100～300rpm，培養(yǎng)時(shí)間5～48h，PH值5.0～9.0；(2)種子罐培養(yǎng)接種量0.1～20％，培養(yǎng)溫度32～42℃，攪拌速度80～500rpm，罐壓0.02～0.14Mpa，通風(fēng)量1∶0.1～1∶2(V/V/min)，培養(yǎng)時(shí)間5～48h，PH值5.0～9.0；(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)接種量1～30％，發(fā)酵溫度32～42℃，攪拌速度80～450rpm，罐壓0.015～0.14Mpa，通風(fēng)量1∶0.1～1∶2(V/V/min)，培養(yǎng)時(shí)間5～48h，發(fā)酵液PH值5.0～9.0。
全文摘要
本發(fā)明是一種歐文氏菌(Erwinia carotovora)發(fā)酵生產(chǎn)門(mén)冬酰胺酶方法。它采用生物技術(shù)從土壤分離、純化培養(yǎng)、誘變育種中獲取歐文氏菌菌株。利用這些菌株，經(jīng)選定的發(fā)酵培養(yǎng)基配方及工藝條件，能高效產(chǎn)出門(mén)冬酰胺酶。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，因此成本較低；能高效表達(dá)門(mén)冬酰胺酶，發(fā)酵效價(jià)≥40IU/ml，最高可達(dá)120IU/ml。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1891819SQ20051003558
公開(kāi)日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2005年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月5日
發(fā)明者梁淑娃, 彭中健, 夏楓耿, 杜少平, 藍(lán)碧鋒, 譚穎嫦, 楊冠東, 張學(xué)智 申請(qǐng)人:廣州市微生物研究所