專利名稱：玉米品系mon863的外源插入載體的旁鄰基因序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術領域的基因序列。具體的說，涉及一種玉米品系MON863的外源插入載體的旁鄰基因序列。
背景技術：
隨著植物遺傳轉化技術在基礎研究和應用研究中的廣泛應用，已生產(chǎn)出了多種轉基因植物。轉基因植物的外源插入載體的旁鄰基因序列是轉基因品系的一個重要生物學特征，因此，外源插入載體的旁鄰基因序列是建立轉基因植物品系特異性檢測方法的重要試驗依據(jù)。
目前已經(jīng)有部分專利和文獻分析了轉基因植物外源插入載體旁鄰基因序列，例如Holck A等人于2002年利用TAIL-PCR方法分析了MON810玉米的旁鄰基因序列，為轉基因MON810玉米的品系特異性檢測方法的建立提供了序列依據(jù)；Ronning S等人利用反向PCR方法于2003年分析了Bt11玉米的旁鄰基因序列，為轉基因Bt11玉米的品系特異性檢測方法的建立提供了序列依據(jù)。然而，在對現(xiàn)有專利和文獻的分析中發(fā)現(xiàn)，還沒有任何關于MON863玉米品系的外源插入載體旁鄰基因序列分析的文章和專利報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供了一種玉米品系MON863的外源插入載體的旁鄰基因序列。本發(fā)明公布了與玉米MON863的外源插入載體PV-ZMIR13兩端鄰接的玉米基因組中的玉米NADH脫氫酶基因的部分序列，編碼NADH脫氫酶亞單位1和2，本發(fā)明可以進一步用于建立轉基因品系特異性PCR檢測方法。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明分離出一種DNA分子，該分子含有MON863玉米外源插入載體的旁鄰基因序列，包括編碼玉米NADH脫氫酶亞單位1和2的部分的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-253位的核苷酸序列完全相同或SEQ ID NO.2中從核苷酸第138-411位的核苷酸序列完全相同；編碼煙草花椰病毒的35S啟動子的部分序列，其來源于外源插入載體PV-ZMIR13，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第254-456位的核苷酸序列完全相同；編碼小麥tahsp 173’終止子的部分序列，其來源于外源插入載體PV-ZMIR13，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.2中從核苷酸第1-137位的核苷酸序列完全相同。
所述的分離，是指，用TAIL-PCR方法從玉米基因組中擴增出特異DNA分子。
所述的MON863外源插入載體PV-ZMIR13，指的是用來轉化生產(chǎn)MON863玉米的重組質粒，其由NPTII抗性基因表達盒和cry3Bb1基因表達盒組成。
所述的MON863外源插入載體PV-ZMIR13的通用元件，指的是CaMV35S啟動子和小麥tahsp 173’終止子，其分別來源于煙草花椰病毒和小麥基因組。
所述的MON863外源插入載體與植物基因組的鄰接區(qū)的DNA序列，指的是一段由玉米基因組序列和外源插入載體序列組成的DNA序列。
其中，MON863玉米品系5’端旁鄰基因序列為456bp，該序列包括編碼玉米NADH脫氫酶亞單位1和2的部分的核苷酸序列，長度為253bp，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-253位的核苷酸序列完全相同；編碼小麥tahsp 173’終止子的部分序列，長度為203bp，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第1-137位的核苷酸序列完全相同。
其中，MON863玉米品系3’端旁鄰基因序列為411bp，該序列包括編碼玉米NADH脫氫酶亞單位1和2的部分的核苷酸序列，長度為274bp，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.2中從核苷酸第138-411位的核苷酸序列完全相同；編碼編碼小麥tahsp 173’終止子的部分序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.2中從核苷酸第1-137位的核苷酸序列完全相同。
本發(fā)明的優(yōu)越性在于，首次克隆了MON863玉米外源基因的旁鄰序列，并且明確了MON863玉米品系的外源插入載體的旁鄰序列可以用作目的DNA擴增片段建立靈敏、特異性的玉米MON863的品系特異性定性、定量PCR檢測。本發(fā)明所克隆、分離的外源插入載體PV-ZMIR13的旁鄰序列可以進一步用于建立轉基因品系特異性PCR檢測方法，這種方法較轉基因篩選檢測、基因特異性檢測和構建特異性檢測方法更加特異的檢測方法，符合國際上轉基因的檢測方法。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1MON863玉米外源插入載體旁鄰序列的克隆一.實驗材料1、植物材料遺傳改良玉米MON863玉米、Mon810玉米、Bt11玉米、Bt176玉米、TC1507玉米、GA21玉米等。
常規(guī)玉米2、酶與試劑植物基因組DNA提取試劑盒為上海市農(nóng)業(yè)科學院和上海出入境檢驗檢疫局聯(lián)合研制的食品DNA抽提試劑盒。
dNTPs、Taq DNA聚合酶及其緩沖液、DL2000 Marker購自大連寶生物工程有限公司。隨機引物、TaqMan探針及引物由上海博亞生物工程有限公司合成。
其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。
3.實驗儀器DY-501型核酸電泳儀(上海精密科學儀器有限公司)PTC-100型PCR擴增儀(MJ Research Inc.)Rotor-Gene 2000定量PCR儀(Corbett Research，Australia)BECKMAN公司的DUR640核酸和蛋白分析儀DNA測序儀(Applied Biosystem377型全自動熒光序列分析儀)DNA電泳分析系統(tǒng)包括暗箱、數(shù)碼照相機、計算機、掃描儀、噴墨打印機、光敏打印機、Tanon UV-2000紫外分析儀、Gis凝膠圖象分析軟件(上海天能公司)
其他儀器包括離心機，恒溫水浴鍋，培養(yǎng)箱，天平等。
二、實驗方法與過程1、外源插入載體的插入情況通過查閱MON863玉米轉基因安全性評價相關的資料，我們發(fā)現(xiàn)MON863玉米是通過將外源質粒PV-ZMIR13轉化到玉米基因組上獲得的。質粒PV-ZMIR13以一個完整的拷貝插入到玉米基因組中，其中包括一個完整的Cry3Bb1基因的表達盒和一個完整的NptII基因的表達盒。
2、外源插入載體各元件來源轉化到MON863玉米基因組中的PV-ZMIR13質粒主要包含兩個完整的基因表達盒，一個是Cry3Bb1基因的表達盒，另一個是NptII基因的表達盒。在Cry3Bb1基因的表達盒中，含有4-AS1啟動子、wt CAB前導序列、水稻Actin基因5’端部分序列、Cry3Bb1基因和tahsp 173’終止子；NptII基因的表達盒包含CaMV35S啟動子、NptII基因和NOS 3’終止子。外源插入質粒PV-ZMIR13各元件的來源詳見表1。
表1.質粒PV-ZMIR13L及遺傳元件表

3、植物基因組DNA提取與檢測3.1 植物DNA提取
a)取適量的玉米樣品放在研缽中，加入液氮將樣品研磨成粉末，稱取約70mg-100mg磨碎的樣品轉入1.5ml的Eppendorf管中；b)視材料量的多少，加入600-700μl已預熱的Buffer A，輕輕混勻后，65℃水浴保溫1小時，期間間或振蕩混勻；c)在管中加入等體積酚/氯仿(600-700μl)，上下顛倒充分混勻，靜置抽提10min；d)12000rpm離心10分鐘，吸取上清到一新的Eppendorf管中；e)加入與上清等體積的異丙醇(約600μl)，混勻，常溫放置10min后，12000rpm離心10min，去上清，保留沉淀；f)在沉淀中加入60μl TER，37℃放置2min后用槍頭將其充分混勻后，于37℃放置約1小時；g)取出后補加140μl TE，再加入200μl酚/氯仿，混勻，靜置片刻；h)12000rpm離心5min，取上清(約180μl)，加入1/10體積3M NaAc和2倍體積無水乙醇，-20℃放置30min；i)12000rpm離心10min，去上清，加75％乙醇200μl，12000rpm離心5min，棄上清，室溫晾干，溶于50μl無菌ddH2O中。
3.2 DNA檢測取3ul提取的DNA溶液，以1％的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)其亮度和擴散程度來判斷DNA的質量。
利用紫外分光光度計測定所提DNA的濃度與純度。
4、TAIL-PCR引物設計根據(jù)獲得的MON86玉米3的外源插入載體的插入拷貝數(shù)、插入方式以及插入載體PV-ZMIR13質粒的各遺傳元件的序列，分別針對外源插入載體的5’端序列(M863TL1，M863TL2，M863TL3)和3’端序列用primer 5.0軟件各設計三條引物(M863TR1，M863TR2，M863TR3)，分別與六條隨機引物配對，進行TAIL-PCR擴增。隨機引物和設計的六條單向特異性引物序列見表2。
表2.用于TAIL-PCR擴增的隨機引物和特異性引物


5、外源插入載體旁鄰序列的TAIL-PCR擴增根據(jù)劉耀光等的報道，TAIL-PCR一般由三輪普通PCR擴增組成，第1輪PCR擴增反應由5次高特異性反應、1次低特異性反應、10次較低特異性反應和12次熱不對稱的超級循環(huán)構成，反應體系為50μL。第2輪擴增反應則將第一級反應的產(chǎn)物稀釋50-1000倍作為模板，通過10次熱不對稱的超級循環(huán)，使特異性的產(chǎn)物被選擇性地擴增，而非特異性的產(chǎn)物被壓制到極低的含量，反應體系為100μL。第3輪擴增反應又將第2次反應的產(chǎn)物稀釋50-1000倍作為模板，一般設置為普通的PCR反應或熱不對稱的超級循環(huán)，反應體系為100μL。通過上述3輪PCR擴增反應獲得與已知序列鄰近的目標序列。
TAIL-PCR的反應程序和條件見表3。
表3. TAIL-PCR反應程序和條件


6、特異性擴增片段克隆6.1 特異性片段電泳回收用2％瓊脂糖凝膠(含10ng/ml EB)電泳分離PCR產(chǎn)物，電泳結束，將凝膠置于紫外分析儀內(nèi)，切取含PCR產(chǎn)物的膠塊，用DNA凝膠回收試劑盒回收，PCR產(chǎn)物最終溶于25-30μl的Eluent Buffer中。
6.2 特異性片段DNA連接在無菌Eppendorf管中加入1μl 10×T4DNA ligase Buffer，8μl回收的PCR產(chǎn)物，0.25μl pMD18-T載體，1μl T4 DNA連接酶，總體積為10μl。將各組分混勻，4℃中連接16h。當PCR產(chǎn)物與載體DNA片段通過酶切形成的互補粘端相連時，兩者之間的質量比為5∶1。
6.3 感受態(tài)細胞制備在LB平板上劃線接種大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)過夜。用接種環(huán)挑取10-12個單菌落(2-3mm直徑)，接種于250mL的SOB培養(yǎng)液中。振蕩培養(yǎng)(18℃，200-250rpm)，至OD600＝0.6。菌液置于冰上10min。離心(4℃，3000rpm，10min)，收集細胞。用80ml預冷的TB溶液重懸細胞，冰浴10min。離心(4℃，3000rpm，10min)，收集細胞。用20ml預冷的TB輕輕地重懸細胞，加入DMSO至終濃度7％，輕輕混勻，置于冰上。10min后，按每管500μl分裝細胞懸液于無菌的eppendorf管中。用液氮快速冷凍，儲存于-70℃。
6.4 轉化在1.5ml eppendorf管中加入200μl的感受態(tài)細胞與10μl的DNA連接產(chǎn)物，手指輕彈管壁，混勻混合物。冰浴30min。42℃，溫育混合物90sec。迅速放回冰上，冰浴10min。加入800μl SOC培養(yǎng)液，37℃，劇烈振蕩混合液1h。將混合液涂布在選擇性培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。
6.5 測序采用ABI377型測序儀(購自美國ABI公司)測定DNA序列，用PCGENE軟件分析序列，由上海博亞生物公司完成。
7、外源插入載體旁鄰序列分析將測序獲得的序列在網(wǎng)上進行BLAST，生物信息學分析，最終確定所擴增獲得的特異序列是否為外源插入載體的旁鄰序列。
三、實驗結果1、TAIL-PCR擴增獲得特異性片段根據(jù)TAIL-PCR擴增方法，單向特異性的PCR引物和隨機引物的組合，經(jīng)過三輪PCR擴增，在對第二、三輪擴增產(chǎn)物的電泳分析結果表明獲得了特異性的MON863玉米品系外源插入載體的旁鄰基因片段。
2、特異性片段測序結果分析2.1MON863玉米品系的5’端玉米基因組和外源插入載體的鄰接區(qū)序列TAIL-PCR方法擴增獲得的單一MON863玉米品系的5’端玉米基因組和外源插入載體的鄰接區(qū)DNA片段，經(jīng)過DNA序列分析和生物信息學分析，鄰接區(qū)的序列長度為411bp，其中含有274bp玉米基因組的序列，137bp外源插入載體的CaMV35S啟動子的5’端序列，具體的MON863玉米品系的5’端玉米基因組和外源插入載體的鄰接區(qū)DNA的序列信息見Seq No.1。
2.2MON863玉米品系的3’端外源插入載體和玉米基因組的鄰接區(qū)序列TAIL-PCR方法擴增獲得的單一的MON863玉米品系的3’端玉米基因組和外源插入載體的鄰接區(qū)DNA片段，經(jīng)過DNA序列分析和生物信息學分析，鄰接區(qū)的序列長度為456bp，其中含有253bp玉米基因組的序列，203bp外源插入載體的tahsp 173’終止子的5’端序列，具體的MON863玉米品系的5’端玉米基因組和外源插入載體的鄰接區(qū)DNA的序列信息見Seq No.2。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱上海交通大學(B)地址上海市東川路800號(C)國家中國(D)郵編200240(E)電話(021)34201073(F)傳真(021)34201073(ii)發(fā)明名稱遺傳改良玉米品系MON863的品系特異性PCR檢測方法(iii)序列數(shù)2(2)SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)長度411堿基(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iii)其他信息描述MON863玉米的5’端插入的旁鄰基因序列(iv)序列描述SEQ ID No.1GCACTCAAAG ACCTGGCGAA TGAGGGCCCA CCCAAGAGCG CTTATGTCAT ATGGGAACTC 60TTGGCTGGAA ACAATCCTTA TGGTTTTTAT ATCCGGTTAG AATAATAAGA AAGAATCAAA 120GTCCAGGTTG GTTGGTGAGC CTAGTGATAG GAGACTATCT AGCTTGGTTC GGAGAGCACT 180TGTTGGGTTT AAGATTAGTT TTTTGCTAAA TGTTACGGCC TAAATGCTGA ACTATTGACC 240CTACTTGTTC GGATGGGTGT TCACCCCAAA GTGTACCAAG CTTTCCGATC CTACCTGTCA 300CTTCATCAAA AGGACAGTAG AAAAGGAAGG TGGCACCTAC AAATGCCATC ATTGCGATAA 360AGGAAAGGCT ATCATTCAAG ATGCCTCTGC CGACAGTGGT CCCAAAGATG G 411
(3)SEQ ID No.2的信息(i)序列特征(A)長度456堿基(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iii)其他信息描述MON863玉米的3’端插入的旁鄰基因序列(iv)序列描述SEQ ID No.2GCGAGTTCTT GCGAGTCTGA TGAGACATCT CTGTATTGTG TTTCTTTCCC CAGTGTTTTC 60TGTACTTGTG TAATCGGCTA ATCGCCAACA GATTCGGCGA TGAATAAATG AGAAATAAAT 120TGTTCTGATT TTGAGTGCAA AAAAAAAGGA ATTAGATCTG TGTGTGTTTT TTGGATCCCC 180GGGGCGGCCG CGGGGAATTC GGTCTCCCTA TAGAGCAGAG CATAGTGACA AAAGTTCCAT 240TTAGATATGG TTGTATCATA TGTATATAAA GAATGTACTC GCAATGAACT GGCTAAGTCC 300AACCAACCAT GATGGCAGCC TGCCCCCCTA TAGCCAAAGC AAGCGATAGC AAATAGTGAT 360TTTATGGAGT AAGCTTCGCT CCGCGCCAAT TAGAAAAAAG TGAAAAGACT CTATGCTCTG 420CTCATATAGA TATGGGATTC CTACTGGGGT TCATGA45權利要求
1.一種玉米品系MON863的外源插入載體的旁鄰基因序列，其特征在于，分離出一種的DNA分子，該分子含有MON863玉米外源插入載體的旁鄰基因序列，包括編碼玉米NADH脫氫酶亞單位1和2的部分的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-253位的核苷酸序列完全相同或SEQ IDNO.2中從核苷酸第138-411位的核苷酸序列完全相同；編碼煙草花椰病毒的35S啟動子的部分序列，其來源于外源插入載體PV-ZMIR13，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第254-456位的核苷酸序列完全相同；編碼小麥tahsp173’終止子的部分序列，其來源于外源插入載體PV-ZMIR13，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.2中從核苷酸第1-137位的核苷酸序列完全相同。
2.根據(jù)權利要求1所述的玉米品系MON863的外源插入載體的旁鄰基因序列，其特征是，所述的分離，是指，用TAIL-PCR方法從玉米基因組中擴增出特異DNA分子。
3.根據(jù)權利要求1所述的玉米品系MON863的外源插入載體的旁鄰基因序列，其特征是，所述的MON863外源插入載體PV-ZMIR13，指的是用來轉化生產(chǎn)MON863玉米的重組質粒，其由NPTII抗性基因表達盒和cry3Bb1基因表達盒組成。
4.根據(jù)權利要求3所述的玉米品系MON863的外源插入載體的旁鄰基因序列，其特征是，所述的MON863外源插入載體PV-ZMIR13，其通用元件，指的是CaMV35S啟動子和小麥tahsp 17 3’終止子，其分別來源于煙草花椰病毒和小麥基因組。
5.根據(jù)權利要求1或3或4所述的玉米品系MON863的外源插入載體的旁鄰基因序列，其特征是，所述的MON863外源插入載體，其與植物基因組的鄰接區(qū)的DNA序列，指的是一段由玉米基因組序列和外源插入載體序列組成的DNA序列，其中，MON863玉米品系5’端旁鄰基因序列為456bp，MON863玉米品系3’端旁鄰基因序列為411bp。
6.根據(jù)權利要求5所述的玉米品系MON863的外源插入載體的旁鄰基因序列，其特征是，所述的玉米基因組序列和外源插入載體序列，包括編碼玉米NADH脫氫酶亞單位1和2的部分的核苷酸序列，長度為253bp，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-253位的核苷酸序列完全相同；編碼小麥tahsp 17 3’終止子的部分序列，長度為203bp，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第1-137位的核苷酸序列完全相同。
7.根據(jù)權利要求5所述的玉米品系MON863的外源插入載體的旁鄰基因序列，其特征是，所述的MON863玉米品系3’端旁鄰基因序列，包括編碼玉米NADH脫氫酶亞單位1和2的部分的核苷酸序列，長度為274bp，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.2中從核苷酸第138-411位的核苷酸序列完全相同；編碼編碼小麥tahsp 17 3’終止子的部分序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ IDNO.2中從核苷酸第1-137位的核苷酸序列完全相同。
全文摘要
一種玉米品系MON863的外源插入載體的旁鄰基因序列，本發(fā)明的MON863玉米外源插入載體的旁鄰基因序列，包括編碼玉米NADH脫氫酶亞單位1和2的部分的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1－253位的核苷酸序列完全相同或SEQ ID NO.2中從核苷酸第138－411位的核苷酸序列完全相同；編碼煙草花椰病毒的35S啟動子的部分序列，其來源于外源插入載體PV－ZMIR13，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第254－456位的核苷酸序列完全相同；編碼小麥tahsp 17 3’終止子的部分序列，其來源于外源插入載體PV－ZMIR13，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.2中從核苷酸第1－137位的核苷酸序列完全相同。本發(fā)明可以進一步用于建立轉基因品系特異性PCR檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK1740322SQ20051002795
公開日2006年3月1日 申請日期2005年7月21日 優(yōu)先權日2005年7月21日
發(fā)明者張大兵, 楊立桃, 潘愛虎, 梁婉琪, 尹長松, 許誦辭, 章可為, 武愛波 申請人:上海交通大學