專利名稱：生產(chǎn)包含類胡蘿卜素的生物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)包含類胡蘿卜素的生物質(zhì)的方法。
類胡蘿卜素是在植物生物體中形成的作為保護性或有色色素的天然染料和活性劑。
在動物生物體中，它們中的數(shù)個被轉(zhuǎn)化成維生素A并作為這些種類的物質(zhì)在主要的組成代謝和操作代謝(operating metabolism)中具有許多特殊作用。β-胡蘿卜素是維生素A的前體并且在動物生物體中被轉(zhuǎn)化成維生素。動物生物體在沒有加入前體的情況下不能合成維生素A。β-胡蘿卜素是脂溶性物質(zhì)并且可以僅在與脂質(zhì)和油有關(guān)的情況中被引入體內(nèi)。在中國，維生素A的特別作用在2000年前就已經(jīng)被了解，其中在眼疾或夜盲癥的情形中，推薦食用新鮮有色水果和綠色蔬菜。
人和動物具有對β-胡蘿卜素的高的天然需求，因為這種物質(zhì)和在體內(nèi)形成這種物質(zhì)的多種物質(zhì)使身體性能穩(wěn)定并且抵御有害的環(huán)境影響。每日最小的需求規(guī)定為0.8-1mg維生素A＝5mg-6mgβ-胡蘿卜素(DGE2000)。按照Heseker等(VERA-Schriftenreihe，Bd.III，2.Auflage，Wiss.Fachverlag Dr.Fleck，Niederkleen，1994)，在聯(lián)邦德意志共和國中的β-胡蘿卜素的每日實際食用量為1.5-2.0mg。按照流行病學(xué)研究，在低血漿水平的β-胡蘿卜素和冠心病以及心肌梗塞的風(fēng)險之間存在很高的關(guān)聯(lián)性(Kardinal等，Euramic study，Lancet 342，1379-84，1993)。
然而，β-胡蘿卜素不僅是在作為活性劑時是有意義的。事實上，在化妝品和藥品中要滿足美麗和健康生活方式的需要，由此利用了β-胡蘿卜素的著色性質(zhì)。
然而，β-胡蘿卜素不僅在人類領(lǐng)域中非常重要。β-胡蘿卜素還在動物營養(yǎng)中具有重要的作用。一般的飼料原料，諸如三葉草，紫花苜蓿包含β-胡蘿卜素，但是植物中的這些部分由于工業(yè)化生產(chǎn)方法導(dǎo)致土壤降解，減少得越來越多。
在自然界，β-胡蘿卜素只在植物生物體和一些微生物中合成。相當大含量的β-胡蘿卜素被包含在胡蘿卜(用于命名)，辣椒，櫻桃，一些藻類和另外地在棕櫚油和綠茶中。在本文上下文中，“相當大”指一般指在干生物質(zhì)中＜0.1％。
工業(yè)規(guī)模的天然β-胡蘿卜素生產(chǎn)者的提取是非常復(fù)雜的并且特別要求非常大的面積，并且生物質(zhì)的下游處理總噸位高。因此，在上個世紀中期，已經(jīng)開始探索化學(xué)合成并開發(fā)它們易于應(yīng)用的可能性。
目前，工業(yè)上90％的β-胡蘿卜素是通過化學(xué)合成產(chǎn)生的。然而，自天然來源提取β-胡蘿卜素的方法正在越來越多地受到重視，因為發(fā)現(xiàn)盡管β-胡蘿卜素在分布上只有＜1％的低分布，β-胡蘿卜素對人和動物的生理作用顯著地被β-胡蘿卜素的天然伴生物質(zhì)所有利地影響，所述伴生物質(zhì)也屬于類胡蘿卜素。
由于通過傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)未滿足該領(lǐng)域?qū)μ烊沪?胡蘿卜素已經(jīng)出現(xiàn)并且越來越多的需要，對于工業(yè)生物技術(shù)β-胡蘿卜素的合成的可能性已經(jīng)研究了約20年，由此考慮關(guān)于β-胡蘿卜素合成的生產(chǎn)力可以被增加到明顯地＞1％干生物質(zhì)，并且特別地，發(fā)酵或藻類培養(yǎng)可供用于本文的生物技術(shù)方法。
通常，在廣泛研究的過程中發(fā)現(xiàn)藻類(例如，杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)，小球藻(Chlorella spec)，Spirulina spec等)，微型真菌，諸如三孢布拉霉(Blakeslea trispora)，瓜笄霉(Choanephora cucurbitarum)和布拉克須霉(Phycomyces blakesleeanus)，細菌，諸如黃桿菌(Flavobacterium)，棒狀桿菌(Corynebacterium)，分枝桿菌(Mycobacterium)和短桿菌(Brevibacterium)，和酵母(紅酵母屬(Rhodotorula))不僅合成β-胡蘿卜素，還甚至能夠在限定的發(fā)酵和細胞培養(yǎng)條件下產(chǎn)生過量的類胡蘿卜素(Lampila等，Mycopatholigia 90，65，80，pp.65-80，1985)。
在類胡蘿卜素中，β-胡蘿卜素的形成尤其值得注意。在藻類Dunaliella的干生物質(zhì)中可以積累多到20％的β-胡蘿卜素(De Baets，Vandedrinck，Vandamme，Encylopedia of Microbiology，Vol.4，837-853，2000)。然而，其經(jīng)濟的細胞培養(yǎng)僅在鹽水中熱帶條件下可能獲得成功。公認地，在培養(yǎng)基中的海藻生物質(zhì)濃度落后于真菌或細菌培養(yǎng)物中的生物質(zhì)濃度約10的一次方，并且必須大面積培養(yǎng)從而獲得工業(yè)上所需的β-胡蘿卜素的產(chǎn)率。
因為這個原因，正在越來越多地集中于微生物的開發(fā)，其同時獲得＞20-30g/l的生物質(zhì)濃度和β-胡蘿卜素的高累積。因此，通常使用野生型菌株或確定的選擇菌株進行誘變。將從它們中衍生并選擇的高性能突變株進行培養(yǎng)并通過設(shè)定優(yōu)化工藝條件用于發(fā)酵生物合成。
誘變的已知方法是用不同濃度的亞硝基胍，單獨或例如與UV輻射組合進行處理(Cubero等，1993，Kuntschikova，2000)按照Weide，Paca，Knorre(“Biotechnologie”，Gustav-FischerVerlag，1987)，β-胡蘿卜素的最高產(chǎn)率(3-4g/l)在三孢布拉霉(Blakeslea trispora)(+)和(-)菌株(高性能的突變株)的半菌株(halfstrain)的混合培養(yǎng)物的發(fā)酵過程中獲得。(-)菌株的β-胡蘿卜素形成由三孢酸所促進(Bu’Lock等，Arch.Microbiol.97，239-244，1974)。發(fā)酵在28℃進行并持續(xù)6-8天。
三孢布拉霉的不同性別的半菌株的組合細胞培養(yǎng)物起初由Hesseltine和Anderson(US-2 865 814，US-2 890 989)建立并且被一些公司進一步發(fā)展。
胡蘿卜素的合成由維生素B1，異煙肼和β-芷香酮的添加而得以促進(Vandamme E.J.，Biotechnology of Vitamins，Pigments and GrowthFactors，31-33，Elsevier Science Publishers LTD，1989)。
三孢酸的重要性在于這種酸與遺傳信息結(jié)合促進在(-)半菌株中的β-胡蘿卜素的過量形成的事實(Caglioti L.等，Tetrahedron Suppl.，7，175-187，1966)。減少的β-胡蘿卜素的形成由三孢酸通過化學(xué)品((Lampila))的定向還原而導(dǎo)致。支持作用通過添加脫落酸(如β-胡蘿卜素的萜)，β-芷香酮(萜)(特別見物質(zhì)Feofilova，Arbuzov Mikrobiologija卷44，3，1975)，α-芷香酮(萜)，和維生素A(萜)(自1994年7月12日的US 005328845)而獲得。這些物質(zhì)的添加加速RNA的翻譯并導(dǎo)致形成類胡蘿卜素的酶的重新合成。另外被分析的添加劑是青霉素，視黃醇，煤油，芳香族化合物，諸如鄰苯二甲酸二甲酯和藜蘆醚，和含氮的雜環(huán)化合物，諸如異丙煙肼(除異煙肼之外，見上)。
產(chǎn)生氧應(yīng)激的物質(zhì)充當β-胡蘿卜素合成的加速劑?？梢酝ㄟ^加入表面活性物質(zhì)來加速在水性介質(zhì)中的氧傳遞，由此增加氧的利用度(例如，Span20Seon-Won Kim等，Journal of Fermentation and Bioengineering，Vol.84，No.4，330-332，1997)。如果臭氧被加入或在發(fā)酵過程中直接產(chǎn)生，也可以產(chǎn)生氧應(yīng)激。還描述了過氧化氫的添加導(dǎo)致了β-胡蘿卜素形成的顯著增加(Jae-Cheol Jeong等，Biotechnology letters 21，683-686，1999)。
通過改變營養(yǎng)液的成分來操縱β-胡蘿卜素的合成也通過磷缺乏的方式而獲得(Goncharova，O.，Konova，I.，Biruzova，V.，Biochemical andstructural features of Blakeslea trispora dependent on mediumcomposition，Microbiology 65，47，1996)，其中改變了Blakesleatrispora BS01(+)和BS01(-)的細胞壁。
碳底物的選擇也對β-胡蘿卜素的合成施加影響。發(fā)現(xiàn)如果復(fù)合底物同時包含糖和有機氮化合物(豆，豆粉，豆提取搗碎的谷物)(Lampila)，它們是最有利的。另外，添加脂肪和油增加β-胡蘿卜素的合成(US 5 422 247A，EP 1 367 131 A1)。
通過添加大豆油，棉籽油或這些油的脂肪酸以及皂腳(作為油精煉的產(chǎn)物，沉淀的脂肪酸)增加的β-胡蘿卜素的形成是參考樣品的80倍。Pazola等，Acta Microbiologica Polonica Vol.17，1，pp.75-82，1968，報道一些脂質(zhì)對混合配對的類胡蘿卜素的形成的影響。脂質(zhì)的組成對于貯存脂的形成是重要的，所述貯存脂是細胞中β-胡蘿卜素的溶劑。發(fā)現(xiàn)脂肪酸的光譜對于內(nèi)源性脂質(zhì)庫具有重要影響。
在搖瓶規(guī)模下進行關(guān)于在真菌中的β-胡蘿卜素生產(chǎn)者的性別和類胡蘿卜素生物合成的基礎(chǔ)研究。幾乎沒有對在大規(guī)模工藝中的β-胡蘿卜素應(yīng)用生產(chǎn)的描述，但是已知一些公司發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素。對于此，使用三孢布拉霉和布拉克須霉的突變株。
目前的應(yīng)用方法基于Ninet和Renaut在1979年開發(fā)的在3201的規(guī)模的小規(guī)模發(fā)酵的發(fā)酵185小時的發(fā)酵方法，其中(+)和(-)半菌株彼此嚴格分開增殖并且在最后一個步驟混合在一起。對于該目的，將兩種半菌株都加入發(fā)酵步驟的營養(yǎng)液中，在那里一起增殖，并且通過添加刺激物在限定的時間引發(fā)β-胡蘿卜素的生物合成。該技術(shù)主要了解自抗生素和酶的生產(chǎn)。在那里，總是選擇多階段的無菌方法，其中將來自搖瓶的生物質(zhì)培養(yǎng)在第一發(fā)酵罐中并且在第二發(fā)酵罐中進一步富集(大小等級1∶10)。通過首先產(chǎn)生生物質(zhì)在第三個步驟中進行目標產(chǎn)物的實際合成并且通過改變發(fā)酵條件來使目標產(chǎn)物(初級代謝產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物)的生產(chǎn)繼續(xù)進行。所有的方法通常進行無菌操作。選擇間斷操作方式來保證無菌狀態(tài)。在達到所述步驟的目的后，倒空發(fā)酵罐并進行滅菌以重復(fù)應(yīng)用。將單一培養(yǎng)物用在上述的每種方法中。傾向于使用形態(tài)上均一的微生物，因為認識到維持必要的處理條件對于這種生物而言更容易。如果它們沒有達到這些要求，通常需要補充化學(xué)和物理作用從而相應(yīng)地影響微生物。
所有的已知類胡蘿卜素方法都不具優(yōu)勢，因為它們僅在有限程度上適合于工業(yè)操作。
目前，已知生產(chǎn)β-胡蘿卜素的單一技術(shù)方法，其中僅在51的發(fā)酵罐中分析攪拌強度和出氣速率的影響，并通過Mantzouridou等在2001年建模的方式(Biochemical Engineering Journal 3561，1-13)測定重要的作用參數(shù)。
本發(fā)明的目的是詳細說明產(chǎn)生包含類胡蘿卜素的生物質(zhì)的方法，其在大規(guī)模下實現(xiàn)，具有低水平的復(fù)雜性并且不含抗生素。
按照本發(fā)明，所述問題通過按照權(quán)利要求1的方法得以解決。該方案的有利實施方案公開在從屬權(quán)利要求中。
本發(fā)明的本質(zhì)存在于通過接合菌門(Zygomycota)，毛霉目(Mucorales)菌株，例如三孢布拉霉(Blakeslea trispora)(高性能突變株)的異宗配合真菌的方式在浸沉培養(yǎng)法(submerged culture)中，工業(yè)生產(chǎn)包含類胡蘿卜素的生物質(zhì)，優(yōu)選地包含β-胡蘿卜素的生物質(zhì)，其中補充三孢酸衍生物和三孢酸于包含培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，其中-按照本發(fā)明使用添加1％的表面活性劑的無離子水在限氮的復(fù)合培養(yǎng)基上出水培養(yǎng)10-12天后，從熱帶三孢布拉霉的(+)和(-)半菌株中獲得純的孢子混懸液，其中10ml的試樣(eprouvette)培養(yǎng)物的孢子混懸液的孢子沉積物重懸在1ml的無離子水中并且隨后用9ml的甘油填充，并且將這些包含沒有膨脹的孢子囊孢子的孢子混懸液裝入管中并保存于-80℃到-85℃，-在(+)半菌株的生物質(zhì)在前面的過程控制中被加入的時候，將三孢酸和/或三孢酸輔助物質(zhì)(co-substance)加入多階段增殖的(-)半菌株而不是(+)半菌株，并且所述混合物隨后在引發(fā)重新開始的生物質(zhì)生產(chǎn)之前經(jīng)歷熟化期，-僅(-)半菌株進行常見的多階段生物質(zhì)增殖并且用于合成β-胡蘿卜素，而(+)半菌株在實驗室規(guī)模上培養(yǎng)在持續(xù)的，循環(huán)或間斷的培養(yǎng)物中，其中取決于過程控制，將生物質(zhì)，培養(yǎng)液，生物質(zhì)勻漿或配素類型的刺激物或三孢酸在該生物質(zhì)的指數(shù)生長期結(jié)束后從該培養(yǎng)物中加入(-)半菌株，生物質(zhì)勻漿和培養(yǎng)液以1∶100的比率，而配素類型的刺激物和三孢酸作為生物合成刺激添加劑以1∶1000到1500的比率加入。
按照本發(fā)明，進一步的是-使用支持β-胡蘿卜素的生物合成的刺激物是有利的。刺激物可以是維生素和其它根據(jù)化學(xué)組成具有與β-胡蘿卜素相關(guān)的結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。
-在生產(chǎn)發(fā)酵罐中的營養(yǎng)液以這樣的方式組成從而在誘導(dǎo)時期結(jié)束的時候，其導(dǎo)致通過限制磷濃度來限制總培養(yǎng)物中的生物質(zhì)生長并且引發(fā)β-胡蘿卜素的合成。還可以通過氧休克和/或溫度減少約至少4℃，組合以磷限制的時間來啟動合成。
-營養(yǎng)液以這樣的方式來組成，從而使得在孢子萌發(fā)和生物質(zhì)增殖的過程中細胞壁中的幾丁質(zhì)合成(building-up)都被限制，由此獲得從真菌細胞中不用溶劑提取β-胡蘿卜素的更好的能力(諸如對于實施例1中所給出的情形而言)。
-以使最佳混合和氣體交換條件出現(xiàn)的方式來補充酶或酶混合物以設(shè)定營養(yǎng)液的粘度，由此盡技術(shù)工藝的可能來進行經(jīng)濟的發(fā)酵操作是有利的。
-另外，可以使用保護β-胡蘿卜素的生物合成的激活劑。它們可以是具有根據(jù)化學(xué)組成與β-胡蘿卜素相關(guān)的結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。
-生物質(zhì)生產(chǎn)的過程和β-胡蘿卜素合成的過程通過磷的限制而彼此分開從而使它們順序進行，由此成功地將發(fā)酵時間明確限制在＜90-100小時，獲得＞25g/kg干生物質(zhì)的高β-胡蘿卜素產(chǎn)率。
以已知方式通過無溶劑提取法來進行從真菌生物質(zhì)中的β-胡蘿卜素提取。
本發(fā)明的描述了這樣的一種方法，所述方法可以通過使用能夠從接合菌門(Zygomycota)，毛霉目(Mucorales)菌株形成β-胡蘿卜素的異宗配合真菌，以最佳的經(jīng)濟和技術(shù)條件進行包含β-類胡蘿卜素的真菌生物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)。
這里，生物質(zhì)單獨地按照(+)和(-)配型(pair type)以多階段只從孢子中進行增殖。
在發(fā)酵生產(chǎn)之前的最后的生物質(zhì)增殖期結(jié)束后，將(+)配型的生物質(zhì)或(+)配型的培養(yǎng)液或(+)配型的勻漿化生物質(zhì)或配素型的刺激物或內(nèi)酯或三孢酸或三孢酸衍生物加入(-)配型的生物質(zhì)，其中在接種物發(fā)酵罐中在1到數(shù)小時的熟化時間后使用該浸沉混合物來起始生產(chǎn)發(fā)酵。營養(yǎng)液以這樣的方式組成從而使生物質(zhì)的生長期通過磷限制在時間tw上終止。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，可以另外通過產(chǎn)生短期應(yīng)激環(huán)境來引發(fā)β-胡蘿卜素的合成。另外，通過以磷比率(速率)(rate)限制生長以及在生長期中的磷限制來使通過植物油從得到的三孢布拉霉BS01(-)的干生物質(zhì)中無溶劑提取β-胡蘿卜素成為可能。
用在本發(fā)明的方法中的(+)配型僅是誘導(dǎo)菌株并且它們的生物質(zhì)被培養(yǎng)在持續(xù)的或循環(huán)的培養(yǎng)物中。與此相反，用在本發(fā)明的方法中的(-)半菌株僅是類胡蘿卜素的生產(chǎn)菌株。
將(+)配型的生物質(zhì)培養(yǎng)在循環(huán)培養(yǎng)物中。與此相反，將(-)配型以多階段持續(xù)進行增殖。在交配過程中，各個(+)配型的生物質(zhì)與各個(-)配型的生物質(zhì)的比率是1∶10到1∶200，優(yōu)選地1∶45到1∶75。(-)半菌株的交配階段，即非再引發(fā)(repriming)階段通過(+)半菌株的培養(yǎng)液，勻漿或合成產(chǎn)物的方式來進行菌株特異性地測定，并且所述時間是1-180分鐘，優(yōu)選30-90分鐘。
營養(yǎng)液由聚合物養(yǎng)分組成，具有磷限制，其中聚合物碳底物(carbonsubstrate)在凝集作用后，在對培養(yǎng)基進行滅菌的過程中進行酶導(dǎo)致的液化作用，其中液化作用大大減少了溶液的粘度，但是阻止了單體碳底物的形成。
營養(yǎng)液以這樣的方式組成并且制備從而使生物質(zhì)生長持續(xù)而快速進行并且培養(yǎng)物中的幾丁質(zhì)生物合成減少，并且在由于磷限制導(dǎo)致的生長終止后，僅底物可供用于產(chǎn)物形成，由此使在通過生產(chǎn)真菌的另外的酶促消化后重新開始的二次生物質(zhì)發(fā)展(development)成為不可能。
按照本發(fā)明，將具有β-胡蘿卜素合成＞2.0％干重的潛力的異宗配合真菌用作β-胡蘿卜素生產(chǎn)者，具體地是三孢布拉霉及其通過誘變衍生的菌株，其中不同的配型也可以起源自不同的系譜系。
將保藏于德意志微生物保藏中心(Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSMZ)的三孢布拉霉的高性能突變株BS01(+)和BS01(-)用作本發(fā)明方法中的基本材料。
對于本發(fā)明重要的是生產(chǎn)和支持培養(yǎng)物嚴格地只從孢子中進行培養(yǎng)。兩種半菌株等同地在分開的培養(yǎng)物中處理，反應(yīng)器大小可達1201。隨后，將BS01(+)半菌株在反應(yīng)器中作為持續(xù)的或循環(huán)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)。將BS01(-)半菌株進一步增殖到生物質(zhì)體積為5m3。到BS01(-)半菌株的生長期結(jié)束時，當營養(yǎng)底物濃度在此時在反應(yīng)器中減少時，將三孢酸衍生物和/或三孢酸以1∶1000-5000的比率加入BS01(-)生物質(zhì)中。所述三孢酸衍生物和/或三孢酸獲自BS01(+)半菌株培養(yǎng)物中。它們可以作為BS01(+)生物質(zhì)或勻漿(在該情形中，以比率1∶10到1∶100)，培養(yǎng)液或單獨的刺激物混合物進行添加。在發(fā)酵條件下在30-180分鐘的關(guān)鍵接觸時間后，將用于β-胡蘿卜素合成的營養(yǎng)液與該誘導(dǎo)的菌絲體混合物一起接種在生產(chǎn)發(fā)酵罐中。該營養(yǎng)液以這樣的方式組成從而使被磷比率限制的生物質(zhì)的增加在24小時后被磷限制所終止，并且β-胡蘿卜素的合成開始。這種合成另外被氧應(yīng)激誘導(dǎo)至少3小時并且一般在78-94小時后，被立即的固體/液體分離和隨后的干燥所終止。
與本發(fā)明有關(guān)，突變原(mutagene)-處理的三孢布拉霉的純合子配型BS01(+)和BS01(-)的菌株維持和培養(yǎng)是重要的從而保證遺傳穩(wěn)定性。對于BS01(+)，通過用500mg/ml濃度的亞硝基胍處理0.02-0.1％的孢子混懸液進行誘變來獲得菌株，而對于BS01(-)，以孢子存活率為5-7％的UV輻射和相同濃度的亞硝基胍進行誘變來獲得菌株。BS01(-)的特征在于細胞壁的幾丁質(zhì)含量減少。兩種半菌株將油裂解為甘油和脂肪酸，但是不能利用裂解產(chǎn)物。另外，它們的特征在于它們菌絲(hyphae)的高分枝程度。對于半菌株，孢子囊孢子的無性生殖在限氮培養(yǎng)基上進行從而獲得足夠高的孢子形成。12天生長后在孢子囊孢子的形態(tài)分化后，使用添加了1％表面活性劑的無離子水，將同質(zhì)的孢子菌苔洗下，再次用無離子水將孢子沉積物洗下并用甘油重懸。將該混懸液裝入安瓿中并存于-80℃到-85℃。不依賴于它們的體積大小，由于離子游離的結(jié)果導(dǎo)致的水結(jié)合被阻止的這些未膨脹孢子的原種保存物是用于發(fā)酵一年的基本材料。
描述在本說明書中的所有特征，后附的實施例和權(quán)利要求可以單獨地和彼此組合在一起都是對于本發(fā)明所必需的。
隨后，本發(fā)明的方法通過兩個實施例的方式來詳細進行解釋，所述實施例關(guān)于三孢布拉霉BS01(+)和BS01(-)的培養(yǎng)，但本發(fā)明并不局限于該真菌因為毛霉目的其它真菌可以用在本發(fā)明的方法中。
1.實施例在用20mg淀粉酶(BAN 800MG，Novo Nordisk)/2l培養(yǎng)基進行淀粉酶處理后將具有20g/l大豆蛋白胨，30g/l玉米淀粉，0.5g/l KH2PO4，6.5ml/l向日葵油，0.002g/l維生素B1，0.001g/l維生素B2的組成的0.3l培養(yǎng)基裝入具有錐形肩狀部的21燒瓶中，并于125℃高壓滅菌30分鐘到45分鐘后用具有2.0×106到4.0×106/ml孢子混懸液的孢子濃度的1ml孢子混懸液接種培養(yǎng)基。通過利用11ml無離子水洗去12天齡的試樣培養(yǎng)物而獲得用0.1ml原種保存物接種的這種孢子混懸液。
于27℃+/-1℃以10cm的振幅于180rpm在2l搖瓶中對兩種半菌株等同地進行第一個增殖步驟24小時。30l接種物發(fā)酵罐的培養(yǎng)基制品由20g/l大豆粉，20g/l玉米淀粉，0.5g/l KH2PO4，1.5g/l向日葵油，0.002g/l維生素B1組成。在發(fā)酵罐中將稱重過的10l自來水中的大豆粉和玉米淀粉樣品加熱到100℃。在冷卻至60℃后加入磷酸二氫鉀和預(yù)先高壓滅菌的向日葵油并將體積填充至22l。在將pH調(diào)節(jié)至pH＝6.5-7.0后于121℃進行滅菌45分鐘。用0.6l BS01(-)半菌株的振蕩培養(yǎng)物進行接種物發(fā)酵罐的接種。在開始同時在2l搖瓶中以所述的方式培養(yǎng)BS01(+)半菌株。24小時的培養(yǎng)后通過向發(fā)酵罐中加入0.36lBS01(+)培養(yǎng)物進行BS01(-)菌株中生物合成的誘導(dǎo)，持續(xù)60-180分鐘。在27.5℃于300rpm上持續(xù)攪拌和0.5vvm的通風(fēng)下進行通過添加BS01(+)半菌株誘導(dǎo)生物合成的BS01(-)菌株的培養(yǎng)。
500l生產(chǎn)發(fā)酵罐的培養(yǎng)基由25g/l大豆粉，10g/l玉米粉，40g/l玉米淀粉，含有2g/l生育酚的油成分組成。將22.5kg的培養(yǎng)基制品在1501自來水中與2.25g淀粉酶(BAN 800MG，Novo Nordisk)一起攪拌，在將pH調(diào)節(jié)至pH＝6.8-7.0后加熱到73℃，并在10分鐘后將溫度控制到100℃。在冷卻到60℃后加入含有生育酚的成分并將體積調(diào)節(jié)至3001。于121℃進行這種制備的培養(yǎng)基的高壓滅菌45分鐘。設(shè)定起始條件，250rpm，0.4vvm的通風(fēng)和27.5℃后，通過壓力疊加的方式將發(fā)酵的誘導(dǎo)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移入生產(chǎn)發(fā)酵罐中。只允許起始自100％的pO2通過通風(fēng)速率(高達1.0vvm)以及不超過300rpm的攪拌器速率的方式減少到10％-20％。在72小時中起始自此值的pO2值提高到40％-60％。通過分別利用20％的堿或20％的酸的兩步控制實現(xiàn)了pH值控制在pH＝7.2-7.4。以酸化階段進行利用蛋白質(zhì)的生長直到第24小時磷限制，隨后代之以堿化階段，顯示中度的NH4-N-釋放。24小時后通過磷限制以30g生物質(zhì)/升完成初級生長。同時，作為在接種物發(fā)酵罐中已經(jīng)進行過的BS01(-)半菌株中β-胡蘿卜素生物合成的誘導(dǎo)的結(jié)果，于早期在生產(chǎn)發(fā)酵罐中從發(fā)酵的第20小時誘導(dǎo)β-胡蘿卜素形成。β-胡蘿卜素含量根據(jù)培養(yǎng)基組成和制備到第84小時為止高達4％生物干重。深紅色的真菌菌絲體是同質(zhì)的并且易于在中止時期輕輕倒出。
2.實施例按照實施例1中對第一個增殖步驟給出的方式進行三孢布拉霉的兩種突變半菌株的培養(yǎng)。培養(yǎng)基以及用BS01(-)半菌株接種30l接種物發(fā)酵罐也與實施例1中的細節(jié)相同。在持續(xù)的和/或循環(huán)的條件下于具有凈體積4l培養(yǎng)基的5l生物反應(yīng)器中進行BS01(+)半菌株的培養(yǎng)。無顆粒的培養(yǎng)基包含5g/l植物明膠，10g/l玉米溶脹水(swelling water)(100％)，5g/l葡萄糖和0.5g/l Rhodigel(Rhodia Food)。通過貯存液的方式將Rhodigel加入到培養(yǎng)基中，由此調(diào)節(jié)粘性以便維持真菌的同質(zhì)生長。通過Ultraturrax的方式在脫水器中緩慢攪拌5g Rhodigel/升，由此產(chǎn)生這種貯存液。在將pH值調(diào)節(jié)到pH 7.0后，將培養(yǎng)基于125℃高壓滅菌35分鐘。利用BS01(+)半菌株的0.3l振蕩培養(yǎng)基進行培養(yǎng)基的接種。在5小時間斷的培養(yǎng)控制之后改變?yōu)镈＝0.1h-1的持續(xù)的培養(yǎng)控制。培養(yǎng)物的生產(chǎn)力總計0.5g/lxh.將0.36BS01(+)培養(yǎng)物加到22l(-)培養(yǎng)物中以在具有8-10g/l生物質(zhì)濃度的30l接種物反應(yīng)器中誘導(dǎo)生物合成(交配)。因而，BS01(+)半菌株的持續(xù)培養(yǎng)被一個循環(huán)所中斷。誘導(dǎo)的條件相應(yīng)于實施例1中的那些條件。類似地，生產(chǎn)的條件是相同的。不依賴于伴隨誘導(dǎo)培養(yǎng)的生產(chǎn)發(fā)酵的循環(huán)過程，BS01(+)半菌株的生物質(zhì)可供用于活性生物質(zhì)，均質(zhì)化生物質(zhì)和配素-類型和非再引發(fā)物質(zhì)的提取。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生包含β-類胡蘿卜素的生物質(zhì)的方法，該方法基于借助異宗配合的真菌在浸沉培養(yǎng)物中的微生物合成來進行，所述異宗配合的真菌通過誘變進行改造并且具有提高的合成和貯藏β-胡蘿卜素的能力，所述方法的特征在于，-在多階段中，所述生物質(zhì)只從孢子中按照(+)和(-)配型分別進行增殖，-在用無離子水洗滌后，將(+)和(-)配型的孢子在-80℃到-85℃甘油保護的條件下貯存在密封管中，-在所述生產(chǎn)發(fā)酵之前的最后的生物質(zhì)增殖期結(jié)束后，將(+)配型的生物質(zhì)或(+)配型的培養(yǎng)液或(+)配型的勻漿化生物質(zhì)或配素型的刺激物或內(nèi)酯或三孢酸或三孢酸衍生物加入(-)配型的生物質(zhì)，-在1-5小時的時間依賴型交配或誘導(dǎo)時間后，將該浸沉混合物轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)發(fā)酵的營養(yǎng)液中，其中所述營養(yǎng)液以這樣的方式組成，即使得被磷比率所限制的生物質(zhì)的生長期在時間tw被完全終止，-另外通過產(chǎn)生溫度和氧應(yīng)激環(huán)境3-7小時來引發(fā)在產(chǎn)物培養(yǎng)物中的β-胡蘿卜素的合成，-其中依靠只是在被磷比率限制的生長期后，不再將無機磷化合物加入所述培養(yǎng)基中來對所述菌株進行磷限制而使從獲得的干生物質(zhì)中無溶劑提取β-胡蘿卜素成為可能。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述(+)配型僅是誘導(dǎo)菌株并且它們的生物質(zhì)培養(yǎng)在持續(xù)的和循環(huán)的培養(yǎng)物中。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述(-)半菌株僅是類胡蘿卜素的生產(chǎn)菌株。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述(+)配型的生物質(zhì)培養(yǎng)在循環(huán)的培養(yǎng)物中并且只有所述(-)配型在多階段中持續(xù)地進行增殖。
5.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于在交配過程中各個(+)配型的生物質(zhì)與各個(-)配型的生物質(zhì)的比率是1∶10到1∶200，優(yōu)選1∶45到1∶75。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于如果應(yīng)用培養(yǎng)液，勻漿或合成產(chǎn)物，所述交配時間或所述熟化時間分別由所用的微生物決定，并且所述時間是1-180分鐘，優(yōu)選30-180分鐘。
7.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述營養(yǎng)液由聚合物底物組成，具有磷限制，并且在所述聚合物碳底物的凝集作用后的準備過程中，經(jīng)歷酶導(dǎo)致的液化作用，其中所述液化作用大大減少了所述溶液的粘度，但是阻止了單體碳底物的形成。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述營養(yǎng)液以這樣的方式組成和制備，即使得所述生物質(zhì)生長持續(xù)而快速進行并且所述培養(yǎng)物中幾丁質(zhì)的生物合成減少，并且在由于磷限制導(dǎo)致生長終止后，僅營養(yǎng)底物可供用于所述產(chǎn)物形成，由此使在通過所述生產(chǎn)真菌的另外的酶促消化后重新開始的二次生物質(zhì)發(fā)展成為不可能。
9.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于在所述發(fā)酵過程中使用應(yīng)激因子。
10.按照權(quán)利要求9的方法，其特征在于所述應(yīng)激因子是氧過剩和/或抗氧化劑。
11.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于使用刺激物。
12.按照權(quán)利要求11的方法，其特征在于所述刺激物是維生素和/或維生素的前體和/或根據(jù)化學(xué)組成與所述β-胡蘿卜素有關(guān)的結(jié)構(gòu)。
13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于根據(jù)化學(xué)組成與所述β-胡蘿卜素有關(guān)的結(jié)構(gòu)是β-芷香酮，三孢酸，類胡蘿卜素，類胡蘿卜素的片段和/或內(nèi)酯。
14.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于將具有β-胡蘿卜素合成＞2.0％干重的潛力的異宗配合真菌用作β-胡蘿卜素生產(chǎn)者。
15.按照權(quán)利要求1-14的方法，其特征在于所述異宗配合的真菌是三孢布拉霉(Blakeslea trispora)及其通過誘變衍生的菌株。
16.按照權(quán)利要求15的方法，其特征在于所述異宗配合的真菌是三孢布拉霉BS01(+)和BS01(-)。
17.按照權(quán)利要求14的方法，其特征在于所述不同配型的異宗配合的真菌起源自一種系譜系。
18.按照權(quán)利要求14的方法，其特征在于所述不同配型的異宗配合真菌起源自不同的不同系譜系。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含類胡蘿卜素的生物質(zhì)的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的目的是提供包含類胡蘿卜素的生物質(zhì)的生產(chǎn)方法，其可以在大規(guī)模上以低水平的復(fù)雜性和不需使用抗生素來實現(xiàn)。為此目的，本發(fā)明提供將具有提高的β－胡蘿卜素的合成和貯存能力的非基因改造的異宗配合真菌培養(yǎng)在浸沉培養(yǎng)物中，由此所述生物質(zhì)以多階段，只從孢子中按照(+)和(－)配型分別進行增殖。在所述生產(chǎn)發(fā)酵之前的最后的生物質(zhì)增殖期完成后，將(+)配型的生物質(zhì)或(+)配型的培養(yǎng)液或(+)配型的勻漿化生物質(zhì)或，代替(+)配型的配素型的刺激物或內(nèi)酯或三孢酸或三孢酸衍生物加入(－)配型的生物質(zhì)，并且在熟化時期持續(xù)數(shù)小時后，將該浸沉混合物轉(zhuǎn)移到產(chǎn)品發(fā)酵的營養(yǎng)液中。所述營養(yǎng)液以這樣的方式組成從而使得在時間t
文檔編號C12R1/645GK1886519SQ200480034773
公開日2006年12月27日 申請日期2004年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月26日
發(fā)明者C·門舍爾, A·克列斯特施默, R·佩茨, A·克里斯特納, K－D·門策爾, M·西魯利斯 申請人:生物協(xié)作有限責(zé)任公司