專利名稱：用于細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)平臺(tái)的組合物和方法
本申請(qǐng)要求于2003年10月10日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/510,358和60/510,348的優(yōu)先權(quán)，并將其全部?jī)?nèi)容加入本發(fā)明作為參考。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般性地涉及通過使用細(xì)胞培養(yǎng)法體外生長(zhǎng)各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的改進(jìn)的方法，和新的細(xì)胞培養(yǎng)表面組合物以及應(yīng)用的方法。
現(xiàn)有技術(shù)的描述已經(jīng)建議將細(xì)胞移植作為用于各種治療需要的全體器官替換的備選方法，所述的治療需要包括眼、腦、肝、皮膚、軟骨和血管中的疾病治療。例如見JP Vacanti等，J.Pediat.Surg.，Vol.23，1988，pp.3-9；PAebischer等，Brain Res.Vol.488，1998，pp.364-368；CB Weinberg和E.Bell，Science，Vol.231，1986 pp.397-400；IV Yannas，CollagenIII，ME Nimni，ed.，CRC Press，Boca Raton，1988；GL Bumgardner等，Hepatology，Vol.8，1988，pp.1158-1161；AM Sun等，Appl.Bioch.Biotech.，Vol.10，1984，pp.87-99；AA Demetriou等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，Vol.83，1986，pp.7475-7479；WT Green Jr.，Clin.Orth.Rel.Res.，Vol 124.1977，pp.237-250；CA Vacanti等，J.Plas.Reconstr.Surg.，1991；88753-9；PA Lucas等，J.Biomed.Mat.Res.，Vol.24，1990，pp.901-911。在組織培養(yǎng)中產(chǎn)生人細(xì)胞系的能力會(huì)提高將細(xì)胞移植作為治療模型以恢復(fù)喪失組織功能的前景。能夠產(chǎn)生從神經(jīng)嵴組織中產(chǎn)生人培養(yǎng)的細(xì)胞系是非常重要的，因?yàn)樵醋云涞慕M織或者器官通常不能在個(gè)體達(dá)到成年期后從損傷中自我修復(fù)。
傳統(tǒng)的用于細(xì)胞體外培養(yǎng)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室器皿通常被涂布有負(fù)電荷以增強(qiáng)培養(yǎng)中哺乳動(dòng)物細(xì)胞的粘附和一些時(shí)候的增殖。但是，用常規(guī)的組織培養(yǎng)表面來實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞的令人滿意的粘附、維持、和增殖在傳統(tǒng)上是最為困難的。已經(jīng)通過加入膠原凝膠層或者將大鼠EHS腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)沉積到組織培養(yǎng)板和皿上來促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞粘附和增殖進(jìn)行了改進(jìn)。然而，由于存在材料不得不在接種細(xì)胞前即刻被鋪到培養(yǎng)物表面這一缺點(diǎn)而妨礙了這些技術(shù)的應(yīng)用。
使用生物聚合物載體來支持粘附、生長(zhǎng)、并最終作為載體來在移植過程中攜帶這些細(xì)胞，對(duì)于細(xì)胞替換治療、特別在衰老過程中通常被損壞的源自神經(jīng)嵴的腦和眼后部的細(xì)胞替換治療的成功是重要的。存在7種一般類別的生物聚合物多核苷酸類、聚酰胺類、多糖類、聚異戊二烯類、木素、多聚磷酸鹽/酯類、和聚羥基烷羧酸鹽/酯類。見例如美國(guó)專利6,495,152。生物聚合物的范圍包括從IV膠原到聚硅氧烷組合物，其表面嵌有碳顆粒，或者其被伯胺和任選的肽處理，或者其被伯胺或者含有羧基的硅烷或者硅氧烷共處理(美國(guó)專利4,822,741)，或者例如，其它修飾的膠原是已知含有天然軟骨材料的(美國(guó)專利6,676,969)，所述的天然軟骨材料已經(jīng)經(jīng)歷了脫脂和其它處理而只剩下II型膠原材料和氨基葡聚糖，或者備選地將純化的II型膠原的纖維與氨基葡聚糖和任何其它所需添加劑混和。這些額外的添加劑可以，例如，包含用來協(xié)助軟骨細(xì)胞對(duì)II型膠原纖維的粘附作用的軟骨粘連蛋白或者錨蛋白II，和生長(zhǎng)因子例如軟骨誘導(dǎo)因子(CIF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFβ)。
在本發(fā)明出現(xiàn)前，從神經(jīng)嵴或者個(gè)體神經(jīng)元培養(yǎng)哺乳動(dòng)物或者人神經(jīng)組織并使其體外生長(zhǎng)和分裂是不可能的。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的一個(gè)方面公開了用碳血漿的穩(wěn)定層涂布組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室器具的方法，所述的碳血漿最優(yōu)選為DLC，其能夠增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)并且可以提供儀器的預(yù)先準(zhǔn)備好的供應(yīng)(ready supply)以成功進(jìn)行這些細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)。
已知來自所述神經(jīng)嵴源或者特別是神經(jīng)元的人或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞呈現(xiàn)出兩種不利的狀態(tài)。一是它們通常在體內(nèi)或者在組織培養(yǎng)條件下不復(fù)制，二是它們對(duì)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)物表面的粘附不大好。通過用被稱為鉆石樣碳(DLC)的碳血漿涂布表面，發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元會(huì)容易地粘附到培養(yǎng)物表面并且呈現(xiàn)增殖應(yīng)答。
DLC膜的機(jī)械和摩擦學(xué)特性與鉆石的這些特性非常類似(空氣中的摩擦系數(shù)大約為0.1，硬度達(dá)到大約80GPa，彈性模量接近600GPa)。此外，這些膜在最侵蝕性的環(huán)境中是化學(xué)上惰性的，而且可以以接近于鉆石密度的密度沉積。但是，與碳汽相沉積相比，鉆石、DLC膜通常在室溫下產(chǎn)生，這使得它們?cè)跓o法經(jīng)歷高溫的基材的應(yīng)用中非常有吸引力。
本發(fā)明公開了DLC涂層到生物聚合物表面的沉積，其又依次支持人和哺乳動(dòng)物神經(jīng)元、以及源自神經(jīng)嵴的其它類型細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是產(chǎn)生一個(gè)用于神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)嵴源細(xì)胞的體外生長(zhǎng)和維持的特化的組織培養(yǎng)平臺(tái)，以用于細(xì)胞系增殖目的和進(jìn)行試驗(yàn)。DLC涂布的本發(fā)明的產(chǎn)物包括組織培養(yǎng)皿、燒瓶、載玻片、濾室，聚合物和玻璃珠，板，和塊。所述的涂層可以被沉積到塑料、玻璃、合成的和天然的生物聚合物，和金屬上。所述的DLC涂層可以被添加到其它類型的涂層例如由培養(yǎng)的牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、粘附分子涂層、和生長(zhǎng)因子涂層的頂上以產(chǎn)生用于特定人或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的改進(jìn)的產(chǎn)物。
此外，本發(fā)明所使用的生物聚合物可以是天然或者合成來源的。天然生物聚合物包含膠原和其它已知的聚合物質(zhì)。對(duì)于合成的聚合物，它們可以是丙烯酸的及其衍生物或者共聚物例如聚甲基丙烯酸甲酯，聚-N-異丙基丙烯酰胺或者聚-2-羥基甲基丙烯酸酯，聚乙烯醇及衍生物及共聚物。所述的生物聚合物可以是薄板或者是微顆粒形式。為了增強(qiáng)所述生物聚合物的生長(zhǎng)支持特性，可以將粘附或生長(zhǎng)促進(jìn)因子在合成過程中嵌入或者整合到其組合物中。此外，適合于支持含有半固體生物聚合物的神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和復(fù)制的三維生長(zhǎng)介質(zhì)也可以被DLC涂布以提高其支持神經(jīng)元生長(zhǎng)和維持的能力。所述的生物聚合物還可以含有殼聚糖或者藻朊酸鈉這些“maypolymer”。
通過對(duì)下面優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述，本發(fā)明的這些和其它目標(biāo)，以及其許多伴隨的益處，將變得更明朗。
發(fā)明詳述在描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的時(shí)候，為了清楚起見采用了特定的命名學(xué)。但是，本發(fā)明并不意欲被這些所選擇的特定的術(shù)語所限，而且應(yīng)該理解每個(gè)特定的術(shù)語包括所有以類似方式操作來實(shí)現(xiàn)類似目的的技術(shù)等價(jià)物。
本發(fā)明所描述的方法允許用DLC和類似的涂層對(duì)聚合物表面進(jìn)行涂布，從而使得其可被用作衍生自神經(jīng)嵴源的細(xì)胞的載體。生物聚合物可以是生物可降解的部分。生物聚合物可以以薄板、微顆粒，或者半固體塊形式存在。使用血漿槍來涂布生物聚合物，所述的血漿槍將在目的培養(yǎng)物表面沉積一層厚度為200-400的碳血漿薄層。
與鉆石樣(DLC)涂層一樣，無定形碳氮化物(C-N)膜可以是非常堅(jiān)硬且抗磨損的。它們可以作為候選物來解決全部髖關(guān)節(jié)置換中無菌松弛(aseptic loosening)的問題。Du等已經(jīng)報(bào)道用掃描電鏡研究了器官培養(yǎng)物中的成骨細(xì)胞在硅、DLC涂布的硅、和無定形C-N膜沉積的硅上的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。硅晶片(silicon wafers)上的細(xì)胞能夠粘附，但是不能在粘附之后擴(kuò)展。相反，在DLC涂層和無定形C-N膜上，細(xì)胞粘附、擴(kuò)展并增殖而對(duì)細(xì)胞生理學(xué)方面則并未有明顯損害。細(xì)胞在涂層和膜上的形態(tài)學(xué)發(fā)育與在對(duì)照中的細(xì)胞類似。這樣的結(jié)果支持DLC涂層的生物相容性，并且對(duì)本發(fā)明中無定形C-N膜的潛在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用是鼓舞人心的(C.Du等，Biomaterials.1998 Apr-May；19(7-9)651-8)。
DLC涂布過程如下血漿裝置由下列部分組成由Lawrence Berkeley NationalLaboratory，Berkeley，CA生產(chǎn)的真空弧形血漿槍，其以重復(fù)脈沖方式運(yùn)作從而將高電功率和熱負(fù)荷相關(guān)問題最小化。裝備有碳負(fù)極的血漿槍形成了純碳血漿的濃密的羽狀物(plume)，其具有大約20eV的定向流能(streaming energy)。將血漿注射入一個(gè)90°的磁性濾器(彎曲的電磁線圈)以從負(fù)極移除所有顆粒材料，隨后將其轉(zhuǎn)運(yùn)過一個(gè)用來平化輻射形血漿分布的大的永久磁多孔構(gòu)型。通過這種方式，會(huì)使得碳血漿沉積在大的沉積區(qū)域范圍內(nèi)在空間上是均質(zhì)的。
為了進(jìn)一步增強(qiáng)膜的均勻性，將要被DLC涂布的基質(zhì)放置于緩慢旋轉(zhuǎn)的盤上，從而消除了方位角不均一性。所描述的裝置被用來形成厚度為大約2-4000，優(yōu)選約200-400的DLC膜。
為了提高生物聚合物支持細(xì)胞生長(zhǎng)或者粘附的能力，含有一種或者多種下列物質(zhì)的粘附混合物可以在合成過程中被嵌入或者整合到其組合物中濃度范圍為1μg-500μg/ml聚合物膠的纖連蛋白，濃度范圍為1μg-500μg/ml聚合物膠的層粘連蛋白，濃度范圍為0.1μg-100μg/ml聚合物膠的RGDS，濃度范圍為1ng-500ng/ml聚合物膠的綴合了聚卡波非(polycarbophil)的bFGF，濃度范圍為10ng-1000ng/ml聚合物膠的綴合了聚卡波非的EGF，濃度范圍為1ng-1000ng/ml聚合物膠的NGF，和濃度為范圍為1μg-500μg/ml聚合物膠的硫酸肝素。
在薄板或者微顆粒形式中，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，涂布的生物聚合物被用作用于神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的攜帶者和在細(xì)胞移植步驟中用于細(xì)胞傳遞的載體。半固體聚合物塊形式可以與集成電路芯片或者CCD芯片偶聯(lián)被用作神經(jīng)細(xì)胞維持裝置來發(fā)揮神經(jīng)刺激監(jiān)測(cè)器的功能?？梢酝ㄟ^用培養(yǎng)的牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞沉積的細(xì)胞外基質(zhì)涂布并隨后鋪上DLC涂層，來進(jìn)一步改善涂布的表面。
實(shí)施例1用DLC涂布板形式的生物聚合物生物聚合物板可以是任何尺寸的，優(yōu)選將本發(fā)明尺寸為大約2cm×2cm的生物聚合物板固定到一個(gè)轉(zhuǎn)動(dòng)盤上，該盤被依次設(shè)立在DLC涂布室中一個(gè)緩慢旋轉(zhuǎn)馬達(dá)的頂部。該血漿設(shè)備將會(huì)通過具有大約20eV的定向流能的噴射槍產(chǎn)生純碳血漿的濃密的羽狀物。血漿被注射入90°磁性濾器中以去除所有顆粒材料來形成高質(zhì)量、無氫的鉆石樣碳。當(dāng)被轉(zhuǎn)運(yùn)通過用來平化輻射形血漿分布的大的永久性磁多孔構(gòu)型的時(shí)候，碳血漿沉積將會(huì)在一個(gè)很大的沉積區(qū)域中被在空間上均質(zhì)化。當(dāng)碳血漿羽狀物接近持有聚合物板的緩慢旋轉(zhuǎn)的盤的時(shí)候，DLC的均勻膜將會(huì)涂布該板的表面。該板可以被用于生長(zhǎng)許多種類的細(xì)胞，而且優(yōu)選是神經(jīng)細(xì)胞，其或者在UV放射或者70％酒精清洗而消毒后作為細(xì)胞移植的載體。
實(shí)施例2用DLC涂布以微顆粒形式的生物聚合物將生物聚合物微顆粒放置到特化的旋轉(zhuǎn)室中，碳血漿的羽狀物如實(shí)施例1所描述的那樣生成。當(dāng)旋轉(zhuǎn)室以垂直軸方向緩慢旋轉(zhuǎn)的時(shí)候，血漿槍被用于將DLC噴霧引入室中，這樣，微顆粒被連續(xù)地從頂部拋到底部從而使得碳血漿有機(jī)會(huì)被以均勻的方式沉積到每個(gè)微球的全部表面區(qū)域。該過程被持續(xù)大約2-3個(gè)小時(shí)的時(shí)間來確保均勻和完成全部顆粒表面的覆蓋。
實(shí)施例3在合成過程中將粘附或者生長(zhǎng)促進(jìn)因子嵌入或者整合到生物聚合物的組合物中并隨后用DLC涂布在合成過程中，可以將粘附或者生長(zhǎng)促進(jìn)因子嵌入或者整合到本發(fā)明的生物聚合物的組合物中，所述的因子包含下列中的一種或者多種濃度范圍為1μg-500μg/ml聚合物膠的纖連蛋白，濃度范圍為1μg-500μg/ml聚合物膠的層粘連蛋白，濃度范圍為0.1μg-100μg/ml聚合物膠的RGDS，濃度范圍為1ng-500ng/ml聚合物膠的綴合了聚卡波非的bFGF，濃度范圍為10ng-1000ng/ml聚合物膠的綴合了聚卡波非的EGF，濃度范圍為1ng-1000ng/ml聚合物膠的NGF，和濃度為范圍為1μg-500μg/ml聚合物膠的硫酸肝素。將生物聚合物隨后制備成薄板或者半固體塊(bloc)，如前面實(shí)施例1中描述的那樣來實(shí)現(xiàn)DLC的沉積?；蛘呖梢詫⒕酆衔镏苽涑晌㈩w粒或者球體，用前面實(shí)施例2中描述的那樣來實(shí)現(xiàn)DLC的沉積。
實(shí)施例4用培養(yǎng)的牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞沉積的細(xì)胞外基質(zhì)涂布生物聚合物并隨后用DLC涂布板或者微顆粒在將DLC沉積到培養(yǎng)物表面之前，可以首先用細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)涂布生物聚合物板和微顆粒塊。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，將牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞(BCE)以低密度(大約2000-150,000細(xì)胞/ml，優(yōu)選大約20,000細(xì)胞/ml)接種到板或者塊的表面，或者允許其粘附到微顆粒的表面。將BCE細(xì)胞保持在含有DME-H16的培養(yǎng)基中，所述的培養(yǎng)基被補(bǔ)充有10％牛血清，5％胎牛血清，2％葡聚糖(40,000MV)，和50ng/ml的bFGF。將細(xì)胞在37℃下10％的CO2中培養(yǎng)7天，期間每隔一天加入濃度為50ng/ml的bFGF。通過用20mM氫氧化銨處理5分鐘所述的聚合物板、塊或者微顆粒來移除BCE細(xì)胞。隨后，用足量的PBS清洗10遍帶有細(xì)胞外基質(zhì)涂層的生物聚合物。干燥后，如先前描述在實(shí)施例1中的那樣對(duì)涂布有ECM的聚合物板或者塊進(jìn)行DLC沉積，而如先前描述在實(shí)施例2中的那樣對(duì)涂布有ECM的微顆粒進(jìn)行DLC沉積。在順序涂布ECM和DLC后，所述的聚合物板、塊、或者微顆粒被通過UV輻射或者酒精清洗來滅菌，并用于神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)或者作為細(xì)胞移植的載體。
實(shí)施例5包含生物聚合物的基質(zhì)，所述生物聚合物具有電連接到集成電路的神經(jīng)元在合成過程中，可以將粘附或者生長(zhǎng)促進(jìn)因子嵌入或者整合到本發(fā)明的生物聚合物的組合物中，所述的因子包含下列中的一種或者多種濃度范圍為1μg-500μg/ml聚合物膠的纖連蛋白，濃度范圍為1μg-500μg/ml聚合物膠的層粘連蛋白，濃度范圍為0.1μg-100μg/ml聚合物膠的RGDS，濃度范圍為1ng-500ng/ml聚合物膠的綴合了聚卡波非的bFGF，濃度范圍為10ng-1000ng/ml聚合物膠的綴合了聚卡波非的EGF，濃度范圍為1ng-1000ng/ml聚合物膠的NGF，和濃度為范圍為1μg-500μg/ml聚合物膠的硫酸肝素。將生物聚合物隨后制備成薄板或者半固體塊，如前面實(shí)施例1中描述的那樣來實(shí)現(xiàn)DLC的沉積?；蛘呖梢詫⒕酆衔镏苽涑晌㈩w?；蛘咔蝮w，如前面實(shí)施例2中描述的那樣來實(shí)現(xiàn)DLC的沉積。
在DLC涂布的基質(zhì)上，集成電路或者芯片已經(jīng)就位。如描述在Zeck，G.& Fromherz，Proc.Nat.Acad.Sci.，98，10457-10462，(2001)中所述。神經(jīng)細(xì)胞將被放置到具有DLC涂層的硅片上，隨后這些神經(jīng)細(xì)胞被微塑料釘(peg)原地圈起來。附近的細(xì)胞將會(huì)生長(zhǎng)到彼此相連并與該片相連。每個(gè)神經(jīng)細(xì)胞下的刺激物將會(huì)產(chǎn)生會(huì)引發(fā)穿過細(xì)胞的電脈沖的電壓變化。施加于片的電脈沖將會(huì)從一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞傳到另一個(gè)，并傳回片以關(guān)閉(trip)硅開關(guān)。
實(shí)施例6在組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室器具的培養(yǎng)物表面的DLC沉積當(dāng)使用平培養(yǎng)表面如皿，濾器襯墊(filter insert)，室載玻片，板，和塊的時(shí)候，可以將這些器具培養(yǎng)表面向上地放置在真空室中呈現(xiàn)給血漿槍，并且如前所述地進(jìn)行涂布操作。當(dāng)使用微載體珠的時(shí)候，需要使它們?cè)谑抑辛鲃?dòng)以確保其所有面都被均勻地涂布。對(duì)于封閉表面例如燒瓶或者管，可以將一種特殊修飾過的血漿槍插入到該容器中并涂布目的表面。厚度為大約20-約4000，優(yōu)選約200-400的均勻的DLC薄層將被沉積到培養(yǎng)物表面。隨后用UV輻射或者酒精沖洗來滅菌產(chǎn)物，包裝、密封并儲(chǔ)存上架直至使用。
實(shí)施例7用培養(yǎng)的牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞分泌的ECM順序涂布培養(yǎng)物表面并隨后DLC沉積在該實(shí)施方案中，將牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞的稀疏培養(yǎng)物(sparse culture)(大約1000-約50,000細(xì)胞/ml，優(yōu)選2000-5000細(xì)胞/ml)接種到所需實(shí)驗(yàn)室器具的培養(yǎng)表面，所述器具包括皿、燒瓶、管、濾器襯墊、室載玻片、微載體珠、輥瓶(roller bottle)、細(xì)胞收集器、片、和塊。將細(xì)胞保持在含有DME-H16的培養(yǎng)基中，所述的培養(yǎng)基被補(bǔ)充有10％牛血清，5％胎牛血清，2％葡聚糖(40,000MV)，和50ng/ml的bFGF。將牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)7-10天直至匯合，期間每隔一天加入濃度為50ng/ml的bFGF。然后去除培養(yǎng)基，用充分的20mM氫氧化銨的蒸餾水溶液處理細(xì)胞3-30分鐘。隨后，用足量的PBS清洗表面10遍以去除殘留的氫氧化銨，在無菌層流通風(fēng)櫥中干燥。隨后如前所述在胞外基質(zhì)的頂部進(jìn)行DLC的涂布。隨后用UV輻射或者酒精沖洗來滅菌產(chǎn)物，包裝、密封并儲(chǔ)存上架直至使用。
實(shí)施例8DLC沉積后順序向培養(yǎng)物表面涂布粘附或者生長(zhǎng)促進(jìn)劑在該備選的實(shí)施方案中，一種或者多種粘附或者生長(zhǎng)促進(jìn)劑包括濃度范圍為1μg-500μg/ml纖連蛋白，濃度范圍為1μg-500μg/ml層粘連蛋白，濃度范圍為0.1μg-100μg/mlRGDS，濃度范圍為1ng-400ng/ml綴合了聚卡波非的bFGF，濃度范圍為10ng-1000ng/ml綴合了聚卡波非的EGF。所述的粘附或者生長(zhǎng)促進(jìn)劑將被添加到培養(yǎng)物表面，并隨后在4℃下溫育20分鐘-2小時(shí)。隨后用PBS清洗表面3遍并在無菌層流通風(fēng)櫥中干燥。隨后在培養(yǎng)物表面上的粘附或者生長(zhǎng)促進(jìn)劑涂層的頂部用DLC層沉積產(chǎn)品。而后用UV輻射或者酒精沖洗來滅菌實(shí)驗(yàn)室器具，包裝、密封并儲(chǔ)存上架直至使用。
已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，很容易對(duì)本發(fā)明做出許多修飾而無需離開由所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明主旨。
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權(quán)利要求
1.一種用于細(xì)胞生長(zhǎng)和粘附的改進(jìn)的表面，其包含涂布有高質(zhì)量、無氫的鉆石樣碳表面的生物聚合物。
2.權(quán)利要求1的改進(jìn)的表面，其中的生物聚合物是可生物降解的
3.權(quán)利要求1的改進(jìn)的表面，其中的生物聚合物是板的形式。
4.權(quán)利要求1的改進(jìn)的表面，其中的生物聚合物是微顆粒的形式。
5.一種在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)神經(jīng)元的方法，其包含在涂布有高質(zhì)量、無氫的鉆石樣碳表面的生物聚合物上接種和生長(zhǎng)神經(jīng)元。
6.權(quán)利要求5的方法，其中的生物聚合物是可生物降解的。
7.權(quán)利要求5的方法，其中的生物聚合物是板的形式。
8.權(quán)利要求5的方法，其中的生物聚合物是微顆粒的形式。
9.權(quán)利要求1的改進(jìn)的表面，其中的生物聚合物已經(jīng)被在其合成過程中嵌入或者整合入了粘附劑，該粘附劑包含下列的一種或者多種層粘連蛋白、纖連蛋白、RGDS、綴合了聚卡波非的bFGF、綴合了聚卡波非的EGF，和硫酸肝素。
10.一種在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)神經(jīng)元的方法，其包含在使用權(quán)利要求9的方法制備的生物聚合物上接種和生長(zhǎng)神經(jīng)元。
11.一種用來檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)的儀器，其包含a)生物聚合物單元，其具有在它的合成過程中被嵌入或者整合入了粘附劑，所述的粘附劑包含下列的一種或者多種層粘連蛋白、纖連蛋白、RGDS、綴合了聚卡波非的bFGF、綴合了聚卡波非的EGF，和硫酸肝素或者神經(jīng)生長(zhǎng)因子，其足以使得神經(jīng)的或者神經(jīng)細(xì)胞以低密度被移植到所述的單元內(nèi)來增殖和發(fā)送神經(jīng)突起；b)集成電路芯片或者電荷偶聯(lián)裝置，其具有一種為所述神經(jīng)突起或者樹突制造電連接的機(jī)構(gòu)；c)用來測(cè)量來自神經(jīng)元的電信號(hào)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)；和d)用于將所述的芯片粘附到檢測(cè)機(jī)構(gòu)的機(jī)構(gòu)。
12.權(quán)利要求11的儀器，其中的生物聚合物單元是獨(dú)立的。
13.權(quán)利要求11的儀器，其中的生物聚合物單元是半固體的。
14.權(quán)利要求11的儀器，其中的集成電路芯片或者電荷偶聯(lián)的裝置在其合成過程中已經(jīng)被在其表面涂布了包含一種或者多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子或者鉆石樣碳的粘附劑，以增強(qiáng)神經(jīng)突起或者樹突與所述的芯片之間的電接觸。
15.一種適于支持神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和復(fù)制的三維生長(zhǎng)介質(zhì)，其包含能夠支持神經(jīng)元生長(zhǎng)的半固體生物聚合物。
16.權(quán)利要求15的生長(zhǎng)介質(zhì)，其還包含“May Polymer”。
17.權(quán)利要求16的生長(zhǎng)介質(zhì)，其中所述的“May Polymer”在其合成過程中已經(jīng)被嵌入或者整合入了粘附劑，所述的粘附劑包含下列的一種或者多種層粘連蛋白、纖連蛋白、RGDS、綴合了聚卡波非的bFGF、綴合了聚卡波非的EGF，和硫酸肝素或者神經(jīng)生長(zhǎng)因子，其足以使得神經(jīng)的或者神經(jīng)細(xì)胞以低密度被移植到所述的單元內(nèi)來增殖和發(fā)送神經(jīng)突起。
18.權(quán)利要求17的生長(zhǎng)介質(zhì)，其中綴合了聚卡波非或者硫酸肝素的bFGF的濃度為大約50μg/mL，綴合了聚卡波非或者硫酸肝素的NGF的濃度為大約50μg/mL，層粘連蛋白的濃度為大約500μg/mL并且RGDS的濃度為大約500μg/mL。
19.一種適于支持神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和復(fù)制的三維生長(zhǎng)介質(zhì)，其包含能夠支持神經(jīng)元生長(zhǎng)的、涂布了鉆石樣碳的半固體生物聚合物。
20.權(quán)利要求19的生長(zhǎng)介質(zhì)，其還包含“May Polymer”。
21.權(quán)利要求20的生長(zhǎng)介質(zhì)，其中所述的“May Polymer”在其合成過程中已經(jīng)被嵌入或者整合入了粘附劑，所述的粘附劑包含下列的一種或者多種層粘連蛋白、纖連蛋白、RGDS、綴合了聚卡波非的bFGF、綴合了聚卡波非的EGF，和硫酸肝素或者神經(jīng)生長(zhǎng)因子，其足以使得神經(jīng)的或者神經(jīng)細(xì)胞以低密度被移植到所述的單元內(nèi)來增殖和發(fā)送神經(jīng)突起。
22.權(quán)利要求21的生長(zhǎng)介質(zhì)，其中所述的生物聚合物被制作成珠、板、或者微顆粒的形狀。
23.一種將神經(jīng)元移植到受體宿主中的方法，其包含將目的神經(jīng)元接種到權(quán)利要求19的生長(zhǎng)介質(zhì)，使所述神經(jīng)元生長(zhǎng)到足夠的密度，并將在所述生長(zhǎng)介質(zhì)中的所述神經(jīng)元植入所述宿主。
24.一種適于支持神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和復(fù)制的三維生長(zhǎng)介質(zhì)，其包含能夠支持神經(jīng)元生長(zhǎng)的、涂布了BCE-ECM的半固體生物聚合物。
25.一種制造權(quán)利要求24的生長(zhǎng)介質(zhì)的方法，包含a)將適于其生長(zhǎng)的培養(yǎng)介質(zhì)中的一群牛角膜內(nèi)皮(BCE)細(xì)胞以低密度接種到所述的三維生長(zhǎng)介質(zhì)中；b)使所述的BCE細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合；和c)將所述介質(zhì)吸出并且用氫氧化銨處理所述的三維生長(zhǎng)介質(zhì)足夠長(zhǎng)的時(shí)間以移除所述細(xì)胞。
26.一種適于支持神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和復(fù)制的三維生長(zhǎng)介質(zhì)，其包含能夠支持神經(jīng)元生長(zhǎng)的、涂布了BCE-ECM和鉆石樣碳的半固體生物聚合物。
27.權(quán)利要求26的生長(zhǎng)介質(zhì)，其還含有“May Polymer”。
28.權(quán)利要求27的生長(zhǎng)介質(zhì)，其中所述的“May Polymer”在其合成過程中已經(jīng)被嵌入或者整合入了粘附劑，所述的粘附劑包含下列的一種或者多種層粘連蛋白、纖連蛋白、RGDS、綴合了聚卡波非的bFGF、綴合了聚卡波非的EGF，和硫酸肝素或者神經(jīng)生長(zhǎng)因子，其足以使得神經(jīng)的或者神經(jīng)細(xì)胞以低密度被移植到所述的單元內(nèi)來增殖和發(fā)送神經(jīng)突起。
28.權(quán)利要求26的生長(zhǎng)介質(zhì)，其中所述的生物聚合物被制作成珠、板、或者微顆粒的形狀。
29.具有適于誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)和粘附的涂層的實(shí)驗(yàn)室儀器，該儀器具有內(nèi)表面和外表面，其中內(nèi)表面是與細(xì)胞和細(xì)胞介質(zhì)接觸的表面，而且所述儀器的所述內(nèi)表面被涂有鉆石樣涂層的膜。
30.權(quán)利要求29的儀器，其選自由細(xì)胞培養(yǎng)皿，平皿，組織培養(yǎng)燒瓶，板，瓶，載玻片，濾室，玻片室，輥瓶，收集器和管組成的組。
31.具有適于誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)和粘附的涂層的實(shí)驗(yàn)室儀器，其包含在至少一種另外的涂層上用鉆石樣涂層的膜涂布所述的儀器。
32.權(quán)利要求31的儀器，其中的涂層是細(xì)胞外基質(zhì)。
33.權(quán)利要求32的儀器，其中的涂層是BCE-ECM。
34.一種涂布適用于誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)和粘附的實(shí)驗(yàn)室儀器的方法，其包含將鉆石樣涂層的膜施用于內(nèi)表面。
35.權(quán)利要求34的方法，其還包含首先用至少一種另外的涂層例如BCE-ECM涂布所述儀器的內(nèi)表面，隨后用鉆石樣涂層涂布。
36.依照權(quán)利要求34的方法制造的儀器。
37.依照權(quán)利要求35的方法制造的儀器。
38.一種用于細(xì)胞生長(zhǎng)和粘附的改進(jìn)的表面，其包含涂布有高質(zhì)量、無氫的鉆石樣碳表面的合成的生物聚合物。
39.權(quán)利要求38的改進(jìn)的表面，其中合成的聚合物是丙烯酸聚合物及其衍生物或者共聚物例如聚甲基丙烯酸甲酯，聚-N-異丙基丙烯酰胺或者聚-2-羥基甲基丙烯酸酯，或者聚乙烯醇及其衍生物和共聚物。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種用鉆石樣碳(DLC)涂布聚合物表面以使其被用作衍生自神經(jīng)嵴源的細(xì)胞(優(yōu)選形成樹突的神經(jīng)細(xì)胞)的載體的方法。被DLC涂布的生物聚合物包括可生物降解的聚合物和其它可移植的生物聚合物以作為載體系統(tǒng)用于將細(xì)胞移植到身體的各部分，包括腦、眼、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)、肺、肝臟、脾、腎、和骨及軟骨。所述的生物聚合物可以是板的形式或者微顆粒形式，而且可以在其合成過程中被嵌入或者整合入粘附或者生長(zhǎng)促進(jìn)劑以增強(qiáng)并支持神經(jīng)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。這種涂布方法還可以增加其它涂布制劑例如培養(yǎng)的牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，以及粘附分子例如纖連蛋白、層粘連蛋白和RGDS。涂布步驟可以是連續(xù)的過程，其中DLC層被添加到ECM涂布表面或者粘附因子涂布表面的頂部。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1910272SQ200480037074
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2004年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月10日
發(fā)明者呂革明 申請(qǐng)人:細(xì)胞生物工程公司