專利名稱：與棉花高強(qiáng)纖維主效基因連鎖的分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)了與棉花高強(qiáng)纖維主效基因連鎖的分子標(biāo)記，用于提高棉花纖維品質(zhì)的分子育種，專用于棉花高強(qiáng)度纖維主效基因的篩選。
棉纖維是重要的紡織工業(yè)原料。美國(guó)棉花品質(zhì)育種的研究已有50多年的歷史。Culp等人從1946年開(kāi)始PD種質(zhì)改良計(jì)劃，歷時(shí)40余年，發(fā)放了30多個(gè)種質(zhì)系和3個(gè)品種。這些種質(zhì)系或品種的纖維品質(zhì)，尤其是纖維強(qiáng)度較常規(guī)品種有較大的提高，產(chǎn)量達(dá)到推廣品種的水平。1982年以來(lái)，為適應(yīng)紡織工業(yè)設(shè)備的改造，美國(guó)加快了對(duì)棉花纖維品質(zhì)的改良。僅1982-1986年度鼓勵(lì)棉纖維強(qiáng)度育種的獎(jiǎng)金就高達(dá)560萬(wàn)美元。從1980年起，美國(guó)纖維比強(qiáng)度每年提高0．25tex／g，到1991年平均達(dá)到了21. 7cN／tex。
隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外都很重視開(kāi)展優(yōu)質(zhì)纖維基因的分子標(biāo)記篩選以用于標(biāo)記輔助選擇。Yu等(1998)在構(gòu)建陸地棉×海島棉種間雜種遺傳圖譜的基礎(chǔ)上，鑒定出與海島棉優(yōu)質(zhì)纖維基因(QTL)連鎖的分子標(biāo)記11個(gè)，其中3個(gè)纖維強(qiáng)度，3個(gè)纖維長(zhǎng)度，5個(gè)纖維細(xì)度。這些QTL可解釋(TM-1×3-79)海陸雜種F2總遺傳變異的35％-50％。Jiang等(1998)的研究也證明四倍體棉種(AADD)中，大部分纖維品質(zhì)、產(chǎn)量的QTL位于D染色體亞組，而四倍體棉種中A染色體亞組的祖先是有纖維的，而D染色體亞組則是光子，沒(méi)有纖維。他們鑒定出的3個(gè)纖維強(qiáng)度QTL可解釋海陸雜種F2總遺傳變異的30．9％。上述這兩個(gè)研究結(jié)果都利用種間雜種F2單株纖維品質(zhì)表現(xiàn)而得出，重復(fù)性如何有待證實(shí)。但是，遺傳效應(yīng)值小的QTL，往往會(huì)隨著環(huán)境的變化而檢測(cè)不到。Shappley等(1998)在陸地棉品種間雜交后代中鑒定出與纖維品質(zhì)連鎖的RFLP標(biāo)記。這些研究結(jié)果為纖維品質(zhì)的輔助選擇乃至克隆纖維品質(zhì)基因打下了基礎(chǔ)。
近15年來(lái)我國(guó)育成的棉花品種產(chǎn)量略高于美國(guó)，纖維品質(zhì)則有些差距。我國(guó)當(dāng)家品種的纖維品質(zhì)中等，基本能滿足紡織工業(yè)的要求，但品質(zhì)單一，纖維強(qiáng)度偏低，紡高支紗的優(yōu)質(zhì)棉需大量進(jìn)口(項(xiàng)時(shí)康、余楠、胡育昌等．1999．論我國(guó)棉花質(zhì)量現(xiàn)狀．棉花學(xué)報(bào)．11(1)1-10)。隨著紡工部門(mén)引入噴氣紡、氣流紡等高效快速的紡紗技術(shù)，以及人民群眾對(duì)衣著要求的普遍提高，對(duì)我國(guó)棉花品種的總體纖維品質(zhì)，尤其是纖維強(qiáng)度提出了更高的要求。從1999年起國(guó)際市場(chǎng)上棉價(jià)又將原來(lái)的按纖維長(zhǎng)度定價(jià)改為按纖維強(qiáng)度的高低定價(jià)。因此，如何在近期內(nèi)大幅度提高我國(guó)棉花品種的纖維強(qiáng)度刻不容緩。要提高現(xiàn)有陸地棉(G．hirsutum L)品種的纖維品質(zhì)水平，首先要收集具有高纖維強(qiáng)度基因的種質(zhì)系作親本與現(xiàn)有的栽培品種進(jìn)行一系列雜交和互交，以便打破強(qiáng)度與產(chǎn)量之間的負(fù)相關(guān)，但在每輪回交中，都要對(duì)纖維品質(zhì)進(jìn)行檢驗(yàn)，成本很高，而且要等到收花期結(jié)束一段時(shí)間后才能知道結(jié)果，因而，要求育種群體大，盲目性也大。因此品質(zhì)育種的成本很高，費(fèi)時(shí)，難度也較大，進(jìn)展緩慢。通過(guò)篩選出一個(gè)或幾個(gè)與高強(qiáng)纖維主效基因緊密連鎖且不受環(huán)境影響的分子標(biāo)記用于輔助選擇，可大大提高高強(qiáng)纖維的選擇效率。
本發(fā)明的目的是篩選出一個(gè)或幾個(gè)與棉花高強(qiáng)纖維主效基因緊密連鎖且不受環(huán)境影響的分子標(biāo)記，這些分子標(biāo)記用于棉花輔助選擇育種，可以大大提高高強(qiáng)纖維的選擇效率，從而盡快提高我國(guó)棉花品種的纖維品質(zhì)水平。
本發(fā)明的實(shí)施方案如下。
與棉花高強(qiáng)纖維主效基因連鎖的分子標(biāo)記，是通過(guò)以下方法篩選出的(1)對(duì)引自江蘇省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所的陸地棉高強(qiáng)纖維種質(zhì)系7235，與引自美國(guó)農(nóng)業(yè)部南方平原農(nóng)業(yè)研究中心作物種質(zhì)資源研究室的遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1進(jìn)行雜交，F(xiàn)1種子自交產(chǎn)生F2。
(2)用CTAB法提取(7235×TM-1)F2分離群體的單株DNA。
(3)采用SSR和RAPD兩種分子標(biāo)記進(jìn)行棉花高強(qiáng)纖維標(biāo)記的篩選。首先用211對(duì)SSR引物對(duì)7235和TM-1親本的DNA多態(tài)性進(jìn)行初步分析。SSR反應(yīng)體系為DNA 94℃預(yù)變性4min后，94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)35次，最后72℃延伸7min。在PE9600擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在Metaphor agrose(FML，Maine，USA)膠上進(jìn)行分離鑒定。RAPD標(biāo)記的篩選是采用美國(guó)OPERON公司開(kāi)發(fā)的10bp寡核苷酸序列作為隨機(jī)引物，在PE-9600熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體積為20ul，其中10×buffer(含25mM MgCl2)2．0ul，2mM dNTPs1．0ul，10uM Primer1ul，5mM TMACI和10mg／ml BSA各0．2ul，Taq酶(5unit／ul)0．2ul，模板DNA 20ng，加ddH2O至20ul。PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)?4℃ 2min預(yù)變性后，接著94℃ 30sec，36℃ 30sec，72℃ 70sec，10個(gè)循環(huán)，再89℃ 20sec，36℃ 20sec，72℃ 60sec，35個(gè)循環(huán)，再72℃ 7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1．4％瓊脂糖凝膠中電泳，然后在紫外透射儀上照相，記錄結(jié)果。
(4)共發(fā)現(xiàn)有3個(gè)SSR標(biāo)記NAU／SSR／Fs1130，NAU／SSR／Fs2190，NAU／SSR／Fs3220和6個(gè)RAPD標(biāo)記，NAU／RAPD／Fs1933，NAU／RAPD／Fs21920，NAU／RAPD／Fs31320，NAU／RAPD／Fs4983，NAU／RAPD／Fs5821，NAU／RAPD／Fs61047與棉花的高強(qiáng)纖維主效基因連鎖。
本發(fā)明選用的是一個(gè)異常棉(G．a(chǎn)nomalum)基因漸滲、有Acala3080和PD4381遺傳背景的優(yōu)質(zhì)纖維種質(zhì)系7235(錢(qián)思穎、黃駿騏、彭躍進(jìn)等。1992。陸地棉(G．hirsutum L．)與異常棉(G．a(chǎn)nomalumWawr．&Peyr．)種間雜種的研究及其在育種上的應(yīng)用。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，25(6)44-51)開(kāi)展棉花高強(qiáng)纖維的QTL分子標(biāo)記篩選。與目前技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是(1)標(biāo)記穩(wěn)定。本研究在陸地棉的遺傳背景上鑒定出與兩個(gè)纖維強(qiáng)度QTLs連鎖的SSR標(biāo)記3個(gè)，RAPD標(biāo)記6個(gè)，尤其是標(biāo)記的一個(gè)主效QTL所占的遺傳變異大，(7235×TM-1)組合在1998，1999年分別在中國(guó)南京，海南，美國(guó)德克薩斯洲配置，產(chǎn)生F2分離群體，用這些標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，表明該標(biāo)記表現(xiàn)穩(wěn)定，不受年份，環(huán)境條件的影響，再加上有SSR引物，輔助選擇方便，應(yīng)是提高我國(guó)棉花品種纖維強(qiáng)度水平的有利基因資源。
(2)輔助育種選擇目標(biāo)明確，節(jié)約成本。在提高強(qiáng)力和皮棉產(chǎn)量相結(jié)合的育種方法中，首先要收集具有強(qiáng)力基因的親本與栽培品種進(jìn)行一系列雜交和互交，并進(jìn)行多次的回交和復(fù)合雜交，以便打破強(qiáng)力與產(chǎn)量之間的負(fù)相關(guān)。但在每輪回交中都要對(duì)纖維強(qiáng)力進(jìn)行單株選擇。用國(guó)產(chǎn)的儀器進(jìn)行纖維強(qiáng)力的測(cè)定，效率很低，即使一個(gè)熟練工人也只能測(cè)10-20個(gè)樣品，而進(jìn)口的HV900儀器(價(jià)格昂貴，一般單位買(mǎi)不起)效率高，但成本也高，而且要等到收花期結(jié)束一段時(shí)間才能知道結(jié)果，這樣要求群體就大，盲目性也大，因此品質(zhì)育種的成本很高，費(fèi)時(shí)，難度也較大。通過(guò)本發(fā)明篩選出的與高強(qiáng)纖維基因緊密連鎖且不受環(huán)境影響的分子標(biāo)記用于輔助選擇，可以在苗期就鑒定出高纖維強(qiáng)度的單株，從而大大提高棉花高強(qiáng)纖維的選擇效率。
本發(fā)明的實(shí)施程序是對(duì)引自江蘇省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所的陸地棉高強(qiáng)纖維種質(zhì)系7235，通過(guò)單株選擇，株行農(nóng)藝性狀的鑒定和纖維品質(zhì)檢驗(yàn)，選出純合的7235株系。據(jù)我們1998年測(cè)定結(jié)果，7235纖維強(qiáng)度為27．3cN／tex，纖維長(zhǎng)度為35mm，纖維細(xì)度(麥克隆值，下同)為4．1；陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的纖維強(qiáng)度則為20．7cN／tex，纖維長(zhǎng)度為30．5mm，纖維細(xì)度為5．0。TM-1引自美國(guó)農(nóng)業(yè)部南方平原農(nóng)業(yè)研究中心作物種質(zhì)資源研究室。
1997年7235與TM-1進(jìn)行雜交，年底F1種子送到海南島，自交產(chǎn)生F2種子。1998年將(7235×TM-1)F2分離群體種在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站。用CTAB法提取這一分離群體的單株DNA。吐絮后，單株收花、取樣、進(jìn)行纖維品質(zhì)測(cè)驗(yàn)。1998年冬和1999年夏分別在海南島三亞和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站種植(7235×TM-1)F3株行，以便用F3株行中單株的纖維強(qiáng)度的平均值來(lái)估算(7235×TM-1)F2的單株水平。為了鑒定纖維品質(zhì)在異地的遺傳表現(xiàn)，1999年還將來(lái)自同一群體的(7235×TM-1)F2種于美國(guó)德克薩斯州大學(xué)城(CollegeStation)農(nóng)業(yè)部南方平原農(nóng)業(yè)研究中心實(shí)驗(yàn)田。所有國(guó)內(nèi)棉樣均送到河南安陽(yáng)農(nóng)業(yè)部纖維品質(zhì)和種子質(zhì)量檢測(cè)中心進(jìn)行纖維品質(zhì)檢驗(yàn)。分子標(biāo)記主要利用微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)和RAPD標(biāo)記。
用211對(duì)SSR引物首先對(duì)7235和TM-1親本的DNA多態(tài)性進(jìn)行初步分析。211對(duì)微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記引物購(gòu)自美國(guó)Research Genetics公司。Taq酶，dNTPs，PCR反應(yīng)的其他試劑均購(gòu)自Sigma公司。SSR反應(yīng)體系為DNA 94℃變性4min后，94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)35次，最后72℃延伸7min。在PE9600擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在Metaphor agrose(FML，Maine，USA)膠上進(jìn)行分離鑒定。本試驗(yàn)采用的隨機(jī)引物為美國(guó)OPERON公司開(kāi)發(fā)的10bp寡核苷酸序列，PCR反應(yīng)在PE-9600熱循環(huán)儀中進(jìn)行。PCR反應(yīng)體積為20ul，其中10×buffer(含25mM MgCl2)2．0ul，2mM dNTPs1．0ul，10uM Primer1ul，5mM TMACI和10mg／ml BSA各0．2ul，Taq酶(5unit／ul)0．2ul，模板DNA 20ng，加ddH2O至20ul。PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)?4℃ 2min預(yù)變性后，接著94℃ 30sec，36℃30sec，72℃ 70sec，10個(gè)循環(huán)，再89℃ 20sec，36℃ 20sec，72℃ 60sec，35個(gè)循環(huán)，再72℃ 7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1．4％瓊脂糖凝膠中電泳，然后在紫外透射儀上照相，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)7235有特異擴(kuò)增帶的SSR，RAPD引物，分別選用高纖維強(qiáng)度／低纖維強(qiáng)度池進(jìn)一步進(jìn)行擴(kuò)增鑒定。構(gòu)建高／低纖維強(qiáng)度池時(shí)，同時(shí)參照了1998年(7235×TM-1)F2在南京的單株表現(xiàn)，1998年冬和1999年夏分別種在海南島和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦實(shí)驗(yàn)站(7235×TM-1)F3株行單株纖維強(qiáng)度的平均表現(xiàn)，各選5～6株構(gòu)成。7235親本特異擴(kuò)增帶在高強(qiáng)纖維池中能重復(fù)，而在低強(qiáng)池中不表現(xiàn)的引物，就用1998年的(7235×TM-1)F2單株DNA進(jìn)行擴(kuò)增。分子標(biāo)記篩選結(jié)果表明，有26對(duì)(12．32％)SSR引物在雙親上有差異。共發(fā)現(xiàn)有3個(gè)SSR標(biāo)記NAU／SSR／Fs1130(用SSR1521引物可擴(kuò)增出130對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段)，NAU／SSR／Fs2190(用SSR2961引物可擴(kuò)增出190對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段)，NAU／SSR／Fs3220(用SSR3255引物可擴(kuò)增出220對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段)和6個(gè)RAPD標(biāo)記，NAU／RAPD／Fs1933(用UBC301引物可擴(kuò)增出933對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段)，NAU／RAPD／Fs21920(用UBC431引物可擴(kuò)增出1920對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段)，NAU／RAPD／Fs31320(用UBC757引物可擴(kuò)增出1320對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段)，NAU／RAPD／Fs4983(用OPAP01引物可擴(kuò)增出983對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段)，NAU／RAPD／Fs5821(用OPAL19引物可擴(kuò)增出821對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段)，NAU／RAPD／Fs61047(用OPM07引物可擴(kuò)增出1047對(duì)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段)與棉花的高強(qiáng)纖維連鎖。利用MAPMAKER／QTL3．0程序它們進(jìn)行連鎖檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)SSR標(biāo)記NAU／SSR／Fs1130，NAU／SSR／Fs2190和以上6個(gè)RAPD標(biāo)記與一個(gè)主效QTL緊密連鎖，在這個(gè)連鎖群上；標(biāo)記的QTL占(7235×TM-1)F2分離群體總遺傳變異的30％以上。此外，這一標(biāo)記的QTL在不同年份，不同環(huán)境表現(xiàn)穩(wěn)定，因此，這是我們發(fā)現(xiàn)的一個(gè)控制棉花高強(qiáng)纖維表現(xiàn)的主效位點(diǎn)。該QTL以加性和隱性遺傳效應(yīng)為主。因此，用分子標(biāo)記輔助選擇可有效地開(kāi)展棉花的高強(qiáng)纖維育種。利用這一標(biāo)記的QTL，預(yù)計(jì)可迅速提高我國(guó)棉花品種纖維強(qiáng)度2-3cN／tex。NAU／SSR／Fs3220標(biāo)記另一個(gè)連鎖群的高強(qiáng)纖維QTL。
權(quán)利要求
1.與棉花高強(qiáng)纖維主效基因連鎖的分子標(biāo)記，是通過(guò)以下方法篩選出的(1)引自江蘇省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所的陸地棉高強(qiáng)纖維種質(zhì)系7235，與引自美國(guó)農(nóng)業(yè)部南方平原農(nóng)業(yè)研究中心作物種質(zhì)資源研究室的遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1進(jìn)行雜交，F(xiàn)1種子自交產(chǎn)生F2；(2)用CTAB法提取(7235×TM-1)F2分離群體的單株DNA；(3)采用SSR和RAPD兩種分子標(biāo)記進(jìn)行棉花高強(qiáng)纖維標(biāo)記的篩選；(4)共篩選出3個(gè)SSR標(biāo)記NAU／SSR／Fs1130，NAU／SSR／Fs2190，NAU／SSR／Fs3220和6個(gè)RAPD標(biāo)記，NAU／RAPD／Fs1933，NAU／RAPD／Fs21920，NAU／RAPD／Fs31320，NAU／RAPD／Fs4983，NAU／RAPD／Fs5821，NAU／RAPD／Fs61047與棉花的高強(qiáng)纖維主效基因連鎖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述與棉花高強(qiáng)纖維主效基因連鎖的分子標(biāo)記，其中采用的SSR和RAPD兩種分子標(biāo)記進(jìn)行棉花高強(qiáng)纖維標(biāo)記的篩選方法為首先用211對(duì)SSR引物對(duì)7235和TM-1親本的DNA多態(tài)性進(jìn)行初步分析，SSR反應(yīng)體系為DNA94℃預(yù)變性4min后，94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)35次，最后72℃延伸7min；在PE9600擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在Metaphor agrose(FML，Maine，USA)膠上進(jìn)行分離鑒定；RAPD標(biāo)記的篩選是采用美國(guó)OPERON公司開(kāi)發(fā)的10bp寡核苷酸序列作為隨機(jī)引物，在PE-9600熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體積為20ul，其中10×buffer(含25mMMgCl2)2．0ul，2mM dNTPs 1．0ul，10uM Primer 1ul，5mM TMACI和10mg／ml BSA各0．2ul，Taq酶(5unit／ul)0．2ul，模板DNA 20ng，加ddH2O至20ul，PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)?4℃ 2min預(yù)變性后，接著94℃30sec，36℃ 30sec，72℃ 70sec，10個(gè)循環(huán)，再89℃ 20sec，36℃ 20sec，72℃ 60sec，35個(gè)循環(huán)，再72℃ 7min；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1．4％瓊脂糖凝膠中電泳，然后在紫外透射儀上照相，記錄結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明與棉花高強(qiáng)纖維主效基因連鎖的分子標(biāo)記,用于提高棉花纖維品質(zhì)的分子育種。利用種質(zhì)系7235為材料,開(kāi)展分子標(biāo)記的篩選,鑒定出與棉花高強(qiáng)纖維基因連鎖的SSR標(biāo)記3個(gè),NAU/SSR/Fs文檔編號(hào)C12Q1/68GK1293256SQ0013029
公開(kāi)日2001年5月2日 申請(qǐng)日期2000年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月10日
發(fā)明者張?zhí)煺? 袁有祿, 郭旺珍 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)