專利名稱：一種新型海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶及其產(chǎn)酶菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物酶領(lǐng)域，特別涉及一種新型海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶及其高產(chǎn)海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶的假單胞桿菌屬未知種菌株QD80。
背景技術(shù)：
海洋遼闊，微生物資源十分豐富，但由于海洋獨特的環(huán)境，包括高鹽、高壓、低營養(yǎng)、低溫等，造就了海洋微生物有別于陸生微生物的許多特異性如不易培養(yǎng)、形態(tài)多樣且在保藏和移種過程中很容易死亡等，不利于海洋微生物研究和開發(fā)的深入，因而迫切需要建立一些簡單、方便、易于操作并能在一定程度上更科學(xué)、更精確、更快速地找到并能分離得到有用微生物菌株，為海洋微生物資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。目前，大分子rRNA已成為一個分子指標，廣泛地用于各種微生物的遺傳和分子差異的研究，加上大量已知微生物的DNA都已被測定并輸入國際基因數(shù)據(jù)庫，成為微生物鑒定分類非常有用的參照系統(tǒng)，從而可以通過對未知微生物DNA序列的測定和比較分析，達到以其進行快速、有效的鑒定分類的確定新的菌株的目的。
近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展，尋找具有全新性質(zhì)的酶已成為國際酶制劑研究的熱點。海洋生物由于生長在海洋這一獨特的環(huán)境中，特別是生活在極端環(huán)境下的海洋微生物和微藻，能產(chǎn)生豐富的極端酶。與陸地微生物所產(chǎn)生的酶相比，海洋酶具有更為獨特的酶學(xué)性質(zhì)，因此引起了國內(nèi)外研究人員的極大關(guān)注。堿性蛋白酶作為一種改進合成洗滌劑去垢性的必要成分已為世人共識。但在過去的10年中，世界洗滌傳統(tǒng)發(fā)生了革命性的改變。全球洗衣正向著低溫、節(jié)水型發(fā)展，傳統(tǒng)的洗滌劑用酶(主要是堿性蛋白酶)在較低溫下所表現(xiàn)出的清潔能力已難以滿足消費者的需求，所以需要在低溫區(qū)域具有明顯相對活性優(yōu)勢的酶。目前已知的洗滌劑用商品低溫堿性蛋白酶包括Properase CT(GENENCOR國際公司，美國)、Savinase4.OT(NOVO公司，丹麥)等品牌，氧化穩(wěn)定性洗滌劑堿性蛋白酶為MaxapemCX(GENENCOR國際公司，美國)。其中Savinase 4.0T酶在pH 10.1條件下，最適反應(yīng)溫度55℃、20℃時相對活性約為15％。Properase CT酶在pH 10條件下，最適反應(yīng)溫度50-55℃、20℃時相對活性約為42％。MaxapemCX酶在最適條件下于20mM H2O2中可穩(wěn)定60min?？梢姡诟髯酝扑]的最適條件下，在低溫區(qū)蛋白酶的相對活性較低，所以這些酶的低溫活性區(qū)和對氧化劑的穩(wěn)定性仍然沒有令人滿意。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供在中國東海海域的海泥中培養(yǎng)分離得到的一種高產(chǎn)新型海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶的假單胞桿菌屬未知種菌株QD80。
本發(fā)明的另一目的提供由上述假單胞桿菌屬未知種菌株QD80高產(chǎn)海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶。
本發(fā)明提供的新型假單胞桿菌屬未知種菌株QD80是從東海海域的海泥中培養(yǎng)分離得到高產(chǎn)新型海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶(簡稱低溫堿性金屬蛋白酶)的假單胞桿菌屬未知種菌株QD80。該假單胞桿菌屬未知種菌株QD80于2004年12月1日保藏于中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC NOM204100。
本發(fā)明提供的假單胞桿菌屬未知種菌株QD809(簡稱菌株QD80)形態(tài)特征形態(tài)特征對菌株(指菌株QD80)進行革蘭氏染色，為革蘭氏陰性菌。顯微鏡形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)形態(tài)特征呈粗的短桿狀；周生鞭毛、好氧；菌落乳白色、凸起、邊緣光滑；不透明、不產(chǎn)生色素。
菌株QD80 16SrDNA序列經(jīng)測定，全長為1443bp。將該16SrDNA序列遞交GenBank進行Blast同源序列檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在親緣關(guān)系相近的前500個序列中，前400個均為假單胞桿菌屬的菌株，QD80與他們都具有98％以上的同源性。
菌株QD80 16srRNA全序列GCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGGTGCTTGCACCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAACCTTGAGTTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTANCACGGTGTGATTCATG菌株QD80 16SrRNA基因序列在某些位點會以不同的幾率發(fā)生突變，在種、屬等水平上表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)和功能的保守性，有“細菌化石”之稱，特別是其進化具有良好的時鐘性質(zhì)，是生物進化史的計時器。應(yīng)用16SrRNA作為分子指標，可以實現(xiàn)快速、微量、準確、簡便的對微生物進行分類鑒定。
本發(fā)明提供的海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶，是由假單胞桿菌屬未知種菌株QD80高產(chǎn)的海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶，特性為
(1)酶的基因ATGATCGAATCCGTCGAGCACTTCCTTGCCCGCCTCAAAAAACGCGACCCAGACCAGCCAGAATTCCACCAGGCGGTGGAAGAAGTCCTGCGCAGCCTGTGGCCTTTTCTCGAAGCCAATCCGCACTACCTGACTTCCGGGATTCTCGAACGTATTTGCGAACCTGAGCGGGCAATTGTGTTTCGCGTGTCATGGGTGGATGACGAAGGCAAAGTGCGGGTTAACCGCGGCTTCCGCATTCAGATGAACAGCGCCATTGGCCCTTACAAAGGCGGGTTGCGCTTCCACCCGTCGGTGAATTTGGGGGTGTTGAAGTTCTTGGCGTTTGAACAAACCTTCAAAAACTCCCTGACCTCGCTGCCCATGGGCGGCGGTAAGGGTGGCTCGGATTTCAACCCCAAGGGCAAGAGCGACGCGGAAGTCATGCGTTTCTGCCAGGCCTTCATGAGCGAGCTGTACCGTCATATCGGTTCGGACGTGGACGTGCCCGCTGGCGATATCGGCGTCGGCGCCCGTGAGATTGGCTTCCTCTTTGGCCAATACAAACGCCTGAGCAACCAGTTCACCTCCGTGTTGACCGGCAAAGGCATGAGCTACGGCGGCAGCCTGATTCGCCCGGAAGCCACCGGGTTTGGCTGCGTGTATTTTGCGCAGGAAATGCTCAAGCGCAGCGGCCAGCGGATTGATGGCAAGCCGGTTGCGATTTCCGGCTCGGGTAACGTGGCGCAGTATGCCGCGCGCAAAGTCATGGACCTGGGCGGCAAAGTCATTTCGCTCTCGGACTCCGAAGGCACCCTGTATTGCGAAGCCGGTCTGGACGACGCGCAGTGGGAAGCACTGATGGAGCTGAAAAACGTCAAGCGCGGACGTATCAGCGAACTGGCGGCGCAATTTGGTCTGGAGTTTCTGGCGGGCCAGCATCCGTGGCATCTGCCCTGTGACATTGCGCTGCCTTGCGCAACACAGAACGAACTGGACGCCGAAGCCGCTCGCACATTGCTGAGCAATGGCTGTGGGTGCGTGGCCGAAGGCGCCAACATGCCGACCACGCTGGAAGCGGTGGACCTGTTTATCGAGGCGGGCATTTTGTTCGCACCGGGCAAAGCCTCCAATGCGGGCGGTGTGGCCGTGAGCGGTCTGGAAATGTCGCAGAACGCCATGCGCTTGCTGTGGACGGCGGGTGAGGTGGACAGCAAGTTGCACAACATCATGCAATCGATCCACCACGCCTGA。
(2)酶(指低溫堿性金屬蛋白酶)的分子量、等電點SDS-PAGE凝膠電泳測得該酶的表觀分子量為49000±1000Dal。HPLC凝膠過濾法測定酶分子量為49320Dal。薄層聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦測定酶的等電點為pH8.5。
(3)酶的底物特異性該蛋白酶在35℃以下低溫條件下具有低活化能和高活性，所以在低溫下能有效的降解蛋白類物質(zhì)，諸如蛋白污漬(奶、血、草汁)或肽及酪蛋白、血紅蛋白、血纖維蛋白、彈性蛋白、肉蛋白、魚蛋白質(zhì)等蛋白質(zhì)。
(4)酶最適反應(yīng)溫度、pH采用Folin-酚法測定酶活性，通過預(yù)先調(diào)整的pH緩沖體系，測定了不同pH對酶活性的影響，結(jié)果該酶的有效pH穩(wěn)定范圍約在6-10(不同pH條件下，20℃保溫60min后的活性)；最適反應(yīng)pH為9-10(20℃，反應(yīng)時間10min)。
通過上述相同的測酶活性方法，測定了不同溫度對酶活性的影響，結(jié)果該酶的有效溫度穩(wěn)定范圍約在20℃以下(不同溫度條件下pH9.5保溫60min后的活性)；最適反應(yīng)溫度為30℃(pH9.5，反應(yīng)時間10min).
(5)酶與常規(guī)試劑的配伍性金屬離子對低溫堿性金屬蛋白酶的影響

配伍化學(xué)試劑對酶活性的影響

抑制物質(zhì)對酶活性的影響

穩(wěn)定劑(增稠劑)對酶活性的影響


(6)酶的穩(wěn)定性該低溫堿性金屬蛋白酶能夠滿足下列條件之一①Folin-酚試劑法測定該低溫堿性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含過氧化氫(H2O2)緩沖溶液(50Mm硼砂鹽緩沖液、pH10，H2O220mM、Ca2+5mM)放置60min后剩余酶活性不低于95％。
②按Folin-酚試劑法測定該低溫堿性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含1％(W/V)過硼酸鈉(NaBO3)緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10，Ca2+5mM)放置60min后剩余酶活性不低于90％。
③按Folin-酚試劑法測定該低溫堿性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS)緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10，LAS500ppm、Ca2+5mM)放置60min后剩余酶活性不低于65％。
④按Folin-酚試劑法測定該低溫堿性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含亞硫酸鈉(Na2SO3)緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10，Na2SO38mM、Ca2+5mM)放置60min后剩余酶活性不低于90％。
⑤按Folin-酚試劑法測定該低溫堿性金屬蛋白酶的活性，10℃下在含5％(W/V)氯化鈉(NaCl)緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10，Ca2+5mM)放置12小時后剩余酶活性不低于70％。
⑥按Folin-酚試劑法測定該低溫堿性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含2％(V/V)乙醇緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10，Ca2+5mM)放置121小時后剩余酶活性不低于70％。
(7)酶動力學(xué)研究①酶基本動力學(xué)參數(shù)以不同濃度酪蛋白為底物，在0.05M甘氨酸—氫氧化鈉pH9.5緩沖液中，反應(yīng)體系溫度18℃，測定反應(yīng)的初速度v0，對[S]作圖，結(jié)果如下 ②溫度對酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的影響以酪蛋白為底物，在0.05M甘氨酸—氫氧化鈉pH9.5緩沖液中，按Folin法測不同溫度下反應(yīng)穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)V、Km的。
結(jié)果由Hanes作圖法求得動力學(xué)參數(shù)V、Km。
T(℃) 5.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0V(10-4g·l-1·s-1) 1.53 6.21 13.41 16.98 23.37 33.05 27.65Km(g·l-1) 0.19 2.11 5.37 6.29 10.65 14.51 10.48根據(jù)Arrhenius公式k＝A·e-Ea/RT上式可改寫為 logk＝logA-Ea/2.3RT將logK對1/T作圖由圖1的直線斜率求得Ea＝33242J/mol。結(jié)果如下反應(yīng) 催化劑 活化能(J/mol)H+66944乙酸丁酯水解 OH-41840胰脂肪酶18828H+83680酪蛋白水解胰蛋白酶50208H+104600蔗糖水解酵母蔗糖酶 33472以Ke和KH表示酶和H+催化的反應(yīng)速度常數(shù)，則logke=logA-Eae2.3RT]]>
logkH=logA-EaH2.3RT]]>logkekH=EaH-Eae2.3RT=83680-332422.3×8.28×303=8.7]]>kekH=5.0×108]]>反應(yīng)的溫度系數(shù)Q10(Q10表示溫度升高10℃，反應(yīng)速度提高的倍數(shù))。
logQ10＝logkT2/kT2＝Ea(1/T1-1/T2)/(2.3R)＝[1/(T1··T2)]10×33242/(2.3×8.28)＝17455[1/(T1··T2)](3)pH對酶動力學(xué)參數(shù)的影響以酪蛋白為底物，在0.05M不同pH值緩沖液(磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉pH6-7；Tris-鹽酸pH8；甘氨酸pH9-11)中，按Folin法測不同pH下反應(yīng)穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)V、Km的，反應(yīng)體系控制30℃。
由Hanes作圖法求得的不同pH下的動力學(xué)參數(shù)V、Km。
pH6.0 7.0 8.08.59.09.510.0 10.5 11Vap(10-4g·l-1·s-1) 3.45 5.83 10.57 12.07 13.16 23.10 23.32 25.85 15.17Kap(g·l-1) 1.31 2.50 3.80 4.48 5.06 10.46 10.53 11.64 7.12將測得的V取log對pH作圖，得到反應(yīng)的pH曲線見圖2。
根據(jù)圖2所測數(shù)據(jù)，求得pKa＝9.3、pKb＝10.7，低溫堿性金屬蛋白酶催化酪蛋白反應(yīng)的最適pH0＝10.0。
(4)抑制劑對酶反應(yīng)的作用以酪蛋白為底物，通過加入不同濃度的EDTA，在0.05M甘氨酸—氫氧化鈉pH9.5緩沖液中，測定反應(yīng)的V、Km，反應(yīng)體系溫度18℃。結(jié)果采用Kinetics軟件進行分析，EDTA對酶抑制情況數(shù)據(jù)分析
競爭性8.390.51 1.67非競爭性 0.800.05 0.06混合 0.100.06 0.09根據(jù)分析結(jié)果我們可以看到，EDTA對于該酶的抑制屬于可逆抑制中的競爭性抑制，在可逆抑制劑存在條件下，酶反應(yīng)系統(tǒng)進行的反應(yīng)可表示為
在這種抑制中，酶不能同時和底物、抑制劑結(jié)合，即不能形成EIS，或者說K′i或K′s＝∞，它的動力學(xué)方程是vi=V·[S][S]+Km(1+[I]/Ki)]]>EDTA與酶結(jié)合后，Km增大了(1+[I]/Ki)倍，而酶和底物的親和力降低了(1+[I]/Ki)倍；[I]愈高，Ki愈小，抑制劑濃度愈高，酶和抑制劑間的結(jié)合力愈強，Km增大，酶和底物親和力進一步降低，酶反應(yīng)速度因之相應(yīng)減緩。抑制程度取決于[I]和[S]、Ks和Ki的相對大小，以(1/vi-1/v)表示抑制程度時，有1vi-1vi=1V·Ks[S]·[I]Ki]]>表明底物、抑制劑在濃度以及它們和酶的親和力上存在著競爭關(guān)系，底物具有保護作用。EDTA和該海洋低溫堿性蛋白酶的活性部位結(jié)合，阻止了酶與底物的進一步結(jié)合，從而抑制了酶的活性，由于EDTA是對金屬有強螯合作用的特征試劑，可能有金屬離子存在于該酶活性中心，該蛋白酶為低溫堿性金屬蛋白酶。該蛋白酶可廣泛應(yīng)用于洗滌劑、飼料、毛織品處理等領(lǐng)域中。


圖1為logK～1/T作2為lgV對pH作圖(30℃)具體實施方式
本發(fā)明用下列實施例來說明本發(fā)明，但本發(fā)明并保護范圍不限于下列實施例實施例1產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)及海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶的生產(chǎn)20℃下將本發(fā)明假單胞桿菌屬未知種菌株QD80在500ml含有3.5％大豆粉、2％麩皮、0.4％ NaH2PO4、0.03％ K2HPO4、0.2％ Ca(Cl)2的培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)48小時(用1M氫氧化鈉將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)到7.5-7.7)，然后可在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并分泌所述的低溫堿性金屬蛋白酶。4℃下以1000G離心此培養(yǎng)物，獲得含有本發(fā)明酶的上清液。上清液中的酶的活性大約為700u/ml(用上述Folin-酚試劑法測定)。
實施例2海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶的純化將在實施例1.中獲得的培養(yǎng)物的上清液再用30-65％飽和度的(NH4)2SO4分級沉淀，離心收取沉淀。將沉淀溶解在蒸餾水中，并透析24小時。將透析液過二乙氨乙基一瓊脂糖(DEAE-Sepharose) FF陰離子交換層析柱，用0-1M NaCl·磷酸緩沖液(20mM，pH7.0)梯度洗脫，收集活性組分再經(jīng)CM-Sepharose FF凝膠層析柱，用0-1M NaCl·磷酸緩沖液(10mM，pH5.0)梯度洗脫，收集活性組分。然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE鑒定，經(jīng)考馬斯亮蘭染色為單一條帶，激光灰度掃描結(jié)果，樣品純度大于95％。
權(quán)利要求
1.一種假單胞桿菌屬未知種菌株QD80為從東海海域的海泥中培養(yǎng)分離得到，該未知種菌株QD80高產(chǎn)海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶，該菌株保藏在中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM204100。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的假單胞桿菌屬未知種菌株QD80，其特征在于該菌株形態(tài)特征與生物生化特征對菌株進行革蘭氏染色，為革蘭氏陰性菌；顯微鏡形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)形態(tài)特征呈粗的短桿狀；周生鞭毛、好氧；菌落乳白色、凸起、邊緣光滑；不透明、不產(chǎn)生色素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的假單胞桿菌屬未知種菌株QD80，其特征在于該菌株QD80 16srRNA全序列如下，全長為1443bpGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGGTGCTTGCACCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAACCTTGAGTTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTANCACGGTGTGATTCATG16SrRNA基因序列在某些位點會以不同的幾率發(fā)生突變，在種、屬等水平上表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)和功能的保守性。
4.一種海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶，其特征在于由假單胞桿菌屬未知種菌株QD80產(chǎn)生的海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶。
5.一種海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶，其特性為(1)酶的基因ATGATCGAATCCGTCGAGCACTTCCTTGCCCGCCTCAAAAAACGCGACCCAGACCAGCCAGAATTCCACCAGGCGGTGGAAGAAGTCCTGCGCAGCCTGTGGCCTTTTCTCGAAGCCAATCCGCACTACCTGACTTCCGGGATTCTCGAACGTATTTGCGAACCTGAGCGGGCAATTGTGTTTCGCGTGTCATGGGTGGATGACGAAGGCAAAGTGCGGGTTAACCGCGGCTTCCGCATTCAGATGAACAGCGCCATTGGCCCTTACAAAGGCGGGTTGCGCTTCCACCCGTCGGTGAATTTGGGGGTGTTGAAGTTCTTGGCGTTTGAACAAACCTTCAAAAACTCCCTGACCTCGCTGCCCATGGGCGGCGGTAAGGGTGGCTCGGATTTCAACCCCAAGGGCAAGAGCGACGCGGAAGTCATGCGTTTCTGCCAGGCCTTCATGAGCGAGCTGTACCGTCATATCGGTTCGGACGTGGACGTGCCCGCTGGCGATATCGGCGTCGGCGCCCGTGAGATTGGCTTCCTCTTTGGCCAATACAAACGCCTGAGCAACCAGTTCACCTCCGTGTTGACCGGCAAAGGCATGAGCTACGGCGGCAGCCTGATTCGCCCGGAAGCCACCGGGTTTGGCTGCGTGTATTTTGCGCAGGAAATGCTCAAGCGCAGCGGCCAGCGGATTGATGGCAAGCCGGTTGCGATTTCCGGCTCGGGTAACGTGGCGCAGTATGCCGCGCGCAAAGTCATGGACCTGGGCGGCAAAGTCATTTCGCTCTCGGACTCCGAAGGCACCCTGTATTGCGAAGCCGGTCTGGACGACGCGCAGTGGGAAGCACTGATGGAGCTGAAAAACGTCAAGCGCGGACGTATCAGCGAACTGGCGGCGCAATTTGGTCTGGAGTTTCTGGCGGGCCAGCATCCGTGGCATCTGCCCTGTGACATTGCGCTGCCTTGCGCAACACAGAACGAACTGGACGCCGAAGCCGCTCGCACATTGCTGAGCAATGGCTGTGGGTGCGTGGCCGAAGGCGCCAACATGCCGACCACGCTGGAAGCGGTGGACCTGTTTATCGAGGCGGGCATTTTGTTCGCACCGGGCAAAGCCTCCAATGCGGGCGGTGTGGCCGTGAGCGGTCTGGAAATGTCGCAGAACGCCATGCGCTTGCTGTGGACGGCGGGTGAGGTGGACAGCAAGTTGCACAACATCATGCAATCGATCCACCACGCCTGA；(2)酶的分子量、等電點酶的表觀分子量為49000±1000Dal，酶分子量為49320 Dal，酶的等電點為pH8.5；(3)酶的底物特異性該蛋白酶在35℃以下低溫條件下具有低活化能和高活性，在低溫下能有效的降解蛋白類物質(zhì)；(4)酶最適反應(yīng)溫度、pH最適反應(yīng)pH為9-10，酶的有效pH穩(wěn)定范圍在6-10，最適反應(yīng)溫度為30℃；(5)酶與常規(guī)試劑的配伍性金屬離子對低溫堿性金屬蛋白酶的影響
配伍化學(xué)試劑對酶活性的影響.
抑制物質(zhì)對酶活性的影響
穩(wěn)定劑對酶活性的影響
(6)酶的穩(wěn)定性該低溫堿性金屬蛋白酶能夠滿足下列條件之一①按Folin-酚試劑法測定該低溫金屬堿性蛋白酶的活性，25℃下在含過氧化氫緩沖溶液(50Mm硼砂鹽緩沖液、pH10，H2O220mM、Ca2+5mM)放置60min后剩余酶活性不低于95％；②按Folin-酚試劑法測定該低溫堿性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含1％(W/V)過硼酸鈉緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10，Ca2+5mM)放置60min后剩余酶活性不低于90％；③按Folin-酚試劑法測定該低溫堿性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含直鏈烷基苯磺酸鈉緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10，直鏈烷基苯磺酸鈉500ppm、Ca2+5mM)放置60min后剩余酶活性不低于65％；④按Folin-酚試劑法測定該低溫堿性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含亞硫酸鈉緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10，Na2SO38mM、Ca2+5mM)放置60min后剩余酶活性不低于90％；⑤按Folin-酚試劑法測定該低溫堿性金屬蛋白酶的活性，10℃下在含5％(W/V)氯化鈉緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10，Ca2+5mM)放置12小時后剩余酶活性不低于70％；⑥按Folin-酚試劑法測定該低溫堿性金屬蛋白酶的活性，25℃下在含2％(V/V)乙醇緩沖溶液(50mM硼砂鹽緩沖液、pH10，Ca2+5mM)放置121小時后剩余酶活性不低于70％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從東海海域的海泥中培養(yǎng)分離得到的假單胞桿菌屬未知種菌株QD80，該菌株保藏在CCTCC，保藏號為CCTCC NOM204100，以及由該菌株高產(chǎn)的新型海洋微生物低溫堿性金屬蛋白酶，可廣泛應(yīng)用于各種洗滌劑、飼料、毛織品處理等領(lǐng)域。
文檔編號C12N1/20GK1632106SQ20051000205
公開日2005年6月29日 申請日期2005年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月12日
發(fā)明者孫謐, 郝建華, 王躍軍, 朱重浩 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所