專利名稱：一種新型抗腫瘤細(xì)胞化合物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及萘酰亞胺類化合物的用途，尤其涉及抗腫瘤細(xì)胞化合物Bl化合物用 以耐藥的作用。
背景技術(shù)：
化療是治療腫瘤的主要手段之一，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的多藥耐藥已成為當(dāng)前影響腫瘤 化學(xué)治療療效的主要障礙，有關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，90%以上腫瘤患者死因或多或少都與耐藥有關(guān)。 近年來，細(xì)胞凋亡與多藥耐藥及腫瘤細(xì)胞的抗藥性的關(guān)系日益受到人們的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn) 抑制凋亡與耐藥的形成存在一定的關(guān)系。細(xì)胞凋亡過程受到許多癌基因調(diào)控，如P53基因 及Bcl-2家族等。Bcl-2基因?yàn)橐灰种萍?xì)胞凋亡的原癌基因，同時(shí)也是一種耐藥基因。當(dāng) Bcl-2蛋白過度表達(dá)時(shí)，可引起細(xì)胞不死亡或病死率下降的抗凋亡作用，從而對抗藥物的治 療作用，使化療藥物失去效果。即Bcl-2導(dǎo)致耐藥主要是通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑而 完成。促凋亡基因中Bax功能與Bcl-2相反，當(dāng)Bax增加時(shí)自身可形成同源二聚體，致使細(xì) 胞凋亡加速，腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性增強(qiáng)。當(dāng)Bcl-2表達(dá)增加，Bax同源二聚體解離， 形成Bcl-2/Bax異源二聚體，抑制了 Bax-Bax同源二聚體的細(xì)胞凋亡作用，從而腫瘤細(xì)胞對 化療藥物產(chǎn)生耐藥性。臨床上遇到這種情況通常是以更換治療方案為對策(如間斷用藥， 替換用藥，聯(lián)合用藥等)，但因?yàn)槎鄶?shù)患者是多藥耐藥，所以更換方案后往往效果亦不佳，最 終導(dǎo)致化療失敗。因此尋找低毒有效的抗腫瘤細(xì)胞耐藥的化合物是提高化療療效的一個重 要方法。萘酰亞胺類化合物Bi，是一種新型的DNA嵌入劑。該化合物已被報(bào)道能通過激發(fā) P53基因的信號通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯及凋亡，達(dá)到抗腫瘤的目的。但是，化合物Bl在 抗腫瘤細(xì)胞耐藥方面的應(yīng)用，還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性的問題，本發(fā)明的目的是提供了萘 酰亞胺類化合物Bl的一種新用途，即克服Bcl-2高表達(dá)引起的多藥耐藥的作用。本發(fā)明所采用的化合物Bl是由實(shí)驗(yàn)室化學(xué)合成，結(jié)構(gòu)式如下所示 上述化合物Bl用以抗腫瘤細(xì)胞耐藥性。進(jìn)一步，所述耐藥性為Bcl-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的耐藥性。進(jìn)一步，所述的耐藥腫瘤為良性腫瘤或惡性腫瘤。進(jìn)一步，所述腫瘤為惡性黑色素瘤，或惡性淋巴瘤，或消化器官的腫瘤，或肺癌， 或乳癌，或睪丸癌，或卵巢癌，或子宮癌，或前列腺癌，或上顎癌，或舌癌，或口腔癌，或咽喉 癌，或甲狀腺癌，或腦部腫瘤，或骨肉瘤，或白血病，或神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，或膀胱腫瘤，或皮膚 癌，或皮膚附屬器官癌，或皮膚轉(zhuǎn)移癌。進(jìn)一步，所述消化器官的腫瘤為胃癌，或腸癌，或肝癌，或膽囊癌，或膽道癌，或胰 腺癌。進(jìn)一步，該化合物Bl用以制備具有抗腫瘤細(xì)胞耐藥性的抗腫瘤藥物。進(jìn)一步，所述藥物的制劑形式包括液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、滴丸 劑或注射劑。且該種萘酰亞胺類化合物Bl低毒，適合于人和哺乳類動物經(jīng)口和非經(jīng)口給藥。且該種萘酰亞胺類化合物Bl的劑型無特定的限制，可作為經(jīng)口給藥的散劑，丸 劑，片劑，膠囊劑等固型制劑，也可作為非經(jīng)口給藥的外用劑，軟膏，貼敷劑，注射劑。且該種萘酰亞胺類化合物Bl，通常能與不影響藥理學(xué)作用的輔助料配合制成經(jīng)口 和非經(jīng)口給藥的制劑。且該種萘酰亞胺類化合物Bi，可經(jīng)水溶劑(如蒸留水)，水溶性制劑(如生理鹽 水)脂溶劑(如胡麻油)等的溶劑用常規(guī)法調(diào)制。且該種萘酰亞胺類化合物Bi，通常能與藥理學(xué)上允許的添加成分(稀釋劑，著色 劑，安定劑，界面活性劑，助溶劑，緩沖劑，矯味劑，香料，保存劑，糖衣劑)相組合，用于經(jīng)口 和非經(jīng)口劑型。且該種萘酰亞胺類化合物Bi，在劑型上通常能與藥理學(xué)上允許的稀釋成分和成型 成分相組合，用于經(jīng)口和非經(jīng)口劑型。且該種萘酰亞胺類化合物Bl經(jīng)口劑型，是指片劑，丸劑，顆粒劑，散劑和膠囊。非 經(jīng)口劑是指靜脈注射劑，肌肉注射劑和皮下注射劑，浴劑，直腸，肛門和陰道給藥。本發(fā)明所述的萘酰亞胺類化合物Bl抗腫瘤細(xì)胞耐藥的作用的有益效果如下(1) 具有臨床應(yīng)用前景，萘酰亞胺類化合物Bl可殺傷Bcl-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，其藥效不受常 規(guī)耐藥機(jī)理影響，對HL60/Bcl-2細(xì)胞的殺傷能力與HL60細(xì)胞基本一致。(2)該化合物具有 較低的毒性，因此具有較好的臨床腫瘤化療、尤其是抗臨床腫瘤多藥耐藥的應(yīng)用前景。


圖1是萘酰亞胺類化合物Bl對腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例做進(jìn)一步的說明。為進(jìn)一步了解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1萘酰亞胺類化合物Bl能克服Bcl-2高表達(dá)引起的腫瘤細(xì)胞耐藥實(shí)驗(yàn)材料
HL60細(xì)胞株購自中國科學(xué)研究院細(xì)胞所。質(zhì)粒pSFFV-neo，pSFFV-neo Bcl-2購自 美國Addgene公司。真核轉(zhuǎn)染pSFFV_neo Bcl-2質(zhì)粒，G418篩選得到HL60的Bcl_2高表 達(dá)株。萘酰亞胺類化合物Bl由實(shí)驗(yàn)室合成。噻唑藍(lán)(3-(4，5-dimethylthiaZ0l-2-yl)-2， 5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)購自 Sigma 公司。對照組、載體組的處理作下說明對照組細(xì)胞加入RPMI 1640培養(yǎng)液實(shí)驗(yàn)方法(1)先將對數(shù)生長期細(xì)胞2 XlO5ceIVml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0. 1ml，培養(yǎng)6 小時(shí)。(2)實(shí)驗(yàn)組加入含濃度范圍在0-5 μ M的藥物的RPMI 1640培養(yǎng)液，對照組則用等 體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個以上的平行孔，置37°C，5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。(3)培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄上清，然后每孔加入100 μ 1的含5mg/ml的MTT，37°C繼續(xù)培 養(yǎng)4小時(shí)。(4)小心吸棄上清，每孔加入100 μ 1的DMSO溶解甲臜，振蕩lOmin，待MTT還原產(chǎn) 物完全溶解，在酶標(biāo)議上用波長為570nm，參比波長為630nm測定光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞 的生長抑制率。
1_ 戀臉 ΗΟΓ)⑶數(shù)據(jù)處理細(xì)胞生長抑制率=^qd Χ 100%實(shí)驗(yàn)結(jié)果藥物作用48小時(shí)，萘酰亞胺類化合物Bl對HL60/Bcl-2和HL60細(xì)胞株的IC50非 常接近，說明該化合物能克服由Bcl-2高表達(dá)引起的腫瘤細(xì)胞耐藥。表1 萘酰亞胺類化合物 Bl 對 HL60、HL60/vector、HL60/Bcl_2 的 IC50 實(shí)施例2萘酰亞胺類化合物Bl誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的改變實(shí)驗(yàn)材料Hoechst33258購自上海美季生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)方法(1)對數(shù)生長期細(xì)胞2 X IO5個/ml接種于24孔板，立刻加藥，對照組加等量體積 的RPMI1640培養(yǎng)液。(2)處理36小時(shí)后離心，倒去上層RPMI 1640培養(yǎng)基，用PBS洗2次，離心去上清 (1500rpm,5min)。(3)加固定液(甲醇乙酸=3 1)，4°C固定lOmin。(4) Hoechst 33258 (5 μ 1/ml)染色，5min。(5) 356nm紫外激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察并照相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
HL60細(xì)胞及HL60/Bcl_2細(xì)胞經(jīng)0. 3 μ MBl作用48小時(shí)后，Hoechst染色，細(xì)胞呈 現(xiàn)核染色質(zhì)濃縮、核碎裂以及出現(xiàn)凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡特征(圖1)。對照組和載體 組細(xì)胞均無形態(tài)學(xué)變化，所發(fā)熒光較均勻(圖1)。實(shí)施例3萘酰亞胺類化合物Bl誘導(dǎo)HL60及HL60/Bcl_2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)材料Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海美季生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)方法(1) 1 X IO6個細(xì)胞用0. 3 μ MBl處理48小時(shí)；(2) IOOOg (約1000-2000rpm)離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞；(3)重懸的細(xì)胞，IOOOg離心5min，棄上清，加入195 μ 1 Annexin V-FITC結(jié)合液 (IX)輕輕重懸細(xì)胞；(4)加入 5 μ 1 Annexin V-FITC，輕輕混勻；(5)室溫(20-25°C )避光孵育lOmin，可以使用鋁箔進(jìn)行避光；(6) IOOOg離心5min,棄上清，加入190 μ 1 Annexin V-FITC結(jié)合液(IX)輕輕重懸 細(xì)胞； (7)加入10 μ 1碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置；(8)隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Armexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光，激發(fā) 波長Ex = 488nm ；發(fā)射波長Em = 530nm實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示，0. 3gM Bl 分別作用 HL60、HL60/vector 和 HL60/Bcl_2 細(xì)胞 48 小時(shí) 后，其凋亡率均達(dá)到50 %以上。表2萘酰亞胺類化合物Bl處理HL60、HL60/vector、HL60/Bcl_2后的凋亡率 以上實(shí)例說明萘酰亞胺類化合物Bl能夠克服Bcl-2高表達(dá)引起的多藥耐藥，且 對HL60/Bcl-2細(xì)胞的殺傷能力與HL60細(xì)胞基本一致。
權(quán)利要求
一種新型抗腫瘤細(xì)胞化合物的用途，該抗腫瘤細(xì)胞化合物B1結(jié)構(gòu)式如下，其特征在于該化合物B1用以抗腫瘤細(xì)胞耐藥性。FSA00000190920800011.tif
2.如權(quán)利要求1的新型抗腫瘤細(xì)胞化合物的用途，其特征在于，所述耐藥性為Bcl-2高 表達(dá)的腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的耐藥性。
3.如權(quán)利要求2的新型抗腫瘤細(xì)胞化合物的用途，其特征在于，所述的耐藥腫瘤為良 性腫瘤或惡性腫瘤。
4.如權(quán)利要求3的新型抗腫瘤細(xì)胞化合物的用途，其特征在于，所述腫瘤為惡性黑色 素瘤，或惡性淋巴瘤，或消化器官的腫瘤，或肺癌，或乳癌，或睪丸癌，或卵巢癌，或子宮癌， 或前列腺癌，或上顎癌，或舌癌，或口腔癌，或咽喉癌，或甲狀腺癌，或腦部腫瘤，或骨肉瘤， 或白血病，或神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，或膀胱腫瘤，或皮膚癌，或皮膚附屬器官癌，或皮膚轉(zhuǎn)移癌。
5.如權(quán)利要求4的新型抗腫瘤細(xì)胞化合物的用途，其特征在于，所述消化器官的腫瘤 為胃癌，或腸癌，或肝癌，或膽囊癌，或膽道癌，或胰腺癌。
6.一種新型抗腫瘤細(xì)胞化合物的用途，該抗腫瘤細(xì)胞化合物Bl結(jié)構(gòu)式如下，其特征在 于該化合物Bl用以制備具有抗腫瘤細(xì)胞耐藥性的抗腫瘤藥物。
7.如權(quán)利要求6的新型抗腫瘤細(xì)胞化合物的用途，其特征在于，所述藥物的制劑形式 包括液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、滴丸劑或注射劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型抗腫瘤細(xì)胞耐藥的化合物(B1)的新用途，即應(yīng)用此化合物使得Bcl-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的作用不受Bcl-2抗凋亡蛋白高表達(dá)的影響，而且該化合物對Bcl-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的殺傷能力與其親本腫瘤細(xì)胞基本一致，具有較低毒性，因此具有很好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號A61P35/00GK101890009SQ20101022702
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者劉建文, 吳愛斌, 姜子敬, 崔大岺, 張煥英, 徐可, 徐玉芳, 林冰, 梁欣, 金惠, 錢旭紅 申請人:華東理工大學(xué)