專利名稱：人hMnk2基因序列、其編碼蛋白及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的人基因和蛋白，尤其涉及一種新的人促分裂原活化蛋白激酶相關(guān)蛋白激酶hMnk2的核酸序列及其編碼蛋白；此外，本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法。
背景技術(shù)：
Mnk蛋白是較新發(fā)現(xiàn)的絲氨酸/蘇氨酸激酶的一個亞家族，與促分裂原活化蛋白激酶(MAP kinase)密切相關(guān)。研究顯示，Mnk蛋白是多種MAP激酶(kinase)的下游調(diào)節(jié)蛋白(EMBO J 1997 Apr 15；16(8)1909-20)。
MAP激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以被多種細(xì)胞外刺激激活，如細(xì)胞因子、生長因子、神經(jīng)介質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)(cellular stress)和細(xì)胞粘著(cell adherence)(Physiol Rev 1999 Jan；79(1)143-80)。MAP激酶在所有的真核細(xì)胞中都有表達(dá)，研究顯示它與細(xì)胞的生長、信號傳導(dǎo)、分化和細(xì)胞凋亡都有關(guān)(ActaPhysiol Scand 1998 Dec；164(4)611-21)。MAP調(diào)控模塊由三個細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶組成磷酸化級聯(lián)，它們是MAP激酶(MAPK)，MAP激酶蛋白激酶(MKK)和MAP激酶蛋白激酶蛋白激酶(MKKK)。它們整合細(xì)胞膜受體活化的信號，通過MAPK易位進(jìn)入細(xì)胞核磷酸化核苷酸靶序列(如轉(zhuǎn)錄因子)的能力將來自細(xì)胞外的信號轉(zhuǎn)化為基因組的響應(yīng)(Essay Biochem 1997；321-16)。
已有的研究表明，MAP激酶家族具有重要的生理功能。MAP激酶家族成員胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular Regulated Kinase)的磷酸化與神經(jīng)突觸變化和以此為基礎(chǔ)的記憶學(xué)習(xí)過程有關(guān)(Drugs Exp Clin Res 1999；25(2-3)99-103)；MAP激酶是致有絲分裂刺激中的重要元件，不同MAP激酶信號傳導(dǎo)通路間的相互交流決定了細(xì)胞對應(yīng)激、凋亡和普通生理過程的反應(yīng)(Postepy Hig Med Dosw 1999；53(2)291-303)；雌激素和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體通過MAP的共表達(dá)使二者的信號傳導(dǎo)途徑會聚偶合(FrontNeuroendocrinol 1999 Apr；20(2)97-121)；MAP激酶的一種——SAPK2(stress-activated protein kinase 2)的信號傳導(dǎo)通路介導(dǎo)氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)的肌動蛋白重組以及VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動，因此該傳導(dǎo)通路在炎癥反應(yīng)和血管生成反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用(Biochem Soc Symp 1999；6479-89)；MAP激酶家族中的JNK(c-Jun N-terminal kinase)的傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)AP-1(activatorprotein-1)的轉(zhuǎn)錄活性，因此JNK為胚胎的形態(tài)建成、細(xì)胞增殖凋亡的調(diào)節(jié)和細(xì)胞的免疫應(yīng)答所必需(Biochem Soc Symp 1999；641-12)；MAP作為生長因子受體酪氨酸激酶的下游途徑將信號最終傳導(dǎo)至細(xì)胞核，活化多個轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)(CellSignal 1999Jan；11(1)1-14)；MAP激酶與血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的生長和凋亡都有關(guān)，這說明MAP激酶在心血管疾病，如自發(fā)性高血壓、動脈粥樣硬化，中發(fā)揮著重要的作用(Acta Physiol Scand 1998 Dec；164(4)611-21)，這是對酪氨酸激酶依賴的生長因子的刺激作出的應(yīng)答(Physiol Res 1998；47(4)215-25)；MAP激酶和其調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子與腎臟的損傷和修復(fù)有關(guān)(Curr Opin Nephrol Hypertens 1998Jul；7(4)425-33)；兩種MAP激酶(p42/p44和p38)相互拮抗的調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白(cyclin)依賴的蛋白激酶(CDKs)，因此MAP在細(xì)胞周期的重進(jìn)入中發(fā)揮重要的作用(Prog Cell Cycle Res 1996；249-58)；MAP激酶參與血管緊張素的生理調(diào)節(jié)作用(Mt Sinai J Med 1998 Mar；65(2)108-17；多種MAP在T淋巴細(xì)胞信號傳導(dǎo)中起著重要的作用，它們既能傳導(dǎo)來自T細(xì)胞受體信號又能調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子從而控制一些重要基因的表達(dá)，其中包括白介素2(IL-2)(Immunol Cell Biol 1997Dec；75(6)528-45)；JNK和p38MAP激酶參與調(diào)節(jié)NF-kappa B轉(zhuǎn)錄因子的活性從而在炎癥反應(yīng)和控制細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用(Immunobiology 1997Dec；198(1-3)35-49)；除了生長因子和細(xì)胞因子其它一些信號也能激活MAP激酶，如紫外線或胞外基質(zhì)的組分，因此MAP激酶可能在人上皮組織增殖分化的調(diào)控中扮演重要的角色(Baillieres Clin Endocrinol Metab 1996 Jul；10(3)323-36)。
在本申請之前，尚沒有公開或報道過本發(fā)明所涉及的人hMnk2蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種新的人基因序列hMnk2(GenbankAccession No.AF125532)，該基因是一個促分裂原活化蛋白激酶相關(guān)蛋白激酶相關(guān)基因。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種新的人蛋白hMnk2。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供一種生產(chǎn)上述人hMnk2蛋白和核酸序列的方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有人hMnk2蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第12-1253位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第12-1253位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第12-1253位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的人hMnk2蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個實(shí)例中該宿主細(xì)胞是大腸桿菌；在另一實(shí)例中，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有人hMnk2蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，該方法包括(1)將編碼具有人hMnk2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hMnk2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第12-1253位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hMnk2蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hMnk2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hMnk2蛋白活性的多肽。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第12-1253位的序列。
本發(fā)明還提供了與hMnk2蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明中，“分離的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人hMnk2蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人hMnk2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第12-1253位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的編碼框第12-1253位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.6中第12-1253位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.7所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第12-1253位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。其中，“嚴(yán)緊條件”是指核苷酸序列在膜上雜交后的洗膜條件。例如，在本領(lǐng)域中，低嚴(yán)緊度洗膜可以在雜交管中倒入150ml左右洗液，放入雜交膜，室溫持續(xù)搖動20分鐘左右，而高嚴(yán)緊度洗膜可以是在雜交管中倒入200ml左右洗液，放入雜交膜，50℃搖床中持續(xù)搖動20分鐘左右。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.6中從核苷酸第12-1253位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人hMnk2相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人hMnk2蛋白或多肽”指具有天然人hMnk2蛋白活性的SEQID NO.7序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人hMnk2相同功能的、SEQ ID NO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括hMnk2蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明人hMnk2多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人hMnk2蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人hMnk2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人hMnk2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括人hMnk2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人hMnk2多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
在本發(fā)明中，“hMnk2保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1

發(fā)明還包括人hRa18蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人hMnk2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的人hMnk2多肽時，可以將hMnk2編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成人hMnk2蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
本發(fā)明還提供了對人hMnk2特異的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對hMnk2特異的抗體。例如，將提純的人hMnk2基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人hMnk2或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohler et al.，Nature 256495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6292，1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑hMnk2功能的抗體，也可以是不影響人hMnk2功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人hMnk2基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人hMnk2基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的hMnk2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以通過用在原核細(xì)胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以通過用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的來免疫動物而得到。
本發(fā)明的人hMnk2抗體可以用來鑒定表達(dá)人hMnk2蛋白或多肽的細(xì)胞，如JurkatT細(xì)胞。例如，可以用一種可檢測的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來標(biāo)記hMnk2特異抗體，然后讓人hMnk2特異抗體與細(xì)胞樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測出與hMnk2特異抗體結(jié)合的細(xì)胞。
除了在細(xì)胞表面檢測人hMnk2外，還可以用Western印跡技術(shù)分析該蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解液可以從培養(yǎng)細(xì)胞或取自病人的組織標(biāo)本如腎上腺中提取，并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞提取物(同時將提純的人hMnk2多肽作為陽性對照)，接著通過電泳雜交將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測hMnk2多肽，可以使用典型的抗體結(jié)合檢測方法，例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測方法。并可使用免疫接種血清或不相關(guān)的單克隆抗體作為非特異反應(yīng)的對照。
還可用Nothern印跡法技術(shù)分析hMnk2基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析人hMnk2的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
人hMnk2DNA的Nothern印跡分析和人hMnk2特異抗體的Western印跡分析還可以聯(lián)合使用，以證實(shí)人hMnk2在生物樣本中的表達(dá)。人hMnk2DNA還可以用于Southern印跡分析或原位雜交分析，以將該基因定位于染色體上，并可進(jìn)行遺傳連鎖分析以找出其它可能的疾病相關(guān)基因。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有hMnk2核苷酸編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼hMnk2的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測樣品中是否存在hMnk2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于hMnk2核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的hMnk2核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選hMnk2同源基因或同源蛋白。
為了得到與hMnk2基因相關(guān)的人cDNAs或基因組DNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選人cDNA或基因組DNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對hMnk2的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自人腎上腺組織的文庫。來自參與內(nèi)分泌的其它人體組織或特定人體細(xì)胞株的cDNA文庫也可用于篩選目的。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與hMnk2相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
根據(jù)核苷酸相似性篩選hMnk2同源物可以按如下方法完成。人體腎上腺cDNA文庫，例如Clontech Cat.#7430-1(Clontech，Palo Alto，Cal.)可以使用一段包含hMnk2基因序列的全部或部分的隨機(jī)引物化DNA探針篩選。要完成對與hMnk2序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鑒定，可以使用雜交溫度為55℃的雜交液，然后用0.5×SSC和0.1％SDS清洗。用這種方法識別的克隆的DNA插入序列可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序來評價它與hMnk2基因的相似性。組織表達(dá)的分布可以用上述的Northern印跡法技術(shù)分析。
hMnk2同源物也可以用針對hMnk2蛋白或多肽的抗體來識別。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法對商品化的或者用已知方法構(gòu)建的，來自細(xì)胞或者組織例如腎上腺的表達(dá)文庫進(jìn)行篩選。將文庫倒入平皿，菌落轉(zhuǎn)移到一張硝化纖維素膜上，使表達(dá)的重組蛋白結(jié)合到膜上。然后就可以用特異性的人hMnk2抗體進(jìn)行典型的抗體結(jié)合和檢測。用這種方法所識別出克隆中的DNA插入序列，可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序進(jìn)行分析以評價它與hMnk2基因的相似性。新識別的基因的組織表達(dá)分布可以同樣地按上述方法進(jìn)行分析。
本發(fā)明的人hMnk2核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來合成有關(guān)序列。在本申請之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明人hMnk2蛋白的的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
本發(fā)明蛋白的編碼序列可用于基因定位。例如，通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進(jìn)行雜交，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長至約2000bp或者更長的cDNA。對于該技術(shù)，可參見Verma等人，Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques，PergamonPress，New York(1988)。
一旦序列被定位于染色體上的某個精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的，例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(可通過Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在網(wǎng)上獲得)。然后，通過連鎖分析來鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。
接著，有必要確定患病個體和健康個體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在于部分或全部患病個體但不存在于正常個體，那么該突變可能就是該疾病的致病因素。
利用本發(fā)明的人hMnk2蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與人hMnk2發(fā)生相互作用的物質(zhì)或，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明人hMnk2蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人hMnk2蛋白為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人hMnk2蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當(dāng)本發(fā)明的人hMnk2蛋白多肽被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新基因具有與已發(fā)表并被確認(rèn)為小鼠(Musmusculus)Mnk2蛋白的基因(GeneBank Accession Y11092)高度同源的序列，并且本發(fā)明的新蛋白具有小鼠(Mus musculus)Mnk2蛋白(GenPept Accession CAA71966)高度保守的氨基酸序列。所以，本發(fā)明的hMnk2是小鼠(Mus musculus)Mnk2蛋白基因的一個同源基因并具有相似的功能。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新蛋白具有與已發(fā)表并被確認(rèn)為Mnk2的基因高度同源的序列，并且本發(fā)明的新蛋白具有Mnk蛋白高度保守的氨基酸序列。進(jìn)一步的研究表明，本發(fā)明與已發(fā)表并被確認(rèn)為小鼠Mnk2基因具有高度同源性，相同性為96。4％，此外與其他Mnk蛋白(如小鼠的Mnk1蛋白和人的Mnk1蛋白)也存在較高同源性。所以，本發(fā)明的hMnk2基因?qū)儆贛nk蛋白家族，是小鼠Mnk2基因的一個同源基因而具有相似的功能。
本發(fā)明人hMnk2核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人hMnk2的表達(dá)水平或者抑制人hMnk2的過度表達(dá)。本發(fā)明的人hMnk2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人hMnk2缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。


圖1為本發(fā)明的人hMnk2與小鼠Mnk2(mMnk2)基因核酸序列(GenBank AccessionY11092)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的核苷酸用“|”標(biāo)出。
圖2為本發(fā)明的人hMnk2蛋白與小鼠Mnk2(mMnk2)的氨基酸序列的同源比較(FASTA)圖。mMnk2.pep小鼠Mnk2蛋白氨基酸序列(GenePept ACCESSION No.CAA71966)；hMnk2人Mnk2蛋白氨基酸序列。其中，相同的氨基酸用“|”標(biāo)出，不同的氨基酸用“+”標(biāo)出。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1hMnk2基因的克隆1.組織分離(Tissue isolation)腎上腺來源于5個正常成年男性供體，在死后四小時內(nèi)取出腎上腺組織，立即置于液氮中冷凍保存。
2.mRNA的分離(mRNA isolation)取出組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3.cDNA文庫的構(gòu)建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物見SEQ ID NO.1。補(bǔ)平末端后，加含EcoRI切點(diǎn)的接頭，接頭序列分別見SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性內(nèi)切酶消化1.5小時，再進(jìn)行片段分離。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)進(jìn)行包裝，宿主菌使用XL 1-Blue MRF’細(xì)菌。涂板并測定滴度。
4.測序及數(shù)據(jù)庫建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3’端和5’端的通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行EST大規(guī)模測序。測序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UN Ultra 450Server上進(jìn)行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，將無同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫。
5.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎(chǔ)上，進(jìn)行cDNA全長克隆，分兩階段進(jìn)行
(1)“電子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針?biāo)褜bEST數(shù)據(jù)庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag，簡稱“EST”)序列認(rèn)為同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER軟件進(jìn)行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(OpenReading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通常可獲取hMnk2基因的全長序列。
(2)cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列的5’或3’端設(shè)計引物，在人類腎上腺M(fèi)arathon-Ready cDNA文庫(Clontech Lab，Inc，USA)中進(jìn)行長距離PCR反應(yīng)。然后對PCR產(chǎn)物克隆、測序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重復(fù)上述過程直至獲得全長。
(3)RT-PCR對于5’和3’端已知的序列，中間尚有一段間隙(gap)無法從已有的公共數(shù)據(jù)庫或自身數(shù)據(jù)庫獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5’端設(shè)計引物，3’端引物采用Oligo-dT，在腎上腺總RNA庫中進(jìn)行擴(kuò)增。然后對產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序。最后拼接并獲得全長。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的人hMnk2蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計引物R15’-CCGGACAGAAGATGGTGCAG-3’(SEQ ID NO.4)為正向引物，寡核苷酸R25’-CGGCATTGACAGTTGGTGTAAA-3’(SEQ ID NO.5)為反向引物，以腎上腺組織的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，R1/R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、59.5℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得目的片段長度為1473bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序，獲得如SEQ ID NO.6所示的序列。
實(shí)施例2hMnk2基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的人hMnk2全長cDNA(GenBank Accession No.AF125532。因申請保密，故在本申請之前未對公眾公開)的長度為1473bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.6，其中開放讀框位于12-1253位核苷酸。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出hMnk2的氨基酸序列，共414個氨基酸殘基，分子量46725.28，pI為5.99。詳細(xì)序列見SEQ ID NO.7。
將hMnk2的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)，用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與人、小鼠以及非洲爪蟾中的Mnk蛋白基因都存在較高的同源性。在核苷酸水平上，它與小鼠Mnk2基因的mRNA全編碼序列(GenBank Accession No.Y11092)的2-1106位堿基有87.6％的相同性(圖1)。在氨基酸水平上，它與Mnk蛋白都具有較高的同源性，與小鼠Mnk2蛋白有96.4％相同性(圖2)。因而可以確定本發(fā)明的hMnk2是一種人的促分裂原活化蛋白酶相關(guān)蛋白激酶。
本發(fā)明的人hMnk2除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人hMnk2還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人hMnk2的N端與小鼠的Mnk2的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人hMnk2的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
實(shí)施例3hMnk2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究1.將hMnk2蛋白的氨基酸序列在PROSITE數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為http//www.motif.genome.ad.jp/motif-bin/)中檢索基序(motif)，得到以下結(jié)果 351 RDAKQRLSAA QVLQHPWVQG CAPENTLPTP MVLQRWDSHF LLPPHPCRIH
(1)在氨基酸序列中，存在以下功能基序(i)下劃線區(qū)(39..44 165..170 232..237 300..305 405..410)為酰氨化位點(diǎn)(amidarion site)；(ii)粗體區(qū)(15..17 43..45 76..78)為蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(Protein kinase Cphosphorylation site)；(iii)斜體區(qū)(106..109 191..194 243..246 270..273 321..324 411..414)為酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(Casein kinase II phosphorylation site)；(iv)粗斜體區(qū)(128..134)為酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(Tyrosine kinasephosphorylation site)；(v)波浪線區(qū)(90..113)為蛋白激酶ATP特征結(jié)合區(qū)域(Protein kinases ATP-bindingregion signature)；(vi)雙線區(qū)(201..213)為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶特征活化位點(diǎn)(Serine/Threonineprotein kinases active-site signature)。
(2)功能分析位點(diǎn)(1)-(4)與翻譯后修飾(post-translational modifications)有關(guān)，是對hMnk2活性進(jìn)行調(diào)控的位點(diǎn)，可以調(diào)節(jié)其活性實(shí)現(xiàn)其生理功能；位點(diǎn)(5)為ATP結(jié)合區(qū)域，ATP為催化反應(yīng)提供能量是該酶催化活性得以實(shí)現(xiàn)所必需；位點(diǎn)(6)為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶特征活化位點(diǎn)，即MAP對其進(jìn)行作用的位點(diǎn)?？偟幕虻慕Y(jié)果說明本發(fā)明所涉及的hMnk2為MAP蛋白的一個下游相關(guān)調(diào)控蛋白。
2.將hMnk2氨基酸序列在模型(pattern)數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為www.isrec-isb-sib.ch)中檢索得到以下結(jié)果1 MVQKKPAELQ GFHRSFKGQN PFELAFSLDQ PDHGDSDFGL QCSARPDMPA 401 VRPGGLVRTV TVNE(1)在氨基酸序列中，存在以下功能結(jié)構(gòu)域(i)斜體區(qū)(84..368)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(Protein kinase domain profile)；
(ii)粗體區(qū)(83..368)真核生物蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(Eukaryotic protein kinasedomain)；(iii)波浪線區(qū)(181..236)酪氨酸蛋白激酶特異性活化位點(diǎn)(Tyrosine proteinkinases specific active-site signature)；(iv)下劃線區(qū)(90..113)蛋白激酶ATP特征結(jié)合區(qū)域(Protein kinasesATP-binding region signature)；(v)雙下劃線區(qū)(201..213)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶特異活化位點(diǎn)(Serine/Threonine protein kinases active-site signature)。
(2)結(jié)構(gòu)分析結(jié)構(gòu)域(i)、(ii)和(iv)說明了本發(fā)明涉及的人hMnk2具有作為蛋白激酶的生理功能；結(jié)構(gòu)域(iii)、(v)為上游蛋白激酶的作用位點(diǎn)，說明了hMnk2具有MAP激酶下游調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)，因而具有其功能。
綜上所述，從hMnk2蛋白的結(jié)構(gòu)和理化特性進(jìn)一步證實(shí)了該基因是Mnk基因家族的成員。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定了功能特異性的生物化學(xué)原理，因此本發(fā)明的人hMnk2基因具有與其它Mnk蛋白基因相似或相同的功能。
實(shí)施例4hMnk2基因的組織表達(dá)譜電子Northern表達(dá)譜。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem BiophysRes Commun 1997 Dec 18；241(2)589-594；Hwang DM，et al.，Circulation 1997Dec 16；96(12)4146-4203)，將hMnk2 cDNA序列在GCG軟件包中的dbEST數(shù)據(jù)庫中做BLAST檢索，在得到的人類EST中，概率值<10e-10、相同性>95％的EST有21個，可視為該基因在組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)本，由此得出表達(dá)該基因的組織譜，發(fā)現(xiàn)其在胸腺、B細(xì)胞生發(fā)中心、松果體、心臟、肺、胰腺、胚胎、神經(jīng)上皮、子宮、睪丸、腎、淋巴瘤、卵巢瘤、腺癌和類癌瘤細(xì)胞中均有表達(dá)。這表明這種蛋白在人體許多組織中都發(fā)揮著重要作用。
實(shí)施例5hMnk2多肽的制備和提純在該實(shí)施例中，將全長的hMnk2編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。
hMnk2蛋白或多肽可以以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。
(a)原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)人hMnk2的全長編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應(yīng)于編碼序列5’和3’端的約20個以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將hMnk2基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選鑒定得到含有pGEX-2T-hMnk2表達(dá)載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-hMnk2。
(b)表達(dá)GST-hMnk2重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-hMnk2工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時，至OD600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時。取培養(yǎng)時間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000轉(zhuǎn)離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時間增加而增加的菌株即為表達(dá)GST-hRab18融合蛋白的工程菌。
(c)GST-hRab18融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GST-hRab18融合表達(dá)蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-hRab18。誘導(dǎo)后的細(xì)菌離心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細(xì)菌，超聲破碎細(xì)菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結(jié)合30分鐘，10000rpm/min離心10分鐘沉淀結(jié)合了GST-hRab18的谷胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm/min離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復(fù)洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在約47kDa處的條帶即為hMnk2蛋白。
實(shí)施例6hMnk2蛋白或多肽在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)
1.hMnk2桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞株根據(jù)人hMnk2的全長編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將hMnk2 cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達(dá)載體3μg，野生型線性桿狀病毒DNA(BaculoGoldTMACMNPV DNA，Pharmingen，SanDiego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無血清的昆蟲培養(yǎng)基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲細(xì)胞懸液于60mm組織培養(yǎng)板中，貼壁1小時后換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，室溫孵育15分鐘后棄培養(yǎng)基，加入前面制備好的DNA載體轉(zhuǎn)染混合物，Parafilm密封培養(yǎng)板，于室溫27℃振搖培養(yǎng)4小時，而后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，收集上清備用。
2.轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體的昆蟲細(xì)胞株的篩選鑒定轉(zhuǎn)染3天后的昆蟲細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(2×106/1ml)，取1ml細(xì)胞懸液置于60mm組織培養(yǎng)皿中，加入3ml培養(yǎng)基，100μl收集的培養(yǎng)上清，貼壁1小時，棄2ml培養(yǎng)基，繼續(xù)室溫培養(yǎng)1小時，棄去所有的培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的含20μl4％X-gal的3ml半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-7天后挑取白色細(xì)胞克隆于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆蟲細(xì)胞。
收集感染的細(xì)胞進(jìn)行Western鑒定。將細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的Multiphor II半干電轉(zhuǎn)移儀中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時，而后于抗hMnk2的抗體溶液中封閉1小時，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標(biāo)記的抗hMnk2一抗的第二抗體溶液中振搖1小時，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物反應(yīng)30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達(dá)hMnk2的Sf9細(xì)胞克隆。
3.hMnk2蛋白的提取純化用高表達(dá)hMnk2的Sf9細(xì)胞克隆的上清大量感染Sf9細(xì)胞，感染48小時后收集細(xì)胞，PBS洗滌。每2×108細(xì)胞加入20ml細(xì)胞裂解液(0.5％Triton X-100，20mM Na3PO4(磷酸鈉，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na3VO4(釩酸鈉)，1mM Pefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細(xì)胞，12000×g離心20min去除細(xì)胞碎片，上清按每2×108的細(xì)胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小時。而后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次，用含20mM N，N’-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測提取的hMnk2蛋白的純度。在約47kDa處的條帶即為hMnk2蛋白。
實(shí)施例7抗人hMnk2抗體的制備1.免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備將實(shí)施例5和6中獲得的人hMnk2重組蛋白分子用層析法進(jìn)行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強(qiáng)免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾細(xì)胞制備見鄂征主編，《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》，北京出版社，第210頁。
2.按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第211頁中的方法，制備飼養(yǎng)細(xì)胞。
3.按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第213頁中的方法，進(jìn)行細(xì)胞融合。
4.抗體的檢測在細(xì)胞融合10-15天后，需逐孔進(jìn)行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細(xì)胞集落生長，就應(yīng)用hMnk2蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗(yàn)、發(fā)射免疫試驗(yàn)(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進(jìn)行克隆培養(yǎng)，并分離出抗體。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>人hMnk2基因序列、其編碼蛋白及制備方法<130>NP-1936<160>7<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA ACTAGTCTCG AGTTTTTTTT TTTTTTTTTT50<210>2<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>接頭序列
<400>2AATTCGGCAC GAG13<210>3<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>接頭序列<400>3GCCGTGCTC 9<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4CCGGACAGAA GATGGTGCAG20
<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5CGGCATTGAC AGTTGGTGTA AA22<210>6<211>1473<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(12)..(1253)<400>61 CCGGACAGAA GATGGTGCAG AAGAAACCAG CCGAACTTCA GGGTTTCCAC51 CGTTCGTTCA AGGGGCAGAA CCCCTTCGAG CTGGCCTTCT CCCTAGACCA101 GCCCGACCAC GGAGACTCTG ACTTTGGCCT GCAGTGCTCA GCCCGCCCTG151 ACATGCCCGC CAGCCAGCCC ATTGACATCC CGGACGCCAA GAAGAGGGGC201 AAGAAGAAGA AGCGCGGCCG GGCCACCGAC AGCTTCTCGG GCAGGTTTGA251 AGACGTCTAC CAGCTGCAGG AAGATGTGCT GGGGGAGGGC GCTCATGCCC301 GAGTGCAGAC CTGCATCAAC CTGATCACCA GCCAGGAGTA CGCCGTCAAG
351 ATCATTGAGA AGCAGCCAGG CCACATTCGG AGCAGGGTTT TCAGGGAGGT401 GGAGATGCTG TACCAGTGCC AGGGACACAG GAACGTCCTA GAGCTGATTG451 AGTTCTTCGA GGAGGAGGAC CGCTTCTACC TGGTGTTTGA GAAGATGCGG501 GGAGGCTCCA TCCTGAGCCA CATCCACAAG CGCCGGCACT TCAACGAGCT551 GGAGGCCAGC GTGGTGGTGC AGGACGTGGC CAGCGCCTTG GACTTTCTGC601 ATAACAAAGG CATCGCCCAC AGGGACCTAA AGCCGGAAAA CATCCTCTGT651 GAGCACCCCA ACCAGGTCTC CCCCGTGAAG ATCTGTGACT TCGACCTGGG701 CAGCGGCATC AAACTCAACG GGGACTGCTC CCCTATCTCC ACCCCGGAGC751 TGCTCACTCC GTGCGGCTCG GCGGAGTACA TGGCCCCGGA GTTAGTGGAG801 GCCTTCAGCG AGGAGGCTAG CATCTACGAC AAGCGCTGCG ACCTGTGGAG851 CCTGGGCGTC ATCTTGTATA TCCTACTCAG CGGCTACCCG CCCTTCGTGG901 GCCGCTGTGG CAGCGACTGC GGCTGGGACC GCGGCGAGGC CTGCCCTGCC951 TGCCAGAACA TGCTGTTTGA GAGCATCCAG GAGGGCAAGT ACGAGTTCCC1001 CGACAAGGAC TGGGCCCACA TCTCCTGCGC TGCCAAAGAC CTCATCTCCA1051 AGCTGCTGGT CCGTGACGCC AAGCAGAGGC TGAGTGCCGC CCAAGTCCTG1101 CAACACCCCT GGGTTCAGGG GTGCGCCCCG GAGAACACCT TGCCCACTCC1151 CATGGTCCTG CAGAGGTGGG ACAGTCACTT CCTCCTCCCT CCCCACCCCT1201 GTCGCATCCA CGTGCGACCT GGAGGACTGG TCAGAACCGT TACTGTGAAT1251 GAGTGAAGAT CCTGGAGGAC CCTGGCCCCA GGCCAGCTCC CATCGCTGGG1301 GGACGGTGAA CGGCCATGTG TTAATGTTAC GATGTTTTTA AAAGACAAAA1351 AAAAAAAAAA AACCTCAAAA GTTTTTTTAA AGTGGGGGAA AAACATCCAA1401 GCACTTTAAT TCCAATGTAC CAGGTGAACT GACGGAGCTC AGAAGTTTTC1451 CTTTACACCA ACTGTCAATG CCG<210>7<211>414<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>7
1 MVQKKPAELQ GFHRSFKGQN PFELAFSLDQ PDHGDSDFGL QCSARPDMPA51 SQPIDIPDAK KRGKKKKRGR ATDSFSGRFE DVYQLQEDVL GEGAHARVQT101 CINLITSQEY AVKIIEKQPG HIRSRVFREV EMLYQCQGHR NVLELIEFFE151 EEDRFYLVFE KMRGGSILSH IHKRRHFNEL EASVVVQDVA SALDFLHNKG201 IAHRDLKPEN ILCEHPNQVS PVKICDFDLG SGIKLNGDCS PISTPELLTP251 CGSAEYMAPE LVEAFSEEAS IYDKRCDLWS LGVILYILLS GYPPFVGRCG301 SDCGWDRGEA CPACQNMLFE SIQEGKYEFP DKDWAHISCA AKDLISKLLV351 RDAKQRLSAA QVLQHPWVQG CAPENTLPTP MVLQRWDSHF LLPPHPCRIH401 VRPGGLVRTV TVNE
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hMnk2蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第12-1253位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第12-1253位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示序列的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第12-1253位的核苷酸序列。
4.一種分離出的人hMnk2蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞由權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化而成。
8.一種產(chǎn)生具有人hMnk2蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(1)將編碼具有人hMnk2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hMnk2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第12-1253位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hMnk2蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hMnk2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hMnk2蛋白活性的多肽。
9.一種抗體，其特征在于，所述抗體能與權(quán)利要求4所述的人hMnk2蛋白多肽特異性結(jié)合。
10.一種探針分子，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在人體正常腎上腺組織中表達(dá)的新的人促分裂原活化蛋白激酶相關(guān)蛋白激酶(MAP kinase－interacting kinase 2，簡稱hMnk2)的基因序列及其編碼蛋白，本發(fā)明還公開了該蛋白和核酸序列的制備方法，以及制備與所述的人hMnk2蛋白特異性結(jié)合的抗體。此外，本發(fā)明還公開了在樣品中檢測hMnk2核酸序列和多肽的方法。本發(fā)明的人hMnk2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人hMnk2缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
文檔編號C12P21/02GK1920026SQ200510029048
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日
發(fā)明者韓澤廣, 黃健 申請人:上海人類基因組研究中心