專利名稱：Hpv58l1在酵母中的最優(yōu)化表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總的來說涉及人乳頭瘤病毒(HPV)感染的預防和/或治療。更具體而言，本發(fā)明涉及編碼HPV58 L1蛋白的合成的多核苷酸，和包含所述多核苷酸的重組載體和宿主。本發(fā)明還涉及HPV58病毒樣顆粒(VLPs)，其中VLPs通過在酵母細胞中表達重組HPV 58 L1或L1+L2而產(chǎn)生，和涉及它們在預防和治療HPV感染的疫苗和藥物組合物中的用途。
背景技術：
有80種以上人乳頭瘤病毒(HPV)，其中很多與各式各樣的生物學表型相關，所述生物學表型為從良性增生性疣到惡性癌(綜述參見McMurray等人，Int.J.Exp.Pathol.82(1)15-33(2001))。HPV6和HPV11是與生殖器或呼吸粘膜的良性疣、非惡性尖銳濕疣和/或輕度發(fā)育不良相關的最普通類型。HPV16和HPV18是與子宮頸、陰道、女陰和肛管的原位和侵襲性癌最常相關的高風險類型。90％以上的子宮頸癌與HPV16、HPV18或較少流行的致癌類型HPV31、-33、-45、-52和-58的感染相關(Schiffman等人，J.Natl.Cancer Inst.85(12)958-64(1993))。在90％以上子宮頸癌中檢測到HPV DNA的觀察結果提供了HPVs引起子宮頸癌的強大流行病學證據(jù)。
乳頭瘤病毒是小(50-60nm)、無包膜、二十面體的DNA病毒，其編碼最多八個早期和兩個晚期基因。該病毒基因組的可讀框(ORFs)命名為E1至E7，和L1和L2，其中“E”表示早期和“L”表示晚期。L1和L2編碼病毒衣殼蛋白，而E基因與如病毒復制和細胞轉化的功能相關。
L1蛋白是主要的衣殼蛋白并具有55-60kDa的分子量。L2蛋白是次要的衣殼蛋白。免疫學數(shù)據(jù)提示在病毒衣殼中，大多數(shù)L2蛋白位于L1蛋白內(nèi)部。在不同乳頭瘤病毒中，L1和L2蛋白都高度保守。
L1蛋白或L1和L2蛋白組合在酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞或細菌中的表達導致病毒樣顆粒(VLPs)的自動裝配(綜述參見Schiller和Roden，in Papillomavirus ReviewsCurrent Researchon Papillomaviruses；Lacey，ed.Leeds，UKLeeds MedicalInformation，pp 101-12(1996))。VLPs形態(tài)上類似于真的病毒體且在施用于動物或人后能夠誘導高效價的中和抗體。因為VLPs不含有潛在地致癌病毒基因組，所以它們?yōu)榛畈《驹贖PV疫苗開發(fā)中的用途提供了安全的備選方案(綜述參見Schiller和Hidesheim，J.Clin.Virol.1967-74(2000))。由于這個原因，L1和L2基因已經(jīng)被確定為HPV感染和疾病的預防和治療性疫苗開發(fā)的免疫學靶。
與在成功轉化的宿主生物中獲得高表達水平的衣殼蛋白、限制純化蛋白的生產(chǎn)相關的困難已阻礙了HPV疫苗開發(fā)和商業(yè)化。因此，盡管鑒定了編碼HPV L1蛋白如HPV58 L1蛋白的野生型核苷酸序列，但是非常期望開發(fā)粗HPV L1蛋白的可容易更新來源，該蛋白利用在指定宿主細胞中表達被最優(yōu)化的編碼HPV58 L1的核苷酸序列。另外，產(chǎn)生具有天然蛋白的賦予免疫性性質(zhì)的用于疫苗開發(fā)的大量HPV58L1 VLPs將有用處。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及引發(fā)或增強由HPV58 L1基因表達的蛋白產(chǎn)物的免疫性的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明提供了編碼HPV58 L1蛋白的多核苷酸，其中為在酵母細胞中高水平表達，多核苷酸已被密碼子最優(yōu)化。本發(fā)明進一步提供了HPV58病毒樣顆粒(VLPs)，其中所述VLPs通過重組HPV58 L1或L1+L2在酵母細胞中表達而產(chǎn)生，并公開了HPV58 VLPs在預防和/或治療HPV相關癌癥的藥物組合物和疫苗中的用途。
本發(fā)明涉及編碼HPV58 L1蛋白的合成DNA分子。設計合成分子的密碼子以使得使用酵母細胞優(yōu)選的密碼子。合成分子可以用作HPV58 L1蛋白的來源，它可以自動裝配入VLPs。所述VLPs可以用于基于VLP的疫苗。
本發(fā)明的示例性實施方案包括編碼如SEQ ID NO2所列的HPV58L1蛋白的合成核酸分子，所述核酸分子包含為在酵母細胞中高水平表達而最優(yōu)化的密碼子的核苷酸序列。在優(yōu)選實施方案中，該核酸包含如SEQ ID NO1所列的核苷酸序列(在此命名為“58 L1 R序列”)。
還提供了含有貫穿本說明書公開的核酸分子的重組載體和重組宿主細胞，其可為原核和真核的。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，宿主細胞是酵母細胞。
本發(fā)明還涉及在重組宿主細胞中表達HPV58 L1蛋白的方法，其包括(a)將包含編碼HPV58 L1蛋白的核酸的載體導入酵母宿主細胞；和(b)在允許表達所述HPV58 L1蛋白的條件下培養(yǎng)該酵母宿主細胞。
本發(fā)明進一步涉及在重組宿主細胞中表達HPV58 L1蛋白的方法，其包括(a)將包含編碼HPV58 L1蛋白的核酸分子的載體導入酵母宿主細胞；其中為在酵母宿主細胞中最佳表達，該核酸分子被密碼子最優(yōu)化和；(b)在允許表達所述HPV58 L1蛋白的條件下培養(yǎng)該酵母宿主細胞。
在本發(fā)明這個方面的優(yōu)選實施方案中，該核酸包含如SEQ ID NO1所列的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及酵母細胞中產(chǎn)生的HPV58病毒樣顆粒(VLPs)，產(chǎn)生HPV58 VLPs的方法和使用HPV58 VLPs的方法。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，酵母選自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形漢遜氏酵母(Hansenulapolymorpha)、巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)、脆壁克魯維氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
本發(fā)明的另一方面是HPV58 VLP，其中VLP通過HPV58 L1或HPV58L1+L2在酵母細胞中重組表達產(chǎn)生。
本發(fā)明的又一個方面是HPV58 VLP，它包含由密碼子最優(yōu)化的HPV58 L1基因產(chǎn)生的HPV58 L1蛋白。在本發(fā)明這個方面的示例性實施方案中，該密碼子最優(yōu)化的HPV58 L1基因包含如SEQ ID NO1所列的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了在動物中誘導免疫反應的方法，其包括給該動物施用HPV58病毒樣顆粒。在優(yōu)選實施方案中，HPV58 VLPs由密碼子最優(yōu)化的基因產(chǎn)生。
本發(fā)明的又一個方面是預防或治療HPV相關的子宮頸癌的方法，其包括給哺乳動物施用包含HPV58 VLPs的疫苗。在本發(fā)明這個方面的優(yōu)選實施方案中，HPV58 VLPs在酵母中產(chǎn)生。
本發(fā)明還涉及包含HPV58病毒樣顆粒(VLPs)的疫苗，其中HPV58VLPs在酵母中產(chǎn)生。
在本發(fā)明這個方面的可供選擇的實施方案中，疫苗進一步包含至少一個另外的HPV類型的VLPs。至少一個另外的HPV類型可以是感興趣的任何HPV類型，包括本領域描述過或隨后鑒定的任何HPV類型。在優(yōu)選實施方案中，HPV類型是與臨床表型如疣或子宮頸癌相關的類型。在進一步優(yōu)選實施方案中，至少一個另外的HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV59和HPV68。
本發(fā)明還涉及包含HPV 58病毒樣顆粒和藥物可接受載體的藥物組合物，其中HPV58 VLPs在酵母中產(chǎn)生。此外，本發(fā)明涉及包含HPV58VLPs和至少一個另外的HPV類型的VLPs的藥物組合物。在優(yōu)選實施方案中，至少一個另外的HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV59和HPV68。
如貫穿本說明書和附加權利要求使用的，單數(shù)形式“一個(a)”、“一個(an)”和“該(the)”包括復數(shù)形式，除非上下文清楚地作出不同指示。
如貫穿本說明書和附加權利要求使用的，應用下列定義和縮寫術語“啟動子”是指DNA鏈上RNA聚合酶結合的識別位點。啟動子與RNA聚合酶形成起始復合物以啟動和驅(qū)動轉錄活動。該復合物可以被稱為“增強子”或“上游激活序列”的激活序列或稱為“沉默子”的抑制序列修飾。
術語“載體”是指通過它，DNA片段可以被導入宿主生物或宿主組織的一些工具。有各種類型的載體，包括質(zhì)粒、病毒(包括腺病毒)、噬菌體和粘粒。
術語“盒”是指待從載體表達的核苷酸或基因序列，例如編碼HPV58L1蛋白的核苷酸或基因序列。通常，該盒包含插入載體的基因序列，在一些實施方案中，該載體提供用于表達所述核苷酸或基因序列的調(diào)節(jié)序列。在其它實施方案中，該核苷酸或基因序列提供用于它表達的調(diào)節(jié)序列。在進一步的實施方案中，該載體提供一些調(diào)節(jié)序列，且所述核苷酸或基因序列提供其它的調(diào)節(jié)序列。例如，該載體可以提供用于轉錄所述核苷酸或基因序列的啟動子，且所述核苷酸或基因序列提供轉錄終止序列。載體可以提供的調(diào)節(jié)序列包括但不限于增強子、轉錄終止序列、剪接受體和供體序列、內(nèi)含子、核糖體結合序列和聚腺苷酸添加序列。
名稱“58 L1野生型序列”和“58 L1 wt序列”是指在此公開為SEQ ID NO3的HPV58 L1序列。盡管以前已經(jīng)描述了HPV 58 L1野生型序列，但是從臨床分離物獲得的DNAs之間找到較小的序列變異并不罕見。因此，代表性的58 L1野生型序列分離自以前表明含有HPV 58 DNA的臨床樣品(參見實施例1)。58 L1野生型序列被用作參照序列來比較在此公開的密碼子最優(yōu)化的58 L1序列(參見

圖1)。
名稱“HPV 58 L1 R”和“58 L1 R”是指示例的在此公開的合成HPV58 L1核苷酸序列(SEQ ID NO1)，其中該序列被重建，從而它包含為酵母細胞高水平表達而優(yōu)選的密碼子。
術語“有效量”意思是足夠的疫苗組合物被導入以產(chǎn)生足夠水平的多肽，從而產(chǎn)生免疫反應。本領域技術人員認識到這個水平可以變化。
“保守性氨基酸置換”是指一個氨基酸殘基被另一個化學上類似的氨基酸殘基取代。這種保守性置換的實例是一個疏水性殘基(異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或甲硫氨酸)置換另一個；一個極性殘基置換相同電荷的另一個極性殘基(例如精氨酸置換賴氨酸；谷氨酸置換天冬氨酸)。
術語“哺乳動物”是指任何哺乳動物，包括人。
“VLP”或“VLPs”是指病毒樣顆?；蚨喾N病毒樣顆粒。
“合成的”是指產(chǎn)生了HPV58 L1基因，從而它含有不同于指定的天然存在的野生型HPV58 L1基因中存在的核苷酸序列(58 L1 wt，SEQID NO3)的核苷酸序列。如上所述，在此提供了合成分子，它包含含有為酵母細胞表達而優(yōu)選的密碼子的核苷酸序列。在此提供的合成分子編碼與野生型HPV58 L1基因(SEQ ID NO2)相同的氨基酸序列。
附圖簡述圖1顯示了比較本發(fā)明的合成HPV58 L1基因中改變的核苷酸(SEQ ID NO1，顯示為“58 L1 R”)(參見實施例2)的序列比對。參照序列是58 L1野生型序列(SEQ ID NO3，顯示為“58 L1 wt”；參見實施例1)。改變的核苷酸在它們的相應位置顯示。括號內(nèi)含有核苷酸號。58 L1重建序列中相同的核苷酸用點顯示。
圖2顯示了重建合成的HPV 58 L1雙鏈核酸和上面的單密碼氨基酸序列。核苷酸號示于左側。
圖3顯示了HPV 58 L1 wt和58 L1 R轉錄物的RNA印跡(參見實施例4)。用等量DIG標記的58L1 wt和58 L1 R DNA探針的混合物探測印跡。顯示了每個泳道中電泳的總RNA的量。右方箭頭指出預測大小的全長58 L1轉錄物。
圖4顯示了HPV 58 L1 wt(58)和58 L1 R(58R)蛋白的蛋白印跡。HPV 16 L1被包括作為參照(16)。10、5和2.5微克總酵母蛋白提取物被變性和應用于10％ SDS-PAGE凝膠。使用與58 L1和16 L1交叉反應的酵母吸收的抗trpE-HPV 31 L1山羊多克隆抗血清檢測HPV58 L1蛋白。分子量標記在左方以kDa顯示。
圖5描繪了ELISA中捕獲和檢測的每微克總酵母蛋白的完整HPV58 L1 VLPs的量(ng)(參見實施例7)。包括了一式兩份實施的兩個實驗結果。HPV 58 L1 wt(黑色和灰色方框)的VLP表達是36ng/μg總酵母蛋白。重建酵母密碼子最優(yōu)化的58 L1-HPV 58 L1 R(白色和陰影方框)的VLP表達為HPV 58 L1 wt表達的約2～3倍，在實驗#2中達到95ng/μg總酵母蛋白。
圖6顯示了由在此描述的HPV 58 L1 R蛋白分子組成的HPV 58VLPs的代表性樣品，如通過透射電子顯微鏡術可見的(參見實施例8)。那個條代表大約100nm。
發(fā)明詳述大多數(shù)子宮頸癌與特異致癌類型的人乳頭瘤病毒(HPV)感染相關。本發(fā)明涉及引發(fā)或增強對由致癌HPV類型的基因表達的蛋白產(chǎn)物的免疫性的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明提供了編碼HPV58 L1的多核苷酸，其中為在酵母中高水平的表達，該多核苷酸已被密碼子最優(yōu)化。本發(fā)明還提供了HPV58病毒樣顆粒(VLPs)，它在酵母中產(chǎn)生，并公開了所述多核苷酸和VLPs在預防和/或治療HPV相關癌癥的藥物組合物和疫苗中的用途。
已經(jīng)報道了野生型HPV58 L1核苷酸序列(Genbank登記號#NC_001443，參見Kirii等人.Virology 185(1)424-427(1991))。本發(fā)明提供了編碼HPV58 L1蛋白的合成DNA分子。本發(fā)明的合成分子包含密碼子序列，其中為高水平表達，至少一些密碼子已經(jīng)被改變而使用酵母細胞優(yōu)選的密碼子。合成分子可以用作HPV58 L1蛋白表達的編碼序列，它可以自動裝配入VLPs。所述VLPs可以用于基于VLP的疫苗，以通過中和抗體和細胞介導免疫提供抗乳頭瘤病毒感染的有效免疫預防。這種基于VLP的疫苗還可用于已建立的HPV感染的治療。
HPV VLPs在酵母細胞中的表達提供了節(jié)省成本的和易于適應在發(fā)酵罐中大規(guī)模生長的優(yōu)點。另外，酵母基因組可以輕易地被改變以確保生長和表達潛力增加的重組體、轉化酵母的選擇。然而，許多HPV L1蛋白，包括HPV58 L1在酵母細胞中以低于商業(yè)上按比例擴大所希望的水平表達。
因此，本發(fā)明涉及為在酵母細胞環(huán)境中高水平表達而被“最優(yōu)化”的HPV58 L1基因序列。
四個可能的核苷酸堿基的“三聯(lián)體”密碼子可存在60個以上的變異形式。因為這些密碼子為僅20個不同的氨基酸(以及轉錄起始和終止)提供了信息，所以一些氨基酸可以由一個以上密碼子編碼，即被稱為密碼子豐余性的現(xiàn)象。由于未完全理解的原因，可替換的密碼子不是均勻存在于不同類型細胞的內(nèi)源DNA中的。實際上，在某些類型細胞中，對于某些密碼子，似乎存在可變自然等級制或“偏愛”。作為一個實例，氨基酸亮氨酸用六個DNA密碼子中的任何一個來指定，包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA和TTG。微生物基因組密碼子使用頻率的全面分析揭示了大腸桿菌(E.coli)內(nèi)源DNA最通常含有CTG指定酪氨酸的密碼子，而酵母和粘菌的DNA最通常包括TTA指定亮氨酸的密碼子?？紤]到這個等級，普遍認為由大腸桿菌宿主獲得富含亮氨酸多肽的高水平表達的可能性將在某種程度上取決于密碼子使用的頻率。例如，很可能富含TTA密碼子的基因?qū)⒃诖竽c桿菌中低表達，而富含CTG的基因或許將在這個宿主中高表達。類似地，在酵母宿主細胞中表達富含亮氨酸的多肽的優(yōu)選密碼子將是TTA。
密碼子偏愛現(xiàn)象對重組DNA技術的含義是顯然的，并且該現(xiàn)象可以用來解釋獲得外源基因在成功轉化的宿主生物中的高表達水平的很多早先失敗-較不“優(yōu)選的”密碼子可能重復存在于插入的基因中和用于表達的宿主細胞機器可能未有效運作。這個現(xiàn)象提示已設計包括計劃的宿主細胞優(yōu)選密碼子的合成基因提供了用于實施重組蛋白表達的外來遺傳材料的最佳形式。因此，本發(fā)明的一個方面是為在酵母細胞中高水平表達而被密碼子最優(yōu)化的HPV58 L1基因。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)編碼相同蛋白序列的可替換密碼子的使用可以消除對酵母細胞表達HPV58 L1蛋白的約束因素。
根據(jù)本發(fā)明，HPV58 L1基因片段轉變?yōu)榫哂邢嗤g序列，但具有Sharp和Cowe(Synonymous Codon Usage in Saccharomycescerevisiae.Yeast 7657-678(1991))描述的可替換密碼子使用的序列，該文獻在此引入作為參考。該方法通常由下列組成，鑒定通常與高表達酵母基因不相關的野生型序列中的密碼子并用在酵母細胞中高表達的最佳密碼子取代它們。然后檢查該新基因序列中通過這些密碼子取代而產(chǎn)生的非期望序列(例如“ATTTA”序列、內(nèi)含子剪接識別位點的非故意產(chǎn)生物、不需要的限制性內(nèi)切酶位點、高GC含量、酵母識別的轉錄終止信號的存在等等)。用編碼相同氨基酸的不同密碼子置換存在的密碼子來消除非期望序列。然后檢測合成基因片段提高的表達。
將如上所述方法用來產(chǎn)生HPV58 L1的合成基因片段，從而產(chǎn)生包含為高水平表達而最優(yōu)化的密碼子的基因。雖然上述方法提供了我們的設計用于HPV疫苗的密碼子最優(yōu)化基因的方法概要，但是本領域技術人員理解類似的疫苗功效或基因表達增加可以通過方法中的小變化或通過該序列中的小變異而實現(xiàn)。
因此，本發(fā)明涉及包含編碼HPV58 L1蛋白或HPV58 L1蛋白的生物學活性片段或突變形式的核苷酸序列的合成多核苷酸，該多核苷酸序列包含為在酵母宿主細胞中表達而最優(yōu)化的密碼子。所述突變形式的HPV58 L1蛋白包括但不限于保守性氨基酸置換、氨基末端截短、羧基末端截短、缺失或添加。任何這種生物學活性片段和/或突變體將編碼至少基本上模擬SEQ ID NO2所列HPV58 L1蛋白的免疫學性能的蛋白或蛋白片段。本發(fā)明的合成多核苷酸編碼表達功能性HPV58L1蛋白的mRNA分子，從而在治療或預防性HPV疫苗開發(fā)中有用。
本發(fā)明的一個方面是編碼SEQ ID NO2所列的HPV58 L1蛋白的密碼子最優(yōu)化的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO1所列的的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及含有貫穿本說明書公開的核酸分子的重組載體和重組宿主細胞，其可為原核和真核的。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，宿主細胞是酵母宿主細胞。
通過在此描述的方法構建的合成HPV58 DNA或其片段可以通過分子克隆入含有合適啟動子和其它適當轉錄調(diào)節(jié)元件的表達載體，并轉移到原核或真核宿主細胞產(chǎn)生重組HPV58 L1而被重組表達。Sambrook等人.(Molecular CloningA Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人，Green Pub.Associates and Wiley-Interscience，New York(1988)；YeastGeneticsA Laboratory Course Manual，Rose等人，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1990))充分描述了這種操作的技術，它們的全部內(nèi)容在此被引入作為參考。
因此，本發(fā)明涉及在重組宿主細胞中表達HPV58 L1蛋白的方法，其包括(a)將包含編碼HPV58 L1蛋白的核酸的載體導入酵母宿主細胞；和(b)在允許表達所述HPV58 L1蛋白的條件下培養(yǎng)該酵母宿主細胞。
本發(fā)明進一步涉及在重組宿主細胞中表達HPV58 L1蛋白的方法，其包括(a)將包含編碼HPV58 L1蛋白的核酸的載體導入酵母宿主細胞；其中為在酵母宿主細胞中最佳表達，該核酸分子被密碼子最優(yōu)化和；(b)在允許表達所述HPV58 L1蛋白的條件下培養(yǎng)該酵母宿主細胞。
本發(fā)明進一步涉及在重組宿主細胞中表達HPV58 L1蛋白的方法，其包括(a)將包含SEQ ID NO1所列的核酸的載體導入酵母宿主細胞；和(b)在允許表達所述HPV58 L1蛋白的條件下培養(yǎng)該酵母宿主細胞。
本發(fā)明的合成基因可以裝配入包含設計提供HPV58 L1蛋白在宿主細胞中有效表達的序列的表達盒。該盒優(yōu)選含有合成基因，相關的轉錄和翻譯控制序列與其可操作地連接，如啟動子和終止序列。在優(yōu)選實施方案中，啟動子是啤酒糖酵母GAL1啟動子，盡管本領域技術人員將認識到可以使用很多其它已知的酵母啟動子如GALl0、GAL7、ADH1、TDH3或PGK啟動子中的任何一種，或使用其它真核基因啟動子。優(yōu)選的轉錄終止子是啤酒糖酵母ADH1終止子，盡管也可以使用其它已知的轉錄終止子。特別優(yōu)選GAL1啟動子-ADH1終止子的組合。
本發(fā)明進一步提供了包含SEQ ID NO2所列的氨基酸序列的分離和純化的HPV 58 L1多肽。
本發(fā)明的另一方面是通過HPV58 L1或L1+L2基因在酵母細胞中重組表達產(chǎn)生的HPV58病毒樣顆粒(VLP)、產(chǎn)生HPV58 VLPs的方法和使用HPV58 VLPs的方法。當人和動物乳頭瘤病毒的主要衣殼蛋白L1在酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞或細菌中表達時，VLPs可以自動裝配(綜述參見Schiller和Roden，in Papillomavirus ReviewsCurrent Research on Papillomaviruses；Lacey，ed.Leeds，UKLeeds Medical Information，pp 101-12(1996))。形態(tài)學不清楚的HPV VLPs還可以通過L1和L2衣殼蛋白的組合表達而產(chǎn)生。VLPs由L1的72個五鄰體組成，為T＝7的二十面體結構(Baker等人，Biophys.J.60(6)1445-56(1991))。
VLPs形態(tài)學上類似于真的病毒體且在施用于動物后能夠誘導高效價的中和抗體。用VLPs免疫兔(Breitburd等人，J.Virol.69(6)3959-63(1995))和狗(Suzich等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(25)11553-57(1995))表明誘導中和抗體和保護免受實驗性乳頭瘤病毒感染。然而，因為VLPs不含有潛在的致癌病毒基因組并且當從單個基因表達時可以自動裝配，所以它們?yōu)榛畈《驹贖PV疫苗開發(fā)中的用途提供了安全的備選方案(綜述參見Schiller和Hidesheim，J.Clin.Virol.1967-74(2000))。
因此，本發(fā)明涉及包含HPV58的重組L1蛋白或重組LI+L2蛋白的病毒樣顆粒，其中重組蛋白在酵母細胞中表達。
如上所述，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，HPV58 VLPs在酵母中產(chǎn)生。在進一步優(yōu)選實施方案中，酵母選自啤酒糖酵母、多形漢遜氏酵母、巴斯德畢赤氏酵母、脆壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母和粟酒裂殖糖酵母。
本發(fā)明的另一方面是HPV58 VLP，它包含由密碼子最優(yōu)化的HPV58L1基因產(chǎn)生的HPV58 L1蛋白。在本發(fā)明這個方面的優(yōu)選實施方案中，該密碼子最優(yōu)化的HPV58 L1基因包含SEQ ID NO1所列的核苷酸序列。
本發(fā)明的又一個方面是產(chǎn)生HPV58 VLPs的方法，其包含(a)用編碼HPV58 L1蛋白或HPV58 L1+L2蛋白的重組DNA分子轉化酵母；(b)在允許表達重組DNA分子的條件下培養(yǎng)轉化的酵母，以產(chǎn)生重組HPV58蛋白；和(c)分離重組HPV58蛋白以產(chǎn)生HPV58 VLPs。
在本發(fā)明這個方面的優(yōu)選實施方案中，用密碼子最優(yōu)化的HPV58L1基因轉化酵母以產(chǎn)生HPV58 VLPs。在特別優(yōu)選實施方案中，該密碼子最優(yōu)化的HPV58 L1基因包含SEQ ID NO1所列的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了在動物中誘導免疫反應的方法，其包括給該動物施用HPV58病毒樣顆粒。在優(yōu)選實施方案中，HPV58 VLPs由密碼子最優(yōu)化的基因產(chǎn)生。
本發(fā)明的又一個方面是預防和/或治療HPV相關的子宮頸癌的方法，其包括給哺乳動物施用包含HPV58 VLPs的疫苗。在本發(fā)明這個方面的優(yōu)選實施方案中，HPV58 VLPs在酵母中產(chǎn)生。
本發(fā)明還涉及包含HPV58病毒樣顆粒(VLPs)的疫苗。
在本發(fā)明這個方面的可供選擇的實施方案中，疫苗進一步包含至少一個另外的HPV類型的VLPs。在優(yōu)選實施方案中，至少一個另外的HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV59和HPV68。
在本發(fā)明這個方面的優(yōu)選實施方案中，疫苗進一步包含HPV16VLPs。
在本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案中，疫苗進一步包含HPV16 VLPs和HPV18 VLPs。
在本發(fā)明又一個優(yōu)選實施方案中，疫苗進一步包含HPV16 VLPs、HPV11 VLPs、HPV16 VLPs和HPV18 VLPs。
本發(fā)明還涉及包含HPV 58病毒樣顆粒的藥物組合物。此外，本發(fā)明涉及包含HPV58 VLPs和至少一個另外的HPV類型的VLPs的藥物組合物。在優(yōu)選實施方案中，至少一個另外的HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV59和HPV68。
本發(fā)明的疫苗組合物可以以允許以最小的潛在毒性最佳抑制HPV58感染的適當劑量單獨使用。另外，可能期望其它試劑的共同施用或順序施用。
引入疫苗受體的病毒樣顆粒量將取決于表達的基因產(chǎn)物的免疫原性。通常，將大約10μg至100μg，和優(yōu)選大約20μg至60μg VLPs的免疫學或預防有效劑量直接施用于肌肉組織。也預期皮下注射、皮內(nèi)導入、通過皮膚印膜和其它施用模式如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或吸入遞送。也預期可以提供加強接種。腸胃外施用，如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或用佐劑如明礬或Merck鋁佐劑與本發(fā)明疫苗的腸胃外導入同時或在本發(fā)明疫苗腸胃外導入之后的其它施用方法，也是有益的。
為描述和公開可以關于本發(fā)明使用的方法和材料的目的，將在此提及的所有出版物都引入作為參考。在此什么也不被認為是承認本發(fā)明無權依靠在先發(fā)明而早于這種公開內(nèi)容。
已經(jīng)參照附圖描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，應當理解本發(fā)明不限于那些確切的實施方案，而且本領域技術人員在其中可以實行各種改變和修改，而不背離附加權利要求所限定的本發(fā)明的范圍或精神。
下列實施例闡明但不限制本發(fā)明。
實施例1代表性的HPV 58 L1序列的測定以前已經(jīng)描述了HPV 58 L1序列(Genbank登記號#NC_001443)。然而從臨床分離物獲得的DNAs之間找到較小的序列變化并不罕見。為測定代表性的HPV58 L1野生型序列，從以前表明含有HPV58 DNA的三個臨床樣品分離DNA。以聚合酶鏈反應(PCR)擴增HPV 58 L1序列，其中使用Taq DNA聚合酶和下列引物HPV 58 L1 F5′-ATGTCCGTGTGGCGGCCTAGT-3’(SEQ ID NO4)和58 3′11 BglII5’-GAGATCTGTGTAAGTACCACAACAATTA-3’(SEQ ID NO5)。將擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳并通過溴化乙錠染色顯現(xiàn)。切割～1500bp L1條帶并使用Geneclean Spin試劑盒(Q-Bio Gene，Carlsbad，CA)純化DNA。然后將DNA連接至TA克隆載體pCR2.1(Invitrogen)。用連接混合物轉化TOP10F′大腸桿菌并鋪平板在含氨芐青霉素加IPTG和X-gal的LB瓊脂上進行藍/白菌落選擇。倒置平板并在37℃培養(yǎng)16小時。白色菌落在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃振蕩培養(yǎng)16小時。實施小量制備以提取質(zhì)粒DNA。
為證明質(zhì)粒中L1基因的存在，實施限制性內(nèi)切核酸酶消化。通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色觀察限制片段。對含有來自三個臨床分離物每一個的克隆L1插入片段的質(zhì)粒進行DNA測序。為了產(chǎn)生進行隨后最優(yōu)化的參照序列，將來自每一克隆的核苷酸和翻譯的氨基酸序列與公開的HPV 58 L1序列相比。三個臨床分離物的序列分析揭示沒有序列與Genbank序列相同。pCR2.1HPV 58L1克隆#4被選為代表性的58 L1序列并且在此可互換地被稱為“58 L1野生型序列”或“58 wt序列”(SEQ ID NO3，參見圖1)。58 L1 wt序列含有五個點突變兩個導致氨基酸改變和三個沉默點突變。導致關于GenbankHPV 58 L1序列的氨基酸改變的點突變位于核苷酸第372位(A-＞T)，其導致第124位氨基酸由亮氨酸變?yōu)楸奖彼?，和核苷酸?97位(A-＞G)，其導致第299位氨基酸由異亮氨酸變?yōu)榧琢虬彼?。三個沉默點突變位于核苷酸第774位(A-＞G)、第792位(T-＞C)和第999位(G-＞A)。
使用Taq聚合酶及其下列引物，PCR擴增58 L1野生型序列，所述引物添加了BamHI突出端5′58 BamHI5’-GGGATCCCACAAAACAAAATGTCCGTGTGGC-3’(SEQ ID NO6)和3′Bam 585’-GGGATCCGTGTAAGTACCACAACAATTA-3’(SEQ ID NO7)。通過瓊脂糖凝膠電泳，隨后通過溴化乙錠染色使產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物顯現(xiàn)。切割～1500bp條帶并使用Geneclean試劑盒純化DNA。然后將PCR產(chǎn)物連接至pCR2.1并用連接混合物轉化TOP10F′細胞。選擇白色菌落并在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃振蕩培養(yǎng)16小時。實施小量制備以提取質(zhì)粒DNA。為了使HPV 58 L1基因從載體序列釋放，進行BamHI限制性內(nèi)切核酸酶消化。使消化的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙錠染色進行觀察。使用Geneclean試劑盒純化L1條帶并連接至去磷酸化的、BamHI消化的pGAL110。用連接混合物轉化DH5α大腸桿菌細胞。為了篩選正確方向的HPV 58 L1插入片段，PCR擴增來自菌落的質(zhì)粒DNA。進行DNA測序來證實插入片段的序列和方向。選擇單個克隆并命名為pGAL110-HPV 58L1 #10。制備所選克隆的Maxiprep DNA。通過用蝸牛酶進行原生質(zhì)球形成(spheroplasting)使啤酒糖酵母細胞成為感受態(tài)并用pGAL110-HPV 58L1 #1轉化。將酵母轉化混合物鋪平板在Leu(-)山梨糖醇瓊脂平板上Leu(-)山梨糖醇頂層瓊脂中并在30℃倒置培養(yǎng)3-5天。挑取菌落并在Leu(-)山梨糖醇瓊脂平板上劃線進行分離。分離的菌落隨后在旋轉管培養(yǎng)中含1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml 5X Leu(-)Ade(-)山梨糖醇中于30℃生長以誘導58 L1轉錄和蛋白表達。
實施例2酵母密碼子最優(yōu)化已經(jīng)描述了酵母優(yōu)選的密碼子(Sharp，Paul M和Cowe，Elizabeth.Synonymous Codon Usage in Saccharomycescerevisiae YEAST 7657-678(1991))。HPV 58 L1 wt蛋白的表達可檢測到，然而為獲得增加的表達，利用優(yōu)選酵母密碼子重建HPV 58L1基因。包含酵母最優(yōu)化密碼子序列的重建58 L1序列與58 L1 wt序列相比含有404個核苷酸改變。所得序列在此稱作“58 L1 R”(R＝重建，參見圖1)。58 L1 R翻譯的氨基酸序列沒有改變。HPV 58 L1 R的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸(SEQ ID NO2)序列在圖2中顯示。所述重建序列提供了增加的HPV 58 L1表達，這是用于疫苗開發(fā)的超過野生型的顯著進步(參見實施例4)。
用于產(chǎn)生最優(yōu)化基因的策略是設計跨越基因的長重疊有義和反義寡聚體，用酵母優(yōu)選密碼子序列置換核苷酸，而保持氨基酸序列。這些寡聚體在使用Pfu聚合酶的PCR反應中用來代替模板DNA。設計另外的擴增引物并用于從模板寡聚體擴增重建序列。
擴增的最佳條件是片段特異性的，然而，大多數(shù)使用類似95℃2分鐘(變性)，隨后為35個循環(huán)的95℃1分鐘(變性)、55℃1分鐘(退火)、72℃3.5分鐘(延伸)，之后為72℃10分鐘最終延伸和4℃保存的程序。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。切除適當大小的條帶并凝膠純化DNA。然后將擴增片段用作模板以裝配1497nt的重建HPV 58L1基因。
重建之后，凝膠純化1497nt條帶并連接至pCR-Blunt載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。連接后，用連接混合物轉化TOP10細胞。使菌落在含卡那霉素的LB中生長并用小量制備技術從菌落中提取質(zhì)粒DNA。對質(zhì)粒DNA進行測序以證實期望的58 L1重建改變。為向兩端添加BamHI突出端，用下列引物從pCR-Blunt-58 L1 R再擴增58 L1 R(重建)5′Bam 58重建5’-GGATCCCACAAAACAAAATGTCTGTCTGGAGACC-3’(SEQ ID NO8)和3′Bam 58重建5’-GGATCCTTACTTCTTGACCTTC-3’(SEQ ID NO9)。
使用Geneclean試劑盒凝膠純化擴增的L1產(chǎn)物并克隆入pCR2.1(Invitrogen)。用pCR2.1質(zhì)粒轉化Top10F′細胞。使白色菌落在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃振蕩培養(yǎng)16小時。實施小量制備以提取質(zhì)粒DNA。為了使HPV 58 L1基因從載體序列釋放，進行BamHI限制性內(nèi)切核酸酶消化。使消化的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙錠染色進行觀察。使用Geneclean試劑盒純化L1條帶并連接至去磷酸化的、BamHI消化的pGAL110。用連接混合物轉化DH5α大腸桿菌細胞。
通過PCR篩選產(chǎn)生的菌落中正確方向的HPV 58 L1插入片段。制備Maxiprep DNA。通過限制酶切消化譜和DNA測序證實序列和方向。將選擇的克隆命名為pGAL110-HPV 58L1R #17。通過原生質(zhì)球形成使啤酒糖酵母細胞成為感受態(tài)并用pGAL110-HPV 58L1R #1轉化。將酵母轉化混合物鋪平板在Leu(-)山梨糖醇瓊脂平板上Leu(-)山梨糖醇頂層瓊脂中并在30℃倒置培養(yǎng)3-5天。挑取菌落并在Leu(-)山梨糖醇瓊脂平板上劃線進行克隆分離。分離的菌落隨后在旋轉管培養(yǎng)中含1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml 5X Leu(-)Ade(-)山梨糖醇中于30℃生長以誘導L1轉錄和蛋白表達。48小時后，沉淀相當于OD600＝10量的培養(yǎng)體積的細胞，除去上清液和冷凍沉淀并保存在-70℃。
實施例3RNA制備在冰上解凍由半乳糖誘導而誘導表達HPV 58 L1或HPV 58 L1 R的轉化酵母細胞的細胞沉淀，懸浮在0.8ml Trizol試劑(LifeTechnologies，Gibco BRL)中并在室溫下溫育5分鐘。向小瓶中添加五分之一體積的氯仿。然后用力振蕩15秒以混合并在室溫下溫育3分鐘。以13k rpms離心5分鐘后，收集上層相并轉移到新的小瓶。添加0.4ml異丙醇并在室溫下溫育10分鐘。為沉淀RNA，以13k rpms離心10分鐘。傾析上清液，用75％EtOH洗滌RNA沉淀并重復離心。傾析上清液和允許RNA沉淀風干15分鐘，隨后是懸浮于無RNA酶的水中。實施分光光度測定法，以使用當A260/280是1.7-2.0時，A260讀數(shù)為1＝40μg/ml的RNA的假定來確定樣品中RNA濃度。
實施例4RNA印跡分析澆鑄1.1％瓊脂糖甲醛凝膠。將5和10微克RNA與變性緩沖液組合(終濃度6％甲醛、50％甲酰胺和0.1x MOPS)并加熱到65℃10分鐘。添加十分之一體積凝膠加樣緩沖液并將樣品加到凝膠上。以75伏特在1x MOPS緩沖液中電泳～3小時。凝膠在10x SSC中洗滌60分鐘。
通過在10x SSC中毛細管作用超過16小時，將RNA轉移到Hybond-N+尼龍膜(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。然后使用Stratagene UV Stratalinker自動交聯(lián)功能(Stratagene，LaJolla，CA)，通過交聯(lián)將RNA固定到尼龍膜上。固定后，使尼龍膜風干。
將Roche DIG High Prime DNA標記和檢測試劑盒I(Hoffmann-LaRoche Ltd.，Basel，瑞士)用于用DIG標記58 L1 wt和58 L1 R DNA序列，以用作探針混合物來檢測RNA印跡上的58 L1 wt和58 L1 R轉錄物。使用抗DIG堿性磷酸酶綴合的抗體按照制造商的推薦進行預雜交、雜交和免疫顯影。簡言之，印跡在37℃溫和振蕩中預雜交30分鐘。通過加熱至95℃5分鐘使探針混合物變性并在冰上猝滅。向雜交液中添加探針混合物并應用于膜上，在44.6℃溫和振蕩中進行4小時。然后除去雜交液并在含0.1％SDS的2x SSC中室溫下洗滌2次5分鐘，隨后在65℃用0.5x SSC和0.1％SDS另外洗滌。然后封閉印跡30分鐘并以1∶5000稀度應用抗DIG堿性磷酸酶綴合的抗體30分鐘。洗滌印跡并通過堿性磷酸酶綴合的抗DIG結合抗體的NBT/BCIP底物檢測確定探針結合的RNA的存在。
表達58 L1 wt的酵母的初步分析提示有功能性的HPV 58 L1全長轉錄和翻譯；然而如果用酵母優(yōu)選密碼子序列重建該序列，則表達水平可能增加。重建58 L1序列被工程改造以刪除任何可能的轉錄提前終止位點以確保穩(wěn)固的轉錄。58 L1 R轉錄物的RNA印跡分析揭示與對58 L1 wt所見到的結果相比全長轉錄物的量增加(圖3)。
實施例5HPV 58 L1蛋白表達在冰上解凍相當于OD600＝10量的細胞的半乳糖誘導培養(yǎng)物的冷凍酵母細胞沉淀，并懸浮于含2mM PMSF的300μl PC緩沖液中(100mMNa2HPO4和0.5M NaCl，pH 7.0)。以～0.5g/管的濃度添加酸洗滌的0.5mm玻璃珠。使管在4℃渦旋5分鐘的3個循環(huán)，其中有1分鐘的中斷。添加7.5μl 20％TritonX100并在4℃重復渦旋步驟5分鐘。將管置于冰上15分鐘，隨后在4℃離心10分鐘。將上清液轉移到無菌微量離心管(microfuge tube)中，標記為總酵母蛋白提取物、標注日期并保存在-70℃。
實施例6蛋白印跡分析通過蛋白印跡分析每個58 L1構建體的二十個分離的酵母菌落的總酵母蛋白提取物，以證實半乳糖誘導后58 L1蛋白的表達。
將代表性的58 L1 wt和58 L1 R分離物的10、5和2.5微克總酵母蛋白提取物與SDS-PAGE加樣緩沖液組合并加熱到95℃10分鐘。包括大約55kD的16 L1蛋白作為陽性對照，連同無HPV L1的總酵母蛋白提取物作為陰性對照(數(shù)據(jù)未顯示)。
將蛋白加樣到10％SDS-PAGE凝膠上并在Tris-甘氨酸緩沖液中電泳。蛋白分離后，將蛋白從凝膠蛋白印跡轉移至硝化纖維素上，并在1x稀釋緩沖液(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)中室溫搖動封閉印跡1小時。將印跡洗滌三次并在室溫下與酵母吸收的山羊抗trpE-HPV 31 L1血清溫育16小時，該血清與HPV 16和HPV 58 L1蛋白交叉反應。然后洗滌印跡三次，并與1∶2500稀度的抗山羊-HRP綴合的抗體溫育1小時。將印跡再次洗滌三次，并應用NBT/BCIP檢測底物(Kirkegaard and PerryLaboratories)。免疫活性蛋白檢測為印跡上的紫色條帶。
在所有情況下，58 L1蛋白檢測為硝化纖維素上相當于大約55kD的清楚免疫活性條帶(圖4)。58 L1 R條帶的強度好象大于對58 L1 wt所見到的，提示通過酵母密碼子最優(yōu)化實現(xiàn)了58 L1表達提高。
實施例7ELISA測定為證明58 L1 VLP表達，通過ELISA分析一部分58 L1 wt和58L1 R總酵母蛋白提取物。用各種方法使表達HPV 58 L1和HPV 58 L1R的酵母細胞生長，包括旋轉管培養(yǎng)、搖瓶和發(fā)酵罐。裂解酵母細胞并制備蛋白提取物以確定每微克總蛋白產(chǎn)生的HPV 58 L1病毒樣顆粒(VLPs)的量。夾心ELISA被設計用于證明HPV 58 L1 VLP表達。
將G蛋白純化的H582C3.F7(F7)單克隆抗體(mAb)用來結合酵母蛋白提取物中的完整58 L1 VLPs。F7特異性識別HPV 58 L1 VLP構象表位。未結合的蛋白被洗掉，并將另一個HPV 58 L1 VLP構象特異性mAb H586E11.F4(F4)用作檢測抗體。真正的構象正確的58 L1 VLPs發(fā)生結合，且通過使用抗小鼠IgG2b HRP綴合的抗體和TMB底物來促進檢測。
具體而言，將F7用來于4℃包被Immulon 4 HBX 96孔平板的底部過夜。用PBS和0.05％ Tween 20洗滌平板三次，隨后用封閉液(PBS+0.05％Tween 20+1％BSA)封閉。將平板洗滌三次并將抗原(在封閉液中稀釋至12.5μg/ml的總酵母細胞裂解物)一式兩份用于A行。純化的HPV 58 L1 VLPs的參照標準物以12.5μg/ml總酵母蛋白中為206ng/ml應用于A行3和4列。然后將參照和試驗樣品沿著每列連續(xù)稀釋兩倍。室溫下三小時后，通過吸出除去過量抗原并洗滌平板3次。在封閉液中稀釋F4構象特異性mAb并將其應用于每個孔，室溫下進行一小時。洗滌平板三次并在封閉液中稀釋抗小鼠IgG2b HRP-綴合的抗體，并在室溫下應用1小時。洗滌平板并將TMB(PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL)應用5分鐘以檢測HRP綴合的抗體復合物。通過添加2M H2SO4終止檢測反應。在450nm波長讀平板并通過與參照標準物相比以ng VLP/μg總蛋白測定HPV 58 L1 VLP的濃度。
圖5顯示了來自兩個分開實驗的，從表達HPV 58 L1 wt和HPV 58L1 R的酵母中檢測到的VLPs的量/μg總蛋白的比較。酵母密碼子最優(yōu)化使HPV 58 L1 VLP表達水平增加了～2-3倍。
實施例8透射電子顯微鏡術為證明58 L1蛋白確實自動裝配形成五鄰體L1殼粒，后者接著自動裝配入病毒樣顆粒，使部分純化的58 L1 R蛋白提取物進行透射電子顯微鏡術(EM)。
使酵母在小規(guī)模發(fā)酵下生長并沉淀。使產(chǎn)生的沉淀進行純化處理。通過免疫印跡分析沉淀和澄清酵母提取物以證明L1蛋白表達和通過純化步驟的保留。然后使澄清酵母提取物在45％蔗糖墊層上進行離心，并將產(chǎn)生的沉淀懸浮于緩沖液中以通過透射EM進行分析。
產(chǎn)生的代表性58 L1 R VLPs圖像在圖6中顯示。這種粗樣品中的球狀顆粒的直徑范圍從30至60nm，一些顆粒顯示規(guī)則排列的殼粒。
序列表序列表<110>Merck & Co.，Inc.
<120>HPV 58 L1在酵母中的最優(yōu)化表達<130>21561PCT<150>60/519,211<151>2003-11-12<160>10<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1497<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV58 L1-R<400>1atgtccgtct ggagaccatc cgaagctacc gtctacttgc caccagttcc agtctccaag 60gtcgtctcca ctgacgaata cgtctctaga acctctatct actactacgc tggttcctct 120agattgttgg ctgttggtaa cccatacttc tccatcaagt ctccaaacaa caacaagaag 180gtcttggttc caaaggtctc tggtttgcaa tacagagtct tcagagtcag attgccagac 240ccaaacaagt tcggtttccc agacacttcc ttctacaacc cagacactca aagattggtc 300tgggcttgtg tcggtttgga aatcggtaga ggtcaaccat tgggtgttgg tgtctctggt 360cacccatact tcaacaagtt cgacgacacc gaaacctcca acagataccc agctcaacca 420ggttctgaca acagagaatg tttgtccatg gactacaagc aaacccaatt gtgtttgatc 480ggttgtaagc caccaactgg tgaacactgg ggtaagggtg ttgcttgtaa caacaacgct 540gctgctaccg actgtccacc attggaattg ttcaactcca tcatcgaaga cggtgacatg 600gtcgacactg gtttcggttg tatggacttc ggtaccttgc aagctaacaa gtccgacgtt 660ccaatcgaca tctgtaactc cacctgtaag tacccagact acttgaagat ggcttctgaa 720ccatacggtg actccttgtt cttcttcttg agaagagaac aaatgttcgt cagacacttc 780ttcaacagag ctggtaagtt gggtgaagct gttccagacg acttgtacat caagggttct 840ggtaacaccg ctgtcatcca atcctctgct ttcttcccaa ctccatctgg ttccatggtc 900acctctgaat ctcaattgtt caacaagcca tactggttgc aaagagctca aggtcacaac 960aacggtatct gttggggtaa ccaattgttc gtcactgtcg tcgacaccac tagatccact 1020aacatgacct tgtgtaccga agtcaccaag gaaggtacct acaagaacga caacttcaag 1080gaatacgtca gacacgtcga ggaatacgac ttgcaattcg tcttccaatt gtgtaagatc 1140
accttgactg ctgaaatcat gacctacatc cacaccatgg actctaacat cttggaagac 1200tggcaattcg gtttgactcc accaccatct gcttccttgc aagacaccta cagattcgtc 1260acctctcaag ctatcacctg tcaaaagact gctccaccaa aggaaaagga agacccattg 1320aacaagtaca ccttctggga agtcaacttg aaggaaaagt tctctgctga cttggaccaa 1380ttcccattgg gtagaaagtt cttgttgcaa tctggtttga aggctaagcc aagattgaag 1440agatctgctc caaccactag agctccatcc accaagagaa agaaggtcaa gaagtaa1497<210>2<211>498<212>PRT<213>人乳頭瘤病毒類型58<400>2Met Ser Val Trp Arg Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val1 5 10 15Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ser Arg Thr Ser20 25 30Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly Asn Pro35 40 45Tyr Phe Ser Ile Lys Ser Pro Asn Asn Asn Lys Lys Val Leu Val Pro50 55 60Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Arg Leu Pro Asp65 70 75 80Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr85 90 95Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Leu Glu Ile Gly Arg Gly Gln100 105 110Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly His Pro Tyr Phe Asn Lys Phe Asp115 120 125Asp Thr Glu Thr Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Gln Pro Gly Ser Asp Asn130 135 140Arg Glu Cys Leu Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile145 150 155 160Gly Cys Lys Pro Pro Thr Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Val Ala Cys165 170 175Asn Asn Asn Ala Ala Ala Thr Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Phe Asn180 185 190Ser Ile Ile Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Cys Met195 200 205Asp Phe Gly Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile210 215 220Cys Asn Ser Thr Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ala Ser Glu225 230 235 240Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe
245 250 255Val Arg His Phe Phe Asn Arg Ala Gly Lys Leu Gly Glu Ala Val Pro260 265 270Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Asn Thr Ala Val Ile Gln Ser275 280 285Ser Ala Phe Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Glu Ser290 295 300Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn305 310 315 320Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr325 330 335Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu Cys Thr Glu Val Thr Lys Glu Gly340 345 350Thr Tyr Lys Asn Asp Asn Phe Lys Glu Tyr Val Arg His Val Glu Glu355 360 365Tyr Asp Leu Gln Phe Val Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala370 375 380Glu Ile Met Thr Tyr Ile His Thr Met Asp Ser Asn Ile Leu Glu Asp385 390 395 400Trp Gln Phe Gly Leu Thr Pro Pro Pro Ser Ala Ser Leu Gln Asp Thr405 410 415Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Thr Ala Pro420 425 430Pro Lys Glu Lys Glu Asp Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val435 440 445Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly450 455 460Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly Leu Lys Ala Lys Pro Arg Leu Lys465 470 475 480Arg Ser Ala Pro Thr Thr Arg Ala Pro Ser Thr Lys Arg Lys Lys Val485 490 495Lys Lys<210>3<211>1497<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒類型58<400>3atgtccgtgt ggcggcctag tgaggccact gtgtacctgc ctcctgtgcc tgtgtctaag 60gttgtaagca ctgatgaata tgtgtcacgc acaagcattt attattatgc tggcagttcc 120agacttttgg ctgttggcaa tccatatttt tccatcaaaa gtcccaataa caataaaaaa 180
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<223>PCR引物<400>4atgtccgtgt ggcggcctag t 21<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5gagatctgtg taagtaccac aacaatta28
<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6gggatcccac aaaacaaaat gtccgtgtgg c 31<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>7gggatccgtg taagtaccac aacaatta 28<210>8<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>8ggatcccaca aaacaaaatg tctgtctgga gacc 34<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>9ggatcccaca aaacaaaatg tctgtctgga gacc 34
<210>10<211>1497<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HPV 58 L1反義<400>10tacaggcaga cctctggtag gcttcgatgg cagatgaacg gtggtcaagg tcagaggttc 60cagcagaggt gactgcttat gcagagatct tggagataga tgatgatgcg accaaggaga 120tctaacaacc gacaaccatt gggtatgaag aggtagttca gaggtttgtt gttgttcttc 180cagaaccaag gtttccagag accaaacgtt atgtctcaga agtctcagtc taacggtctg 240ggtttgttca agccaaaggg tctgtgaagg aagatgttgg gtctgtgagt ttctaaccag 300acccgaacac agccaaacct ttagccatct ccagttggta acccacaacc acagagacca 360gtgggtatga agttgttcaa gctgctgtgg ctttggaggt tgtctatggg tcgagttggt 420ccaagactgt tgtctcttac aaacaggtac ctgatgttcg tttgggttaa cacaaactag 480ccaacattcg gtggttgacc acttgtgacc ccattcccac aacgaacatt gttgttgcga 540cgacgatggc tgacaggtgg taaccttaac aagttgaggt agtagcttct gccactgtac 600cagctgtgac caaagccaac atacctgaag ccatggaacg ttcgattgtt caggctgcaa 660ggttagctgt agacattgag gtggacattc atgggtctga tgaacttcta ccgaagactt 720ggtatgccac tgaggaacaa gaagaagaac tcttctcttg tttacaagca gtctgtgaag 780aagttgtctc gaccattcaa cccacttcga caaggtctgc tgaacatgta gttcccaaga 840ccattgtggc gacagtaggt taggagacga aagaagggtt gaggtagacc aaggtaccag 900tggagactta gagttaacaa gttgttcggt atgaccaacg tttctcgagt tccagtgttg 960ttgccataga caaccccatt ggttaacaag cagtgacagc agctgtggtg atctaggtga 1020ttgtactgga acacatggct tcagtggttc cttccatgga tgttcttgct gttgaagttc 1080cttatgcagt ctgtgcagct ccttatgctg aacgttaagc agaaggttaa cacattctag 1140tggaactgac gactttagta ctggatgtag gtgtggtacc tgagattgta gaaccttctg 1200accgttaagc caaactgagg tggtggtaga cgaaggaacg ttctgtggat gtctaagcag 1260tggagagttc gatagtggac agttttctga cgaggtggtt tccttttcct tctgggtaac 1320ttgttcatgt ggaagaccct tcagttgaac ttccttttca agagacgact gaacctggtt 1380aagggtaacc catctttcaa gaacaacgtt agaccaaact tccgattcgg ttctaacttc 1440tctagacgag gttggtgatc tcgaggtagg tggttctctt tcttccagtt cttcatt149權利要求
1.一種核酸分子，其包含編碼SEQ ID NO2所列的HPV58 L1蛋白的核苷酸序列，為在酵母細胞中高水平表達，該核酸序列被密碼子最優(yōu)化。
2.包含權利要求1的核酸分子的載體。
3.包含權利要求2的載體的宿主細胞。
4.權利要求3的宿主細胞，其中該宿主細胞是酵母細胞。
5.權利要求4的宿主細胞，其中該酵母細胞選自啤酒糖酵母、多形漢遜氏酵母、巴斯德畢赤氏酵母、脆壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母和粟酒裂殖糖酵母。
6.權利要求5的宿主細胞，其中該宿主細胞是啤酒糖酵母。
7.權利要求1的核酸分子，其中該核苷酸的序列包含SEQ IDNO1所列的核苷酸序列。
8.包含權利要求7的核酸分子的載體。
9.包含權利要求8的載體的宿主細胞。
10.包含HPV58的重組L1蛋白或重組L1+L2蛋白的病毒樣顆粒(VLPs)，其中該重組L1蛋白或重組L1+L2蛋白在酵母中產(chǎn)生。
11.權利要求10的VLPs，其中該重組L1蛋白或重組L1+L2蛋白由密碼子最優(yōu)化的HPV58 L1核酸分子編碼。
12.權利要求11的VLPs，其中該密碼子最優(yōu)化的核酸分子包含SEQ ID NO1所列的核苷酸序列。
13.一種產(chǎn)生權利要求11的VLPs的方法，其包括(a)用編碼HPV58 L1蛋白或HPV58 L1+L2蛋白的密碼子最優(yōu)化的DNA分子轉化酵母；(b)在允許表達密碼子最優(yōu)化的DNA分子的條件下培養(yǎng)轉化的酵母，以產(chǎn)生重組乳頭瘤病毒蛋白；和(c)分離重組乳頭瘤病毒蛋白以產(chǎn)生權利要求11的VLPs。
14.包含權利要求11的VLPs的疫苗。
15.包含權利要求11的VLPs的藥物組合物。
16.一種預防HPV感染的方法，其包括給哺乳動物施用權利要求14的疫苗。
17.一種在動物中誘導免疫反應的方法，其包括給該動物施用權利要求11的VLPs。
18.權利要求11的病毒樣顆粒，其中酵母選自啤酒糖酵母、多形漢遜氏酵母、巴斯德畢赤氏酵母、脆壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母和粟酒裂殖糖酵母。
19.權利要求18的病毒樣顆粒，其中該酵母是啤酒糖酵母。
20.權利要求14的疫苗，進一步包括至少一個另外的HPV類型的VLPs。
21.權利要求20的疫苗，其中該至少一個另外的HPV類型選自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV59和HPV68。
22.權利要求21的疫苗，其中該至少一個HPV類型包括HPV 16。
23.權利要求22的疫苗，進一步包含HPV18 VLPs。
24.權利要求23的疫苗，進一步包含HPV6 VLPs和HPV11 VLPs。
25.權利要求24的疫苗，進一步包含HPV31 VLPs。
26.權利要求23的疫苗，進一步包含HPV31 VLPs。
27.權利要求25的疫苗，進一步包含HPV45 VLPs。
28.權利要求26的疫苗，進一步包含HPV45 VLPs。
29.一種分離和純化的HPV 58 L1多肽，其包含SEQ ID NO2所列的氨基酸序列。
全文摘要
提供了編碼HPV58 L1蛋白的合成DNA分子。具體而言，本發(fā)明提供了編碼HPV58 L1蛋白的多核苷酸，其中為在酵母細胞中高水平表達，所述多核苷酸被密碼子最優(yōu)化。合成分子可以用于產(chǎn)生HPV58病毒樣顆粒(VLPs)，和產(chǎn)生包含HPV58 VLPs的疫苗和藥物組合物。本發(fā)明的疫苗通過中和抗體和細胞介導免疫，提供了抵抗乳頭瘤病毒感染的有效免疫預防，并且也可用于存在的HPV感染的治療。
文檔編號C12N15/81GK1942583SQ200480033235
公開日2007年4月4日 申請日期2004年11月10日 優(yōu)先權日2003年11月12日
發(fā)明者J·T·布賴恩, M·K·布朗洛夫, L·D·舒爾茨, 王心民, K·U·揚森 申請人:默克公司