專利名稱：苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法。
背景技術(shù)：
紫花苜蓿(Medicago sativa L.，以下簡稱苜蓿)是一種多年生豆科牧草，營養(yǎng)價值豐富，是草食動物優(yōu)質(zhì)的飼草，有“牧草之王”的美譽。長期以來，紫花苜蓿的保存主要以曬制干草為主，這種方法的最大缺點是營養(yǎng)物質(zhì)損失嚴(yán)重。近幾年，加拿大、日本等國家開始利用青貯的方法保存苜蓿，解決了苜蓿保存過程中營養(yǎng)物質(zhì)損失嚴(yán)重的問題。由于苜蓿可溶性糖含量低，緩沖能高，屬于難青貯的豆科牧草，直接青貯效果不好，需要在青貯發(fā)酵過程中使用添加劑。國外目前使用比較普遍的添加劑種類有甲酸、乳酸菌制劑、酶制劑、以及乳酸菌和酶制劑的混合物等。我國在苜蓿青貯方面的研究尚處于起步階段，對苜蓿青貯添加劑的研究尚屬空白，但我國苜蓿青貯市場潛力巨大，青貯添加劑的市場前景很好。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Mitsuaki Ohshima等(1997)在AnimalFeed Science Technology雜志第66期(129-137頁)首次提出綠汁發(fā)酵液(Previously Fermented Juice，簡寫為PFJ)的制作方法及其在苜蓿青貯中的效果。該方法的主要制作過程如下新鮮苜蓿→切碎→加水→浸漬→粉碎(打漿)→過濾→濾液中加葡萄糖→發(fā)酵→制成PFJ。由于綠汁發(fā)酵液含有多種來源于苜蓿的乳酸菌菌種，在苜蓿青貯中有明顯降低青貯料pH值的作用，并且，綠汁發(fā)酵液制作簡單，取材方便，家畜食用青貯料后無副作用，青貯制作過程中對人體無害，因此，逐漸開始在生產(chǎn)中得到應(yīng)用。作為乳酸發(fā)酵的啟動因子，綠汁發(fā)酵液能夠在青貯過程中促進(jìn)乳酸菌種群擴(kuò)大，抑制其它有害菌的生長，改善苜蓿青貯品質(zhì)。許多的研究證明用綠汁發(fā)酵液青貯苜蓿，其作用比接種單一乳酸菌更有效，可顯著降低青貯苜蓿的pH值。然而，綠汁發(fā)酵液中除含有多種乳酸菌外，還含有多種有害的菌種，這些菌種同樣也具有啟動因子的作用，在苜蓿青貯過程中誘導(dǎo)有害菌種群擴(kuò)大，因而降低或減緩了綠汁發(fā)酵液更好地促進(jìn)乳酸菌擴(kuò)大繁殖的作用，使得青貯苜蓿在預(yù)備發(fā)酵期和酸化前期不能在短期內(nèi)急劇降低青貯料的pH值，這是綠汁發(fā)酵液作為青貯添加劑在苜蓿青貯中存在的最大缺陷，影響到青貯苜蓿高質(zhì)量發(fā)酵和形成高質(zhì)量的青貯料。在進(jìn)一步的檢索中，還未見將綠汁發(fā)酵液和糞鏈球菌混合作為苜蓿青貯添加劑及其制備方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對背景技術(shù)中綠汁發(fā)酵液青貯的不足和缺陷，提供一種苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法，使其在綠汁發(fā)酵液中加入該糞鏈球菌強化了綠汁發(fā)酵液促進(jìn)青貯苜蓿發(fā)酵，快速降低pH值的作用，提高青貯苜蓿的質(zhì)量。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，所述的苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液由綠汁發(fā)酵液(PFJ)和保存有糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)的MRS液體培養(yǎng)基按50-70％∶30-50％的重量百分比組成，方法步驟如下(1)選擇新鮮的苜蓿材料；(2)制成綠汁發(fā)酵液；(3)糞鏈球菌活化；(4)將綠汁發(fā)酵液(PFJ)與活化的糞鏈球菌按比混合，形成苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液。
所述的步驟(1)，具體為取新鮮的苜蓿植株，去掉基部和頂部各約10cm，同時去掉主枝和比較粗的枝條，將剩余的幼枝和葉保留，作為綠汁發(fā)酵液的制作材料。
所述的步驟(2)，具體為(a)將選好的新鮮苜蓿材料，切碎成3-5cm；(b)按苜蓿g和水ml 1∶2.5的比例加入蒸餾水，充分混合，用高速組織粉碎機將混合后的苜蓿搗碎，靜置1小時，經(jīng)雙層紗布過濾；(c)按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在濾液中加入葡萄糖或相當(dāng)葡萄糖量的糖漿，充分?jǐn)嚢瑁糜?0的環(huán)境中發(fā)酵48小時，制成綠汁發(fā)酵液。
所述的步驟(3)，具體為將糞鏈球菌放在MRS液體培養(yǎng)基中活化，活化溫度35～37℃，活化時間24～36小時，活化完成時，每ml液體培養(yǎng)基中至少含有乳酸鏈球菌2×107cfu。
所述的MRS液體培養(yǎng)基(％)配方為蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，檸檬酸二銨0.2g，乙酸鈉0.5g，葡萄糖2g，土溫800.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，pH＝6.2，121℃滅菌15min。
所述的步驟(4)，具體為把綠汁發(fā)酵液與在MRS液體培養(yǎng)基中活化的糞鏈球菌按50-70％∶30-50％的比例混合，形成苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液，其中每10ml該微生物發(fā)酵液含PFJ 5-7ml，糞鏈球菌107～108cuf，青貯時每公斤苜蓿加入10-15ml微生物發(fā)酵液。
本發(fā)明的特點在于將糞鏈球菌與PFJ兩個功能互補的添加劑按比例混合，形成本發(fā)酵液，它不同于國外單獨用PFJ作為苜蓿青貯添加劑的方法。綠汁發(fā)酵液是乳酸發(fā)酵的啟動因子，而糞鏈球菌是青貯酸化期起主要作用的乳酸菌菌種，是酸化期繁殖最快的乳酸菌菌種，兩種添加劑的綜合和互補，強化了綠汁發(fā)酵液促進(jìn)青貯苜蓿發(fā)酵的作用，使本發(fā)酵液比綠汁發(fā)酵液單獨使用有更好的降低pH值和提高青貯質(zhì)量的效果。用本發(fā)酵液處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料pH值比用綠汁發(fā)酵液處理降低10.2～11.7％。
具體實施例方式
結(jié)合本發(fā)明方法步驟提供以下實施例實施例一1、選擇新鮮苜蓿材料取新鮮的苜蓿植株，去掉基部和頂部各約10cm，同時去掉主枝和比較粗的枝條，將剩余的幼枝和葉保留，作為綠汁發(fā)酵液的制作材料；2、制成綠汁發(fā)酵液將新鮮的苜蓿材料切碎成3-5cm，按苜蓿(g)和水(ml)1∶2.5比例加入蒸餾水，充分混合，用高速組織粉碎機搗碎，靜置1小時，雙層紗布過濾，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在濾液中加入葡萄糖或相當(dāng)葡萄糖量的糖漿，充分?jǐn)嚢?，置?0℃發(fā)酵48小時，制成綠汁發(fā)酵液；3、糞鏈球菌活化將糞鏈球菌放在MRS液體培養(yǎng)基中活化，活化溫度35℃，活化時間24小時，活化完成時，每ml液體培養(yǎng)基中至少含有糞鏈球菌2×107cfu。
所述的MRS液體培養(yǎng)基(％)配方為蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，檸檬酸二銨0.2g，乙酸鈉0.5g，葡萄糖2g，土溫800.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4H200.025g，pH＝6.2，121℃滅菌15min。
4、苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液制作把綠汁發(fā)酵液與在MRS液體培養(yǎng)基中的活化糞鏈球菌按50％∶50％的比例混合，形成苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液，其中每10ml該微生物發(fā)酵液含PFJ 5ml，糞鏈球菌108cuf，青貯時每公斤苜蓿加入10ml微生物發(fā)酵液。
表1 實施例一的苜蓿青貯效果

從表1看出，用本發(fā)酵液處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料感觀評價達(dá)到優(yōu)良，而PFJ的感觀評價為中等；pH值和蛋白質(zhì)含量分別比PFJ處理低11.7％和提高10.1％，差異均達(dá)到顯著水平。
實施例二1、選擇新鮮苜蓿材料取新鮮的苜蓿植株，去掉基部和頂部各約10cm，同時去掉主枝和比較粗的枝條，將剩余的幼枝和葉保留，作為綠汁發(fā)酵液的制作材料；2、制成綠汁發(fā)酵液將新鮮的苜蓿材料切碎成3-5cm，按苜蓿(g)和水(ml)1∶2.5的比例加入蒸餾水，充分混合，用高速組織粉碎機搗碎，靜置1小時，雙層紗布過濾，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在濾液中加入葡萄糖或相當(dāng)葡萄糖量的糖漿，充分?jǐn)嚢?，置?0℃發(fā)酵48小時，制成綠汁發(fā)酵液；3、糞鏈球菌活化將糞鏈球菌放在MRS液體培養(yǎng)基中活化，活化溫度37℃，活化時間30小時，活化完成時，每ml液體培養(yǎng)基中至少含有糞鏈球菌2×107cfu。
所述的MRS液體培養(yǎng)基(％)配方與實施例一相同。
4、苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制作把綠汁發(fā)酵液與在MRS液體培養(yǎng)基中的活化糞鏈球菌按60％∶40％的比例混合，形成苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液，其中每10ml該微生物發(fā)酵液含PFJ 6ml，乳酸鏈球菌8×107cuf，青貯時每公斤苜蓿加入12ml微生物發(fā)酵液。
表2 實施例二的苜蓿青貯效果

從表2看出，用本發(fā)酵液處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料感觀評價達(dá)到優(yōu)良，而PFJ的感觀評價為中等；pH值和蛋白質(zhì)含量分別比PFJ處理低10.7％和提高9.7％，差異均達(dá)到顯著水平。
實施例三1、選擇新鮮苜蓿材料取新鮮的苜蓿植株，去掉基部和頂部各約10cm，同時去掉主枝和比較粗的枝條，將剩余的幼枝和葉保留，作為綠汁發(fā)酵液的制作材料；2、制成綠汁發(fā)酵液將新鮮的苜蓿材料切碎成3-5cm，按苜蓿(g)和水(ml)1∶2.5的比例加入蒸餾水，充分混合，用高速組織粉碎機搗碎，靜置1小時，雙層紗布過濾，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在濾液中加入葡萄糖或相當(dāng)葡萄糖量的糖漿，充分?jǐn)嚢?，置?0℃發(fā)酵48小時，制成綠汁發(fā)酵液；3、糞鏈球菌活化將糞鏈球菌放在MRS液體培養(yǎng)基中活化，活化溫度37℃，活化時間36小時，活化完成時，每ml液體培養(yǎng)基中至少含有糞鏈球菌2×107cfu。
所述的MRS液體培養(yǎng)基(％)配方與實施例一相同。
4、苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制作把綠汁發(fā)酵液與在MRS液體培養(yǎng)基中的活化糞鏈球菌按70％∶30％的比例混合，形成苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液，其中每10ml該微生物發(fā)酵液含PFJ 7ml，乳酸鏈球菌6×107cuf，青貯時每公斤苜蓿加入15ml微生物發(fā)酵液。
表3 實施例三的苜蓿青貯效果

從表3看出，用本發(fā)酵液處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料感觀評價達(dá)到優(yōu)良，而PFJ的感觀評價為中等；pH值和蛋白質(zhì)含量分別比PFJ處理低10.2％和提高8.8％，差異均達(dá)到顯著水平。
上述三個實施例的制作方法流程可以簡述為新鮮苜?！x→切碎→浸漬→粉碎(打漿)→靜置→過濾→加葡萄糖→發(fā)酵→制成PFJ→糞鏈球菌活化→PFJ+糞鏈球菌混合→苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液。
權(quán)利要求
1.一種苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法，其特征在于，所述的苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液由綠汁發(fā)酵液和保存有糞鏈球菌的MRS液體培養(yǎng)基按50-70％∶30-50％的重量百分比混合組成，制備步驟如下(1)選擇新鮮的苜蓿材料；(2)制成綠汁發(fā)酵液；(3)糞鏈球菌活化；(4)將綠汁發(fā)酵液與活化的糞鏈球菌按比混合，形成苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法，其特征是，所述的步驟(1)，具體為取新鮮的苜蓿植株，去掉基部和頂部各約10cm，同時去掉主枝和比較粗的枝條，將剩余的幼枝和葉保留。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法，其特征是，所述的步驟(2)，具體為(a)將選好的新鮮苜蓿材料，切碎成3-5cm；(b)加入蒸餾水，充分混合，用高速組織粉碎機將混合后的苜蓿搗碎，靜置1小時，經(jīng)雙層紗布過濾；(c)在濾液中加入葡萄糖，充分?jǐn)嚢?，置?0的環(huán)境中發(fā)酵48小時，制成綠汁發(fā)酵液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法，其特征是，所述的(b)中，按苜蓿g和水ml 1∶2.5的比例加入蒸餾水。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法，其特征是，所述的(c)中，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在濾液中加入葡萄糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或者5所述的苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法，其特征是，葡萄糖或采用相當(dāng)葡萄糖量的糖漿。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法，其特征是，所述的步驟(3)，具體為將糞鏈球菌放在MRS液體培養(yǎng)基中活化，活化溫度35～37℃，活化時間24～36小時，活化完成時，每ml液體培養(yǎng)基中至少含有糞鏈球菌2×107cfu。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法，其特征是，所述的MRS液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，檸檬酸二銨0.2g，乙酸鈉0.5g，葡萄糖2g，土溫80 0.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，pH＝6.2，121℃滅菌15min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法，其特征是，所述的步驟(4)，具體為把綠汁發(fā)酵液與在MRS液體培養(yǎng)基中的活化糞鏈球菌按50-70％∶30-50％的比例混合，形成苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或者9所述的苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法，其特征是，其中每10ml微生物發(fā)酵液含PFJ 5-7ml，乳酸鏈球菌107～108cuf，青貯時每公斤苜蓿加入10-15ml微生物發(fā)酵液。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液的制備方法，所述的苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液由綠汁發(fā)酵液和保存有糞鏈球菌的MRS液體培養(yǎng)基按50－70％∶30－50％的重量百分比混合組成，制備步驟如下(1)選擇新鮮的苜蓿材料；(2)制成綠汁發(fā)酵液；(3)糞鏈球菌活化；(4)將綠汁發(fā)酵液與活化的糞鏈球菌按比混合，形成苜蓿青貯的微生物發(fā)酵液。使用本發(fā)酵液比綠汁發(fā)酵液單獨使用有更好的降低pH值和提高青貯質(zhì)量的效果。用本發(fā)酵液處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料pH值比用綠汁發(fā)酵液處理降低10.2～11.7％。
文檔編號C12R1/46GK1757713SQ20051002869
公開日2006年4月12日 申請日期2005年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月11日
發(fā)明者安淵, 田瑞霞, 王光文 申請人:上海交通大學(xué)