專利名稱：一種抗關(guān)節(jié)炎藥物細(xì)胞靶標(biāo)篩選系統(tǒng)及篩藥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種抗關(guān)節(jié)炎藥物篩選的新方法，更具體地說(shuō)涉及到化合物對(duì)酶mPGES-1promoter表達(dá)的特異性抑制來(lái)評(píng)價(jià)該化合物是否有希望發(fā)展成為新型抗關(guān)節(jié)炎藥物。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的慢性累及關(guān)節(jié)的炎癥性疾病，即病變損害的部位是人體的關(guān)節(jié)，關(guān)節(jié)有紅、腫、熱、痛，功能障礙的炎癥表現(xiàn)，或病理上構(gòu)成關(guān)節(jié)的各組織有變質(zhì)、滲出、增生性改變。最常見(jiàn)的是骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎兩種，我國(guó)目前關(guān)節(jié)炎患者估計(jì)有1億以上，且人數(shù)還在不斷增加。
關(guān)節(jié)炎患者炎癥發(fā)生時(shí)，細(xì)胞膜上的磷脂在磷脂酶A2的催化下釋放花生四烯酸(AA)，AA隨之在環(huán)氧化酶(COX)作用下生成PGG2/PGH2，PGH2在不同酶的催化下產(chǎn)生前列腺素類物質(zhì)和血栓烷(TXA2)，如在前列腺素E合成酶(PGES)作用下生成PGE2。其中，PGE2是主要的炎癥介質(zhì)，參與炎癥、發(fā)熱、疼痛反應(yīng)，參與骨吸收和癌癥；而PGD2、PGF2α為抗炎性前列腺素。TXA2是由血小板產(chǎn)生，有使血小板聚集和血管收縮的作用。PGI2在血管內(nèi)皮細(xì)胞組成性表達(dá)，PGI2/TXA2的平衡對(duì)維持心血管安全方面起著重要作用。環(huán)氧化酶(COX)催化AA生成PGG2/PGH2，主要有兩種COX-1和COX-2。COX-1是組成性酶，結(jié)構(gòu)性表達(dá)于幾乎所有組織中，維持胃、腎、血小板等組織器官的生理功能。COX-2為誘導(dǎo)酶，炎癥反應(yīng)時(shí)受炎癥因子刺激在炎癥組織大量表達(dá)，促進(jìn)PGE2的大量生成而參與炎癥反應(yīng)。對(duì)COX的認(rèn)識(shí)產(chǎn)生目前治療RA的一大類藥物非甾體抗炎免疫藥(NSAIDs)。以對(duì)COX的抑制活性分為三類，非特異性抑制COX活性的NSAID，如阿司匹林、吲哚美辛、奇諾力、氟滅酸、扶他林、布洛芬、芬必得等；傾向性COX-2抑制劑，如尼美舒利、美羅昔康、氯諾昔康；特異性COX-2抑制劑，如Celecoxib(塞來(lái)昔布)、Rofecoxib(羅非昔布)、Valdecoxib(伐地昔布)，特異性COX-2抑制劑減輕了COX-1被抑制引起的胃腸道等不良反應(yīng)，但由于COX-2在內(nèi)皮細(xì)胞、前列腺、肺等器官以及正常腎臟皮質(zhì)的致密斑及髓質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)，特異性COX-2抑制劑有延緩潰瘍面的愈合，引起腎臟的不良反應(yīng)，增加血栓形成的危險(xiǎn)，增加氣喘病人支氣管哮喘的可能性。最近，Rofecoxib(羅非昔布)、Valdecoxib(伐地昔布)即因?yàn)樵黾硬∪诵难馨l(fā)病的幾率而相繼被廠家和FDA召回，同時(shí)FDA發(fā)布所有非甾體抗炎免疫藥的最新用藥指導(dǎo)，就如何使用NSAIDs發(fā)表了聲明，綜合現(xiàn)有數(shù)據(jù)，所有NSAIDs均有潛在的心血管危險(xiǎn)。
前列腺素E合成酶(PGES)是PGE2生物合成過(guò)程的末端限速酶，催化環(huán)氧合酶的產(chǎn)物PGH2轉(zhuǎn)化成PGE2，根據(jù)PGES在細(xì)胞中的定位和對(duì)谷胱甘肽的依賴性，可將PGES分為三種cPGES、mPGES-1和mPGES-2。(1)胞漿PGES(cPGES)，為谷胱甘肽依賴型的組成性酶，表達(dá)在多種組織和細(xì)胞中不受炎癥刺激因子的影響。cPGES的氨基酸序列與人的p23蛋白部分序列一致，是一23KD的伴侶分子，細(xì)胞中其活性的調(diào)節(jié)依賴于與hsp90的結(jié)合，催化COX-1來(lái)源的PGH2轉(zhuǎn)化為PGE2；(2)mPGES-1為一16KD的膜結(jié)合蛋白，與微粒體GSH-S-轉(zhuǎn)移酶(MGST1)在氨基酸序列上有38％的同源性，以前命名為PIG12和MGST1-L1。廣泛分布于各種組織和細(xì)胞中，是GSH依賴型的誘導(dǎo)型酶。在體外可被誘導(dǎo)COX-2的促炎癥反應(yīng)因子所誘導(dǎo)，包括LPS、IL-1β和TNFα等，其高水平表達(dá)于肺癌A549、HeLa、結(jié)腸癌、子宮腺癌和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，中度表達(dá)在胎盤、前列腺、睪丸、乳腺、膀胱和腎臟中。IL-1β誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞、IL-1β或TNFα誘導(dǎo)人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞、TNFα或LPS誘導(dǎo)鼠腹膜巨噬細(xì)胞共同表達(dá)mPGES-1和COX-2，mPGES-1與誘導(dǎo)型的COX-2相偶聯(lián)，促進(jìn)后續(xù)PGE2的合成。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，mPGES-1主要于活動(dòng)期滑膜細(xì)胞，而在靜止期其表達(dá)幾乎不能檢出；另一方面，mPGES-2組成性表達(dá)，在活動(dòng)期和靜止期均能檢出，存在于滑膜細(xì)胞和滑膜組織。同mPGES-1+/+小鼠相比，mPGES-1-/-小鼠具有明顯降低炎癥效應(yīng)的作用。缺失mPGES-1的鼠腹腔細(xì)胞被LPS刺激時(shí)，失去產(chǎn)生PGE2的能力。在關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型AIA模型中，對(duì)mPGES-1、mPGES-2、cPGES/p23、PGI2、COX-1、COX-2表達(dá)的mRNA和蛋白水平分析表明，mPGES-1表達(dá)可增加50-80倍，類似于COX-2。mPGES-2在第1天到15天間下降2-3倍，cPGES和COX-1能被誘導(dǎo)，但水平遠(yuǎn)低于mPGES-1(僅2-6倍)。PGI2在第1天短暫升高，3天后到第25天之間PGIS mRNA表達(dá)下降3-9倍，說(shuō)明其在AIA慢性炎癥維持中發(fā)揮愈小的作用。(3)mPGES-2與mPGES-1不同，其是非GSH依賴型、組成型表達(dá)的酶，不被組織炎癥和損傷顯著誘導(dǎo)，但在人結(jié)腸癌中，表達(dá)有顯著增加。主要存在于大腦、心臟、脾臟、子宮、腎、肝及骨骼肌肉中，mPGES-2作為一高爾基體膜相關(guān)蛋白被合成，自動(dòng)切割其N端疏水區(qū)成為成熟蛋白分布在胞漿中，并有在核周邊聚集的趨勢(shì)?？赏ㄟ^(guò)COX-1和COX-2介導(dǎo)PGE2的產(chǎn)生，在組織體內(nèi)平衡和疾病中發(fā)揮作用。
因此開(kāi)發(fā)選擇性抑制mPGES-1表達(dá)或酶活性從而抑制PGE2生成的藥物將具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為了避免目前環(huán)氧化酶(COX-1、COX-2)抑制劑藥物的副作用，我們以COX-1和COX-2作為對(duì)照篩選的靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗關(guān)節(jié)炎藥物的細(xì)胞靶標(biāo)篩選系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一目的是提供應(yīng)用細(xì)胞靶標(biāo)篩選系統(tǒng)篩選抗關(guān)節(jié)炎藥物的方法。
本發(fā)明建立了一種抗關(guān)節(jié)炎藥物的細(xì)胞靶標(biāo)篩選系統(tǒng)及篩藥方法。本發(fā)明建立的細(xì)胞靶標(biāo)篩藥系統(tǒng)是運(yùn)用分子克隆技術(shù)，分別將mPGES-1 promoter、COX-1 promoter和COX-2promoter基因克隆進(jìn)pGL3BN載體Luciferase基因上游的克隆位點(diǎn)Xho I/Hind III、NheI/Xho I、Xho I/Bgl II之間，從而構(gòu)建重組載體pGL3BN/mPGES-1 promoter、pGL3BN/COX-1promoter、pGL3BN/COX-2 promoter，然后將重組質(zhì)粒pGL3BN/mPGES-1 promoter、pGL3BN/COX-1 promoter、pGL3BN/COX-2 promoter利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染人A549細(xì)胞株，運(yùn)用細(xì)胞克隆的有限稀釋法篩選得到基因水平上穩(wěn)定表達(dá)的篩藥細(xì)胞靶標(biāo)M1、M2和M3(mPGES-1 promoter的表達(dá)會(huì)啟動(dòng)其下游Luciferase的表達(dá)，也就是說(shuō)測(cè)定Luciferase表達(dá)的水平可以反映mPGES-1 promoter表達(dá)的程度，同理也適用于COX-1 promoter和COX-2promoter)，進(jìn)而共同組成細(xì)胞靶標(biāo)篩藥系統(tǒng)。
如上所述利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的詳細(xì)操作為將10ul脂質(zhì)體加入100ul不含血清和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)液混勻，共做三份(溶液A)；然后各取2ugpGL3BN/mPGES-1 promoter、pGL3BN/COX-1 promoter、pGL3BN/COX-2 promoter質(zhì)粒DNA分別加入100ul不含血清和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)液混勻(溶液B、C、D)。分別將溶液B、C、D與一份溶液A混合，室溫?cái)R置40分鐘，備用。轉(zhuǎn)染前一天，A549細(xì)胞以3×105數(shù)進(jìn)6孔培養(yǎng)板中的每一孔，加入1ml含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染時(shí)，用2ml RPMI 1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞一次，加入0.8ml RPMI 1640培養(yǎng)液入混合液，將三份混合液分別加于三孔細(xì)胞上，細(xì)胞與質(zhì)粒在培養(yǎng)箱中于5％ CO2和37℃條件下轉(zhuǎn)染24小時(shí)。將培養(yǎng)液換成正常培養(yǎng)液，即含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時(shí)，形成瞬轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將瞬轉(zhuǎn)染細(xì)胞以2000細(xì)胞/100mm平皿的細(xì)胞分布密度分進(jìn)培養(yǎng)皿，在含800ug/ml G418的RPMI 1640培養(yǎng)液中于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三周后可見(jiàn)細(xì)胞集落形成，用10ul槍頭挑取單個(gè)集落入48孔板擴(kuò)增培養(yǎng)。待單克隆細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板孔后，一部分細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，一部分細(xì)胞測(cè)定luciferase表達(dá)，luciferase表達(dá)達(dá)1000/1×105cell以上且10代以上傳代其表達(dá)無(wú)降低者，即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。由此方法篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株M1、M2和M3。
本發(fā)明所述的mPGES-1 promoter的基因序列為5’-cacagcttcattctctgacagttctggtggatgaagcctgaaatgggtctcacagggctaaaatcaaagtgtcgggagggctgcgttctgtctgaacgcagagagtttgtttcgtccccttttccagtttctagaggcccctggtattccttgggccatgatctctccttcatcttcaaggccagcaggttagcgtctctcctgtctgacccctattctgtcctttcatctcctctcttaatgctgcctctgtttttatatcttttctctaattttactgcctccctcttggaagggcccctctgtatactctgggctcacccagataaactaggataatttctcccatctcaaatccttacgaaatcccatgtgaaaagtcccttttgccacatagtcacagtcacgggttctagggattgggacatggatgtctttaggggtggagggcgtccttcagcctgccacagatggcaaagtcatgccattgtggctgcagctccattgtccaggctgagtgtgggggcgcatggcgtggttctcatgcccaccacctaccctgaccctgcggaggtgggcaggaggcagcgataatcaccacgtgcagaggtcctgccaggtgcccagcctcatcattccctagaaggcaggcaccaccacatgctcccacactgtagataaggaaacagctttgaaacagatttgaaagtgtttgaggatttgcctggaaggagggctccagagccagggactgggtccgggacacccggagactctctgcttcttggagctccggcaactgcttgtctttctcttcacaggagaagggggccctgctgccgctgccgtggggcggggcgtgggcggtgctggctgcaggaaggctctcccctcccactttgtgctttccctgcaggctgctcctctgtcgagctgatcacacccacagttgagct-3’本發(fā)明所述的COX-1 promoter的基因序列為5’-atgggaacaccttgggtgagaatgggggaggggcttcccgcaggtttcacctctcccacctggcataatttctaccctgcacccagtgatgcccaggagccagcacaagaacctctgagctctcctgccggctttccccactgtggggcccacaggatggctgggtgtgctggggaaactgagggagatgacttgtgggtgccagcaccatgggactttgggtgatcttggacctattccttcctccttctaggtgcttcctgagctggcgaaaaggagagctggatgctgggattctataaattcggcggtggatgtgagtctagctacagcatggaccctggccagccctggaatctgagttcagagatctttgaaaaaatgccttccgataactgagcacctactacatctggacactgcaccaggagatttgtgtgcattccctcattgaatcttacaccaccctctgggatggtttttgctattaagccgattttatagatgagaatactgagggctagaaaagataagtaccttgtccaaggtgacacggccagtaagctgtggagtctggatttgaactaggctctcttggagtttggagcccggtcttttcatttctggcagagacctgtggcttcagggggcggagccagccccatgggggaagtaagtccttcctgttagatctgtctgaggagtagtgagtttctcatctaggaaaccatcagcaggccaggctggactgccccatttctagccccctttcttctctgcagactgccctgtttctagccccttttcttctctacccttttctgtagagtgcgttagacccattttacagaaggggactctgagaccctttcttctctgcggggcagggtatgtggttcagacgagccgcttccatccccagttctgtccctaagccctgggtgacctcagcattgagcatcgtctctgagcctcagtttcctgtctatatctagtgccaccaggcatcagaaacgtaagtgcttcaaggatcttgggtgaaaagccgctttagcggcgagcatacactaattaattaaaatgccttggccggggctgggcagaggaagtaagcgggcagccgaggtgacagctggagggaggagcgggggtggagccgggggaagggtggggaggggatgggctggagctccgggcagtgtgcgaggcgcacgcacaggagcctgcactctgcgtcccgcaccccagcagccgcg-3’本發(fā)明所述的COX-2 promoter的基因序列為5’-attattaaattatcaaaaagaaaatgatccacgctcttagttgaaatttcatgtaagattccatgcaataaataggagtgccataaatggaatgatgaaatatgactagaggaggagaaaggcttcctagatgagatggaattttagtcatccgtgtctcatgaagaatcagatgtgtacactaagcaaaacagttaaaaaaaaaacctccaagtgagtctcttatttatttttttcttataagacttctacaaattgaggtacctggtgtagttttatttcaggttttatgctgtcattttcctgtaatgctaaggacttaggacataactgaattttctattttccacttcttttctggtgtgtgtgtatatatatatgtatatatacacacacacatatacatatatatattttttagtatctcaccctcacatgctcctccctgagcactacccatgatagatgttaaacaaaagcaaagatgaaattccagctgtcaaaatctcccttccatctaattaattcctcatccaactatgttccaaaacgagaatagaaaattagccccaataagcccaggcaactgaaaagtaaatgctatgttgtactttgatccatggtcacaactcataatcttggaaaagtggacagaaaagacaaaagagtgaactttaaaactcgaatttattttaccagtatctcctatgaagggctagtaaccaaaataatccacgcatcagggagagaaatgccttaaggcatacgttttggacatttagcgtccctgcaaattctggccatcgccgcttcctttgtccatcagaaggcaggaaactttatattggtgacccgtggagctcacattaactatttacagggtaactgcttaggaccagtattatgaggagaatttacctttcccgcctctctttccaagaaacaaggagggggtgaaggtacggagaacagtatttcttctgttgaaagcaacttagctacaaagataaattacagctatgtacactgaaggtagctatttcattccacaaaataagagttttttaaaaagctatgtatgtatgtgctgcatatagagcagatatacagcctattaagcgtcgtcactaaaacataaaacatgtcagcctttcttaaccttactcgccccagtctgtcccgacgtgacttcctcgaccctctaaagacgtacagaccagacacggcggcggcggcgggagaggggattccctgcgcccccggacctcagggccgctcagattcctggagaggaagccaagtgtccttctgccctcccccggtatcccatccaaggcgatcagtccagaactggctctcggaagcgctcgggcaaagactgcgaagaagaaaagacatctggcggaaacctgtgcgcctggggcggtggaactcggggaggagagggagggatcagacaggagagtggggactaccccctctgctcccaaattggggcagcttcctgggtttccgattttctcatttccgtgggtaaaaaaccctgcccccaccgggcttacgcaatttttttaaggggagaggagggaaaaatttgtggggggtacgaaaaggcggaaagaaacagtcatttcgtcacatgggcttggttttcagtcttataaaaaggaaggttctctcggttagcgaccaattgtcatacgacttgcagtgagcgtcaggagcacgtccaggaactcctcagcagcgcctccttcagctccacagccagacgccctcagacagcaaagcctacccccgcgccgcgccctgcccgccgctgcgatgctcgcccgcgccctgctgctgtgcgcggtcctggcg-3’被篩選化合物對(duì)mPGES-1 promoter表達(dá)的影響可通過(guò)其下游luciferase報(bào)告基因的表達(dá)水平來(lái)說(shuō)明，也就是說(shuō)被篩選化合物和M1細(xì)胞共同培養(yǎng)后通過(guò)測(cè)定M1細(xì)胞luciferase基因表達(dá)水平可反映被篩選化合物對(duì)mPGES-1 promoter表達(dá)的影響。同理通過(guò)測(cè)定M2、M3細(xì)胞luciferase基因表達(dá)水平可分別反映被篩選化合物對(duì)COX-1 promoter和COX-2promoter表達(dá)的影響。
通過(guò)測(cè)定被篩選化合物作用于M1細(xì)胞luciferase基因表達(dá)的降低來(lái)篩選抑制mPGES-1promoter表達(dá)的物質(zhì)；通過(guò)測(cè)定被篩選化合物作用于M2細(xì)胞luciferase基因表達(dá)的降低來(lái)篩選抑制COX-1 promoter表達(dá)的物質(zhì)；通過(guò)測(cè)定被篩選化合物作用于M3細(xì)胞luciferase基因表達(dá)的降低來(lái)篩選抑制COX-2 promoter表達(dá)的物質(zhì)。我們定義mPGES-1 promoter特異性抑制劑為對(duì)mPGES-1 promoter的抑制率大于40％而對(duì)COX-1 promoter和COX-2 promoter的抑制率均小于10％。通過(guò)篩選mPGES-1 promoter特異性抑制劑來(lái)篩選抗關(guān)節(jié)炎藥物。
本發(fā)明的另一目的提供了應(yīng)用上述細(xì)胞靶標(biāo)篩藥系統(tǒng)篩選抗關(guān)節(jié)炎藥物的方法，該方法包括以下步驟(1)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株M1、M2和M3，分別以5*104個(gè)/孔細(xì)胞接種于48孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)一天，吸去昨日的舊培養(yǎng)液，換上新培養(yǎng)液，體積200ul/孔。
(2)加被篩選物質(zhì)(不同來(lái)源的化合物或混合物)于細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)一天。
(3)吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.9％NaCl洗2遍。
(4)加入1×CCLR 100ul/孔覆蓋細(xì)胞。
(5)充分吹打細(xì)胞，將細(xì)胞碎片和液體轉(zhuǎn)入離心管，12,000×g離心5秒，將上清轉(zhuǎn)入新管中。
(6)將20ul細(xì)胞抽提液與100ul的Luciferase Assay Reagent(室溫平衡)用槍頭混勻。
(7)將管子放入Luminometer中，按Go鍵開(kāi)始檢測(cè)。
(8)樣品抑制率定義為(1-樣品的熒光值/對(duì)照的熒光值)×100％，樣品對(duì)M1細(xì)胞的抑制率大于40％且同時(shí)對(duì)M2和M3的抑制率小于10％為中選化合物。
本發(fā)明的細(xì)胞靶標(biāo)系統(tǒng)可用于篩選合成的單個(gè)或復(fù)合化合物，篩選植物提取的單個(gè)化合物或混合物，篩選各種微生物代謝產(chǎn)物中選擇性抑制mPGES-1的物質(zhì)從而達(dá)到抑制PGE2生成的目的。


圖1、建立由mPGES-1 promoter、COX-1 promoter和COX-2 promoter基因分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株組成的篩藥系統(tǒng)及測(cè)定Luciferase路線圖。
運(yùn)用分子克隆技術(shù)，分別將mPGES-1 promoter、COX-1 promoter和COX-2 promoter基因部分克隆進(jìn)pGL3BN載體Luciferase基因上游的克隆位點(diǎn)Xho I/Hind III、Nhe I/Xho I、Xho I/Bgl II之間，從而構(gòu)建重組載體pGL3BN/mPGES-1 promoter、pGL3BN/COX-1 promoter、pGL3BN/COX-2 promoter，然后將重組載體pGL3BN/mPGES-1 promoter、pGL3BN/COX-1promoter、pGL3BN/COX-2 promoter利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染人A549細(xì)胞株，運(yùn)用細(xì)胞克隆的有限稀釋法篩選得到基因水平上穩(wěn)定表達(dá)的篩藥細(xì)胞靶標(biāo)M1、M2和M3。
圖2、利用所建細(xì)胞靶標(biāo)篩藥系統(tǒng)對(duì)化合物CM188的篩選。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例(1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株M1、M2和M3分別以5*104個(gè)/孔細(xì)胞接種于48孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)一天，吸去昨日的舊培養(yǎng)液，換上新培養(yǎng)液，體積200ul/孔。
(2)分別加終濃度為0ug/ml、10ug/ml、30ug/ml、100ug/ml、300ug/ml的吲哚美辛、化合物CM188、CM123、槲皮素、次野尾素于細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)一天。吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.9％NaCl洗2遍。
(3)加入1×CCLR 100ul/孔覆蓋細(xì)胞。充分吹打細(xì)胞，將細(xì)胞碎片和液體轉(zhuǎn)入離心管，12,000×g離心5秒，將上清轉(zhuǎn)入新管中。
(4)將20ul細(xì)胞抽提液與100ul的Luciferase Assay Reagent(室溫平衡)用槍頭混勻。將管子放入Luminometer中，按Go鍵開(kāi)始檢測(cè)。
結(jié)果如下表所示，其中吲哚美辛、槲皮素、次野尾素對(duì)細(xì)胞M1的mPGES-1 promoter表達(dá)的抑制率均大于40％，但是吲哚美辛、次野尾素對(duì)M2細(xì)胞COX-1 promoter、M3細(xì)胞COX-2 promoter表達(dá)的抑制率也均大于10％；槲皮素雖然對(duì)M3細(xì)胞無(wú)抑制，但其對(duì)M2細(xì)胞抑制率遠(yuǎn)大于10％，故吲哚美辛、槲皮素、次野尾素均不符合中選化合物的定義，予以淘汰。而化合物CM188、CM123對(duì)細(xì)胞M1的mPGES-1 promoter表達(dá)的抑制率可達(dá)到68.16％和45.81％，對(duì)M2細(xì)胞COX-1 promoter表達(dá)的抑制率在篩藥濃度范圍內(nèi)最大為9.31％和3.55％，小于10％，對(duì)M3細(xì)胞COX-2 promoter的表達(dá)抑制率為8.67％或無(wú)抑制，符合我們對(duì)中選化合物的定義，故化合物CM188、CM123是特異性抑制mPGES-1 promoter表達(dá)的化合物，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的藥理藥效學(xué)的評(píng)價(jià)可有望發(fā)展成新的抗關(guān)節(jié)炎藥物。

注“-”表示無(wú)抑制作用，“×”表示不符合中選化合物的定義，“√”表示符合中選化合物的定義，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。
權(quán)利要求
1.一種抗關(guān)節(jié)炎藥物的細(xì)胞靶標(biāo)篩選系統(tǒng)由如下步驟組成a)將mPGES-1promoter、COX-1promoter和COX-2promoter的部分基因克隆進(jìn)pGL3BN載體Luciferase基因上游的克隆位點(diǎn)Xho I/Hind III、Nhe I/Xho I、Xho I/BglII之間重組載體pGL3BN/mPGES-1promoter、pGL3BN/COX-1promoter、pGL3BN/COX-2promoter；b)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pGL3BN/mPGES-1promoter、pGL3BN/COX-1promoter、pGL3BN/COX-2promoter利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染人A549細(xì)胞株；c)利用有限稀釋法篩選得到基因水平上穩(wěn)定表達(dá)的篩藥細(xì)胞靶標(biāo)M1、M2和M3；d)mPGES-1promoter的表達(dá)啟動(dòng)其下游Luciferase的表達(dá)。以Luciferase表達(dá)水平反映mPGES-1promoter表達(dá)程度。同理適用COX-1promoter及COX-2promoter組成共同的靶標(biāo)篩選系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗關(guān)節(jié)炎藥物的細(xì)胞靶標(biāo)篩選系統(tǒng)，其特征在于mPGES-1promoter、COX-1promoter和COX-2promoter的部分基因序列為mPGES-1promoter基因序列為5’-cacagcttcattctctgacagttctggtggatgaagcctgaaatgggtctcacagggctaaaatcaaagtgtcgggagggctgcgttctgtctgaacgcagagagtttgtttcgtccccttttccagtttctagaggcccctggtattccttgggccatgatctctccttcatcttcaaggccagcaggttagcgtctctcctgtctgacccctattctgtcctttcatctcctctcttaatgctgcctctgtttttatatcttttctctaattttactgcctccctcttggaagggcccctctgtatactctgggctcacccagataaactaggataatttctcccatctcaaatccttacgaaatcccatgtgaaaagtcccttttgccacatagtcacagtcacgggttctagggattgggacatggatgtctttaggggtggagggcgtccttcagcctgccacagatggcaaagtcatgccattgtggctgcagctccattgtccaggctgagtgtgggggcgcatggcgtggttctcatgcccaccacctaccctgaccctgcggaggtgggcaggaggcagcgataatcaccacgtgcagaggtcctgccaggtgcccagcctcatcattccctagaaggcaggcaccaccacatgctcccacactgtagataaggaaacagctttgaaacagatttgaaagtgtttgaggatttgcctggaaggagggctccagagccagggactgggtccgggacacccggagactctctgcttcttggagctccggcaactgcttgtctttctcttcacaggagaagggggccctgctgccgctgccgtggggcggggcgtgggcggtgctggctgcaggaaggctctcccctcccactttgtgctttccctgcaggctgctcctctgtcgagctgatcacacccacagttgagct-3’COX-1promoter的基因序列為5’-atgggaacaccttgggtgagaatgggggaggggcttcccgcaggtttcacctctcccacctggcataatttctaccctgcacccagtgatgcccaggagccagcacaagaacctctgagctctcctgccggctttccccactgtggggcccacaggatggctgggtgtgctggggaaactgagggagatgacttgtgggtgccagcaccatgggactttgggtgatcttggacctattccttcctccttctaggtgcttcctgagctggcgaaaaggagagctggatgctgggattctataaattcggcggtggatgtgagtctagctacagcatggaccctggccagccctggaatctgagttcagagatctttgaaaaaatgccttccgataactgagcacctactacatctggacactgcaccaggagatttgtgtgcattccctcattgaatcttacaccaccctctgggatggtttttgctattaagccgattttatagatgagaatactgagggctagaaaagataagtaccttgtccaaggtgacacggccagtaagctgtggagtctggatttgaactaggctctcttggagtttggagcccggtcttttcatttctggcagagacctgtggcttcagggggcggagccagccccatgggggaagtaagtccttcctgttagatctgtctgaggagtagtgagtttctcatctaggaaaccatcagcaggccaggctggactgccccatttctagccccctttcttctctgcagactgccctgtttctagccccttttcttctctacccttttctgtagagtgcgttagacccattttacagaaggggactctgagaccctttcttctctgcggggcagggtatgtggttcagacgagccgcttccatccccagttctgtccctaagccctgggtgacctcagcattgagcatcgtctctgagcctcagtttcctgtctatatctagtgccaccaggcatcagaaacgtaagtgcttcaaggatcttgggtgaaaagccgctttagcggcgagcatacactaattaattaaaatgccttggccggggctgggcagaggaagtaagcgggcagccgaggtgacagctggagggaggagcgggggtggagccgggggaagggtggggaggggatgggctggagctccgggcagtgtgcgaggcgcacgcacaggagcctgcactctgcgtcccgcaccccagcagccgcg-3’COX-2promoter的基因序列為5’-attattaaattatcaaaaagaaaatgatccacgctcttagttgaaatttcatgtaagattccatgcaataaataggagtgccataaatggaatgatgaaatatgactagaggaggagaaaggcttcctagatgagatggaattttagtcatccgtgtctcatgaagaatcagatgtgtacactaagcaaaacagttaaaaaaaaaacctccaagtgagtctcttatttatttttttcttataagacttctacaaattgaggtacctggtgtagttttatttcaggttttatgctgtcattttcctgtaatgctaaggacttaggacataactgaattttctattttccacttcttttctggtgtgtgtgtatatatatatgtatatatacacacacacatatacatatatatattttttagtatctcaccctcacatgctcctccctgagcactacccatgatagatgttaaacaaaagcaaagatgaaattccagctgtcaaaatctcccttccatctaattaattcctcatccaactatgttccaaaacgagaatagaaaattagccccaataagcccaggcaactgaaaagtaaatgctatgttgtactttgatccatggtcacaactcataatcttggaaaagtggacagaaaagacaaaagagtgaactttaaaactcgaatttattttaccagtatctcctatgaagggctagtaaccaaaataatccacgcatcagggagagaaatgccttaaggcatacgttttggacatttagcgtccctgcaaattctggccatcgccgcttcctttgtccatcagaaggcaggaaactttatattggtgacccgtggagctcacattaactatttacagggtaactgcttaggaccagtattatgaggagaatttacctttcccgcctctctttccaagaaacaaggagggggtgaaggtacggagaacagtatttcttctgttgaaagcaacttagctacaaagataaattacagctatgtacactgaaggtagctatttcattccacaaaataagagttttttaaaaagctatgtatgtatgtgctgcatatagagcagatatacagcctattaagcgtcgtcactaaaacataaaacatgtcagcctttcttaaccttactcgccccagtctgtcccgacgtgacttcctcgaccctctaaagacgtacagaccagacacggcggcggcggcgggagaggggattccctgcgcccccggacctcagggccgctcagattcctggagaggaagccaagtgtccttctgccctcccccggtatcccatccaaggcgatcagtccagaactggctctcggaagcgctcgggcaaagactgcgaagaagaaaagacatctggcggaaacctgtgcgcctggggcggtggaactcggggaggagagggagggatcagacaggagagtggggactaccccctctgctcccaaattggggcagcttcctgggtttccgattttctcatttccgtgggtaaaaaaccctgcccccaccgggcttacgcaatttttttaaggggagaggagggaaaaatttgtggggggtacgaaaaggcggaaagaaacagtcatttcgtcacatgggcttggttttcagtcttataaaaaggaaggttctctcggttagcgaccaattgtcatacgacttgcagtgagcgtcaggagcacgtccaggaactcctcagcagcgcctccttcagctccacagccagacgccctcagacagcaaagcctacccccgcgccgcgccctgcccgccgctgcgatgctcgcccgcgccctgctgctgtgcgcggtcctggcg-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗關(guān)節(jié)炎藥物的細(xì)胞靶標(biāo)篩選系統(tǒng)，其特征在于轉(zhuǎn)染人A549細(xì)胞通過(guò)脂質(zhì)體加入不含血清和抗菌素的RPMI1640培養(yǎng)液混勻溶液A分做三份，然后將pGL3BN/mPGES-1promoter、pGL3BN/COX-1promoter、pGL3BN/COX-2promoter；質(zhì)粒DNA分別與上述的不含血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液混勻溶液B、C、D，分別將溶液B、C、D與一份溶液A混合備用，然后與A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染形成瞬轉(zhuǎn)染細(xì)胞然后在含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中于37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，測(cè)定Luciferase表達(dá)即得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株；用此方法篩選得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株M1、M2、M3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗關(guān)節(jié)炎藥物的細(xì)胞靶標(biāo)篩選系統(tǒng)，其特征在于被篩選化合物通過(guò)mPGES-1promoter Luciferase報(bào)告基因的表達(dá)水平反映被篩選化合物對(duì)mPGES-1promoter表達(dá)的影響；通過(guò)測(cè)定M2、M3細(xì)胞Luciferase基因表達(dá)水平分別反映被篩化合物對(duì)COX-1promoter或COX-2promoter表達(dá)影響。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗關(guān)節(jié)炎藥物的細(xì)胞靶標(biāo)篩選系統(tǒng)的篩選抗關(guān)節(jié)炎藥物的方法包括如下步驟1)培養(yǎng)M1 M2 M3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株得培養(yǎng)液；2)加入被篩選化合物到上述培養(yǎng)液中，和細(xì)胞培養(yǎng)一天；3)吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用稀NaCl水洗，加入1×CCLR 100ul/孔覆蓋細(xì)胞；4)充分吹打細(xì)胞，將細(xì)胞碎片和液體離心，上清轉(zhuǎn)入新管中；5)將細(xì)胞抽提液與Luciferase試劑用槍頭混勻；6)將管子放入Luminometer中檢測(cè)樣品抑制率。
全文摘要
本發(fā)明建立了一種抗關(guān)節(jié)炎藥物的細(xì)胞靶標(biāo)篩選系統(tǒng)及篩藥的方法。本發(fā)明建立的細(xì)胞靶標(biāo)篩藥系統(tǒng)是運(yùn)用分子克隆技術(shù)，分別將mPGES－1 promoter、COX－1 promoter和COX－2promoter部分基因克隆進(jìn)人細(xì)胞株，獲得在基因水平上表達(dá)的篩藥細(xì)胞靶標(biāo)M1、M2和M3，進(jìn)而共同組成細(xì)胞靶標(biāo)篩藥系統(tǒng)。通過(guò)測(cè)定被篩選化合物抑制M1、M2和M3細(xì)胞luciferase表達(dá)的程度來(lái)篩選抗關(guān)節(jié)炎藥物。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1821423SQ20051002895
公開(kāi)日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2005年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月19日
發(fā)明者龔邦強(qiáng), 郭雷, 連霽虹, 紀(jì)偉 申請(qǐng)人:上海凱曼生物科技有限公司