專利名稱：使用生物反應器對造血干細胞來源的細胞因子誘導的殺傷細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殺傷細胞的培養(yǎng)技術(shù)，尤其是涉及一種使用生物反應器對造血干細胞來源的細胞因子誘導的殺傷細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，在我國癌癥已超過心血管疾病成為第一位致死原因。大量的研究表明，腫瘤的形成和患者的機體免疫機能低下有直接的原因。1909年Ehrlich首先提出，免疫系統(tǒng)不僅負責防御外來病原的侵襲，而且能從肌體內(nèi)清除改變了宿主成分的細胞。腫瘤細胞是由正常體細胞變異而成，體內(nèi)存在專門清除腫瘤細胞的機制——腫瘤免疫機制。當腫瘤免疫機能足以清除體內(nèi)不斷產(chǎn)生的腫瘤細胞，人體能夠保持健康，反之則形成腫瘤。免疫功能分為細胞免疫和體液免疫兩個部分，淋巴細胞是細胞免疫功能的實現(xiàn)者，是免疫系統(tǒng)抵抗腫瘤的主要物質(zhì)力量。通過了解淋巴細胞抵抗腫瘤的功能，就可以知道腫瘤免疫細胞過繼治療的理論基礎(chǔ)。發(fā)揮腫瘤免疫功能的淋巴細胞有詳細的分工，主要有以下幾種第一種是抗原提呈細胞(APC)抗原提呈細胞能夠識別并捕獲病原體或腫瘤細胞上的非宿主物質(zhì)(抗原)，提呈給免疫系統(tǒng)激發(fā)特異性的應對機制，是免疫系統(tǒng)的“偵察員”。在腫瘤免疫的過程中，免疫系統(tǒng)首先要能夠認識腫瘤細胞和正常體細胞的區(qū)別，然后才能夠引導免疫機制將腫瘤細胞準確清除，這個過程就是依靠抗原提呈細胞捕獲和加工“腫瘤抗原”。如前所述，腫瘤細胞是改變了宿主成分的細胞，會表達正常體細胞所沒有的標志物(腫瘤抗原)。抗原提呈細胞發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原，會將其捕獲并加工成免疫系統(tǒng)容易識別的組織相容性抗原/腫瘤抗原復合物，傳遞給負責免疫系統(tǒng)信息處理的T輔助性細胞(Th細胞)，激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對腫瘤抗原的特異性反應，引導免疫系統(tǒng)清除腫瘤細胞。樹突狀細胞是分布最廣泛，效率最高的一種抗原提呈細胞。
第二種是輔助性T細胞(Th細胞)輔助性T細胞是免疫系統(tǒng)中的信息處理和指揮中心。T輔助性細胞剛開始以Th細胞前體的形式存在，在接受抗原提呈細胞遞呈的抗原復合物之后，分化成為Th細胞中間期Th0，Th0經(jīng)過不同的細胞因子誘導，分化成為Th1或Th2，分別負責細胞免疫和體液免疫的動員。在腫瘤免疫機制中，Th1細胞根據(jù)獲得的腫瘤抗原對體內(nèi)億萬個Tc細胞進行選擇，當Tc細胞上的T細胞受體和腫瘤抗原能夠緊密結(jié)合，這個Tc細胞就會被選中并被激活，從而獲得大量能夠識別相關(guān)腫瘤抗原并殺滅腫瘤細胞的Tc細胞。根據(jù)經(jīng)典的克隆選擇學說，Th2細胞以類似的機制選擇分泌特異性抗體的B淋巴細胞，使之大量擴增發(fā)揮體液免疫作用。
第三種是殺傷性T細胞(Tc)殺傷性T細胞(Tc)是根據(jù)抗原識別特異性目標，具有特異性殺傷入侵的病原體或內(nèi)部產(chǎn)生的腫瘤細胞功能的T淋巴細胞。在抵抗腫瘤的過程中，Tc細胞在Th1細胞作用下通過組織相容性抗原/腫瘤抗原復合物與T細胞受體(TCR)結(jié)合被特異性選擇激活，因而Tc細胞表面的T細胞受體(TCR)能夠識別特定的腫瘤抗原，引導Tc細胞發(fā)揮細胞毒作用殺傷腫瘤細胞。Tc細胞在識別腫瘤細胞后會釋放穿孔素，殺傷效力是非常強大的，是免疫系統(tǒng)中抓捕特異腫瘤細胞的“刑警”；經(jīng)過Th細胞傳遞腫瘤抗原激活的Tc細胞，其表面的T細胞受體(TCR)和腫瘤抗原有非常強的親和力，是引導Tc細胞緝拿腫瘤細胞的“通緝令”。
第四種是自然殺傷細胞(NK)自然殺傷細胞(NK)是體內(nèi)的另一類淋巴細胞，能夠殺傷無宿主成分的病原體或變異體細胞。腫瘤細胞是改變宿主成分的細胞，除了表達腫瘤抗原這個特點外，還不表達正常體細胞都表達的主要組織相容性抗原I(MHC I)或者MHC I表達變異。在腫瘤免疫體系中自然殺傷細胞發(fā)揮的作用很大，能根據(jù)MHC I分子變異或不表達這個特點識別腫瘤細胞，而且對腫瘤細胞具有很強的殺傷效力。MHC I分子是正常體細胞的“合法身份證明”，NK細胞就是專門殺傷無“合法身份證明”的腫瘤細胞的武裝警察。體內(nèi)NK細胞數(shù)量多、抗瘤譜廣、殺傷效力強，是機體抵抗腫瘤的天然屏障。
免疫細胞過繼治療的發(fā)展歷程和種類種類有五種第一種是淋巴因子激活的殺傷細胞(Lymphokine ActivedKiller，LAK細胞)進入上世紀八十年代，隨著分子生物學的發(fā)展，許多細胞因子的基因被克隆，運用基因重組技術(shù)在原核或真核細胞中進行表達，使那些在生理條件下難以分離的細胞因子得以大量生產(chǎn)，促進了腫瘤免疫治療的發(fā)展。其中最為令人們鼓舞的是又稱促淋巴細胞生長因子的白細胞介素-2(IL-2)的出現(xiàn)，幾乎所有的淋巴細胞都有IL-2受體，人們希望注射IL-2促進體內(nèi)淋巴細胞的生長，增強免疫機能對抗腫瘤。但這一想法很快因為發(fā)現(xiàn)IL-2在體內(nèi)有強烈的毒副作用而被否定。Rosenberg在1984年，用IL-2在體外活化和擴增的淋巴細胞，獲得了對腫瘤細胞有較強的殺傷活性、抗瘤譜較為廣泛、不損傷正常的淋巴細胞，稱為淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK細胞)。臨床研究中應用LAK細胞輸入病人體內(nèi)進行過繼免疫治療，對黑色素瘤、腎細胞癌、淋巴瘤等有一定療效，尤其那些在常規(guī)療法不能取得療效的患者中也取得了一些部分緩解和完全緩解的病例。
但是LAK細胞作為最早的免疫細胞過繼治療的方法，有許多的缺點需要完善。首先LAK細胞在體外培養(yǎng)需要使用大量的IL-2，回輸?shù)襟w內(nèi)仍然會出現(xiàn)水鈉潴留等毒副作用，對腫瘤的殺傷又無特異性，而且細胞容易出現(xiàn)老化，生長速度和持續(xù)生長能力都不甚理想。
第二種是腫瘤浸潤性淋巴細胞(Tumor infitrating lymphocyte，TIL)1986年Rosenberg的研究組荷瘤小鼠實體瘤中，首次分離到了腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)，在體外加入少量的IL-2進行培養(yǎng)，獲得的細胞其殺傷效率高于LAK細胞50-100；后來發(fā)現(xiàn)腫瘤病人的胸、腹水分離出的淋巴細胞，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)獲得的淋巴細胞，在體外加入IL-2進行培養(yǎng)，也可以獲得殺瘤效率很高的效應細胞。這就是細胞免疫過繼療法的另一種類腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
TIL在體外擴增的過程中，經(jīng)流式細胞計數(shù)器檢測，細胞的表面標志CD4和DC8總數(shù)都上升，而CD4/DC8的比例不斷下降。CD4是輔助性T細胞的表面標志，CD8是殺傷性T細胞的表面標志，這表明體外擴增的TIL中以殺傷性T細胞為主。在體外擴增的TIL回輸?shù)襟w內(nèi)，會在腫瘤周圍形成較長時間的聚集，對自身的腫瘤有特異性殺傷作用。
第三種是腫瘤特異性細胞毒T淋巴細胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)隨著對腫瘤抗原、抗原的加工呈遞和T細胞識別機制的研究有了突破性進展，基因工程重組細胞因子、人源化基因工程抗體進入臨床應用，以及樹突狀細胞的深入研究，已經(jīng)可以在體外誘導對腫瘤具有特異性的殺傷性T細胞。研究者們提取外周血單核細胞(PBMCs)，在體外和細胞因子混合培養(yǎng)誘導成為樹突狀細胞(DC)，在DC中加入腫瘤抗原，然后和自體T淋巴細胞混合培養(yǎng)。DC細胞完成抗原提呈后，通過輔助性T細胞激活殺傷性T細胞，經(jīng)過培養(yǎng)獲得腫瘤特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)，CTL回輸?shù)襟w內(nèi)也會形成在腫瘤組織周圍的浸潤，發(fā)揮類似TIL的殺傷腫瘤作用。
第四種是細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokines induce killer cells，CIK)CIK細胞是通過抽取腫瘤患者自體、同種異體外周血，分離出淋巴細胞，在抗CD3單克隆抗體和IL-2等細胞因子的作用下在體外大量擴增，然后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)達到腫瘤免疫治療的目的。Suthanthiran等(1984)最先顯示，用抗CD3單抗預處理人混合淋巴細胞培養(yǎng)中的記憶細胞，能誘導出專一的次級細胞溶解活力和自然殺傷細胞樣活力。Uberti等(1994)用固相抗CD3單抗和IL-2處理PBMCs，得到具非MHC限制的細胞毒細胞，用于骨髓移植后的過繼細胞免疫治療。以后CIK細胞逐漸成為腫瘤免疫治療的重點。
CD3是T淋巴細胞的特征表面標志，大約有67％的成人個體的外周血細胞表達CD3分子。研究表明CD3分子還是在T淋巴細胞分化增殖中起重要調(diào)控作用的細胞膜蛋白，至少由5個多肽亞基(γ、δ、ε、ζ、η)組成，在細胞膜上和T細胞受體(TCR)的兩個異源二聚體αβ和γδ都偶聯(lián)。當抗CD3單克隆抗體和CD3分子的特定位點結(jié)合后，會使CD3分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，進而使與之偶聯(lián)的T細胞受體(TCR)受到影響，啟動T細胞的信號系統(tǒng)導致T細胞被激活，表面的IL-2受體表達量增多，可在IL-2的協(xié)同作用下可以在體外長時間存活并且快速增殖。
CIK細胞具有諸多優(yōu)點一是IL-2用量少，引起的毒副反應；二是主要含有CD3+CD8+的T殺傷細胞(TC細胞)和CD3+CD8+具有自然殺傷細胞作用的細胞，對腫瘤殺傷效率非常強大；三是CIK細胞使用抗CD3單克隆抗體和IL-2兩種方式激活，在體外培養(yǎng)不易老化可以較長時間存活和以較快的速度增殖；四是CIK細胞在被激活后能持續(xù)較高水平地表達分泌多種細胞因子，回輸?shù)襟w內(nèi)后促進經(jīng)過放療、化療腫瘤病人淋巴細胞數(shù)量迅速回升。
第五種是DC瘤苗(Dendritic Cell Tumor Vaccin)機體的免疫應答首先由抗原遞呈細胞(antigen presenting cell，APC)捕獲、加工和處理抗原，再將抗原遞呈給T，B淋巴細胞，從而引發(fā)一系列的免疫應答。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)作為功能最強的APC，在體內(nèi)發(fā)揮強大的免疫監(jiān)視功能。腫瘤患者體內(nèi)DC功能缺陷，不能有效遞呈腫瘤抗原，導致免疫無能或免疫耐受。
DC在體內(nèi)分布雖廣，但數(shù)量極少，外周血單核細胞中DC的比例還不到1％，在淋巴器官中雖數(shù)量較多但難以收集，而且由于分離出的DC具有異質(zhì)性，難以滿足對DC的基礎(chǔ)研究及臨床應用的需要。此外，體內(nèi)的DC因為腫瘤分泌的一些因子，如IL-10，TGF，VEGF限制其成熟而發(fā)生功能缺陷。因此，利用DC的前體細胞體外誘導分化擴增DC是研究DC瘤苗的必要途徑。方法一是利用從骨髓、臍血、外周血分離純化而來的CD34+干細胞，GM-CSF、TNF-α等細胞因子的作用下誘導分化成DC；方法二是分離外周血單核細胞體外誘導擴增DC在體外用GM-CSF、IL-4等細胞因子的作用下誘導分化成DC。在獲得DC細胞后，使用以已知抗原肽沖擊DC、以全腫瘤抗原沖擊DC、以基因轉(zhuǎn)染DC、以免疫輔助分子基因轉(zhuǎn)染DC、使用經(jīng)處理的腫瘤細胞與DC融合等方法構(gòu)件DC瘤苗，再回輸?shù)襟w內(nèi)激活免疫系統(tǒng)的特異性抗瘤機制。
隨著DC體外誘導擴增技術(shù)的發(fā)展及分子生物學技術(shù)和基因工程技術(shù)應用于DC瘤苗構(gòu)建方法的發(fā)現(xiàn)，DC瘤苗用于腫瘤免疫治療的實驗和臨床研究更趨成熟，有望成為腫瘤免疫治療的一種有效方式。
免疫細胞過繼治療面臨的問題從以上的綜述可以看出，免疫細胞過繼治療是很有發(fā)展前景的，但是也面臨著不少的問題制約其進一步發(fā)展。第一是對腫瘤的殺傷效力還沒有完全發(fā)揮細胞免疫中抗原提呈、效應細胞激活、效應細胞培養(yǎng)等過程是環(huán)環(huán)相扣的，而且要求各個環(huán)節(jié)的細胞具有相同的基因背景。而當今所開發(fā)的各種免疫細胞培養(yǎng)方法，都只涉及細胞免疫的一個方面，沒有實現(xiàn)各種細胞之間的協(xié)同作用，不能將細胞免疫功能的效應發(fā)揮到最大化。
第二是規(guī)模小、成本高免疫細胞發(fā)揮作用受MHC I抗原限制，而當今所開發(fā)的各種免疫細胞培養(yǎng)方法，都只涉及細胞免疫的一個方面，為了和腫瘤宿主的其他免疫細胞保持基因背景的統(tǒng)一，只能夠?qū)嵤﹤€體化治療方案。在現(xiàn)階段用于過繼治療的免疫細胞，都是來自病人自體或親屬，免疫細胞過繼治療只能是個性化治療，這就決定了規(guī)模受到限制，必然造成治療的成本比較高，難以大規(guī)模推廣。
第三是生產(chǎn)標準化程度低，質(zhì)量不穩(wěn)定由于是個性化的治療，不同患者的情況差別很大，不同個體免疫細胞的生產(chǎn)條件也有不同。生產(chǎn)過程很難依照一定的標準開展，導致培養(yǎng)出來的免疫細胞的質(zhì)量不統(tǒng)一，制約了免疫細胞過繼治療的大規(guī)模推廣。
第四是質(zhì)量控制困難根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《人的體細胞治療臨床實驗指導原則》，對用于臨床治療的人的體細胞的檢驗項目很多，如果應用于每一個病人的免疫細胞都進行檢驗，工作量會相當大而且成本高昂，很難實現(xiàn)。
如果免疫細胞過繼治療能夠在技術(shù)上取得突破，在實際應用中實現(xiàn)規(guī)?；藴驶?，那么以上的各種問題就可以迎刃而解，腫瘤的生物治療將會迎來一個新的發(fā)展機遇。

發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有免疫細胞培養(yǎng)方法沒有實現(xiàn)各種細胞之間的協(xié)同作用，不能將細胞免疫功能的效應發(fā)揮到最大化，具有規(guī)模小、成本高，生產(chǎn)標準化程度低，質(zhì)量不穩(wěn)定和質(zhì)量控制困難的缺點，本發(fā)明提供一種使用生物反應器對造血干細胞來源的細胞因子誘導的殺傷細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種使用生物反應器對造血干細胞來源的細胞因子誘導的殺傷細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，包括臍帶血造血干細胞的獲得，以細胞因子將造血干細胞誘導成DC細胞、并完成對腫瘤抗原的提呈作用，完成對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞的選擇激活，以化學法連接抗CD3單抗的瓊脂糖微載體的制備，CIK細胞的激活和CIK細胞在生物反應器中進行連續(xù)培養(yǎng)，所述以化學法連接抗CD3單抗的瓊脂糖微載體的制備是以共價方法將單抗連接在微載體上，提高單抗與細胞的接觸面積，增大培養(yǎng)空間，提高細胞密度，又可以在空間實現(xiàn)樹突狀細胞、輔助性T細胞、殺傷性T細胞之間的接觸，便于腫瘤抗原的提呈和殺傷性T細胞的選擇激活，由于CIK細胞培養(yǎng)實現(xiàn)立體化，所以可以使用生物反應器進行大規(guī)模培養(yǎng)，將瓊脂糖微載體在pH為10.5-11的0.1MTris緩沖液中和加入溴化氰使終濃度為0.1M，在搖床上20-25℃作用過夜；1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，使瓊脂糖微載體和溴化氰反應液分離，用pH為11的Tris緩沖液洗滌/離心5次，將活化的瓊脂糖微載體風干備用，將瓊脂糖微載體和抗CD3抗體以1g/3-5mg的比例，在pH為9.5-10的0.1MTris緩沖液中混合，在搖床上20-25℃作用1小時，使抗CD3抗體充分結(jié)合到瓊脂糖微載體上，加入足夠量的甘氨酸封閉瓊脂糖微載體未反應的位點，用DMEM培養(yǎng)液洗滌離心10次，將微載體在4-8℃風干后，用鈷60輻照滅菌后備用；所述CIK細胞的激活是將完成對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞的選擇激活中處理過的臍帶血造血干細胞以0.8-1×108個細胞/1g微載體的比例混合，在培養(yǎng)瓶中以含有10％胎牛血清和終濃度為300-500ng/ml的IL-2的PMRI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，這時臍帶血造血干細胞中含有的單核細胞和殺傷性T細胞會在連接和微載體上的抗CD3單抗和IL-2的作用下被激活成為CIK細胞，進入快速生長的狀態(tài)，在抗CD3單抗的支持下生長8-10天后，CIK細胞會逐漸成熟并擺脫對抗CD3單抗的依賴，這時可以將細胞轉(zhuǎn)入到生物反應器中進行大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)；所述CIK細胞在生物反應器中進行連續(xù)培養(yǎng)采用攪拌式生物反應器，以攪拌速度60-80轉(zhuǎn)/分鐘，溶氧量為45-55％，pH為7.2，溫度為37℃，培養(yǎng)基替換速度為1-1.5ml/分鐘的條件進行培養(yǎng)，能夠為細胞提供穩(wěn)定而合適的生長條件，而反應器的細胞截留裝置使細胞能夠保持高密度狀態(tài)，使CIK細胞能夠得到長時間、高密度地培養(yǎng)，當反應器內(nèi)的細胞密度達到3-5×107之后，就可以每天收集500-800ml的細胞培養(yǎng)液，得到2-4×1010的CIK細胞，剩余的細胞繼續(xù)在反應器內(nèi)進行連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)收集。
所述臍帶血造血干細胞的獲得是取健康足月嬰兒臍帶血30-50ml，并加入枸櫞酸鈉抗凝，用淋巴細胞分離液以2500轉(zhuǎn)/分鐘離心25-30分鐘，收集臍帶血造血干細胞，以胚胎成纖維細胞作為滋養(yǎng)細胞，在含有10％胎牛血清的PMRI1640完全培養(yǎng)基中，加入終濃度為200-250ng/ml的IL-3和50-80ng/ml的CSF，在5％二氧化碳濃度下37℃培養(yǎng)，這時候臍帶血造血干細胞能夠在不分化的狀態(tài)下持續(xù)快速生長，不斷傳代，獲得大量的臍帶血單核細胞，用于CIK細胞的生產(chǎn)。
所述以細胞因子將造血干細胞誘導成DC細胞、并完成對腫瘤抗原的提呈作用是將臍帶血造血干細胞在含有終濃度為80-100ng/ml的IL-4、200-250ng/ml的GM-CSF和100-200ng/ml的TNF-α的含有10％胎牛血清的PMRI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將臍帶血造血干細胞誘導成樹突狀細胞DC，將腫瘤細胞碎片加入到DC細胞中，使DC細胞完成對腫瘤抗原的提呈作用。
所述完成對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞的選擇激活是將經(jīng)過腫瘤抗原沖擊的DC細胞和臍帶血造血干細胞共同培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有10％胎牛血清和終濃度為300-400ng/ml的IL-12的PMRI1640完全培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)，這時DC細胞會將加工過的腫瘤抗原傳遞給輔助性T細胞，輔助性T細胞會選擇激活對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞。
本發(fā)明的積極效果是本發(fā)明以共價方法將單抗連接在微載體上，既提高了單抗與細胞的接觸面積，增大培養(yǎng)空間，提高細胞密度；又可以在空間實現(xiàn)樹突狀細胞、輔助性T細胞、殺傷性T細胞之間的接觸，便于腫瘤抗原的提呈和殺傷性T細胞的選擇激活；由于CIK細胞培養(yǎng)實現(xiàn)立體化，所以可以使用生物反應器進行大規(guī)模培養(yǎng)。
具體表現(xiàn)是能夠使所培養(yǎng)的CIK細胞殺傷腫瘤的效率更高；能夠使所培養(yǎng)的CIK細胞克服個體差異依賴性的限制，具有大規(guī)模推廣的可能；能夠引入微載體、運用大規(guī)模培養(yǎng)設備，實現(xiàn)使所培養(yǎng)的CIK細胞大規(guī)模標準化培養(yǎng)，使CIK細胞實現(xiàn)安全有效、穩(wěn)定均一、質(zhì)量可控、經(jīng)濟可行的目標；是一種大規(guī)模、連續(xù)、高密度培養(yǎng)免疫細胞的方法。
使用了臍帶血來源的造血干細胞，獲得基因背景相同的各種免疫效應細胞，整合各種免疫細胞培養(yǎng)方法，突破腫瘤免疫治療的“個體化限制”，并使用生物反應器實現(xiàn)對免疫細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，實現(xiàn)殺傷腫瘤免的免疫效應細胞大規(guī)模、低成本、穩(wěn)定、高效的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)目標；
具體實施方式一種使用生物反應器對造血干細胞來源的細胞因子誘導的殺傷細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)步驟1是大量的臍帶血造血干細胞的獲得取健康足月嬰兒臍帶血50ml，并加入枸櫞酸鈉抗凝，用淋巴細胞分離液以2500轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集臍帶血造血干細胞；以胚胎成纖維細胞作為滋養(yǎng)細胞，在含有10％胎牛血清的PMRI1640完全培養(yǎng)基中，加入終濃度為200ng/ml的IL-3和50ng/ml的CSF，在5％二氧化碳濃度下37℃培養(yǎng)；這時候臍帶血造血干細胞能夠在不分化的狀態(tài)下持續(xù)快速生長，不斷傳代，獲得大量的臍帶血單核細胞，用于CIK細胞的生產(chǎn)。
步驟2是以細胞因子將造血干細胞誘導成DC細胞，并完成對腫瘤抗原的提呈作用將步驟1臍帶血造血干細胞在含有終濃度為100ng/ml的IL-4、200ng/ml的GM-CSF和100ng/ml的TNF-α的含有10％胎牛血清的PMRI1640完全培養(yǎng)基中中培養(yǎng)，將臍帶血造血干細胞誘導成樹突狀細胞DC；將腫瘤細胞碎片加入到DC細胞中，使DC細胞完成對腫瘤抗原的提呈作用。
步驟3是完成對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞的選擇激活將步驟2中經(jīng)過腫瘤抗原沖擊的DC細胞和臍帶血造血干細胞共同培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有10％胎牛血清和終濃度為300ng/ml的IL-12的PMRI1640完全培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)，這時DC細胞會將加工過的腫瘤抗原傳遞給輔助性T細胞，輔助性T細胞會選擇激活對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞。
步驟4是以化學法連接抗CD3單抗的瓊脂堂微載體的制備將瓊脂糖微載體在pH11的0.1MTris緩沖液中和溴化氰混合，在搖床上25℃作用過夜；離心使瓊脂糖微載體和溴化氰反應液分離，用pH11的Tris緩沖液洗滌/離心5次，將活化的瓊脂糖微載體風干備用；將瓊脂糖微載體和抗CD3抗體以1g/5mg的比例，在pH10的0.1MTris緩沖液中混合，在搖床上25℃作用1小時，使抗CD3抗體充分結(jié)合到瓊脂糖微載體上；加入足夠量的甘氨酸封閉瓊脂糖微載體未反應的位點，用DMEM培養(yǎng)液洗滌離心10次，用鈷60輻照滅菌后備用。
在本實施例中，抗CD3單抗與細胞的接觸是免疫細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵，接觸面積越大細胞培養(yǎng)密度越高。本發(fā)明以共價方法將單抗連接在微載體上，提高單抗與細胞的接觸面積，增大培養(yǎng)空間，提高細胞密度；又可以在空間實現(xiàn)樹突狀細胞、輔助性T細胞、殺傷性T細胞之間的接觸，便于腫瘤抗原的提呈和殺傷性T細胞的選擇激活。由于CIK細胞培養(yǎng)實現(xiàn)立體化，所以可以使用生物反應器進行大規(guī)模培養(yǎng)。
步驟5是CIK細胞的激活將步驟3中處理過的臍帶血造血干細胞以108個細胞/1g微載體的比例混合，在培養(yǎng)瓶中以含有10％胎牛血清和終濃度為500ng/ml的IL-2的PMRI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，這時臍帶血造血干細胞中含有的單核細胞和殺傷性T細胞會在連接和微載體上的抗CD3單抗和IL-2的作用下被激活成為CIK細胞，進入快速生長的狀態(tài)。在抗CD3單抗的支持下生長8-10天后，CIK細胞會逐漸成熟，這時可以將細胞轉(zhuǎn)入到生物反應器中進行大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)。
步驟6是CIK細胞在生物反應器中進行連續(xù)培養(yǎng)生物反應器是一種模擬體內(nèi)環(huán)境，提供給細胞適宜的生長條件的設備。本發(fā)明使用德國B.Braun公司生產(chǎn)的5L攪拌式生物反應器，以攪拌速度60-80轉(zhuǎn)/分鐘，溶氧量為45-55％，pH7.2，溫度為37℃，培養(yǎng)基替換速度為1-1.5ml/分鐘的條件進行培養(yǎng)，全部參數(shù)都是有傳感器自動檢測，由反應器自動控制，能夠為細胞提供穩(wěn)定而合適的生長條件，而反應器的細胞截留裝置使細胞能夠保持高密度狀態(tài)，使CIK細胞能夠得到長時間、高密度地培養(yǎng)。當反應器內(nèi)的細胞密度達到3-5×107之后，就可以每天收集500ml的細胞培養(yǎng)液，得到2×1010的CIK細胞(可以滿足20位患者一次的治療量)。剩余的細胞繼續(xù)在反應器內(nèi)進行連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)收集。
權(quán)利要求
1.一種使用生物反應器對造血干細胞來源的細胞因子誘導的殺傷細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，包括臍帶血造血干細胞的獲得，以細胞因子將造血干細胞誘導成DC細胞、并完成對腫瘤抗原的提呈作用，完成對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞的選擇激活，以化學法連接抗CD3單抗的瓊脂糖微載體的制備，CIK細胞的激活和CIK細胞在生物反應器中進行連續(xù)培養(yǎng)，其特征是所述以化學法連接抗CD3單抗的瓊脂糖微載體的制備是以共價方法將單抗連接在微載體上，提高單抗與細胞的接觸面積，增大培養(yǎng)空間，提高細胞密度，又可以在空間實現(xiàn)樹突狀細胞、輔助性T細胞、殺傷性T細胞之間的接觸，便于腫瘤抗原的提呈和殺傷性T細胞的選擇激活，由于CIK細胞培養(yǎng)實現(xiàn)立體化，所以可以使用生物反應器進行大規(guī)模培養(yǎng)，將瓊脂糖微載體在pH為10.5-11的0.1MTris緩沖液中和加入溴化氰使終濃度為0.1M，在搖床上20-25℃作用過夜；1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，使瓊脂糖微載體和溴化氰反應液分離，用pH為11的Tris緩沖液洗滌/離心5次，將活化的瓊脂糖微載體風干備用，將瓊脂糖微載體和抗CD3抗體以1g/3-5mg的比例，在pH為9.5-10的0.1MTris緩沖液中混合，在搖床上20-25℃作用1小時，使抗CD3抗體充分結(jié)合到瓊脂糖微載體上，加入足夠量的甘氨酸封閉瓊脂糖微載體未反應的位點，用DMEM培養(yǎng)液洗滌離心10次，將微載體在4-8℃風干后，用鈷60輻照滅菌后備用；所述CIK細胞的激活是將完成對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞的選擇激活中處理過的臍帶血造血干細胞以0.8-1×108個細胞/1g微載體的比例混合，在培養(yǎng)瓶中以含有10％胎牛血清和終濃度為300-500ng/ml的IL-2的PMRI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，這時臍帶血造血干細胞中含有的單核細胞和殺傷性T細胞會在連接和微載體上的抗CD3單抗和IL-2的作用下被激活成為CIK細胞，進入快速生長的狀態(tài)，在抗CD3單抗的支持下生長8-10天后，CIK細胞會逐漸成熟并擺脫對抗CD3單抗的依賴，這時可以將細胞轉(zhuǎn)入到生物反應器中進行大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)；所述CIK細胞在生物反應器中進行連續(xù)培養(yǎng)采用攪拌式生物反應器，以攪拌速度60-80轉(zhuǎn)/分鐘，溶氧量為45-55％，pH為7.2，溫度為37℃，培養(yǎng)基替換速度為1-1.5ml/分鐘的條件進行培養(yǎng)，能夠為細胞提供穩(wěn)定而合適的生長條件，而反應器的細胞截留裝置使細胞能夠保持高密度狀態(tài)，使CIK細胞能夠得到長時間、高密度地培養(yǎng)，當反應器內(nèi)的細胞密度達到3-5×107之后，就可以每天收集500-800ml的細胞培養(yǎng)液，得到2-4×1010的CIK細胞，剩余的細胞繼續(xù)在反應器內(nèi)進行連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)收集。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用生物反應器對造血干細胞來源的細胞因子誘導的殺傷細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其特征是所述臍帶血造血干細胞的獲得是取健康足月嬰兒臍帶血30-50ml，并加入枸櫞酸鈉抗凝，用淋巴細胞分離液以2500轉(zhuǎn)/分鐘離心25-30分鐘，收集臍帶血造血干細胞，以胚胎成纖維細胞作為滋養(yǎng)細胞，在含有10％胎牛血清的PMRI1640完全培養(yǎng)基中，加入終濃度為200-250ng/ml的IL-3和50-80ng/ml的CSF，在5％二氧化碳濃度下37℃培養(yǎng)，這時候臍帶血造血干細胞能夠在不分化的狀態(tài)下持續(xù)快速生長，不斷傳代，獲得大量的臍帶血單核細胞，用于CIK細胞的生產(chǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用生物反應器對造血干細胞來源的細胞因子誘導的殺傷細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其特征是所述以細胞因子將造血干細胞誘導成DC細胞、并完成對腫瘤抗原的提呈作用是將臍帶血造血干細胞在含有終濃度為80-100ng/ml的IL-4、200-250ng/ml的GM-CSF和100-200ng/ml的TNF-α的含有10％胎牛血清的PMRI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將臍帶血造血干細胞誘導成樹突狀細胞DC，將腫瘤細胞碎片加入到DC細胞中，使DC細胞完成對腫瘤抗原的提呈作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用生物反應器對造血干細胞來源的細胞因子誘導的殺傷細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其特征是所述完成對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞的選擇激活是將經(jīng)過腫瘤抗原沖擊的DC細胞和臍帶血造血干細胞共同培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有10％胎牛血清和終濃度為300-400ng/ml的IL-12的PMRI1640完全培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)，這時DC細胞會將加工過的腫瘤抗原傳遞給輔助性T細胞，輔助性T細胞會選擇激活對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用生物反應器對造血干細胞來源的細胞因子誘導的殺傷細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，包括臍帶血造血干細胞的獲得，以細胞因子將造血干細胞誘導成DC細胞、并完成對腫瘤抗原的提呈作用，完成對腫瘤具有特異性殺傷作用的殺傷性T淋巴細胞的選擇激活，以化學法連接抗CD
文檔編號C12N5/08GK1699558SQ20051003503
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月9日
發(fā)明者郭杰標 申請人:鄭麗琴