專利名稱：樣品制備方法和裝置的制作方法
相關(guān)申請本申請要求2003年8月12日提交的美國專利申請No.60/494702的優(yōu)先權(quán)，其公開的內(nèi)容在此以其全文引為參考。
政府支持本發(fā)明全部或部分得到了研究和工程防衛(wèi)董事會(DefenseDirevtorate of Research and Engineering)的支持Lincoln合同號F19628-95-C-0002。政府對本發(fā)明有確定無疑的權(quán)利。
背景技術(shù)：
生物學(xué)、化學(xué)和環(huán)境研究經(jīng)常需要從非均一群體的材料中分離出特定的靶。通常情況下，特定靶的分離及其進一步分析受到以下因素的阻礙，包括(a)材料的非均一起始混合物中靶的濃度非常低，(b)存在降解靶的試劑，(c)存在干擾靶的分離的試劑，以及(d)存在干擾分離后的靶的分析的試劑。最有利的方法和成分可以便利從含有非靶材料的非均一混合物的廣范圍的液體或固體樣品中分離出低濃度的靶。這樣的方法和成分還可以被改性或與現(xiàn)有的方法結(jié)合使用以幫助維持靶的完整性(例如防止其降解或污染)，和/或抑制將干擾靶的進一步分析的試劑(例如干擾DNA樣品的PCR分析的試劑，干擾蛋白樣品的質(zhì)譜分析的試劑，或干擾細菌或病毒的細胞學(xué)分析的試劑)的活性。
在細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、化學(xué)、毒理學(xué)和藥理學(xué)等領(lǐng)域的進展已經(jīng)涌現(xiàn)了各種各樣的分析生物材料、化學(xué)材料和環(huán)境材料的技術(shù)的進展，這些材料包括但不限于DNA、RNA、蛋白、細菌細胞和孢子(包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌)、病毒(包括DNA病毒和RNA病毒)、小的有機分子和大的化學(xué)化合物。但是，許多有力的分析工具的有效應(yīng)用經(jīng)常因為不能將所需的靶材料與樣品中包含的非均一群體的材料分離而受到阻礙。本發(fā)明提供了促進從環(huán)境、生物和化學(xué)樣品中分離和/或鑒定靶的方法、成分和裝置。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了可以用于從非均一試劑混合物中分離和/或鑒定靶的方法、成分和裝置。靶的分離便于靶的進一步分析和鑒定，這些靶可以是DNA、RNA、蛋白、細菌細胞或孢子、病毒、小的有機分子或大的化學(xué)化合物。本發(fā)明在法醫(yī)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境、工業(yè)、公共衛(wèi)生和反生物恐怖主義領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，適合用于從廣泛范圍的氣體、液體和固體樣品中分離靶。
第一方面，本發(fā)明提供了改進的從非均一樣品中分離靶的方法。在一個實施方案中，該方法包括將含有所需的靶的樣品與能夠以更高親和性與靶結(jié)合的基材相接觸，該基材與靶的親和性高于基材與非靶材料的親和性。在另一個實施方案中，基材的表面用改性劑包被，以便進一步增加基材對一種或多種特定靶的親和性。在另一個實施方案中，基材用一種或多種本文公開的含胺改性劑包被。使用包被有一種或多種簡單改性劑的磁性或非磁性基材，對于依賴于使用與特定靶具有免疫反應(yīng)性的抗體包被的珠子來分離或檢測靶的分離技術(shù)來說，是一種巨大的改進。本文公開的簡單改性劑與抗體包被珠子相比不僅更便宜和更容易生產(chǎn)，而且具有更普遍的應(yīng)用性，并且不需要鑒定和生產(chǎn)與每種可能的所需靶具有免疫反應(yīng)性的抗體。這種對可能的靶的更多信息的需要對于目前可用的技術(shù)的通用性和性價比來說是極大的限制。
靶可以是DNA、RNA、蛋白、細菌細胞或孢子、病毒、小的有機分子或化學(xué)化合物。此外，靶DNA、RNA或蛋白可以來自于人類或非人類的動物、植物、細菌、病毒、真菌或原生動物。本發(fā)明預(yù)料單獨使用本方法，或與以前公開的SNAP方法結(jié)合使用，用于抑制核酸降解或核酸樣品污染的條件下用抑制靶核酸進一步分析的試劑來分離和分析核酸。
在使用這兩種方法中任一種分離靶之后，可以使用細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、化學(xué)或毒理學(xué)的常規(guī)技術(shù)對靶進行進一步分析。所用的具體技術(shù)可以基于靶進行選擇，本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員可以容易地選擇出適合的技術(shù)。在一個實施方案中，靶是從特定的生物或環(huán)境樣品中獲得的DNA，DNA的進一步分析可以包括DNA的PCR分析。DNA可以是人類、動物、細菌、植物、真菌、原生動物或病毒來源的，這依賴于技術(shù)的具體應(yīng)用。在另一個實施方案中，靶是從特定的生物樣品或環(huán)境樣品中獲得的RNA，RNA的進一步分析可以包括RNA的RT-PCR分析或RNA的原位雜交分析。RNA可以是人類、動物、細菌、植物、真菌、原生動物或病毒來源的。在另一個實施方案中，靶是從特定的生物樣品或環(huán)境樣品中獲得的細菌細胞或孢子。進一步分析可以包括細菌細胞或孢子本身的分析。分析細胞或孢子的示例性的方法包括但不限于顯微術(shù)、培養(yǎng)、細胞學(xué)測試和細菌細胞表面標記物分析。此外，靶細菌細胞或孢子的分析可以包括從靶細胞或孢子中制備的DNA或RNA的分析，以及細胞或孢子本身的分析和從靶細胞或孢子中制備的DNA或RNA的分析。在另一個實施方案中，靶是從特定的生物樣品或環(huán)境樣品中獲得的蛋白。蛋白可以是人類、動物、細菌、植物、真菌、原生動物或病毒來源的，這依賴于技術(shù)的具體應(yīng)用。蛋白的進一步分析可以包括肽序列測定、質(zhì)譜分析和一維或二維凝膠電泳。
在第二方面，本發(fā)明提供了能夠與基材的表面偶聯(lián)的特定表面改性劑。用一種或多種表面改性劑改性的基材與未改性的基材和用其它表面改性劑改性的基材相比對特定的靶具有更高的親和性。本發(fā)明預(yù)料廣范圍的基材的改性，包括但不限于板、芯片、蓋玻片、培養(yǎng)瓶、管、珠子、探針、光學(xué)纖維、濾器、柱體(cartridge)、條帶等。此外，本發(fā)明預(yù)料這樣的基材可以由廣泛材料中的任何一種制成，包括但不限于塑料、玻璃、金屬和二氧化硅，此外材料還可以具有磁性或順磁性的特性。正如從示例基材的列表中可以分析出的那樣，適合的基材實際上可以是任何大小或形狀的，本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員可以根據(jù)具體的靶以及必須從中分析靶的具體的材料來容易地選擇適合的基材。
在一個實施方案中，基材用一種表面改性劑改性。在另一個實施方案中，基材用兩種或兩種以上表面改性劑改性。在另一個實施方案中，表面改性劑與基材通過一個可剪切的接頭相連接，使得改性劑可以從基材上釋放出來。當使用多種表面改性劑時，每種試劑可以對同樣的靶具有增加的親和性，試劑也可以對不同的靶具有增加的親和性，以便改性的基材能夠分離一種以上的靶。此外，當使用多種表面改性劑時，每種試劑可以對特定的靶具有相同的親和性，試劑也可以對特定的靶具有不同的親和性。
在第三方面，本發(fā)明提供了能夠用于從生物樣品、化學(xué)樣品或環(huán)境樣品中分離靶的裝置。本發(fā)明包括了兩類裝置。第一類包括能夠便利基材和樣品之間的相互作用的裝置。這種裝置對于大規(guī)模執(zhí)行本發(fā)明的方法是特別重要的。例如，當從土壤、水、空氣或體液的少量樣品中分離靶時，有效地將改性的基材投送到含有靶的樣品是容易的。在這種情況下，確保整個樣品與基材相接觸是容易的，因此基材有機會與整個樣品中的靶相互作用。但是，當涉及較大的樣品時，確保基材與可能均勻或不均勻地分布在整個大樣品中的靶相接觸不是那么容易的過程。對于這種情況，本發(fā)明提供了便于將基材與整個含有靶的大量樣品均勻混合的裝置。表明這種裝置的應(yīng)用的一個例子是在工業(yè)食品加工廠中。含有食品、飲料和用于生產(chǎn)各種不同食品或飲料的成分的大容器可能在加工和儲存過程中污染細菌、病毒或化學(xué)材料。但是，有效地檢測這樣的潛在有害污染物受到樣品的大體積的妨礙。這種第一類裝置的一個應(yīng)用是在食品加工工業(yè)中，其中裝置可以用于日常有效地評估大體積食品或成分的質(zhì)量。
第二類裝置提供了另外的包被基材，例如濾器和柱體，可以用于方便地處理含有靶的樣品。這些裝置具有廣泛的生物學(xué)、環(huán)境和工業(yè)應(yīng)用，可以用于有效地分析固體、液體或氣體樣品。值得特別注意的是，基于親和規(guī)程分析樣品的濾器和柱體可以單獨使用，也可以與其它可用的濾器和柱體結(jié)合使用。濾器和柱體可以用于各種情況下。
值得特別注意的是，本發(fā)明的方法、成分和裝置可用于傳統(tǒng)的實驗室或醫(yī)院，或者用于其它實驗室設(shè)備和裝備的使用可能受到限制的領(lǐng)域。此外，使用本發(fā)明的成分和裝置，分離方法執(zhí)行的時間可以短于其它傳統(tǒng)的分離方法。進行快速樣品分析的能力在任何數(shù)量的實驗室和野外應(yīng)用中都是關(guān)鍵的。例如，減少樣品的分析時間可以使醫(yī)生和醫(yī)院立刻給病人提供診斷測試的結(jié)果。這縮短了開始治療之前的時間，并降低了病人走掉或不服從的危險。另一個例子，快速的分析便利了犯罪現(xiàn)場調(diào)查。對于進一步分析來說，環(huán)境污染的快速分析便于在污染和具體的工業(yè)或自然事件之間建立聯(lián)系。
在上述的任何一種情況下，本發(fā)明的分離方法(無論使用濾器、柱體或其它基材執(zhí)行)可以在少于30分鐘內(nèi)完成。在另一個實施方案中，分離方法可以在少于等于25、20、15、14、13、12、11、10、9或8分鐘內(nèi)完成。在另一個實施方案中，分離方法可以在少于或等于7、6、5或4分鐘之內(nèi)完成。使用本發(fā)明的方法分離的靶也可以或選使用其它快速分析技術(shù)進一步分析。
在上述的任何一種情況下，執(zhí)行本發(fā)明的分離方法(如果使用濾器、柱體或其它基材執(zhí)行)所需的時間包括了靶與基材結(jié)合所需的時間(例如捕獲時間)，也可以包括從基材上釋放靶所需的時間(例如洗脫時間)。在一個實施方案中，捕獲時間可以少于或等于30、25、20、15、14、13、12、11、10、9或8分鐘。在另一個實施方案中，捕獲時間可以少于或等于7、6、5、4、3、2或1分鐘。在另一個實施方案中，捕獲時間可以是5-10分鐘、1-5分鐘、1分鐘或少于1分鐘。由本發(fā)明的方法捕獲的靶也可以從基材上洗脫下來。洗脫的靶也可以使用其它的快速分析技術(shù)來進一步分析。
在另一個實施方案中，洗脫時間可以少于或等于30、25、20、15、14、13、12、11、10、9或8分鐘。在另一個實施方案中，洗脫時間可以少于或等于7、6、5、4、3、2或1分鐘。在另一個實施方案中，洗脫時間可以是5-10分鐘、1-5分鐘、1分鐘或少于1分鐘。用本發(fā)明的方法洗脫的靶也可以或選使用其它的快速分析技術(shù)來進一步分析。
在上述的任何一種情況下，本發(fā)明的分離方法可能需要使用有效量的基材。盡管使用較大濃度的基材在某些應(yīng)用中可能具有優(yōu)勢，使用最小濃度的基材可以幫助降低方法的花費，并幫助增加它在野外的易用性(例如減少需要使用的消耗性試劑的量)。在一個實施方案中，基材的量大于10mg/mL樣品。在一個實施方案中，基材的量少于或等于10mg/mL樣品。在另一個實施方案中，基材的量少于或等于7、6或5mg/mL樣品。在另一個實施方案中，基材的量少于或等于4、3、2或1mg/mL樣品。在另一個實施方案中，基材的量是5-10mg/mL樣品或1-5mg/mL樣品。
本發(fā)明的實踐除特別指明之外，將使用細胞生物學(xué)、細胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都在本技術(shù)領(lǐng)域范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻中有描述。參見例如《分子克隆實驗指南》(第二版)(Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis主編，冷泉港出版社，1989)；《DNA克隆》(第一卷和第二卷)(D.N.Glover主編，1985)；《寡聚核苷酸合成》(M.J.Gait主編，1984)；Mullis等的美國專利No.4683195；《核酸雜交》(B.D.Hames & S.J.Higgins主編，1984)；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(B.D.Hames & S.J.Higgins主編，1984)；《動物細胞的培養(yǎng)》(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；《固定化細胞和酶》(IRL出版社，1986)；B.Perbal，《分子克隆實驗指導(dǎo)》(1984)；《酶學(xué)方法》專題論文(Academic Press，Inc.，N.Y.)；《哺乳動物細胞的基因轉(zhuǎn)移載體》(J.H.Miller和M.P.Calos主編，1987，冷泉港實驗室)；《酶學(xué)方法》154和155卷(Wu等主編)，《細胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》(Mayer和Walker主編，Academic Press，London，1987)；《實驗免疫學(xué)手冊》(I-IV卷)(D.M.Weir和C.C.Blackwell主編，1986)；《小鼠胚胎操作》(冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1986)。
從下面的詳細描述和權(quán)利要求中，本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點將變得顯而易見。
附圖詳述

圖1提供了親和規(guī)程的圖示。
圖2顯示了含有表面改性劑的代表性硅片(左圖)以及用含有表面改性劑的硅片改性的基材(右圖)。
圖3顯示了代表性的含硅表面改性劑(左圖)以及用含硅表面改性劑改性的基材(右圖)。與圖2中顯示的表面改性劑相反，該模型提供了含有多個彼此相同或不同的活性區(qū)域的表面改性劑。
圖4顯示了流式細胞分析，可以用于方便地評估和定量基材和靶之間的相互作用。
圖5顯示了熒光分析，可以用于方便地評估和定量基材和靶之間的相互作用。
圖6圖示了軸頸軸承流動的原理。右邊的圖顯示了用于混合顆粒淤泥的軸頸軸承流動的模擬結(jié)果。
圖7顯示了大規(guī)模親和規(guī)程的示意圖。大規(guī)模方法包括了使用無序混合裝置以便于標準親和規(guī)程中的基材和靶之間的相互作用。在該圖示中，基材(磁珠)、樣品土壤和水被混合產(chǎn)生了淤泥。含有靶和基材的淤泥被放置在無序混合裝置上以低速混合，以便于靶和基材之間的相互作用。在混合后，內(nèi)部的圓柱被電磁鐵取代，用于移除靶-基材復(fù)合物。因為基材是磁珠，靶-基材復(fù)合物可以容易地與電磁鐵相吸引。在從淤泥中移除靶-基材復(fù)合物后，將靶細胞從珠子上分離，然后裂解并使用SNAP處理檢查靶細胞中包含的DNA。
圖8概述了可商購的磁珠的分析結(jié)果。數(shù)據(jù)被規(guī)格化為SNAP單獨分析的樣品的信號，以便圖中出現(xiàn)的示意圖表明與SNAP單獨分析相比哪個珠子增強了的信號。
圖9概述了可商購的非磁珠的分析結(jié)果。這些珠子的效力通過在將珠子和樣品保溫后測量吸附在珠子上的DNA的百分數(shù)來評估。
圖10顯示了用于改性幾種不同基材表面的表面改性劑(標記為字母A-Y)的結(jié)構(gòu)。
圖11顯示了我們的幾種胺功能化珠子具有改進的DNA的吸附性。
圖12顯示了我們的胺功能化珠子和幾種可商購珠子對兩種不同細菌靶的吸附性。
圖13顯示了我們的胺功能化珠子和幾種可商購珠子對兩種不同細菌靶的吸附性。
圖14顯示了我們的胺功能化珠子和幾種可商購珠子對細菌靶的營養(yǎng)體和孢子體形式的吸附性。
圖15顯示了物理性吸附到不同基材表面上的細菌靶的SEM圖象。
圖16顯示了使用親和規(guī)程和SNAP的組合改進了靶(在這種情況下是細菌DNA)的鑒定。
圖17顯示了DNA與包被的基材的吸附受到鹽濃度的影響。
圖18顯示了DNA與包被的基材的吸附受到鹽濃度和pH的雙重影響。
圖19顯示了基材能夠有效地結(jié)合存在于各種樣品，包括水、培養(yǎng)基和非實驗室級的環(huán)境水中的靶DNA。
圖20顯示了溫度的操作可以用來從基材上洗脫靶DNA。
圖21顯示了可以使用電洗脫將靶從基材上釋放。圖21A顯示了GeneCapsule裝置的圖解，以及基材在裝置中的放置。圖21B顯示了裝載基材后GeneCapsule裝置的圖解。圖21C顯示了在電洗脫后小牛胸腺DNA從胺珠子上的洗脫。可以看見大量的小牛胸腺DNA從基材上遷移出來。
圖22顯示了對DNA具有親和性的各種磁珠的捕獲和釋放活性的比較。對每種類型的珠子來說，1毫克基材被加入到1mL500pg/mL的DNA標準去離子水溶液中。對每種類型的珠子來說，最左邊的條代表被捕獲到基材上的DNA的百分數(shù)。中間的條代表被捕獲的DNA釋放到洗脫緩沖液中的百分數(shù)，洗脫緩沖液包含150μL 100μg/mL小牛胸腺DNA的0.01N NaOH。這被稱為回收的靶的百分數(shù)，是回收的DNA與捕獲的DNA的比率。最右邊的條代表了效率，是回收的DNA與最初樣品中存在的總DNA(500pg)的比率。
圖23顯示了可商購的胺包被的磁珠捕獲DNA的效率作為基材量和捕獲時間(例如基材和樣品之間的接觸時間)的函數(shù)。
圖24顯示了可商購的胺包被的磁珠捕獲DNA的效率作為基材量和捕獲時間(例如基材和樣品之間的接觸時間)的函數(shù)。
圖25顯示了可商購的胺包被的磁珠釋放DNA的效率作為基材量和洗脫時間的函數(shù)。
圖26顯示了可商購的胺包被的磁珠釋放DNA的效率作為基材量和洗脫時間的函數(shù)。
圖27顯示了洗脫體積對洗脫效率的影響。
圖28顯示了pH對洗脫效率的影響。
圖29顯示了使用干親和磁性規(guī)程將細菌DNA從干土壤樣品分離出來后PCR的結(jié)果。虛線表明只使用SNAP方法處理分離DNA的土壤樣品，實線表明了在SNAP處理前先與帶靜電荷的非磁珠接觸的土壤樣品。
圖30顯示了從含有與水混合形成淤泥的砂土樣品中，使用含有磁珠的柱體分離細菌孢子后的PCR結(jié)果。從砂土中的靶孢子獲得的DNA可以直接用PCR分析，也可以在使用親和規(guī)程從樣品中分離后再進行PCR分析。在PCR之前先分離靶與含有靶的樣品直接PCR分析相比，導(dǎo)致檢測量增加了一個數(shù)量級。
圖31顯示了用于無序混合的裝置(無序混合裝置)。
圖32顯示了對只使用SNAP規(guī)程分離的DNA(上圖)或使用大規(guī)模親和規(guī)程加SNAP規(guī)程分離的DNA(下圖)進行的PCR反應(yīng)的凝膠電泳。在兩個圖中，箭頭被用來指明擴增的條帶。這些結(jié)果表明大規(guī)模的親和規(guī)程改進了對在大量樣品中檢測的限制。
圖33顯示了對只使用SNAP規(guī)程分離的DNA或使用大規(guī)模親和規(guī)程加SNAP規(guī)程分離的DNA進行的PCR反應(yīng)的凝膠電泳。箭頭被用來指明擴增的條帶。這些結(jié)果表明大規(guī)模的親和規(guī)程改進了對在大量樣品中檢測的限制。
圖34顯示了表面改性的收集管。
圖35顯示了含有表面改性基材的濾器的兩種設(shè)計。盡管圖中提供的具體例子表明濾器被用于收集空氣樣品(氣體樣品)，同樣的設(shè)計可以容易地改造以構(gòu)建用于收集液體樣品的濾器。
圖36顯示了可以通過一個或多個基材用于處理樣品的LiNK裝置的變體。此外，裝置還可以在收集后保存樣品。
圖37顯示了改進的雙室(LiNK)裝置。改進的裝置含有二氧化硅柱增強樣品的純化和濃縮。
圖38顯示了LiNK類裝置的兩種修改的設(shè)計。成對設(shè)計或雙室設(shè)計允許了對樣品中的細菌和其它細胞，在缺少用于便利樣品核酸的分析所需的離液序列高的鹽的情況下進行培養(yǎng)。
發(fā)明詳述(1)綜述生物學(xué)、化學(xué)和環(huán)境科學(xué)經(jīng)常需要對首先必須從非均一群體材料中分離或檢測的靶進行分析。該過程還可能由于在樣品中存在可能降解靶或抑制靶的后續(xù)分析的污染物而進一步復(fù)雜化。本發(fā)明提供了用于從非均一群體材料中純化靶的方法、成分和裝置。這些方法、成分和裝置可以用于廣范圍的靶(例如DNA、RNA、蛋白、細菌和細菌孢子(包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌)、病毒(包括DNA病毒和RNA病毒)、小有機分子和化學(xué)化合物)，具有廣泛的生物學(xué)、化學(xué)和環(huán)境應(yīng)用。
在本文中詳細描述的改進的方法和成分極大地增強了從廣泛的氣體、液體和固體樣品中分離或檢測靶的能力。此外，本發(fā)明可以與以前描述的在分離期間和進一步分析之前幫助維持靶的完整性的方法和裝置相結(jié)合使用。這些幫助維持靶的完整性的方法和裝置在2003年7月10日提交的共同待決的美國專利申請2003/0129614中有詳細的描述，在此以其全文引為參考。簡單地說，美國專利申請2003/0129614公開了被設(shè)計來便利從樣品中獲得的核酸的分離和分析的方法和成分，該核酸的獲得，是通過在能夠抑制樣品中可以降解靶或可以結(jié)合靶并抑制靶的進一步分析的試劑成分存在的情況下對樣品進行處理。例如，樣品中的試劑能夠降解核酸例如DNA。這種降解減少了給定樣品中DNA的濃度，也降低了DNA的質(zhì)量，以至于很難對DNA進行處理以進一步在測試例如PCR中進行分析。
發(fā)明用途本發(fā)明的方法、成分和裝置具有許多潛在的應(yīng)用。例如，許多在法醫(yī)學(xué)中使用的分析方法需要純化DNA、蛋白或有機小分子、例如復(fù)雜樣品中的非肽類激素。這樣的樣品包括人類或動物的體液或組織，包括但不限于血液、唾液、痰、尿液、糞便、皮膚細胞、頭發(fā)毛囊、精液、陰道液、骨骼片段、骨髓、腦材料、腦脊液、羊水等。從這些復(fù)雜樣品中純化和進一步分析靶受到下列因素的妨礙(a)樣品中通常較低的靶濃度；(b)樣品受到環(huán)境污染物或樣品中隨著時間降解靶的試劑的降解；以及(c)在這些復(fù)雜體液中存在著干擾靶純化后進行分析所需的技術(shù)的試劑。因此，本發(fā)明對法醫(yī)科學(xué)有重要的應(yīng)用，將增強分析生物樣品的能力。此外，我們注意到本發(fā)明的方法和成分能夠有效地從材料混合物中分離靶，該材料混合物可能存在于“骯臟”的環(huán)境例如土壤或水中。因此，本發(fā)明不僅對直接從個體提供的新鮮體液樣品或在相對未擾亂的環(huán)境中的樣品進行的法醫(yī)和其它研究提供了便利，而且可用于分析必須從土壤、水(包括淡水和海水)或其它可能含有較高濃度的污染物或其它降解試劑的來源中回收的樣品。因此，本發(fā)明的方法、成分和裝置可廣泛應(yīng)用于在實驗室、醫(yī)院和醫(yī)生辦公場所中分析生物材料，以及在野外被警察、醫(yī)學(xué)檢查人員、急救醫(yī)務(wù)技術(shù)人員、犯罪調(diào)查員、Haz-mat人員和其他野外工作人員用于分析生物樣品。
但是，本發(fā)明在生物科學(xué)中的應(yīng)用不限于法醫(yī)學(xué)。醫(yī)學(xué)和遺傳測試領(lǐng)域的進展已經(jīng)開始改變了我們進行衛(wèi)生護理的方式。許多診斷測試已經(jīng)可以使用或目前正在開發(fā)。這些測試依賴于分析在人類或動物體液或組織中包含的特定靶(DNA、蛋白、激素)的能力。因此，本發(fā)明可用于進一步改進分析生物樣品的容易性和效率。此外，既然本發(fā)明的方法和成分允許分離較小量的靶，在診斷時使用這些方法和成分將幫助減少必須從特定病人獲得的樣品的量。此外，本發(fā)明提供的方法允許以以前不可能獲得的速度和使用最少的試劑從廣范圍的樣品中分離靶?？焖倭畠r分析樣品的能力在衛(wèi)生護理和醫(yī)學(xué)工業(yè)、以及在許多本文中詳細描述的發(fā)明的其它應(yīng)用中具有優(yōu)勢。
作為另一個例子，本發(fā)明可用于篩選血液、血液制品或其它預(yù)包裝的醫(yī)學(xué)供應(yīng)品，以確保這些供應(yīng)品不含特定的污染物例如細菌和病毒。
除了醫(yī)學(xué)應(yīng)用之外，本發(fā)明還具有各種環(huán)境應(yīng)用?？梢苑治鏊?、土壤或空氣樣品中特定靶的存在。這樣的靶包括DNA、RNA、蛋白、小的有機分子、化學(xué)化合物、細菌細胞或孢子(包括革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌)和病毒(包括DNA病毒和RNA病毒)。DNA、RNA和蛋白可以來自于人類、非人類的動物、植物、細菌、真菌、原生動物和病毒。例如，從當?shù)爻靥?、湖泊和海灘收集的水樣品可以被分析以評估潛在有害的細菌或化學(xué)污染物的存在和濃度。這種分析可用于監(jiān)測這些水源的衛(wèi)生，并評估它們對于人類消費的安全性。同樣地，土壤樣品可以被收集和分析以評估自然或工業(yè)來源的污染水平。
作為另一個例子，含有本發(fā)明成分的柱體和濾器可用于監(jiān)測空氣和水供應(yīng)。這樣的柱體和濾器可以用于評估建筑物、機場和其它依賴循環(huán)空氣的封閉環(huán)境中的空氣質(zhì)量。此外，這樣的柱體可用于養(yǎng)魚箱、水族館等，以幫助監(jiān)測水的質(zhì)量并幫助精確確定水質(zhì)量的任何變化來源。
本發(fā)明的最后一個非限制性的應(yīng)用例子可以被廣泛地分類到本土安全領(lǐng)域。既然存在使用生物和/或化學(xué)武器的戰(zhàn)爭的威脅，能夠用來鑒定食物、水、土壤或空氣中的生物或化學(xué)試劑的存在的方法和成分就具有極大可能的應(yīng)用。例如，環(huán)繞當?shù)厮畮旎蚱渌赡艿墓粼吹乃屯寥罉悠房梢员皇占?，并分析生物或化學(xué)污染物的存在。此外，柱體和濾器可用于監(jiān)測空氣(建筑物、火車、飛機或其它交通工具外部或內(nèi)部)中生物或化學(xué)污染物的存在。本發(fā)明預(yù)料生物污染物可以通過檢測來自特定的生物體(例如細菌或病毒)的DNA或RNA、或通過檢測細菌或病毒本身來鑒定?；瘜W(xué)污染物可以通過檢測有機分子本身、以及檢測它的化學(xué)副產(chǎn)物或代謝物來鑒定?？梢员粰z測的示例性生物和化學(xué)試劑包括炭疽桿菌、篦麻毒素、布魯氏桿菌、天花病毒、鼠疫菌、Q熱立克次氏體、土拉菌、肉毒梭菌、葡萄球菌、和病毒性出血熱包括埃博拉病毒、芥子氣、產(chǎn)氣莢膜梭菌、駱駝痘病毒、沙林、甲氟磷酸異己酯、O-乙基-S-二異丙基氨基甲基甲基膦酰基硫醇、二甲氨基氰磷酸乙酯和氫氰酸。臨床和環(huán)境相關(guān)的示例性病毒可以基于它們的基因型以及它們是否具有包膜進行分類，包括(1)單鏈、正義鏈、有包膜、RNA病毒；(2)單鏈、正義鏈、無包膜、RNA病毒；(3)單鏈、反義鏈、有包膜、RNA病毒；(4)雙鏈、無包膜、RNA病毒；以及(5)雙鏈，有包膜、DNA病毒。單鏈、正義鏈、有包膜的RNA病毒包括但不限于東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、SARS、丙型肝炎病毒、HIV和西尼羅病毒。單鏈、正義鏈、無包膜的RNA病毒包括但不限于諾沃克病毒、甲型肝炎病毒和鼻病毒。單鏈、反義鏈、有包膜的RNA病毒包括但不限于埃博拉病毒、馬堡病毒和流感病毒。雙鏈、無包膜的RNA病毒包括但不限于輪狀病毒。雙鏈，有包膜的DNA病毒包括但不限于乙型肝炎病毒和重型天花病毒。
對于上面描述的本發(fā)明的各種潛在的法醫(yī)、醫(yī)學(xué)、診斷、環(huán)境、工業(yè)和安全應(yīng)用，本發(fā)明預(yù)料到了使用本發(fā)明的方法、裝置和成分從非均一樣品中分離和/或鑒定靶。因此，這些方法、成分和裝置不僅可用于特定的靶和樣品的進一步分析，而且可用于從樣品中移除靶(例如不需要的靶)。使用本發(fā)明移除靶的例子包括了樣品的去污染。在從樣品中分離(例如移除、物理分離)所有或部分靶之后，樣品可以比在移除靶之前更安全地操作。被分離的靶也可以被丟棄(例如根據(jù)任何可能與靶結(jié)合的危險物的本質(zhì)適當?shù)貋G棄)，或可以使用根據(jù)任何可能與靶結(jié)合的危險物的本質(zhì)來說適合的試劑和預(yù)防措施進一步研究。
(2)定義為了方便起見，在此收集了某些在說明書、實施例和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語。除特別定義以外，所有本文使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬的專業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員所通常理解的那樣具有同樣的意義。
本文使用的“一個”和“一種”是指一個或一個以上，和一種或一種以上(即至少一個/種)。例如，一種“元件”意味著一種或一種以上的元件。
術(shù)語“靶”被用于指所需的特定分子。示例性的靶包括DNA、RNA、蛋白、革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、細菌孢子、DNA病毒和RNA病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒)、有機小分子(包括非肽類激素)和化學(xué)化合物。DNA、RNA和蛋白可以來自人類、非人類的動物、植物、真菌、原生動物、細菌和病毒。對于前述靶中的任何一種，本發(fā)明預(yù)料通用類別的靶(例如樣品中的所有DNA)的純化，以及一類靶中特定的種類(例如特定的細菌或針對給定抗原的抗體)的純化。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，靶是使用本發(fā)明的方法、成分和裝置從非均一樣品中基本上純化的分子。
術(shù)語“樣品”指生物、化學(xué)或環(huán)境材料的非均一混合物。本發(fā)明的方法、成分和裝置允許從樣品中分離、檢測或基本上純化特定的靶。樣品可以是氣體、液體或固體(例如濕的固體樣品或干的固體樣品)，可以包括生物學(xué)、化學(xué)或環(huán)境材料。示例性的生物樣品包括但不限于血液、唾液、痰、尿液、糞便、皮膚細胞、頭發(fā)毛囊、精液、陰道液、骨骼片段、骨髓、腦材料、腦脊液和羊水等。示例性的環(huán)境樣品包括但不限于土壤、水、非實驗室級的環(huán)境水樣、淤泥、空氣、植物和其它植物性材料、油、液體礦物沉積物和固體礦物沉積物。本發(fā)明還預(yù)料這些方法和成分在許多商業(yè)和工業(yè)應(yīng)用中的應(yīng)用，包括在食品加工或其它商業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中污染物的純化。
術(shù)語“基材”被用來指任何可以被改性或用“表面改性劑”包被、以便促進或增強包被的基材與一種或多種靶之間相互作用的表面。基材在大小和形狀方面可以廣泛地改變，具體的基材可以由本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員根據(jù)改性劑、靶、樣品和與本發(fā)明的具體應(yīng)用特定相關(guān)的其它因素容易地選擇。示例性的基材包括但不限于磁珠、非磁珠、管(例如聚丙烯管、聚氨基甲酸乙酯管等)、玻璃載玻片或蓋玻片、芯片、匣子、濾器、柱體和探針包括光學(xué)纖維探針。
表面改性劑可以與基材共價或非共價地偶聯(lián)，表面改性劑還可以或選含有可剪切的接頭，以便表面改性劑的活性區(qū)域可以從基材上釋放。術(shù)語“活性區(qū)域”被用于指改性劑中含有的與靶相互作用的區(qū)域的部分。在改性劑含有可剪切的接頭的實施方案中，接頭被剪切釋放出靶和改性劑的活性區(qū)域，而留下改性劑的某些部分結(jié)合在基材上。
術(shù)語“親和規(guī)程”或“AP”被用來指通過將樣品與基材相接觸從樣品基本上純化或分離靶的方法。基材的表面可以包被有改性劑以促進或增強基材和特定靶之間的相互作用。
術(shù)語“親和磁性規(guī)程”或“AMP”被用來指基材具有磁性特征的AP方法的實施方案。與AP方法中使用的基材相同，用于AMP方法的基材可以包被有改性劑以促進或增強基材和特定靶之間的相互作用。
親和規(guī)程和親和磁性規(guī)程包括了靶捕獲階段，其中靶和基材相互作用形成靶-基材復(fù)合物。靶和基材結(jié)合形成靶-基材復(fù)合物所需的時間在本文中稱為“捕獲時間”。通過“靶和基材結(jié)合形成靶-基材復(fù)合物”意味著靶和基材之間足夠的相互作用，以便樣品中超過50％(例如至少51％)的靶與基材結(jié)合形成靶-基材復(fù)合物。在某些實施方案中，樣品中超過60％、70％、75％、80％、85％、90％或超過95％的靶與基材結(jié)合形成靶-基材復(fù)合物。
在AP和AMP的某些應(yīng)用中，靶-基材復(fù)合物被破壞，被結(jié)合的靶從基材上洗脫下來。從基材上洗脫靶所需的時間在此被稱為“洗脫時間”。通過“從基材上洗脫或移除靶以破壞靶-基材復(fù)合物”意味著破壞了超過50％(例如至少51％)的靶-基材復(fù)合物。在某些實施方案中，超過60％、70％、75％、80％、85％、90％或超過95％以前結(jié)合到靶的樣品中的靶被洗脫。
術(shù)語“偶聯(lián)區(qū)域”是指改性劑上與基材相互作用的部分。
術(shù)語“SNAP”或“SNAP方法”或“SNAP規(guī)程”將完全可以相互交換使用，是指在共同待決的美國
發(fā)明者馬克·A·霍利斯, 尼古拉斯·弗里蘭·賈德森, 克里斯蒂娜·瑪麗·魯津斯基, 拉利塔·帕拉梅斯瓦蘭, 西奧多·費登欣, 凱瑟琳·卡夫雷拉, 勞拉·T·博爾托林 申請人:麻省理工學(xué)院