專利名稱：一種分泌型畢赤酵母菌株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程菌和微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種表達(dá)D-氨基酸氧化酶的分泌型畢赤酵母菌株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAO，EC 1.4.3.3)是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔基的典型黃素蛋白酶類，它催化D型氨基酸氧化脫氨反應(yīng)生成相應(yīng)的酮酸和氨，并伴隨著一分子氧還原，而釋放出過(guò)氧化氫。在兩步酶法生產(chǎn)7-氨基酸頭孢烷酸(7-ACA)工藝中，DAO用于轉(zhuǎn)化頭孢菌素C(CPC)的第一步反應(yīng)。
巴斯德畢赤酵母已經(jīng)成為一種主要的真核微生物表達(dá)系統(tǒng)(Cregg JM.，Vedvick TS.，Raschke WC.Bio/Technology.11905-910，1993)。畢赤酵母可以高密度發(fā)酵，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中整合質(zhì)粒常用的啟動(dòng)子是醇氧化酶啟動(dòng)子(Alcohol oxidasel promoter，PAOX1)和三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，PGAP)。
甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母菌株能夠表達(dá)三角酵母來(lái)源的DAO(Yu J，Yang S，Yuan ZY.J.Mol.Catal B-Enzym.18291-297，2002)，但是誘導(dǎo)型畢赤酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中，需要添加甲醇誘導(dǎo)，而且發(fā)酵過(guò)程中條件控制比較復(fù)雜；而產(chǎn)物的提取需要先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，因此也有必要進(jìn)一步加以改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有表達(dá)D-氨基酸氧化酶(DAO)的甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母菌的上述缺點(diǎn)和不足，從而提供一種表達(dá)DAO的分泌型畢赤酵母基因工程菌株。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種表達(dá)DAO的分泌型畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的表達(dá)DAO的分泌型畢赤酵母菌株轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pMMWY01，該重組質(zhì)粒以三磷酸甘油醛脫氫酶基因?yàn)閱?dòng)子，并含有D-氨基酸氧化酶基因和ZeocinTM抗性基因。
本發(fā)明的分泌型畢赤酵母重組菌株的構(gòu)建方法包括以下步驟A、PCR擴(kuò)增HDAO片段，割膠回收帶有組氨酸純化標(biāo)簽的DAO基因(HDAO)片段；HDAO基因片段與pGEM-T載體用T4連接酶連接后得到重組質(zhì)粒pMMWY。質(zhì)粒pMMWY用PstI酶切，割膠回收HDAO基因片段。
B、畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZαB含有釀酒酵母來(lái)源的信號(hào)肽(Saccharomyces cerevisiaeα-Factor Secretion Signal)，載體pGAPZαB用PstI單酶切，乙醇沉淀回收線性化載體片段，用T4連接酶連接pGAPZαB線性化片段和HDAO基因片段，得到重組質(zhì)粒pMMWY01。
C、將重組質(zhì)粒pMMWY01電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母宿主菌中，構(gòu)建成表達(dá)D-氨基酸氧化酶的分泌型畢赤酵母重組菌株。
與現(xiàn)有技術(shù)中已知的DAO生產(chǎn)菌株相比，本發(fā)明的帶組氨酸標(biāo)簽的重組DAO的表達(dá)菌株在培養(yǎng)過(guò)程中能夠分泌重組D-氨基酸氧化酶，與胞內(nèi)表達(dá)D-氨基酸氧化酶的重組菌株相比較，免除了細(xì)胞破碎步驟。
本發(fā)明中新構(gòu)建的分泌型重組畢赤酵母菌株，借助釀酒酵母來(lái)源的信號(hào)肽分泌表達(dá)重組D-氨基酸氧化酶，免除了細(xì)胞破碎步驟。利用蛋白質(zhì)工程在DAO基因的N端加上了6個(gè)組氨酸，我們稱為組氨酸純化標(biāo)簽，利用金屬螯合親和層析一步法純化就可以去除雜酶，簡(jiǎn)化了目的蛋白質(zhì)提純工藝。


圖1為在畢赤酵母中分泌表達(dá)三角酵母DAO的重組整合質(zhì)粒pMMWY01構(gòu)建流程圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。
以下實(shí)施例中，DNA片段連接、質(zhì)粒的制備，化學(xué)轉(zhuǎn)化法和克隆均參照分子克隆(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.P.，Maniatis，T.(2001)“Molecular CloningA Laboratory Manual3rd ed，”Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)DAO的分泌型巴斯德畢赤酵母菌株MMWY01已于2005年8月9日提交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號(hào)為CCTCC M 205089。
實(shí)施例1、質(zhì)粒構(gòu)建1、材料質(zhì)粒pGEM-TPromega公司產(chǎn)品，大小為3.0kb，含有氨芐青霉素抗性基因。
質(zhì)粒pGAPZαBInvitrogen公司產(chǎn)品，大小為3.1kb，含有Zeocin抗性基因，啟動(dòng)子是三磷酸甘油醛脫氫酶基因。
質(zhì)粒pLHB-3按照Liu HB.等(Liu HB.，Jiang WH.，Yang YL.Cloning，Sequencing andExpression of D-amino acid oxidase gene.Chinese Journal of Biotechnology 15337-342，1999)的方法構(gòu)建，大小為6.4kb，含有帶組氨酸純化標(biāo)簽的DAO基因(HDAO)，卡那霉素抗性基因，啟動(dòng)子是T7lac，且?guī)в薪M氨酸純化標(biāo)簽。
2、方法如圖1所示，以質(zhì)粒pLHB-3為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增HDAO基因的一對(duì)引物如下上游引物5’-AA CA ATGGCTAAAATCGTTGTT-3’；下游引物5’-CTAAAGGTTTGGTCGAGTAAG-3’。
擴(kuò)增條件為94℃，30s，56℃，30s，72℃，1min，30個(gè)循環(huán)。
PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收得到約1.1kb大小HDAO基因片段；HDAO基因片段與pGEM-T載體用T4連接酶連接后得到重組質(zhì)粒pMMWY。質(zhì)粒pMMWY用Pst I酶切，割膠回收約1.1kb大小HDAO基因片段；表達(dá)載體pGAPZαB用Pst I酶切線性化。T4連接酶連接上述兩個(gè)基因片段得到重組質(zhì)粒pMMWY01，該重組質(zhì)粒的啟動(dòng)子是三磷酸甘油醛脫氫酶基因，含有HDAO基因和Zeocin抗性基因。
實(shí)施例2、質(zhì)粒擴(kuò)增實(shí)施例1得到的質(zhì)粒pMMWY01采用常規(guī)的化學(xué)轉(zhuǎn)化法《參考分子克隆》轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌DH5α(Takara)，挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％氯化鈉)中，在37℃培養(yǎng)擴(kuò)增pMMWY01質(zhì)粒。
實(shí)施例3、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化重組大腸桿菌在LB培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)后，參照《分子克隆》用堿裂解法從大腸桿菌抽提重組質(zhì)粒pMMWY01，抽提的質(zhì)粒pMMWY01再用Bln I酶切線性化，乙醇沉淀回收線性化重組質(zhì)粒約10μg，然后將線性化質(zhì)粒與畢赤酵母宿主菌GS115(his-mut+)感受態(tài)細(xì)胞80μl混合放于電轉(zhuǎn)化杯，同時(shí)準(zhǔn)備一份不添加線性化質(zhì)粒pMMZY03的感受態(tài)細(xì)胞作為陰性對(duì)照，冰浴放置5min。采用Bio-rad電轉(zhuǎn)化儀，電轉(zhuǎn)化參數(shù)設(shè)置是1.5KV，25μF，200Ω，電擊時(shí)間是4.6ms，電擊轉(zhuǎn)化后立即加人1ml冰浴的山梨醇。電擊轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂在含有100μg/ml ZeocinTM的YPDS(2％蛋白胨，1％酵母膏，2％葡萄糖，1M山梨醇，2％瓊脂粉)平板上，放置28℃培養(yǎng)，2～3天后YPDS平板上長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子。
實(shí)施例4、轉(zhuǎn)化子篩選從YPDS平板上挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化子接種至YPD培養(yǎng)基(2％蛋白胨，1％酵母膏，2％葡萄糖)中，200rpm搖床培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵至24h時(shí)取發(fā)酵液樣品測(cè)定DAO活力。
一個(gè)酶活力單位(U)的DAO定義37℃，pH8.5條件下，每分鐘氧化脫氨生成1μmol酮酸所需的酶量。
采用比色法測(cè)定DAO活力(Nilsson.K.，Mosbach.K.，Appl.Biochem.Biotechnol.，6293-308，1981)，具體如下所取發(fā)酵液樣品經(jīng)離心后取上清，加入用0.1mol/L、pH8.0的焦磷酸鈉緩沖液配制的50mmol/L DL-甲硫氨酸溶液，在37℃浴中振蕩反應(yīng)30min，加入10％的三氯乙酸終止反應(yīng)。將終止液稀釋10倍后加入0.2％的2，4-二硝基苯肼飽和溶液，混勻靜置10min。加入3mol/L的NaOH溶液，混勻后靜置15min，離心后測(cè)定OD550值。
按照上述方法測(cè)定10個(gè)轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵液在24h時(shí)的DAO活力，結(jié)果如表1所示表1、DAO活力測(cè)定

上述結(jié)果是測(cè)定發(fā)酵上清液而得到，可見(jiàn)本發(fā)明的表達(dá)DAO的重組菌株是將DAO分泌到培養(yǎng)基中，因而是一種分泌型的表達(dá)菌株。
通過(guò)上述測(cè)定DAO活力的方法篩選出DAO表達(dá)最高的重組菌株，命名為MMWY01。該菌株并已于2005年8月9日提交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號(hào)為CCTCC M 205089。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)D-氨基酸氧化酶的分泌型畢赤酵母重組菌株，其特征在于，所述菌株轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pMMWY01，該重組質(zhì)粒以三磷酸甘油醛脫氫酶基因?yàn)閱?dòng)子，并含有D-氨基酸氧化酶基因和ZeocinTM抗性基因。
2.如權(quán)利要求1所述的分泌型畢赤酵母重組菌株，其特征在于，所述重組質(zhì)粒pMMWY01還帶有組氨酸標(biāo)簽。
3.如權(quán)利要求1或2所述的分泌型畢赤酵母重組菌株，其特征在于，所述菌株的保藏號(hào)CCTCC M 205089。
4.一種分泌型畢赤酵母重組菌株的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟A、PCR擴(kuò)增帶有組氨酸純化標(biāo)簽的D-氨基酸氧化酶基因片段，擴(kuò)增的基因片段與pGEM-T載體連接后得到重組質(zhì)粒pMMWY，質(zhì)粒pMMWY用PstI酶切后回收帶有組氨酸純化標(biāo)簽的D-氨基酸氧化酶基因片段；B、表達(dá)載體pGAPZαB用PstI酶切線性化后用連接酶與帶有組氨酸純化標(biāo)簽的D-氨基酸氧化酶基因片段相連接，得到重組質(zhì)粒pMMWY01。C、將重組質(zhì)粒pMMWY01電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母宿主菌中，構(gòu)建成表達(dá)D-氨基酸氧化酶的分泌型畢赤酵母重組菌株。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟A和B中所使用的連接酶為T4連接酶。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在將重組質(zhì)粒pMMWY01電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母宿主菌前還包括將重組質(zhì)粒pMMWY01導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。
7.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒以三磷酸甘油醛脫氫酶基因?yàn)閱?dòng)子，并含有D-氨基酸氧化酶基因和ZeocinTM抗性基因。
8.如權(quán)利要求7所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒還帶有組氨酸純化標(biāo)簽。
全文摘要
本發(fā)明構(gòu)建了一種新的分泌型畢赤酵母表達(dá)載體用于表達(dá)帶組氨酸標(biāo)簽的重組D－氨基酸氧化酶。工程菌培養(yǎng)過(guò)程中能夠分泌重組D－氨基酸氧化酶，與胞內(nèi)表達(dá)D－氨基酸氧化酶的重組菌株相比較，免除了細(xì)胞破碎步驟。利用蛋白質(zhì)工程在DAO基因的N端加上了6個(gè)組氨酸，利用金屬螯合親和層析一步法純化就可以去除雜酶，簡(jiǎn)化了目的蛋白質(zhì)提純工藝。
文檔編號(hào)C12R1/84GK1757708SQ20051002875
公開日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2005年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月12日
發(fā)明者楊晟, 鄭華寶, 王筱蘭, 陳軍, 楊蘊(yùn)劉, 姜衛(wèi)紅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院