專利名稱：一種糖苷酶催化與鹽析萃取偶聯(lián)制備天然藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鹽析萃取與糖苷酶水解反應(yīng)偶聯(lián)制備藥 物或藥物中間體的方法。
背景技術(shù)：
天然產(chǎn)物逐漸成為醫(yī)藥、食品及飼料的重要來源，以天然產(chǎn)物為主的保健食品和 藥物目前具有相當(dāng)大的市場。糖苷類天然產(chǎn)物在眾多天然產(chǎn)物中占有重要地位，一系列 具有生物活性及藥用價(jià)值的糖苷相繼投入使用，如天麻苷、熊果苷、洋地黃苷、桔梗皂苷、人 參皂苷等。苷類的活性常與糖基的類型和數(shù)量相關(guān)，糖基的改變可引起活性的變化，許多 苷元都具有比糖苷更強(qiáng)的生物活性，因此糖苷水解研究受到人們的普遍關(guān)注。相比于化 學(xué)(酸或堿)水解，生物或酶催化水解具有選擇性高、條件溫和、活性保留率高、環(huán)境污染 小等特點(diǎn)，因而近年來研究開發(fā)的報(bào)道也比較多。例如，沈玥等利用乳酸菌葡萄糖苷 酶水解大豆異黃酮，制備大豆異黃酮苷元(中國油脂，2009,34(9) :60-63)；伍毅等利用固 定化葡萄糖苷酶水解銀杏黃酮苷制備黃酮苷元(哈爾濱工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30 (5) 584-588)；楊軼舜等利用固定化β -葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化京尼平苷制備京尼平(華東理工碩士 學(xué)位論文，2009)；胡英杰等用蝸牛酶水解牛蒡子苷制備苷元(廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004， 21(6) =473-475)；韓鳳梅等用纖維素酶對(duì)盾葉薯蕷進(jìn)行預(yù)處理，提高薯蕷皂苷元得率(化 學(xué)與生物工程，2004，6J6-27)；，李夢青等用纖維素酶把虎杖中的白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化成白藜 蘆醇(精細(xì)化工，2008，25 (5) :467-470)，等等。由于糖苷類天然產(chǎn)物大多數(shù)水溶性較差，反應(yīng)體系中的底物濃度較低，因此生 物或酶催化水解的效率比較低。不少學(xué)者開展了一些研究試圖解決上述問題，結(jié)果表明 有些有機(jī)溶劑能夠增加糖苷的溶解度，提高酶催化反應(yīng)的速度。如詹秀文發(fā)現(xiàn)四氫呋喃 (彡8% )、二甲基亞砜(彡18% )、含2%四氫呋喃的二甲基亞砜(彡15% )、含10%二甲 基亞砜的四氫呋喃(< 8%)對(duì)豬胰脂肪酶都有激活作用(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文， 2008)。盡管有機(jī)相酶催化反應(yīng)速度得到提高，但是隨著產(chǎn)物的不斷積累，酶的活性往往受 到高濃度產(chǎn)物的抑制，尤其是水解下來的單糖對(duì)酶的活性有明顯的抑制作用，嚴(yán)重影響反 應(yīng)速度和轉(zhuǎn)化率。如郁惠蕾等研究表明高濃度的單糖可使糖苷水解酶催化的糖苷水解反應(yīng) 向逆方向進(jìn)行(有機(jī)化學(xué)，2006，沈(6) :1052-1058).如果能將產(chǎn)物及時(shí)移走，那么無疑將 解除產(chǎn)物對(duì)酶的抑制作用，進(jìn)一步提高反應(yīng)速度。萃取與發(fā)酵或酶催化反應(yīng)耦合，實(shí)現(xiàn)邊反應(yīng)邊分離，這是近幾年研究的熱點(diǎn)，但在 糖苷酶催化的水解反應(yīng)方面尚無文獻(xiàn)報(bào)道。鹽析萃取近年來在天然產(chǎn)物分離方面有一些成 功的嘗試，如利用親水性的低分子有機(jī)物與無機(jī)鹽溶液形成的新型雙水相將極性較強(qiáng)的有 效成分富集在上相，或者用無機(jī)鹽溶液、親水性的低分子有機(jī)物以及疏水性有機(jī)物形成的 三液相體系分離不同極性的有效成分(中國專利CN101637667)。將糖苷酶催化與鹽析萃 取分離偶聯(lián)還需要解決酶在有機(jī)相中的穩(wěn)定性問題，考察底物、產(chǎn)物、酶的分配與匹配，達(dá) 到提高底物溶解度，解除產(chǎn)物抑制，提高酶催化效率的目的。本發(fā)明的目的就在于開發(fā)一種新的、易于產(chǎn)業(yè)化的反應(yīng)分離耦合的方法，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
為解決天然活性成分在酶催化轉(zhuǎn)化與提取分離過程中存在的諸多問題，如有效成 分在水相中溶解度低，產(chǎn)物積累抑制酶催化活性，有效成分轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物分離步驟繁瑣等，本 發(fā)明提供了一種糖苷酶催化與鹽析萃取偶聯(lián)制備天然藥物或中間體的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括如下步驟將酶催化轉(zhuǎn)化的底物溶解于親水性有機(jī)溶劑中，加入可溶性無機(jī)鹽，靜置分成上 下兩相，然后將糖苷酶加入上相，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。水解下的單糖分配于下相(無機(jī)鹽相)，上 相是富含目標(biāo)產(chǎn)物的萃取液；或者向兩相系統(tǒng)中加入疏水性有機(jī)溶劑，形成三液相，然后將 糖苷酶加入中間相，反應(yīng)產(chǎn)生的單糖分配于無機(jī)鹽相，目標(biāo)產(chǎn)物富集于上相，未反應(yīng)的底物 和酶則保留在中間相。糖苷酶催化轉(zhuǎn)化的底物為糖苷類單體化合物(留體和萜類皂苷、蒽醌萜類以及環(huán) 烯醚類皂苷)或含此類成分的藥材粉末、提取物，單體化合物如盾葉新苷、三角葉皂苷、薯 蕷皂苷元-葡萄糖三糖苷、薯蕷皂苷元-葡萄糖二糖苷、延玲草次苷、白藜蘆醇苷、京尼平 苷、人參皂苷Re、RgU Rd、Re、甘草酸、大豆皂苷I、II、IV等，藥材如盾葉薯蕷、虎杖、桅子、 人參、甘草、大豆等中藥材。目標(biāo)產(chǎn)物為糖基數(shù)目少于轉(zhuǎn)化底物的藥物或藥物中間體，如薯 蕷皂苷元、白藜蘆醇、京尼平、人參皂苷Rg3、人參皂苷他2、人參皂苷F2、人參皂苷CK、單葡 萄糖醛酸-甘草次酸、大豆留醇B等。糖苷酶為淀粉酶、纖維素酶、β葡萄糖苷酶、柚苷酶、半乳糖苷酶或者蝸牛酶等商 品酶中一種或兩種以上的混合酶，也可以是能產(chǎn)生以上酶的微生物細(xì)胞或誘導(dǎo)產(chǎn)生的同工 酶，同工酶由微生物經(jīng)藥材或糖苷單體化合物誘導(dǎo)產(chǎn)生。這些酶也可以是經(jīng)過化學(xué)修飾或 者固定化的酶，以便提高酶的穩(wěn)定性與重復(fù)利用性。糖苷酶可以水解天然產(chǎn)物中存在的幾 種糖苷鍵β -葡萄糖苷鍵、鼠李糖苷鍵、半乳糖苷鍵等。可溶性無機(jī)鹽為磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、鹵化物或其二種以上混合物，可溶性無 機(jī)鹽占體系的質(zhì)量份數(shù)為5 35%。親水性有機(jī)溶劑為醇類、短鏈醚類、呋喃類、亞砜類、環(huán)氧烷類或其二種以上混合 物，親水性有機(jī)溶劑占體系的質(zhì)量份數(shù)為5 40%。三液相鹽析萃取體系中所選用的疏水性有機(jī)溶劑為烷類、酯類、長鏈醚類或其混 合物，疏水性有機(jī)溶劑占體系的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 60%。酶催化反應(yīng)溫度為20 70°C，攪拌轉(zhuǎn)速為20 250rpm。糖苷酶水解反應(yīng)的時(shí)間 為 0. 5 200h。反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，可以將含有糖的無機(jī)鹽相轉(zhuǎn)移，更換新的無機(jī)鹽相，或者在三相萃取 催化反應(yīng)中將含有產(chǎn)物的疏水性有機(jī)相轉(zhuǎn)移，更換新的疏水性有機(jī)相，再補(bǔ)加底物和少許 酶，使反應(yīng)不斷進(jìn)行。本發(fā)明的有益效果(1)有機(jī)溶劑有助于提高底物的溶解度；(2)將糖苷酶催化與鹽析萃取偶聯(lián)有利于解除產(chǎn)物對(duì)酶活性的抑制作用，提高反 應(yīng)速率；
(3)酶催化轉(zhuǎn)化和鹽析萃取偶聯(lián)可以實(shí)現(xiàn)邊反應(yīng)邊分離，簡化生產(chǎn)流程，提高生產(chǎn) 效率，降低生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例。實(shí)施例1 纖維素酶催化轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷與雙水相萃取相耦合將5g硫酸銨溶于10. Sg水中，配成硫酸銨溶液。將上述無機(jī)鹽溶液和4. 2g溶有 白藜蘆醇苷的乙醇混合，攪拌均勻，靜置IOmin分相。將纖維素酶緩慢加入乙醇相，攪拌上 相反應(yīng)10h。反應(yīng)溫度25°C，攪拌轉(zhuǎn)速為70rpm。分析結(jié)果表明，100%的白藜蘆醇苷分配在 上相，并且在10小時(shí)內(nèi)完全轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇。以水相中的酶催化反應(yīng)相比，同等條件下白 藜蘆醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%則需要12h，雙水相的存在明顯縮短了反應(yīng)時(shí)間。實(shí)施例2 蝸牛酶催化轉(zhuǎn)化盾葉薯蕷與雙水相萃取的耦合將粗皂苷溶于1，4-丁二醇中，制備1，4-丁二醇皂苷液。取3. 36g硫酸銨和11. 04g 水配成硫酸銨溶液。將上述無機(jī)鹽溶液和3. 6g 1，4-丁二醇皂苷液混合，攪拌后靜置IOmin 分相。分析各種皂苷的分布表明，20%的薯蕷皂苷元分配在上相(1，4_ 丁二醇相)，80% 的薯蕷皂苷元分配在下相(硫酸銨相)，而盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷、葡萄糖三糖苷、葡 萄糖二糖苷、延齡草次苷在上下相的分配各占一半。將蝸牛酶溶液緩慢加入上相，反應(yīng)溫 度50°C，攪拌轉(zhuǎn)速為70rpm，反應(yīng)48h，薯蕷皂苷元的轉(zhuǎn)化率達(dá)到11%。以等量的酶和底物 在水相中反應(yīng)以及移去下相只留上相的酶催化反應(yīng)作為對(duì)照，前者薯蕷皂苷元轉(zhuǎn)化率僅為 2. 5%，后者為5%，說明酶催化與雙水相耦合過程有明顯優(yōu)勢。實(shí)施例3 蝸牛酶催化轉(zhuǎn)化盾葉薯蕷皂苷與三液相萃取的耦合將粗皂苷溶于1，4-丁二醇中，制備1，4-丁二醇皂苷液。取3. 36g硫酸銨和11. 04g 水配成硫酸銨溶液。將上述無機(jī)鹽溶液和3. 6g 1，4-丁二醇皂苷液及2. Og石油醚混合， 攪拌后靜置lOmin，形成三液相。分析各種皂苷的分配表明，95%的薯蕷皂苷元分配在上相 (石油醚相)，5%的薯蕷皂苷元分配在中相(1，4_丁二醇相)，80%的葡萄糖三糖苷、葡萄糖 二糖苷、延齡草次苷分配在中相(1，4_ 丁二醇相)，其余20%分配于下相(硫酸銨相)。將 蝸牛酶溶液緩慢加入中間相，反應(yīng)溫度35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為IOOrpm，反應(yīng)48h，薯蕷皂苷元轉(zhuǎn) 化率為30%。以等量的酶和底物在水相中反應(yīng)以及移去上下相只保留中間相的酶催化反應(yīng) 作為對(duì)照，前者薯蕷皂苷元轉(zhuǎn)化率僅為2.5%，后者為5%;酶催化與三液相耦合的反應(yīng)效率 至少提高六倍。實(shí)施例4 纖維素酶催化轉(zhuǎn)化盾葉薯蕷皂苷與三液相萃取的耦合將粗皂苷溶于1，4_ 二氧六環(huán)中，制備1，4_ 二氧六環(huán)皂苷液。取3.6g硫酸銨和 10. Sg水配成硫酸銨溶液。將上述無機(jī)鹽溶液和3. 6g 1,4- 二氧六環(huán)皂苷液及2. Og正己 烷混合，攪拌后靜置lOmin，形成三液相。各種皂苷的分析結(jié)果表明，100%的薯蕷皂苷元分 配在上相(正己烷相)，100%的葡萄糖三糖苷、葡萄糖二糖苷、延齡草次苷分配在中相(1， 4-二氧六環(huán)相)。將纖維素酶溶液緩慢加入中間相，反應(yīng)溫度35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為lOOrpm。反 應(yīng)72h，薯蕷皂苷元轉(zhuǎn)化率為69%。以等量的酶和底物在水相中反應(yīng)以及移去上下相只保 留中間相的酶催化反應(yīng)作為對(duì)照，前者薯蕷皂苷元轉(zhuǎn)化率僅為2. 5%，后者為34% ；酶催化 與三液相耦合的反應(yīng)效率比有機(jī)相反應(yīng)提高一倍，比水相反應(yīng)提高27. 6倍。
權(quán)利要求
1.一種糖苷酶催化與鹽析萃取偶聯(lián)制備天然藥物的方法，其特征在于將酶催化轉(zhuǎn)化 的底物溶解于親水性有機(jī)溶劑中，加入可溶性無機(jī)鹽，靜置分成上下兩相，然后將糖苷酶加 入上相，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；水解下的單糖分配于下相，上相是富含目標(biāo)產(chǎn)物的萃取液；或者向 兩相系統(tǒng)中加入疏水性有機(jī)溶劑，形成三液相，然后將糖苷酶加入中間相，反應(yīng)產(chǎn)生的單糖 分配于無機(jī)鹽相，目標(biāo)產(chǎn)物富集于上相，未反應(yīng)的底物和酶則保留在中間相；糖苷酶催化轉(zhuǎn)化的底物為糖苷類單體化合物或含此類成分的藥材粉末、提取物；糖苷酶為淀粉酶、纖維素酶、β葡萄糖苷酶、柚苷酶、半乳糖苷酶或者蝸牛酶等商品酶 中一種或兩種以上的混合酶；或是能產(chǎn)生以上酶的微生物細(xì)胞或誘導(dǎo)產(chǎn)生的同工酶，同工 酶由微生物經(jīng)藥材或糖苷單體化合物誘導(dǎo)產(chǎn)生；可溶性無機(jī)鹽為磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、商化物或其二種以上混合物，可溶性無機(jī)鹽 占體系的質(zhì)量份數(shù)為5 35% ；親水性有機(jī)溶劑為醇類、短鏈醚類、呋喃類、亞砜類、環(huán)氧烷類或其二種以上混合物，親 水性有機(jī)溶劑占體系的質(zhì)量份數(shù)為5 40% ；三液相鹽析萃取體系中所選用的疏水性有機(jī)溶劑為烷類、酯類、長鏈醚類或其混合物， 疏水性有機(jī)溶劑占體系的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 60% ；酶催化反應(yīng)溫度為20 70°C，攪拌轉(zhuǎn)速為20 250rpm ；糖苷酶水解反應(yīng)的時(shí)間為 0. 5 200h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種糖苷酶催化與鹽析萃取偶聯(lián)制備天然藥物的方法，其特 征還在于糖苷酶是經(jīng)過化學(xué)修飾或者固定化的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種糖苷酶催化與鹽析萃取偶聯(lián)制備天然藥物的方法，其特 征還在于糖苷類單體化合物包括留體和萜類皂苷、蒽醌萜類以及環(huán)烯醚類皂苷。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種糖苷酶催化與鹽析萃取偶聯(lián)制備天然藥物的方法，其特 征還在于糖苷類單體化合物是指盾葉新苷、三角葉皂苷、薯蕷皂苷元_葡萄糖三糖苷、薯 蕷皂苷元_葡萄糖二糖苷、延玲草次苷、白藜蘆醇苷、京尼平苷、人參皂苷Re、Rgl、Rd、Rc、甘 草酸、大豆皂苷I、II、IV;藥材粉末是指盾葉薯蕷、虎杖、桅子、人參、甘草、大豆。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的一種糖苷酶催化與鹽析萃取偶聯(lián)制備天然藥物的方 法，其特征在于反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，將含有糖的無機(jī)鹽相轉(zhuǎn)移，更換新的無機(jī)鹽相，或者在三相萃 取催化反應(yīng)中將含有產(chǎn)物的疏水性有機(jī)相轉(zhuǎn)移，更換新的疏水性有機(jī)相，再補(bǔ)加底物和少 許酶，使反應(yīng)不斷進(jìn)行。
全文摘要
一種糖苷酶催化與鹽析萃取偶聯(lián)制備天然藥物的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，其特點(diǎn)在于將酶催化水解反應(yīng)與產(chǎn)物的鹽析萃取相耦合。將糖苷酶和天然產(chǎn)物加入到鹽析萃取體系中，利用糖苷酶將含糖基的天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為去除糖基的有效成分，同時(shí)利用體系的萃取能力將產(chǎn)物與底物分離開來。本發(fā)明的益處和效果在于開發(fā)了一種新的、易于產(chǎn)業(yè)化的反應(yīng)分離耦合的方法，提高了生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)C12P19/16GK102094052SQ20101058474
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月12日
發(fā)明者修志龍, 孫亞琴, 董悅生, 韓松, 魏奪 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)