專利名稱：基于vefg,her－2,psa蛋白質(zhì)異構(gòu)體的用于診斷和治療的疾病的特效試劑的制作方法
背景自身的抗體是由稱之為漿細(xì)胞的特殊淋巴細(xì)胞最初生成的。宿主動物體內(nèi)產(chǎn)生的強烈的抗體反應(yīng)，是通過介導(dǎo)和調(diào)整B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞的過程來進(jìn)行控制的。這種分化包括由原初B細(xì)胞(含有修飾的抗體作為細(xì)胞表面抗原受體，并不分泌抗體)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴SB細(xì)胞(含有細(xì)胞表面抗體并且也分泌抗體)，然后轉(zhuǎn)變?yōu)闈{細(xì)胞(高度特異的抗體生產(chǎn)者，并不含表面抗原受體)。這種分化過程受抗原存在情況以及B細(xì)胞和T輔助細(xì)胞間通訊情況的影響。
由于抗體具有特異地結(jié)合抗原的能力，其已經(jīng)被廣泛地用于研究、診斷和治療應(yīng)用中。單克隆抗體的發(fā)展擴(kuò)大了抗體潛在運用價值。與多克隆抗血清不同(其包含針對不同表位的抗體混合物)，單克隆抗體直接針對抗原上的單一的決定因子或表位，并且具有均一性。此外，單克隆抗體可以無限量地被生產(chǎn)。
抗體試劑在蛋白質(zhì)體研究和藥物應(yīng)用中的使用已被極大地擴(kuò)展和多樣化。這些運用包括抗體治療，免疫測定，親和純化，蛋白質(zhì)表達(dá)，功能分析，組織和生物體成像。抗體微陣列技術(shù)目前正處于其初期，但在診斷和其他廣泛的臨床應(yīng)用上具有極大的發(fā)展?jié)摿ΑＨ欢?，在人類全基因組編碼的總數(shù)大于100000種蛋白質(zhì)中，目前只有少部分擁有其抗體配對物。這主要歸因于目前抗體的生產(chǎn)在很小的范圍基礎(chǔ)上完成，并且其過程耗時費力。
例如，一種生產(chǎn)抗體的方法由Kohler和Milstein最初提出(Kohler and Milstein(1975)Nature 256495)，一種分泌抗體的免疫細(xì)胞先從被免疫的小鼠中分離，然后與B細(xì)胞腫瘤的一種骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。最終的雜交細(xì)胞(例如雜交瘤細(xì)胞)能夠在體外存活。一旦建立，這些雜交瘤細(xì)胞將不斷分泌特定的抗體。
另一種生產(chǎn)單克隆抗體的方法是噬菌體展示庫的構(gòu)建。這種方法通過提取人全部外周血細(xì)胞的mRNA，隨后構(gòu)建cDNA文庫，包含合適的所有免疫球蛋白可變區(qū)域的序列。這些cDNAs被插入噬菌體，將免疫球蛋白可變區(qū)表達(dá)為Fab片段。理論上，如果噬菌體庫足夠大，通過用感興趣的抗原篩選噬菌體，可以分離出表達(dá)期望的Fab片段的特異噬菌體。然而，這種方法一般僅應(yīng)用于充分純化的抗原，而不能用于抗原混合物，如細(xì)胞表達(dá)的數(shù)千種表面抗原。
單克隆抗體目前應(yīng)用于治療急性和慢性人類疾病的臨床試驗，包括白血病，淋巴瘤，實體瘤(例如結(jié)腸，乳房，肝)，AIDS和自身免疫疾病?？贵w治療試劑作為商業(yè)應(yīng)用的例子是抗-Her2(Trastuzumab或Herceptin)?？?Her2是第一種人工抗體，用于治療HER2的陽性轉(zhuǎn)移乳房癌，其針對并阻止HER2蛋白的過量表達(dá)活動。雖然抗-Her2已經(jīng)成功治療乳房癌，然而這種藥物的副作用導(dǎo)致27％的病人產(chǎn)生心肌癥(Horton J.(2002)Cancer Control，9499-507，Ewer et al.(2002)Proc Annu Meet Am Soc C1in Oncol.21489)。這種藥物的其他副作用也已有報道，包括一些超敏反應(yīng)(包括過敏)，浸潤反應(yīng)，肺部病變。
對于Her2的鼠同源物erbB2的更多研究，解釋了在防止擴(kuò)大化的心肌癥中Her2的作用(Crone et al.(2002)Nat Med 8(5)459-465)。另一獨立的臨床研究報道，在20位運用抗-Her2的病人中，7位病人出現(xiàn)心肌攝取放射標(biāo)記的抗-Her2現(xiàn)象(Behe etal.(2002)N Engl J Med.345995-996)。這些研究讓研究者得出結(jié)論由于運用抗-Her2進(jìn)行治療的病人中，抗-Her2不能區(qū)分乳房和心肌中的Her2，從而導(dǎo)致心肌炎的產(chǎn)生?？?Her2治療性抗體的設(shè)計無法使抗體區(qū)分在疾病組織中過量表達(dá)的突變Her2和在心肌組織中表達(dá)的正常Her2。雖然抗-Her2對于其目標(biāo)蛋白Her2具有高度的特異性，但是一個重要的問題是這個抗體無法區(qū)分疾病組織和正常、健康組織。綜上所述，設(shè)計具備更好的特異性和有效性的抗體治療方法十分必要。
這樣，需要一種用于診斷和治療應(yīng)用的高產(chǎn)的抗體生產(chǎn)方法，以及藥物發(fā)明。
摘要這里提供了一些治療性復(fù)合物，包含例如一種表位的抑制物，該表位含有經(jīng)證實為疾病相關(guān)表位的外顯子結(jié)合點，和一個藥物可接受載體。這種抑制物可以是一個抗體，如一種單克隆抗體，可與SEQ ID NO序號為2，4，6，8，10，11，13或15-25的任何一個表位特異結(jié)合。
另外，提供了包含核酸的治療性復(fù)合物，此核酸包含疾病相關(guān)外顯子結(jié)合點的表位和藥物接受載體編碼序列。這種核酸序列可以編碼一種在SEQ ID NO序號為2，4，6，8，10，11，13或15-25中與疾病相關(guān)的表位。包含編碼疾病相關(guān)的包括在SEQ ID NO序號為2，4，6，8，10，11，13或15-25中的表位序列的核酸的表達(dá)載體也被顯示。表達(dá)載體另外可以包含編碼載體蛋白序列的核酸。治療性復(fù)合物也可包含一種多肽，該多肽包含疾病相關(guān)外顯子結(jié)合點的表位和一個藥物接受載體。這個多肽可以包含一種包括在SEQ ID NO序號為2，4，6，8，10，11，13或15-25的疾病相關(guān)的表位。
此外，提供了一些siRNAs，針對編碼表位的核酸序列，該表位包含從SEQ ID NO序號為2，4，6，8，10，11，13或15-25中任一個挑選出來的氨基酸序列，還提供了編碼siRNA的核酸。另外還包括了包含有這些核酸的載體，以及包含siRNA或編碼此類的核酸的細(xì)胞。SiRNA或核酸可以以一種包含藥物接受載體的治療性復(fù)合物形式存在。
試劑盒也被提供。例如，治療性試劑盒包含一種表位的抑制物，該表位包含一個外顯子結(jié)合點，并被認(rèn)為是一種疾病相關(guān)表位，試劑盒也可以包括治療方案必需的第二種試劑或材料。試劑盒還包含使用說明書，以及施行抑制物的設(shè)備。診斷試劑盒包含一種表位的抑制物，該表位包含一個外顯子結(jié)合點，并被認(rèn)為是一種疾病相關(guān)表位，試劑盒也可以包括診斷方案必須的第二種試劑或材料。
此外顯示了一些治療方案。測定受試者是否患有VEGF異構(gòu)體相關(guān)的疾病，包括(1)將來自受試者樣本與特異結(jié)合表位(來自SEQ ID NO2或4)的抗體相聯(lián)，(2)測定抗體與樣本的結(jié)合情況，若抗體與樣本結(jié)合說明受試者患有VEGF異構(gòu)體相關(guān)的疾病。測定受試者是否患有HER-2異構(gòu)體相關(guān)的疾病，包括(1)將來自受試者樣本與特異結(jié)合表位(來自SEQ ID NO6或8)的抗體相聯(lián)，(2)測定抗體與樣本的結(jié)合情況，若抗體與樣本結(jié)合說明受試者患有HER-2異構(gòu)體相關(guān)的疾病。測定受試者是否患有PSA異構(gòu)體相關(guān)的疾病，包括(1)將來自受試者樣本與特異結(jié)合表位(來自SEQ ID NO10，11或13)的抗體相聯(lián)，(2)測定抗體與樣本的結(jié)合情況，若抗體與樣本結(jié)合說明受試者患有PSA異構(gòu)體相關(guān)的疾病。測定受試者是否患有某蛋白異構(gòu)體相關(guān)的疾病，包括(1)將來自受試者樣本與特異結(jié)合蛋白質(zhì)異構(gòu)體疾病相關(guān)表位的抗體相聯(lián)，該蛋白由這里所述的方法鑒定，(2)測定抗體與樣本的結(jié)合情況，若抗體與樣本結(jié)合說明受試者患有某蛋白異構(gòu)體相關(guān)的疾病。
一種治療性方法包括，例如，通過給予病人所需的治療性有效劑量的試劑進(jìn)行治療，例如一種特異結(jié)合疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的抗體。這種試劑可以是之前所述的一種抗體。
一種治療方案例子可以是這樣一種方法對于特異蛋白異構(gòu)體相關(guān)疾病的病人的治療，包括給予病人所需的疾病相關(guān)外顯子-結(jié)合點表位的抑制物，例如那些被認(rèn)為是疾病相關(guān)外顯子-結(jié)合點表位的抑制物。這種疾病可以是癌癥，這些外顯子結(jié)合點表位將在SEQ ID NO2，4，6，8，10，11，13，或15-25中任一個中列出。病人也可被給予化療治療。這里還提供了一種疾病相關(guān)外顯子結(jié)合點表位抑制物的使用方法，在疾病治療的藥劑的制備中有所運用，而該抑制物被認(rèn)為是疾病相關(guān)外顯子結(jié)合點表位抑制物。該疾病可以是癌癥，該藥劑可以和其他化療藥劑聯(lián)用。在某方面，與從SEQ ID N02，4，SEQ ID NO6，8，SEQ ID NO10，11，13列出的表位分別特異結(jié)合的抗體，將分別用于治療VEOF，HER-2，PSA異構(gòu)體相關(guān)疾病藥劑的制備。另一方面，某一抗體被用于制備治療蛋白質(zhì)異構(gòu)體相關(guān)疾病的藥物，該抗體可特異結(jié)合一種由這里所述方法鑒定的與疾病相關(guān)的蛋白異構(gòu)體的外顯子結(jié)合點表位。
另一方面，提供了一些疾病相關(guān)外顯子結(jié)合點表位抑制子的應(yīng)用方法，其被認(rèn)為是一種疾病相關(guān)外顯子結(jié)合點表位的抑制子，用于制備一種治療疾病的藥物。這些疾病可能是癌癥。此方法可能額外包括給予病人其他化療藥劑治療。
其他的方法包括與以下所列表位(SEQ ID NO2或4；SEQID NO6或8；SEQ ID NO10，11或13；SEQ ID NO15；SEQ ID NO16；SEQ ID NO20-21；SEQ ID NO22-24；或SEQ ID NO25)特異結(jié)合的抗體的應(yīng)用，分別用于治療VEGF，HER-2，PSA PDGFRβ，PSMA，CD86，催乳素，或胰島素受體的異構(gòu)體相關(guān)疾病藥物的制備。另一方法包括與一種由這里所述方法鑒定的疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體外顯子結(jié)合點表位特異結(jié)合的抗體的應(yīng)用方法，用于治療蛋白質(zhì)異構(gòu)體相關(guān)疾病的藥物制備。
另外提供了一些從眾多抗體中鑒定與目標(biāo)蛋白結(jié)合的抗體的方法(1)提供相互不同的連接有載體蛋白的眾多抗體，其中至少有一種抗體可與包含目標(biāo)蛋白部分結(jié)構(gòu)的融合蛋白特異結(jié)合；(2)將部分或全部抗體連接到一個固相表面，從而得到覆蓋有抗體的固相表面，不同的抗體連接在固相表面的不同部位；(3)將覆蓋有抗體的固相與融合蛋白相連；(4)通過實驗方法驗證載體蛋白的存在與否，存在載體蛋白的表明存在針對目標(biāo)蛋白的抗體。這些抗體可以是純化或未純化的抗體制備物。它們可以是免疫或未免疫動物的血清，或雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。
目標(biāo)蛋白可以是一種蛋白或配基的異構(gòu)體，可有效引發(fā)針對它的抗體。某一方面，一種蛋白的異構(gòu)體是與疾病相關(guān)的異構(gòu)體，例如VEGF異構(gòu)體VEGF165和VEGF121，或一種可以有效引發(fā)針對其抗體的配基。連接了目標(biāo)蛋白的載體蛋白可以包含分泌性堿性磷酸脂酶(SEAP)，辣根過氧化物酶，β-半乳糖酶，熒光素酶，或酶活性基團(tuán)，以及IgG Fc(γ鏈)或其配基。提供的抗體可能與一固體表面相連，如蛋白質(zhì)A，蛋白質(zhì)A瓊脂糖或其他蛋白質(zhì)A偶聯(lián)物；蛋白質(zhì)G，蛋白質(zhì)G瓊脂糖或其他蛋白質(zhì)G偶聯(lián)物。分析載體蛋白存在情況的測定方法可以包括化學(xué)發(fā)光分析，熒光分析或比色分析。從眾多抗體中鑒定目標(biāo)蛋白抗體的方法需進(jìn)一步在步驟3和4之間包含一洗脫步驟用于移去未綁定的目標(biāo)蛋白。
目標(biāo)蛋白可以是一種蛋白或配基的異構(gòu)體，可有效引發(fā)針對它的抗體。某一方面，一種蛋白的異構(gòu)體是與疾病相關(guān)的異構(gòu)體，如病毒蛋白或可有效引發(fā)針對它的抗體的一種蛋白。連接了目標(biāo)蛋白的載體蛋白可以包含分泌性堿性磷酸脂酶(SEAP)，辣根過氧化物酶，β-半乳糖酶，熒光素酶或酶活性基團(tuán)以及IgG Fc(γ鏈)。融合蛋白或編碼融合蛋白的核酸(例如表達(dá)載體)的集合物，可以導(dǎo)入宿主體(例如老鼠)。宿主能夠同時接受至少310100種融合蛋白或100種編碼蛋白的核酸。
另外提供了一種生產(chǎn)單克隆抗體集合物的方法，其中至少有一種單克隆抗體能夠結(jié)合疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體，包括(1)將融合蛋白或編碼融合蛋白的核酸的集合物導(dǎo)入某一宿主，其中每一融合蛋白至少包含疾病相關(guān)蛋白異構(gòu)體的配基和一個載體蛋白；(2)從宿主脾細(xì)胞中制備單克隆抗體分泌細(xì)胞的集合物；(3)由權(quán)利1所述方法篩選細(xì)胞，得到至少一種可以結(jié)合疾病相關(guān)蛋白異構(gòu)體的單克隆抗體。
這些融合蛋白可以包括血管內(nèi)皮生長因子異構(gòu)體165(VEGF165)多肽DRARQENPCGPCSE(SEQ IN NO2)；血管內(nèi)皮生長因子異構(gòu)體121(VEGF121)多肽DRARQEKCDKPRR(SEQ INNO4)；HER-2接合異構(gòu)體1多肽INCTHSPLTS(SEQ IN NO6)；HER-2接合異構(gòu)體2多肽CTHSCVASPLT(SEQ IN NO8)或任何SEQ IN NOS10，11，13或15-25。載體蛋白可包含分泌性堿性磷酸脂酶(SEAP)，辣根過氧化物酶，β-半乳糖酶，熒光素酶，或酶活性基團(tuán)以及IgG Fc(γ鏈)。融合蛋白或編碼融合蛋白的核酸(例如表達(dá)載體)的集合物，可以導(dǎo)入宿主體(例如老鼠)。宿主(例如老鼠)能夠同時接受至少310100種融合蛋白或100種編碼蛋白的核酸。
這里提供了一些方法，從大量的抗體集合物中分離特異綁定目標(biāo)蛋白的抗體，這些抗體與編碼這些抗體的核酸相關(guān)，包括(1)將目標(biāo)蛋白的至少一個配基與一個在固體表面的突起相連，(2)在適合抗原/抗體復(fù)合物形成的條件下，將連接有蛋白的突起與編碼這些抗體的核酸相關(guān)的抗體集合物相連；(3)分離與突起相連的抗體，即分離到針對目標(biāo)蛋白的抗體。
在某一方面，與編碼這些抗體的核酸相關(guān)的抗體是噬菌體。分離抗體的方法可額外包括將抗體從突起上分離下來的過程，并且/或者在步驟(2)和(3)之間加入一步洗脫過程。與不同的突起連接的不同蛋白可包含在與突起集合物連接的蛋白集合物中。固相表面可以包含至少10100或1000個突起。目標(biāo)蛋白的配基可與鑰孔嘁血藍(lán)素(KLH)，分泌型堿性磷酸酶(SEAP)，IgG Fc(γ鏈)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，或多聚組氨酸標(biāo)記尾巴。固相表面可包含生物素或鏈霉親和素，鎳，或谷胱甘肽。
這里還提供了一些測定在樣本中抗原存在情況的方法，包括(1)在適合抗原/抗體復(fù)合物形成的條件下，將樣本與固相連接，該固相表面包含固定于特定位置的抗體集合物，(2)在適合抗原/抗體復(fù)合物形成的條件下，將融合蛋白集合物與固相表面相連，每一個融合蛋白包含一個與固相表面的抗體特異接合的多聚肽，以及一個載體蛋白，(3)測定固相表面的每一個特定位置上載體蛋白的存在情況，若在某特定位置有載體蛋白的缺失或減少，則表明具有在特定位置與抗體接合的抗原，即表明樣本中具有抗原。
固相表面可以包含至少100或1000個抗體。固相表面也可以是一種抗體陣列，每一個抗體固定于陣列的特定位置。載體蛋白可以是酶或具有酶活性的配基，則此方法還可進(jìn)一步包括將固相表面與酶底物相連的過程。
在這里還提供了一種鑒定目標(biāo)蛋白中的表位的方法，包括(1)提供編碼融合蛋白聚合物的核酸，這里的每一個融合蛋白包含目標(biāo)蛋白的6到15個或8到12個氨基酸多肽和一個載體蛋白，并且這些多肽包括了目標(biāo)蛋白的不同序列，(2)將核酸集合物導(dǎo)入動物宿主；(3)從宿主細(xì)胞中制備單克隆抗體分泌細(xì)胞的集合物；(4)由前述方法篩選細(xì)胞，以鑒定針對目標(biāo)蛋白的抗體，若存在針對某一多肽的抗體則表明該多肽對應(yīng)于目標(biāo)蛋白上的表位。蛋白可以是細(xì)胞表面受體，融合蛋白還可包含受體胞外部分上的氨基酸序列。
制備針對疾病的DNA疫苗的方法包括(1)鑒定疾病相關(guān)的蛋白上的一個或多個表位，例如，通過這里描述的鑒定目標(biāo)蛋白上的表位的方法；(2)將編碼一個或多個表位的核酸序列導(dǎo)入以個表達(dá)載體，即制備針對疾病的DNA疫苗。這里還提供了制備針對疾病的疫苗方法，包括(1)通過這里描述的鑒定目標(biāo)蛋白上的表位的方法，鑒定疾病相關(guān)的蛋白上的一個或多個表位；(2)制備包含一個或多個表位的氨基酸序列的多肽，即制備了針對疾病的疫苗。
圖表的簡單描述

圖1顯示一種篩選噬菌體顯示文庫的示范方法。
圖2顯示一種篩選表位的示范方法。
圖3顯示一種篩選抗體陣列的示范方法。
圖4顯示一種VEGF異構(gòu)體121，165，206的陳列。
圖5顯示一種針對疾病相關(guān)VEGF異構(gòu)體的示范抗體的設(shè)計方法。
圖6顯示一種針對疾病相關(guān)CD44異構(gòu)體的示范抗體的設(shè)計方法。
詳細(xì)描述定義出于方便，在說明，例子和附加聲明中使用的術(shù)語都在這里匯集。除非另有定義，這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語擁有相同的含義，被具備這項發(fā)明所屬領(lǐng)域通常技能的人所共識。
在說明和聲明中使用的單數(shù)形式“一個”，“一個”，“這個”包括了復(fù)數(shù)情況，除非文中另有清楚說明。例如，術(shù)語“一個細(xì)胞”包括了細(xì)胞的集合物，包括它的混合物。
這里所用的術(shù)語“試劑”表示一種化學(xué)成分，一種化學(xué)成分混合物，一種生物大分子(如一種核酸，一種抗體，一種蛋白質(zhì)或其配基，例如一種多肽)，或一種來源于生物材料，如細(xì)菌，植物，真菌，或動物(特別是哺乳動物)細(xì)胞或組織的提取物。這些藥劑的活性將作為“治療試劑”或“診斷試劑”有效地實施，“治療試劑”或“診斷試劑”指局部或系統(tǒng)地作用于主體的具有生物學(xué)的，生理學(xué)的或藥劑學(xué)的活性底物。
術(shù)語“氨基酸”是指包含所有分子，無論天然或人工合成的，其包括氨基活性和酸活性，并可以被包括在自然發(fā)生的氨基酸聚合體中。氨基酸的示范例子包括自然發(fā)生的氨基酸，類似物，派生物和其同源物；具有不同側(cè)鏈的氨基酸類似物；以及所有前述的任何立體異構(gòu)物。
這里所使用的術(shù)語“抗體”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子上的抗原接合配基，例如包含(“以免疫反應(yīng)”)特異接合抗原的抗原接合位點的分子。在一個示范性的例子中，術(shù)語“抗體”特定地包括單克隆抗體(包括促效藥，拮抗劑和抑制性或中和抗體)。從結(jié)構(gòu)上看，最簡單的自然發(fā)生的抗體(如IgG)包括四個多肽鏈，即以二硫鍵交聯(lián)的兩個重鏈(H)和兩個輕鏈(L)。術(shù)語“VH”指抗體重鏈上的可變區(qū)域。術(shù)語“VL”指抗體輕鏈上的可變區(qū)域。天然的免疫球蛋白代表了包括數(shù)種分子，如IgD，IgG，IgA，IgM，IgE的分子大家族。該術(shù)語也包括雜交抗體，嵌合體抗體，人工化抗體，變更抗體，及其片段。包括但不僅限于Fab片段，和Fv片段?？贵w可以用常規(guī)的技術(shù)片段化，并且用已述的完整抗體的篩選方法可篩選有效的片段。免疫球蛋白的Fab片段是一個多聚體蛋白，由免疫球蛋白的配基構(gòu)成，包含了免疫球蛋白分子重鏈和輕鏈上的免疫活性部分，以共價鍵接合，并可以特異接合抗原。通過在此領(lǐng)域中所熟知的方法，可用木瓜蛋白酶將完整的免疫球蛋白分子水解成Fab片段。然而，F(xiàn)ab片段還可通過此領(lǐng)域中其他方法，在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)期望的免疫球蛋白重鏈和輕鏈配基而獲得。
這里使用的“抗原”指可以激發(fā)一種或多種抗體的物質(zhì)?？乖ǎ粌H限于多肽，蛋白，糖蛋白，多聚糖和脂類，其配基和其接合物。
在眾多其他抗原中，如果一種抗體更適宜結(jié)合某一抗原，那么可稱這種抗體“特異結(jié)合”該抗原或抗原上的表位。例如，抗體可能具有少于50％，20％，10％，5％，1％，0.1％的與其他一種或多種抗原的交叉反應(yīng)。
這里使用的術(shù)語“載體蛋白”指一種蛋白或多肽，可以提高與某蛋白相關(guān)的針對此蛋白的抗體產(chǎn)生量，并且/或者能夠用于測定與之相關(guān)的蛋白。出于免疫目的，許多不同的載體蛋白可以與多肽聯(lián)用。選擇使用何種載體蛋白取決于免疫原性，可溶性，(使之能獲得與載體的最佳結(jié)合情況)，以及鑒定針對目標(biāo)蛋白的抗體的篩選方法。兩種最常用的載體是鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)，和牛血清白蛋白(BSA)。其他例子包括堿性磷酸酶(SEAP)，辣根過氧化酶，熒光素酶，β-半乳糖甘酶，IgG Fc(γ鏈)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，多聚組氨酸標(biāo)記和其他酶，如β-內(nèi)酰胺酶，其他分泌蛋白或多肽。
這用到的術(shù)語“蛋白質(zhì)異構(gòu)體”指任何長度的氨基酸的聚合體，起源于選擇性拼接結(jié)果。選擇性拼接是一種過程(在轉(zhuǎn)錄階段)，在以給定的RNA分子中，可選擇的外顯子(例如編碼某一蛋白上特定區(qū)域的基因的一部分)被合成(通過RNA聚合酶分子)，在同一基因中形成不同的mRNAs(信使RNA分子)。每一種這樣的mRNA稱為“基因轉(zhuǎn)錄子”。通常，通過不同外顯子的細(xì)胞或組織特異性聯(lián)合，一個單一的基因可以編碼幾種不同的mRNA轉(zhuǎn)錄。例如，VEGF165和VEGF121都源自VEGF基因。通過刪除外顯子6得到VEGF165(例外顯子5和外顯子7接合)，通過刪除外顯子6和7得到VEGF121(例外顯子5和外顯子8接合)。其他選擇性拼接的產(chǎn)生原因/來源包括移碼(例mRNA/轉(zhuǎn)錄子中的不同的密碼子被核糖體翻譯)或翻譯起始或終止位點的改變(在mRNA上，并在其翻譯時)，作為結(jié)果，給定的內(nèi)含子仍保留在mRNA轉(zhuǎn)錄子中。不同的身體組織以及一些疾病可以導(dǎo)致在給定的基因中產(chǎn)生選擇性拼接(例作為結(jié)果，在不同組織或疾病組織中產(chǎn)生不同的蛋白)。
“疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體”或“疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體”或“疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體”指源自選擇性拼接的任何蛋白質(zhì)或多肽，其存在或異常的水平與疾病相關(guān)。例如，與非疾病影響的組織或細(xì)胞相比，可以發(fā)現(xiàn)其以異常水平或異常形式存在于受疾病影響的組織或細(xì)胞中。它可以是一種異常高表達(dá)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體，或是一種異常低表達(dá)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體，而其更改了的表達(dá)情況與疾病的發(fā)生和/發(fā)展相關(guān)。一種疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體也可以是一個突變或遺傳變異過程中的基因翻譯產(chǎn)物，其與其他與疾病起因有關(guān)的基因直接相關(guān)，或與之不均衡聯(lián)接。
術(shù)語“表位”指抗原上一段與抗體適宜并特異接合的區(qū)域。一個單克隆抗體適宜結(jié)合某分子的單一特定表位，該分子可從分子特性上鑒定。一個特別的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)異構(gòu)體的表位可由有限的氨基酸殘基構(gòu)成，例如5-15或8-12個殘基，其在蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)異構(gòu)體上以線性或非線性形式存在。被抗體識別的表位可以是，例如5-15或8-12個殘基構(gòu)成的短肽，在疾病相關(guān)的(不以正常蛋白質(zhì)異構(gòu)體形式存在的)蛋白質(zhì)異構(gòu)體中，其跨越了兩個區(qū)域，或兩外顯子，或兩個多聚多肽片段的接合部位。疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體可以是一種選擇性拼接的RNA多變形式的翻譯產(chǎn)物，其缺少一個或多個與編碼正常蛋白的RNA相關(guān)的外顯子。
ADAPI表位是一線性的或非線性的表位，如8-10個或10-15個能用于提升抗體識別蛋白質(zhì)異構(gòu)體能力的氨基酸。而這種蛋白質(zhì)異構(gòu)體起源于mRNA的選擇性拼接或蛋白質(zhì)的不同的翻譯后修飾，正如蛋白質(zhì)的水解。對于橫跨兩個外顯子“聯(lián)接區(qū)域”的線性表位而言，表位序列可能是在20個氨基酸殘余區(qū)域之內(nèi)的鄰近序列，包含例如，外顯子結(jié)合點兩邊的各10個氨基酸殘余。
“疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的表位”指由外顯子編碼的表位，且由于例如拼接，在相同基因編碼的正常蛋白質(zhì)中并不表達(dá)。它也可以是由兩個外顯子結(jié)合點編碼的表位，其外顯子結(jié)合點在正常蛋白質(zhì)中不表達(dá)。
這里使用的“表達(dá)”指多聚核苷酸轉(zhuǎn)錄成mRNA的過程和/或被轉(zhuǎn)錄的mRNA隨之被翻譯成肽，多肽或蛋白質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)錄和編碼的多肽正確地被稱為“基因產(chǎn)品”。如果多肽來源于染色體DNA，表達(dá)可能包括在真核細(xì)胞中mRNA的拼接。
術(shù)語“免疫原”指在動物中引發(fā)免疫反應(yīng)的化合物。這里使用的免疫原也指融合蛋白和編碼這些融合蛋白的核酸。
“單克隆抗體”指在抗體制備中的抗體分子，所有抗體具有相同的特異性并且有相同的核酸產(chǎn)生。對于直接指向特異蛋白的單克隆抗體的制備來說，任何由細(xì)胞系連續(xù)培養(yǎng)提供的抗體分子產(chǎn)品的技術(shù)都可以利用。這種技術(shù)包括，但非限制于，雜腫瘤技術(shù)(見Kohler和Milstein(1975)Nature 256496-497)；trioma技術(shù)；人B-細(xì)胞雜腫瘤技術(shù)(見Kozbor，等。(Immunol Today 472)，EBV雜交瘤技術(shù)(見Cole等，1985，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)和噬菌體顯示來生產(chǎn)人單克隆抗體。人單克隆抗體可以被應(yīng)用于這里所述的方法實踐中，并可由人雜交瘤(見Cote等。(1983).Proc.Natl.Acad.Sci.USA802026-2030)或EB病毒體外轉(zhuǎn)化的人雜交瘤(見Cole等。(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy.Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)生產(chǎn)。
短語“非腸道給藥”或“非腸道地給藥”被熟知，并指區(qū)別于腸道內(nèi)和局部給藥的給藥途徑，通常通過注射方法，并包括但不限于靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，動脈內(nèi)，鞘內(nèi)的，囊內(nèi)的，眶內(nèi)的，心臟內(nèi)，皮內(nèi)，腹膜內(nèi)，氣管，皮下，表皮下，關(guān)節(jié)內(nèi)，包囊下的，蛛網(wǎng)膜下的，脊髓內(nèi)，胸骨內(nèi)注射和輸液。
“病人”，“主體”或“宿主”指人類或動物。
術(shù)語“多聚核酸”，“核酸”可替換使用。它們指任何長度的核酸聚合體，無論是脫氧核糖核酸還是核糖核酸或其類似物。多聚核酸可具有任何三級空間結(jié)構(gòu)，具有任何功能，可以是已知也可是未知的。以下是未受限的多聚核酸例子基因或基因片段上編碼或非編碼區(qū)域，由連接分析定義的位點，外顯子，內(nèi)含子，信使RNA(mRNA)，轉(zhuǎn)運RNA，核糖體RNA，核酸酶，cDNA，重組多聚核酸，分支多聚核酸，質(zhì)粒，載體，分離的DNA或任何序列，分離的RNA或任何序列，核酸探針，引物。多聚核酸可能包含修正的核酸，如甲基化核酸和核酸類似物。如果出現(xiàn)(修正的核酸)，核酸結(jié)構(gòu)將在聚合物的裝配之前或之后被給予修正。核酸序列可能被非核酸成分所中斷。在聚合之后，多聚核酸能被進(jìn)一步修正，例如結(jié)合一個標(biāo)記成分。術(shù)語“重組”多聚核酸指在自然中不存在，或相連于其他多聚核酸以非自然形式排列的基因組，cDNA，源自半合成，或合成的核酸?！肮丫酆怂帷敝干儆?00，75，50，25，或10個核苷酸的單鏈核酸。
術(shù)語“多聚肽”，“多肽”和“蛋白質(zhì)”(單鏈)在這里可交替使用，指任何長度的氨基酸聚合體。聚合體可以是線性或環(huán)狀，可能包含修正的氨基酸，并可能被非氨基酸所中斷。該術(shù)語也包含被修正的，如二硫化物結(jié)合形式，糖基化，脂化，乙?；姿峄?，或其他任何處理，如聯(lián)接標(biāo)記成分的氨基酸聚合物。這里使用的術(shù)語“氨基酸”指天然或非天然或合成的氨基酸，包括氨基乙酸和D或L型異構(gòu)體，及氨基酸類似物和擬肽。
“預(yù)防性的”或“治療性的”治療此領(lǐng)域是熟知的，指給予宿主一種藥物治療。若在有害情況(如疾病或其他對宿主動物有害的情況)的臨床表現(xiàn)出現(xiàn)之前給予治療，那么這種治療是預(yù)防性的，例如，它保護(hù)宿主免受有害情況；而若在有害情況的臨床表現(xiàn)出現(xiàn)之后給予治療，那么這種治療是治療性的(例如將減少，改良或改善現(xiàn)有的有害情況或其副作用)。
術(shù)語“藥物可接受的載體”在此領(lǐng)域是熟知的，指藥物可接受的材料，成分或媒介，如液體或固體填充物，稀釋山梨(糖)醇液，賦形劑，溶劑或包裝材料，起著將任何主體成分或組成，從一個器官，或身體部分，承載或轉(zhuǎn)運到另一個器官，或身體部分的作用。每一個載體必須是可接受的，即與主體成分或組成具有同一性，并對病人無害?？勺鳛樗幬锟山邮艿妮d體的材料例子有(1)糖，如乳糖，葡萄糖和蔗糖，(2)淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素，和其派生物，如羧甲基纖維素鈉，乙烷基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉狀黃芪膠；(5)麥芽；(6)凝膠；(7)滑石；(8)賦形劑，如可可油和蠟栓劑；(9)油，如花生油，棉籽油，紅花油，芝麻油，橄欖油，玉米油，大豆油；(10)乙二醇，如丙烯乙二醇；(11)多羥基化合物，如甘油，山梨(糖)醇，甘露醇和聚乙二醇；(12)硅脂，如乙烷油酸鹽，乙烷十二酸酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)褐藻酸；(16)去除熱源的水；(17)等滲鹽溶液；(18)Ringer’s液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖液；(21)其他藥物學(xué)使用的無毒可兼容物質(zhì)。
短語“系統(tǒng)治療”，“系統(tǒng)地治療”，“外周治療”，“外周地治療”在此領(lǐng)域是熟知的，指某些成分，治療劑或其他材料，不直接針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而是進(jìn)入病人的其他系統(tǒng)，從而影響新陳代謝和其他類似的過程。
“目標(biāo)蛋白”指一種蛋白質(zhì)，例如一種蛋白的異構(gòu)體，其可以引發(fā)抗體增高。
“治療”一種疾病指至少改善疾病的癥狀或至少阻止疾病的惡化。
“載體”是一種能轉(zhuǎn)化并導(dǎo)入核酸分子進(jìn)入宿主細(xì)胞，并且/或者在宿主細(xì)胞間，可自我復(fù)制的核酸分子。該術(shù)語包括了最初功能為將一種核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞的載體，最初功能為核酸復(fù)制的載體，及表達(dá)載體，其功能為轉(zhuǎn)錄并/或翻譯DNA或RNA。也可包括不只具有以上一種功能的載體。這里使用的“表達(dá)載體”被定義為多聚核酸，當(dāng)導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞時可以被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽?！氨磉_(dá)系統(tǒng)”通常指包含了表達(dá)載體的合適的宿主細(xì)胞，具有產(chǎn)生期望的表達(dá)產(chǎn)物的能力。
生產(chǎn)和篩選抗體的方法這里提供了從眾多的抗體中鑒定可以綁定目標(biāo)蛋白的抗體的方法，包括(1)提供至少特定地綁定一種融合蛋白，至少包括連接載體蛋白的目標(biāo)蛋白的部分的抗體。(2)至少某些抗體連接到一個固相表面，從而得到覆蓋有抗體的固相表面，從而不同的抗體連接在不同的固相表面或在一個或更多個固相表面的不同位點。(3)將覆蓋有抗體的固相與融合蛋白相連；(4)通過實驗方法驗證載體蛋白的存在與否，載體蛋白的存在表明存在針對目標(biāo)蛋白的抗體。這些抗體可以是純化的抗體制備物，如免疫球蛋白制備物(血清，免疫動物的多克隆抗血清)，單克隆抗體，細(xì)胞培養(yǎng)基(如雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清)，或是實驗動物的腹水。相反的，抗體和融合蛋白連接后它們再與固相表面連接。這種方法也包括，首先生產(chǎn)結(jié)合融合蛋白的單克隆抗體，例如，給宿主注射融合蛋白并且從宿主得到的細(xì)胞中準(zhǔn)備產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。在某種情況下，生產(chǎn)單克隆抗體包括，(1)給宿主注射眾多融合蛋白或融合蛋白編碼的核酸，每種融合蛋白至少包含目標(biāo)蛋白和載體蛋白的一部分。(2)準(zhǔn)備產(chǎn)生大量單克隆抗體的細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞，來源于宿主的細(xì)胞。(3)篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞來分離那些希望得到的特征，例如通過檢測載體蛋白。例如，至少310100300或1000種融合蛋白或編碼融合蛋白的核酸被注射入宿主。通過使用這里描述的篩選分析方法可便利地篩選針對每種融合蛋白產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，如通過檢測抗體綁定到融合蛋白后的載體蛋白可以檢測希望得到的抗體的存在。在有些情況下，對宿主注射的所有融合蛋白而言，載體蛋白是相同的或基本相同。在后者的情況下，篩選相當(dāng)簡單，因為相同的分析將允許鑒定產(chǎn)生大量不同抗體的細(xì)胞。
這里描述的任何方法將進(jìn)一步包括決定是否鑒定的綁定蛋白異構(gòu)體的抗體是與疾病無關(guān)的，例如鑒定特異地或優(yōu)先地綁定疾病相關(guān)的蛋白異構(gòu)體的抗體。例如，抗體綁定與疾病相關(guān)的蛋白異構(gòu)體的Km值或親和力至少高于與疾病無關(guān)的疾病蛋白異構(gòu)體的Km值或親和力的2，3，5，10，30或100倍。
這一領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到針對目標(biāo)蛋白的抗體也許并不連接載體蛋白，用包含至少一部分目標(biāo)蛋白和載體蛋白的融合蛋白篩選抗體產(chǎn)生的細(xì)胞。因此，在有些情況下，注射入宿主的蛋白質(zhì)不同于用于篩選抗體產(chǎn)生細(xì)胞的蛋白質(zhì)。當(dāng)然，即使宿主注射的蛋白質(zhì)不包含用于鑒定抗體的載體蛋白的氨基酸序列，但是此蛋白質(zhì)必定包含提高宿主免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列。
在有些情況下，通過給宿主注射眾多蛋白質(zhì)來得到抗體，例如融合蛋白。在另一些情況下，通過給宿主注射一種或多種編碼眾多蛋白質(zhì)的核酸來得到抗體，例如融合蛋白。例如，編碼眾多蛋白質(zhì)的一種核酸被注射入宿主來準(zhǔn)備眾多蛋白質(zhì)的抗體。相反，編碼兩種或更多蛋白質(zhì)的兩種或更多核酸被注射入宿主來準(zhǔn)備兩種或更多蛋白質(zhì)的抗體。當(dāng)一種核酸編碼兩種或更多蛋白時，核酸包含兩種或更多啟動子和/或其他調(diào)控元件。核酸也可能在編碼兩個或更多蛋白質(zhì)的開放式閱讀框之間包含數(shù)個核糖體結(jié)合位點。
在有些情況下，載體蛋白是便于從眾多抗體中鑒定綁定目標(biāo)蛋白抗體的蛋白質(zhì)。載體蛋白可通過多種方法鑒定。適當(dāng)?shù)姆椒ㄒ暂d體蛋白的種類而定。例如，載體蛋白可以用特定綁定載體蛋白的抗體來鑒定。因此，載體蛋白可以是獲得或準(zhǔn)備抗體的任何蛋白質(zhì)或分子。例如，載體蛋白可以是一種標(biāo)簽，如組氨酸標(biāo)簽。載體蛋白可以是免疫球蛋白分子的不變區(qū)域，如IgG區(qū)域。載體蛋白也可以是被標(biāo)記的蛋白質(zhì)或其他分子，如熒光，磷光，放射性標(biāo)記。其他載體蛋白可以是使酶活性增強的酶或酶的部分。例如，載體蛋白可以是分泌性的堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，熒光素酶，β-半乳糖甘酶或使酶活性增加的它們中的部分。酶可以是任何希望得到的種類，如人或非人的，如鼠。
這里也提供了制備綁定疾病相關(guān)蛋白或疾病相關(guān)蛋白異構(gòu)體的抗體的方法，入疾病相關(guān)的外顯子結(jié)合點蛋白。在某些情況下，與載體蛋白相同地，從數(shù)據(jù)庫和編碼包含在表達(dá)載體中的10-15或8-12個目標(biāo)序列的寡核苷酸中選擇人目標(biāo)基因序列。然后，核苷酸被引入動物(如鼠)在體內(nèi)引起抗原的表達(dá)并且促進(jìn)免疫反應(yīng)。從動物中分離B細(xì)胞并且產(chǎn)生雜交細(xì)胞。根據(jù)這里所述的方法篩選雜交細(xì)胞，如通過載體蛋白的鑒定。
可以根據(jù)這一領(lǐng)域的蛋白質(zhì)合成的方法，通過化學(xué)合成制備蛋白質(zhì)(如融合蛋白)。也可以通過重組獲得蛋白質(zhì)。尤其，可以通過融合編碼目標(biāo)蛋白或其一部分的核酸和編碼載體蛋白或其一部分的核酸來制備融合蛋白。
編碼目標(biāo)蛋白和載體蛋白的核酸可以通過如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，從基因組DNA中擴(kuò)增基因片段，cDNA，RNA(如通過RT-PCR)或克隆序列來獲得。根據(jù)已知的基因或cDNA序列選擇PCR初始序列，致使得到相對唯一的擴(kuò)增片段。為了達(dá)到特異性和最佳擴(kuò)增目的的需要，計算機程序可以用于初始序列的設(shè)計。參見如，Oligo version 5.0(National Biosciences)。用于設(shè)計和選擇擴(kuò)增初始序列的因素在例如bv Rylchik，W.(1993)“Selection of pimers for Polymerase Chain Reaction?！盜n Methods in Molecular Biology，vol.15，White B.ed.，Humans Press，N.J中被述及。可以從基因庫或其他公共資源中得到序列。相反地，這項發(fā)明的核酸也可以通過這一領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法來合成，如通過使用DNA自動合成器。(這種合成器可以從Biosearch，Applied Biosystems，等購買)在宿主或細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的合適的克隆載體可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建，或從這一領(lǐng)域提供的大量的克隆載體中選擇。盡管選擇的克隆載體根據(jù)宿主細(xì)胞被用的意圖而變，但是有用的克隆載體通常具有自我復(fù)制的能力，擁有獨特的核酸限制性內(nèi)切酶單一位點或帶有能用于選擇包含載體的克隆的標(biāo)記基因。合適地，但非限制性地例子有，質(zhì)粒和細(xì)菌病毒，如PUC18，mp18，mp19，pBR322，pMB9，ColE1，pCR1，RP4，噬菌體DNAs和穿梭載體如pSA3和Pat28。這些和許多其他載體可以從商業(yè)賣主購買，如BioRad，Stratagene，和Invitrogen。
如果可適用，在這里描述的方法中使用的表達(dá)載體通常是包含編碼目標(biāo)蛋白或其一部分并且連接一種載體蛋白或其一部分的多聚核苷酸的可復(fù)制多聚核苷酸結(jié)構(gòu)。這里描述的多聚核苷酸有效地連接合適的轉(zhuǎn)錄控制元件，例如啟動子，增強子和終止子。對表達(dá)而言(如翻譯)，一種或更多的翻譯控制元件通常也是需要的，如核糖體結(jié)合位點，翻譯起始位點和終止代碼。這種轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控元件起源于目標(biāo)蛋白或其同源序列(來源于其他基因或生物體)。編碼信號肽的多聚核苷酸序列也能包括允許穿越或橫跨細(xì)胞膜或從細(xì)胞分泌的多肽。大量的表達(dá)載體適合在真核細(xì)胞中表達(dá)，包括在這領(lǐng)域已知的酵母細(xì)胞，鳥類細(xì)胞，哺乳動物的細(xì)胞。表達(dá)載體的其中一個例子是pcDNA3(Invirogen，San Diego，Calif.)，其轉(zhuǎn)錄起始于細(xì)胞巨化病毒(CMV)早期啟動子/增強子。這個載體也包含用于多聚核苷酸插入的多個核酸限制性內(nèi)切酶識別位點。合適的克隆和表達(dá)載體包括任何這一領(lǐng)域已知的用于細(xì)菌，哺乳動物，酵母和昆蟲的表達(dá)系統(tǒng)。特殊的表達(dá)載體和合適的宿主細(xì)胞已被這一領(lǐng)域所知并且無需在這里詳細(xì)描述?？蓞⒁奊acesa and Ramji(1994)Vectors，John Wiley&Sons。
克隆和表達(dá)載體典型地包含一個可選擇標(biāo)記(如，與載體一起轉(zhuǎn)化的編碼宿主細(xì)胞存活或生長必需的蛋白質(zhì)基因)，盡管這種標(biāo)記基因可能攜帶其他多聚核苷酸序列共同轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞。只有選擇性基因被轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞的那些細(xì)胞才能在選擇性條件培養(yǎng)下生長。典型的選擇性基因有下列特點之一(a)對抗生素或其他毒性物質(zhì)(如氨芐青霉素，新霉素，氨甲葉酸)有抗性作用；(b)補充營養(yǎng)缺陷形缺失物質(zhì)；(c)提供從培養(yǎng)基中不能獲得的必要營養(yǎng)。合適的標(biāo)記基因的選擇有宿主決定，不同宿主合適的基因已被這一領(lǐng)域所知?？寺『捅磉_(dá)載體典型地包含被宿主識別的復(fù)制系統(tǒng)。
在宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)?？梢允?，例如基于病毒的載體。
當(dāng)給予宿主動物以蛋白治療時，真核和原核宿主系統(tǒng)都可以用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。聚合多肽可從細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)基中分離，并按照其使用需要的程度進(jìn)行純化。這項發(fā)明中使用的合適的原核宿主細(xì)胞例子是埃希氏菌屬大腸桿菌。真核宿主細(xì)胞的例子包括禽類，昆蟲，植物，動物細(xì)胞如COS7，HeLa，CHO細(xì)胞。來源于真核生物的哺乳動物細(xì)胞系也經(jīng)常作為表達(dá)聚合多肽的宿主細(xì)胞。培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞的繁殖是眾所周知的。見組織培養(yǎng)，學(xué)院出版社，Kruse和Patterson，eds.(1973)。
“轉(zhuǎn)化”指通過已知的方法將帶有期望的核酸的載體介導(dǎo)入宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的方法，其依賴于宿主細(xì)胞的類型，包括電刺激轉(zhuǎn)化；用于轉(zhuǎn)化的氯化鈣，氯酸銣磷酸鈣，DEAE-右旋糖苷，或其他試劑；微注射轟擊；脂質(zhì)體；感染(載體是一種感染性的試劑)；及其他方法。一般地，見Sambrook等。(1989)和Ausubel等(ed)，(1987).上述核酸轉(zhuǎn)入的參照細(xì)胞也包括這些細(xì)胞的子代細(xì)胞。
當(dāng)轉(zhuǎn)化入一個合適的宿主細(xì)胞，如，E.coli或COS-7，通過這里所述的方法可以檢測到融合蛋白的表達(dá)。例如，基于鑒定連接了融合蛋白的載體蛋白，可以通過對培養(yǎng)上清或細(xì)胞裂解物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，熒光，或比色分析來測定聚合多肽的存在情況。
通過酶切完整聚合多肽可以制備整個分子的特定聚合多肽片段。蛋白水解酶的例子包括，但不局限于，胰島素，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，血纖維蛋白溶酶，凝血酶。完整聚合多肽可以同時，或分別與一種或多種蛋白酶反應(yīng)?？蛇x地，或另外，完整的聚合多肽還可被二硫化物去除試劑進(jìn)行處理。通過此領(lǐng)域中所知的方法，多肽可以被相互分離，包括但不局限于，凝膠過濾色譜層析，凝膠電泳，和反相HPLC。
通過大量的熟知的生產(chǎn)抗體的方法，可以制備抗體，例如，多克隆抗體和單克隆抗體。抗體可從許多物種中被激發(fā)并分離，如雞，老鼠(mouse)，老鼠(rat)，兔子，山羊，綿羊，馬，駱駝，猴子和人類。生產(chǎn)單克隆抗體的典型的方法，包括，用設(shè)計好的免疫原注射宿主動物，通常是老鼠。在某一方面，蛋白的集合物被用于注射，如一些融合蛋白，另一方面，一些核酸的集合物被用于注射，這些核酸編碼蛋白，例如融合蛋白，其每一個融合蛋白包括了目標(biāo)蛋白的至少一部分及一個載體蛋白。在某一特別方面，宿主是一種嚙齒動物，例如，老鼠。如在U.S.Pat.No.5721.122中所述，作為一種例子，用于免疫的老鼠可以是“零-抗原”。
在某一方面，宿主是一種轉(zhuǎn)基因動物，其帶有人類免疫球蛋白位點.例如，轉(zhuǎn)基因動物可以是包含了人免疫球蛋白基因的老鼠，其內(nèi)生免疫球蛋白基因已經(jīng)被部分或完全地抑制活性。通過應(yīng)答，在轉(zhuǎn)基因宿主中觀察到人類抗體的產(chǎn)生，其在所有方面與人類中觀察到的(抗體)十分相似，包括了基因重排，裝配，抗體庫.這些方法在以下專利，例如，U.S.Pat.Nos.5545,807；5545,806；5569,825，5625,126；5633,425；5661,016，及下列發(fā)表刊物Marks etal.，Bio/Technology 10779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature 368812-13(1994)；Fishwildet al.，Nature Biotechnology 14845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14.826(1996)；Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)中有所闡述。
一種或多種抗原可以通過運用各種不同的方法免疫宿主動物。例如，通過皮下，肌肉內(nèi)，皮內(nèi)，靜脈內(nèi)，并且/或者腹膜內(nèi)的注射。此外，淋巴器官，腿彎部的淋巴結(jié)，并且/或者腳墊內(nèi)的注射也是可行的。分別地并且/或者同時地聯(lián)合運用兩種或更多不同的免疫途徑，對于動物免疫可能是更適合的。
用于宿主動物免疫的融合蛋白的用量，例如，可以在0.01ug-250ug之間，1ug-100ug之間是比較合適的用量?？蛇x地，用于宿主動物免疫的編碼融合蛋白集合物的核酸的用量，例如，可以在0.01ug-100ug之間，1ug-25ug之間是比較合適的用量。例如，一只老鼠可注射10ug蛋白或10ug核酸。
在一特定方面，一只宿主動物可以注射三種或更多不同的蛋白，如融合蛋白，或其編碼核酸，例如，至少3，10，30，100，300，或1000種不同蛋白或核酸或其聯(lián)合物。在此項發(fā)明中的某一方面，一種宿主動物注射了包含2或更多不同蛋白或編碼蛋白的核酸的混合物，可選地，還包含生理可接受的稀釋液，如PBS或其他緩沖液。更適宜地，用于制備混合成分的融合蛋白已經(jīng)至少經(jīng)過一步的純化過程。
這里所述的方法容許生產(chǎn)特異針對鑒定了的表位的抗體。更適宜地，被抗體識別的用于制備抗體的抗原，其氨基酸數(shù)量具有最少值，例如，至少具有6個氨基酸長度?？乖部芍辽倬哂?0，15，20，50，100個氨基酸長度。因此，抗原的氨基酸長度可以在6到15或8-12的范圍。此外，針對線性表位(連續(xù)的氨基酸)的抗體，針對三維結(jié)構(gòu)表位，例如，非線性表位，也可以通過例如，基于蛋白質(zhì)結(jié)晶數(shù)據(jù)的方法進(jìn)行制備。含有蛋白期望區(qū)域重疊序列的聚合多肽可以用于注射宿主。例如，短抗原(或多肽抗原)可以被設(shè)計成某蛋白質(zhì)氨基酸線性序列的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，或蛋白質(zhì)氨基酸線性序列的交錯形式。包含期望目標(biāo)蛋白的不同長度的多肽，也可以用于注射宿主動物。在抗體集合物中，期望至少有一種抗體可以和自身抗原全長或部分區(qū)域相結(jié)合。具備生物抑制功能的抗體或中和抗體也可以期望通過這里所述的方法進(jìn)行鑒定。
短抗原的集合物，例如，具備某一表位的長度，可以(基于一個目標(biāo)蛋白)被設(shè)計并用于注射宿主。可選地，具備不同蛋白序列的短抗原的集合物也可注射入一個宿主。
某一方面，可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)異構(gòu)體抗體，如外顯子結(jié)合點特異抗體。這些抗體可以針對短肽序列，其存在于(1)一種特殊的蛋白質(zhì)異構(gòu)體外顯子中，(2)跨越特殊蛋白質(zhì)異構(gòu)體的外顯子-外顯子區(qū)域(3)跨越一個外顯子刪除位點。由于其特異針對一種特殊的異構(gòu)體，這些短序列稱為“標(biāo)記表位”?！皹?biāo)記表位”可由非線性氨基酸序列構(gòu)成三維表位形式。它可以，例如，代表了一種三維表位，其代表目標(biāo)蛋白質(zhì)異構(gòu)體的一種構(gòu)象特征，而這種構(gòu)象特征在目標(biāo)蛋白質(zhì)其他異構(gòu)體中未有出現(xiàn)。
在抗體集合物中鑒定針對某一蛋白質(zhì)異構(gòu)體的抗體的示范方法包括(1)提供彼此不同的抗體集合物，其中至少有一種抗體可特異結(jié)合融合蛋白，該融合蛋白至少包含了蛋白質(zhì)異構(gòu)體的一部分區(qū)域，并連接了一個載體蛋白；(2)將抗體集合物與某一固相表面相連，得到覆蓋了抗體集合物的固相表面，不同的抗體結(jié)合在此固相表面上的不同位置，(3)將覆蓋了抗體集合物的固相表面與融合蛋白相連，(4)執(zhí)行一項可鑒定載體蛋白存在情況的實驗方法，若存在載體蛋白則表面存在有針對某一蛋白質(zhì)異構(gòu)體的抗體。
在注射了編碼期望蛋白的核酸集合物后的不同時期，可以通過檢測被注射動物的血清，判斷源自這些核酸的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生情況。用于檢測的方法將依賴于該蛋白是否連接有載體蛋白，以及載體蛋白的類型。在某一方面，載體蛋白是分泌性堿性磷酸酶(SEAP)。檢測SEAP融合蛋白或其他產(chǎn)物的方法包括從被注射動物靜脈中抽取血液樣本，血清經(jīng)鹽溶液稀釋。SEAP融合蛋白的水平可以通過檢測加入堿性磷酸酶底物后其激發(fā)的信號的方法進(jìn)行檢測。商業(yè)化的SEAP利用方法包括，但不僅限于Clontech’s Great EscAPcTMSEAP方法。其他融合蛋白的分析方法包括，但不僅限于一些商業(yè)化的方法，色度，半乳糖苷酶熒光或化學(xué)發(fā)光底物，HRP，內(nèi)酰胺酶和lusiferase。這些方法擅長于抗體的高通量篩選。
當(dāng)最初的反應(yīng)較弱時，需要間隔性地加強免疫動物，直到抗體滴度升高或穩(wěn)定。免疫后，(實驗取血)獲得樣本血清，以檢測特異抗體的產(chǎn)生。更適宜地，從宿主動物分離免疫細(xì)胞的前3-5天再給予最后一次免疫追加。
通過篩選，可以從被注射動物中得到針對一個目標(biāo)蛋白的短抗原或針對各種目標(biāo)蛋白的抗體。所制備的針對一個多肽的抗體可以測試其與多肽以及自身目標(biāo)蛋白的活性?？贵w與多肽和/或自身目標(biāo)蛋白的親和力可以至少為10-6M，10-7M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M，10-12M。
單克隆抗體可以通過雜交瘤方法制備，最初在Kohler et al.，Nature，256495(1975)中闡述。如前所述，在雜交瘤方法中，生產(chǎn)抗體或具備抗體生產(chǎn)能力的脾細(xì)胞可以從被免疫的動物中獲得。運用合適的“融合試劑”，如聚乙二醇或仙臺病毒，這些細(xì)胞可以和骨髓瘤細(xì)胞融合，從而形成雜交瘤細(xì)胞。(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中生長，其中含有可地恰當(dāng)?shù)匾种莆慈诤系母复撬枇黾?xì)胞的生長或存活的物質(zhì)。例如，如果父代骨髓瘤細(xì)胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，那么雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中可特別包含次黃嘌呤，氨喋呤，和胸(腺嘧啶脫氧核)苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)可抑制HGPRT-缺失細(xì)胞的生長。
首選的骨髓瘤細(xì)胞是那些可高效地融合，為已選擇的抗體生產(chǎn)細(xì)胞提供高水平的穩(wěn)定的抗體生產(chǎn)能力，及對HAT等培養(yǎng)基敏感。在這之中，首選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤細(xì)胞，如美國加利福尼亞州圣地亞哥Salk細(xì)胞分配中心提供的MOPC-21和MPC-11鼠腫瘤，和美國弗吉尼亞洲馬納薩斯的American TypeCulture Collectailable提供的P3X63AgU.1，SP-2，X63-AG8-653細(xì)胞。210-RCY3.Ag1.2.3鼠骨髓瘤細(xì)胞系也是適用的。人骨髓瘤和鼠-人無限骨髓瘤細(xì)胞系在人單克隆抗體生產(chǎn)中已有敘述(Kozbor，j.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applicaations，pp.51-63(maredl Dekker，Inc.，New York，1987))可選擇地，可以通過其他方法從被免疫動物的免疫細(xì)胞中制備雜交瘤細(xì)胞系，例如，通過一種病毒(如，Epstein Barr病毒)或一種癌基因作用于免疫細(xì)胞使之無限生長，從而獲得生產(chǎn)期望的單克隆抗體的無限生長細(xì)胞系。見Babcook et al.PNAS(USA)，937843-7848(1996)，涉及將來源于產(chǎn)生特異單克隆抗體細(xì)胞的免疫球蛋白cDNAs進(jìn)行克隆，從而生產(chǎn)單克隆抗體，而其他生產(chǎn)單克隆抗體的策略為使用被免疫動物的免疫細(xì)胞。
產(chǎn)生抗體的細(xì)胞隨之通過篩選，鑒定出那些產(chǎn)生針對期望蛋白的抗體的細(xì)胞。篩選那些與已經(jīng)進(jìn)行動物免疫的每一個抗原結(jié)合的抗體的工作，通常在培養(yǎng)上清和/或純化抗體中進(jìn)行，例如，從這里敘述的源自融合過程的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中。
在某一方面，將要測定的單克隆抗體可以于一個固相連接，例如，包含蛋白A，蛋白A瓊脂糖(凝膠)，或其他蛋白A絡(luò)合物，蛋白G，蛋白G瓊脂糖(凝膠)，或其他蛋白G絡(luò)合物。通常在多孔板中篩選生產(chǎn)抗體的細(xì)胞。固相表面與抗原連接?？蛇x地，在測定的單克隆抗體與固相結(jié)合之前，抗體-抗原復(fù)合物可以通過免疫沉淀反應(yīng)形成。當(dāng)抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合到固相表面是，未結(jié)合的抗原可以通過沖洗除去，從而可以通過測定抗原來鑒定陽性結(jié)果。
在某一方面，可以包含一個載體蛋白。在這種情況下，可以通過測定載體蛋白的試劑來測定與抗體結(jié)合的抗原的存在情況。例如，載體蛋白可以通過使用一種特異結(jié)合載體蛋白的試劑，如一種抗體來測定。如果這種載體蛋白是一種酶或其具備酶活性的配基，該載體蛋白的測定可以通過酶學(xué)方法進(jìn)行。相應(yīng)地，可以根據(jù)此領(lǐng)域中已知的方法，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光方法，熒光方法，或比色方法。
當(dāng)生產(chǎn)抗體雜交瘤細(xì)胞期望的特異性，親和力和/或活性經(jīng)鑒定后，單細(xì)胞克隆可以通過有限稀釋方法進(jìn)行亞克隆(Goding，Monoclonal antibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))；單細(xì)胞通過挑選進(jìn)行克隆，或在軟瓊脂上生長進(jìn)行克隆(Harlow and Lane，antibodiesA laboratory Manual ColdSpring harbor Laboratory(1988)；pps 224-227)。
雜交瘤克隆何以由標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)。用于培養(yǎng)的適合的培養(yǎng)基包括，例如DMEM或RP-1640培養(yǎng)基，雜交瘤細(xì)胞可以作為動物腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)。(Harlow and Lane，AntibodiesAlaboratory Manual Cold Spring harbor Laboratory(1988)；Chapter7)。
亞克隆分泌的單克隆抗體可以通過常用的方法從培養(yǎng)基，腹水，血清中分離，例如G蛋白或A瓊脂糖凝膠，羥磷灰石色譜，凝膠電泳，透析，親和色譜。
針對期望抗原的抗體分離過程之后，抗體可以進(jìn)一步被利用或改良。在某一方面，嵌合體抗體被生產(chǎn)?！扒逗象w”抗體是由經(jīng)過遺傳工程改造的基因編碼的，這樣其輕鏈和重鏈基因由不同物種的免疫球蛋白基因片段構(gòu)成。例如，鼠單克隆抗體基因可變(V)片段，例如這里所述方法得到的，可以和人恒定(C)片段相連接。這樣的嵌合體抗體對于人的抗原性可能比具有鼠恒定區(qū)和鼠可變區(qū)的抗體低。
這里使用的術(shù)語，人工化抗體(HuAB)指一種嵌合體抗體，其結(jié)構(gòu)與人類結(jié)構(gòu)具有充分的同一性(例如至少85％)，具有從非人源抗體中獲得的CDRs，并其任何恒定區(qū)中至少85-90％，更適宜地，95％的多肽序列與人免疫球蛋白恒定區(qū)相一致。見示例，PCT出版WO90/07861和歐洲專利號0451216。因此，一個HuAb的所有部分，除了CDRs，都與一個或多個人免疫球蛋白序列對應(yīng)部分具有充分的同一性。這里使用的術(shù)語“結(jié)構(gòu)區(qū)域”，指免疫球蛋白輕鏈和重鏈上可變區(qū)域的部分，其(與CDR’s不同)在同一物種的不同免疫球蛋白中是相對保守的，見kabat，et al.(1987)Esequences of Proteins of Immunologic Interest，4thEd.，USDept.Health and Human Servieds。
根據(jù)已知的方法，可從大量人細(xì)胞，但首選免疫B細(xì)胞中分離人類恒定區(qū)域的DNA序列。根據(jù)已知的方法，生產(chǎn)人類抗體的可變區(qū)域或CDRs可以從與此區(qū)域結(jié)合的單克隆抗體中分離，單克隆抗體可從任何方便的哺乳動物資源，包括老鼠，老鼠，兔子或其他可生產(chǎn)抗體的脊椎動物中產(chǎn)生。
用于DNA測序和表達(dá)并分泌抗體的細(xì)胞可以充許多地方得到，如American type culture collection(“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”5thedition(1985)Rodkville，Md.，USA)。在上述提到的獲得抗體的方法(通過一種或多種抗原免疫動物)以外，還有其他合適的生產(chǎn)抗體的方法。Cole et al.和Boerner et al.提供的技術(shù)也可以用于制備人單克隆抗體。(Cole et al.，Monoclonal antibodies and Cancer therapy，Alan r.Liss，p.77(1985)andBoerner et al.，J.Immunol.，147(1)86-95(1991))。
在某些方面，抗體文庫，其中每一個抗體對應(yīng)于編碼其的核酸，如噬菌體顯示系統(tǒng)，被用于高通量篩選對應(yīng)一種或多種抗原的抗體。在某種特定情況下，一種或多種抗原，如目標(biāo)蛋白的配基，與固相表面上的一個或多個突起或延伸相連接，其中不同的抗原與不同的突起相連。固相表面可以具有眾多突起，例如，至少為2，5，10，25，50，100，300，1000，或3000個突起。帶有突起集合物的固相表面稱之為“多突起表面”。固相表面可以是具有大量突起的平板。連有突起的固相表面的一個示例是那些做成適合于承載的模式，如多孔板。商業(yè)性公司如Nelge NUNC或V&P Scientific，Inc.，可以提供或制造連有突起的固相表面。蛋白和融合蛋白可以通過合成或重組的方法進(jìn)行制備，例如，在COS細(xì)胞中表達(dá)。根據(jù)此領(lǐng)域中已知的方法，可以將蛋白質(zhì)與固相表面進(jìn)行連接。例如，固相表面可以被抗生物素蛋白，鏈菌素抗體，鎳，谷氨酸鹽抗-標(biāo)志抗體或抗-人Fc抗體覆蓋。接著固相表面可以被抗體文庫覆蓋，例如，噬菌體顯示文庫，其中每一個抗體對應(yīng)于編碼該抗體的核酸。結(jié)合一段時間，有效形成或產(chǎn)生抗原-抗體復(fù)合物。接著沖洗以去除未連接的抗體，將置于一多孔容器上，使每一個突起或延伸都處于容器的不同孔中。根據(jù)此領(lǐng)域中已知的方法，通過酸溶液洗滌，抗原或抗原/抗體復(fù)合物可以從固相表面上分離下來，并進(jìn)入的孔中。更多的抗體可以從對應(yīng)該抗體的編碼核酸中生產(chǎn)出來，例如噬菌體。這個方法可以重復(fù)多次。一個多孔容器可以含有12，24，48，96，384，1536個孔。其他可利用的固相表面包括多孔容器或珠子(例如Dynabeads)，其中，抗原存在于不同的孔或珠子上。這里包括了以此目的設(shè)計的，并可選擇地連接抗原的固相表面。
用于此方法的抗原可以由連接或未連接載體蛋白的蛋白質(zhì)構(gòu)成。當(dāng)載體蛋白與抗原相連時，抗原/抗體復(fù)合物的檢測可以通過檢測載體蛋白的存在情況進(jìn)行?？蛇x地，載體蛋白可以用于使抗原和固相表面相連。當(dāng)使用載體蛋白時，應(yīng)排除抗體僅和載體蛋白反應(yīng)的情況，例如，將文庫覆蓋于已經(jīng)予連接載體蛋白的固相表面。
一種包括了篩選噬菌體顯示文庫的方法的某一方面在圖1中有所闡明。
抗體文庫，例如，噬菌體顯示文庫，可以從自身的人源文庫或疾病關(guān)聯(lián)文庫中分離的核酸中制備。Hoogenboom和Winter對噬菌體顯示文庫進(jìn)行了進(jìn)一步闡述，J.Mol.Biol.，227381(1992)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581(1991)。制備噬菌體文庫的適合方法已經(jīng)有所綜述和闡明，見Wnter et al.，Annu.Rev.Immunol.，12433-55(1994)；Soderlind et al.，Immunological Reviews，130109-123(1992)；Hoogenboom.Tibtech February 1997，Vol.15；Neri et al.，Cell Biophysics，2747-61(1995)。單鏈抗體文庫的制備方法也有論述，見WO92/01047，WO92/20791，WO93/06213，WO93/11236，WO93/19172，WO95/01438，WO95/15388?？贵w文庫也有商業(yè)化的供應(yīng)，例如，劍橋抗體技術(shù)(C.A.T)，英國劍橋。
抗體純化的方法是此領(lǐng)域中所熟知的。見，Hriow和lane(1988)antibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.純化方法包括鹽沉淀(例如，銨鹽)，離子交換色譜(例如，在陽離子或陰離子交換色譜柱上，以中性PH開始并以離子強度逐漸加強的梯度洗脫)，凝膠過濾色譜(包括凝膠過濾HPLC)，和親和樹脂色譜，例如蛋白A，蛋白G，羥磷灰石，抗-抗體?？贵w還可以通過此領(lǐng)域中熟知的方法進(jìn)行親和柱純化。
這里敘述的方法也可以用于“表位篩選”(作為一種示范方法，見圖2，)。在某一方面，生產(chǎn)蛋白，如融合蛋白的表達(dá)載體上包含的寡聚核酸，具有特異目標(biāo)蛋白的短重疊和交錯序列。表達(dá)載體可以導(dǎo)入宿主以產(chǎn)生抗體，則可以鑒定受限于生產(chǎn)的抗體的表位。例如，免疫宿主中得到的血清可與融合蛋白相作用，測定對應(yīng)于每個融合蛋白的抗體的總量。在特定情況下，編碼多肽的寡聚核酸或多肽可以用于免疫宿主，包含多肽和載體蛋白的融合蛋白被用于血清篩選。方法還包括從被免疫宿主中制備單克隆抗體，并用包含載體蛋白的融合蛋白篩選單克隆抗體。
短重疊氨基酸序列也可以通過化學(xué)合成，并與一個載體蛋白相連。這些融合蛋白可用于覆蓋固相表面的多-突起板，隨后用抗體文庫，例如噬菌體顯示文庫，進(jìn)行覆蓋。掃描區(qū)域上每一個表位的抗體可以從抗體文庫中被分離，并用于中和或“抑制功能”活性試驗。
抗體可以作為，例如抑制抗體，被使用。此外，序列的混合物，根據(jù)分離出抗體或未分離出抗體的情況，可以表明表位在目標(biāo)蛋白上的位置。蛋白質(zhì)上的表位定位信息可以用于生產(chǎn)治療劑，例如小分子。這也可以應(yīng)用于，例如，測定受體胞外區(qū)域上的表位位置，例如G蛋白結(jié)合受體(GPCRs)。此方法也可用于制備GPCRs抑制抗體，包括趨化因子和激素受體。
在有些情況下，檢測針對目標(biāo)蛋白表位的方法包括(1)提供編碼眾多融合蛋白的核酸，其中每種融合蛋白包含目標(biāo)蛋白和載體蛋白的6-15或8-12個氨基酸多肽，而這些多肽又包含不同序列的目標(biāo)蛋白。(2)給動物宿主注射眾多融合蛋白。(3)從宿主動物中獲得血清；篩選血清檢測或確定目標(biāo)蛋白表位的抗體數(shù)量，存在針對多肽的抗體表明此抗體對應(yīng)于目標(biāo)蛋白多肽。在另一些情況下，方法包含上面(1)、(2)，(3)從宿主細(xì)胞中制備產(chǎn)生眾多單克隆抗體的細(xì)胞。(4)根據(jù)這里描述的方法篩選細(xì)胞來鑒定目標(biāo)蛋白抗體，存在針對多肽的抗體表明此抗體對應(yīng)于目標(biāo)蛋白多肽。多肽可能包含目標(biāo)蛋白的交錯序列。
這些方法，如這里描述的對于抗原與抗體綁定的探測分析，能進(jìn)一步用于篩選抗體組。在某些方面，抗體組與測試蛋白(如，血清，細(xì)胞或組織蛋白)一起在抗原/抗體復(fù)合物能夠形成的條件下孵育。(見圖3)沒有綁定的蛋白質(zhì)被洗去。然后，抗體組與包含多肽的融合蛋白接觸，如綁定抗體組其中之一抗體并連接載體蛋白(如，SEAP)的多肽。在洗脫未綁定蛋白后，探測載體蛋白(如，通過增加堿性磷酸酶基質(zhì))，可讀取抗體組。讀取抗體組特定區(qū)域是陽性將表明無多肽-載體蛋白的抑制綁定蛋白質(zhì)被加入，并且測試的樣品不包含由特定抗體識別的蛋白質(zhì)。因此，在樣品中，越少的載體蛋白被特定抗體檢測，則越多被抗體識別的蛋白質(zhì)存在。
與靶標(biāo)疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的成分特定綁定與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的藥劑能用于治療和診斷的目的。這種藥劑可以綁定由外顯子編碼且僅存在于mRNA中編碼疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的蛋白質(zhì)的一個區(qū)域，如由相同基因編碼，在正常蛋白質(zhì)中并不存在。這種藥劑可以綁定包含外顯子結(jié)合點的且僅存在于mRNA中編碼疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的蛋白質(zhì)的一個區(qū)域。藥劑可以是綁定與疾病相關(guān)的蛋白特定區(qū)域的任何分子或分子絡(luò)合物(或化合物)。
藥劑可以是與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的拮抗物或抑制劑，如與疾病相關(guān)的結(jié)合表位的拼接變異體的拮抗物或抑制劑。抑制劑可能先前并不知道或先前以為是疾病特定表位拼接變異體的抑制劑。抑制劑可能已經(jīng)被測定為疾病特定表位拼接變異體的抑制劑。這種拮抗物或抑制劑可以被用于治療或阻止與特殊拼接變異體相關(guān)的疾病，將進(jìn)一步在這里被描述。
判斷藥劑是拮抗物或抑制劑的方法，包括用疾病的細(xì)胞或動物模型的方法，如包括將癌細(xì)胞的移植入裸鼠。
藥劑可能是一種先前不知道的綁定疾病相關(guān)表位的蛋白質(zhì)。例如，它可以是一種先前未知的抗體或先前未知的綁定表位的抗體。藥劑可以是已經(jīng)被測定的綁定疾病相關(guān)蛋白表位的藥劑。藥劑可以是由這里描述的任何方法鑒定的藥劑。
在某些方面，藥劑是一種抗體，其中的片段或其中的派生物，如嵌合的或乳化的抗體。抗體可以根據(jù)這一領(lǐng)域已知的或這里描述的方法獲得。綁定特定疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的抗體將進(jìn)一步在這里被描述，如疾病相關(guān)的表位可能包含一個外顯子結(jié)合點。
抗體可以綁定特定的疾病相關(guān)蛋白異構(gòu)體，如在表1中描述的那些?？贵w可以是綁定特定的疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體的表位，如在表1中描述的那些。
已經(jīng)被證明與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體可以通過如下數(shù)據(jù)庫確定PubMed(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/)，PubMed Central(http//www.pubmedcentral.nih.gov/about/intro.html)，OMIM(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝OMIM)，PROW(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PROW/)。
一旦被鑒定，疾病相關(guān)異構(gòu)體的序列可以從基因庫得到(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/GenbankSearch.html)。表1列出了與疾病相關(guān)蛋白異構(gòu)體的例子和異構(gòu)體的基因庫編號。
表1疾病相關(guān)的異構(gòu)體蛋白示例
表2疾病相關(guān)的病毒蛋白示例
于不同蛋白質(zhì)異構(gòu)體相關(guān)的疾病的示例包括，但不僅限于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病，急性骨髓白血病(AML)，慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)，卵巢癌，前列腺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，黑色素瘤，肺癌，腎癌，肌肉萎縮癥，神經(jīng)精神異常，常染色體多囊腎病(ADPKD)，心血管疾病，阿爾茨海默氏病。與肺癌和結(jié)腸癌相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)165和VEGF121(見示例和圖5)。膀胱，乳腺，卵巢和肺癌相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體包括HER2異構(gòu)體1和HER異構(gòu)體2(見示例)。與許多癌癥和自身免疫疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體包括CD44異構(gòu)體CD44R1，CD44v5，CD44v7，CD44v3(見示例和圖6)。
疾病相關(guān)的表位可以包含僅在疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體中表達(dá)的，該外顯子不在正常蛋白質(zhì)中，例如不與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)中表達(dá)。這些多肽的氨基酸序列包含了疾病相關(guān)外顯子結(jié)合點，并在表3中列出。
表3疾病相關(guān)多肽的氨基酸序列
“/”指外顯子結(jié)合點處。
試劑也可以是一種蛋白質(zhì)(除了抗體以外)，一個多肽或其派生物或類似物，如擬肽。鑒定例如蛋白質(zhì)，多肽或其他分子或重組分子等試劑的方法在此領(lǐng)域中是熟知的。
其他針對疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體的試劑包括那些抑制疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體的生產(chǎn)的物質(zhì)。例證性的試劑包括小干擾RNAs(siRNAs)或核酸，反義核酸，核酸酶，三重核酸密碼子，顯性負(fù)性突變，小干擾RNAs(siRNAs)或核酸，反義核酸，核酸酶，三重核酸密碼子可以針對那些編碼只存在于疾病相關(guān)蛋白質(zhì)中的配基的核酸序列，該配基在同樣基因編碼的正常蛋白質(zhì)中不存在。例如，這些試劑可以針對一種核酸序列，其中的外顯子只存在于疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體中，而不存在于正常蛋白中。它們也可以針對那些跨越了外顯子-外顯子結(jié)合點區(qū)域，并特異對應(yīng)于疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體的核酸序列。
siRNA分子可以包含一種核酸序列，本質(zhì)上由存在于與疾病相關(guān)的拼接變異體中的一個序列組成，但不存在于相同基因的與疾病無關(guān)的拼接變異體中。例如，siRNA分子可以包含一種核酸序列包含或本質(zhì)上由列出的SEQ ID NOs1(VEGF 165特定核酸序列)，SEQ ID NOs3(VEGF 121特定核酸序列)，SEQ ID NOs5或7(Her2拼接變異體特定核酸序列)序列組成?；蛉魏尉幋a多肽的核酸序列SEQ ID NOs2，4，6，8，10，11，13，或15-25。
siRNA分子可能包含兩條鏈，每條鏈原則上包含至少相互互補的核酸序列。這種序列原則上對應(yīng)于疾病相關(guān)的拼接變異體序列，作為siRNA“正義序列”或更常見地作為“正義目標(biāo)序列”被提及并且這種序列原則上作為補充序列，作為siRNA“反義序列”或“反義目標(biāo)序列”被提及。正義和反義目標(biāo)序列可以是15-30左右的連續(xù)分子長；19-25左右的連續(xù)分子長；19-23左右的連續(xù)分子長或大約19，20，21，22或23左右分子長。正義和反義序列的長度由這種情況決定，具有上述長度的正義和反義靶標(biāo)序列的siRNA能抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，更適宜地，并不顯著引發(fā)宿主的干擾反應(yīng)。
siRNA的正鏈目標(biāo)序列可以是至少與目標(biāo)基因部分“本質(zhì)上相同”或“充分地相同”，如至少有95％，98或99％相同，提供的siRNA包含的序列可以干擾基因序列的表達(dá)。
正鏈目標(biāo)序列的核酸堿基構(gòu)成可以是約50％的腺腺嘌呤(As)和胸腺嘧啶脫氧核苷(Ts)和50％的胞嘧啶(Cs)和鳥嘌呤(Gs)。可選地，堿基的構(gòu)成中Cs/Gs的含量也可以至少為50％，例如含60％，70％，80％的Cs/Gs。相應(yīng)地，正鏈目標(biāo)序列的選擇將基于核酸的堿基構(gòu)成。關(guān)于siRNA對于目標(biāo)核酸的可及性，以下的方面是應(yīng)考慮的，例如Lee等在Nature Biotech.(2002)19500中描述的。此項應(yīng)用包括寡核酸鏈的使用，其作為探針可與目標(biāo)蛋白互補，以測定底物的可及性，例如在細(xì)胞提取物中。當(dāng)與寡聚核酸探針形成二聚體后，該底物對于RNase H敏感。因此，通過(例如PCR)測定RNase H對于給定探針的敏感性，反映了選擇位點的可及性，并可能體現(xiàn)相應(yīng)的siRNA對于抑制目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄能力的預(yù)測值。可以通過算法來鑒定引物，用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法或者用于鑒定反義寡聚核酸以鑒定首個目標(biāo)序列。
正鏈和反鏈目標(biāo)序列是合適地、高效互補的，siRNA包含的兩條序列可以抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，例如，可介導(dǎo)RNA干擾。作為示例，該序列在期望的條件下可以高效地互補從而形成雜交鏈，例如在一種細(xì)胞中。相應(yīng)地，正義鏈和反義鏈目標(biāo)序列可以至少為95％，97％，98％，99％或100％同一性，例如，至少有5，4，3，2，1，或0個核酸的不同。
正義鏈和反義鏈靶序列是一些合適的序列，除了目標(biāo)核酸或其互補鏈，它們可能不與其他序列相互作用。這一點可以通過以下例子證實，將選擇的序列和其他目標(biāo)細(xì)胞基因組的序列進(jìn)行比較。序列比較可以通過此領(lǐng)域中的方法進(jìn)行，例如運用BLAST運算方法，在此將進(jìn)一步闡述。當(dāng)然，還可以進(jìn)行小范圍的試驗，以驗證特異的首個目標(biāo)序列可以特異抑制目標(biāo)核酸，而非其他基因的表達(dá)。
除了正義鏈和反義鏈以外，siRNA還可以包含其他序列。例如，siRNA可以由兩股RNA構(gòu)成的RNA雙鏈，其中至少一股鏈具有3’突出端。另一股鏈可以是平末端或具有突出端。當(dāng)RNA分子由雙鏈構(gòu)成，并且每條鏈都包含突出端的情況下，兩條鏈的突出端可以是同樣長度或不同長度。在一特別情況下，siRNA包含正義鏈和反義鏈序列，其每一條序列存在于一條RNA鏈上，并由約15-30，例如19-25個成對核酸構(gòu)成，并在RNA3’端具有1-3個，更常見為2個核酸構(gòu)成的突出端。為了進(jìn)一步提高此發(fā)明涉及的RNA的穩(wěn)定性，3’突出端可以增加抵抗降解的能力。在某一方面，加入嘌呤核苷酸，例如腺嘌呤或鳥嘌呤，可以加強RNA的穩(wěn)定性?？蛇x地，通過嘧啶替換形成改良的類似物，例如將2個尿嘧啶核酸形成的3’突出端替換成2’胸腺嘧啶，可以增強siRNA的穩(wěn)定性，并不會影響其效力。在組織培養(yǎng)液中，2’羥基的缺失可以增強核酸突出端的穩(wěn)定性。SiRNA的RNA鏈擁有5’磷酸基和3’羥基。
在某一方面，siRNA分子包含兩條RNA鏈，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。在另一情況，siRNA分子由一條RNA鏈構(gòu)成，形成發(fā)卡環(huán)，其中正義鏈和反義鏈靶序列進(jìn)行雜交，并且在兩個序列間是一段空間結(jié)構(gòu)，有效地形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)環(huán)。空間序列可以包含任何長度的任何核酸聚合物，具有此序列的空間結(jié)構(gòu)連接的兩條互補寡聚核酸可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，其中至少空間結(jié)構(gòu)的一部分可在發(fā)卡的近端形成環(huán)結(jié)構(gòu)。例如，空間序列可以是3到30個核酸，或3到20個核酸，或5到15個核酸，或5到10個核酸，或3到9個核酸。該序列可以包含任何序列，只要不干擾發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。特別地，空間序列最好不應(yīng)包含第一或第二靶序列的重要同源物，因其可以干擾發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成?？臻g序列也不宜于其他序列相似，例如將要引入核酸的細(xì)胞基因組序列，因這將在細(xì)胞中造成不良情況。
具備此領(lǐng)域中一般技術(shù)的人可以理解，當(dāng)特指一個核酸時，例如RNA，此RNA可以包含自然發(fā)生的核酸或其派生物，只要該派生物可以增強核酸的穩(wěn)定性。任何派生物都是可接受的，只要該核酸能夠具備所期望的功能。例如，siRNA可以包含核酸派生物，只要該siRNA仍能夠抑制靶基因的表達(dá)。
例如，siRNA可以包含一個或多個改良的堿基，和/或一個為了增強穩(wěn)定性或其他原因而改良的主鏈。例如，自然RNA的磷酸二酯鍵可以被改良，從而至少包含氮或硫原子中的一種。此外，磷酸二酯包含不常見的堿基，如次黃(嘌呤核)苷，或改良堿基如三苯甲基化堿基，作為兩個例子，在此發(fā)明中也可以被使用。對RNA的大量的改良提供了許多有用的效果，并作為此領(lǐng)域中的技術(shù)被熟知。這里使用的術(shù)語“siRNA”包含了如化學(xué)的，酶的或代謝的siRNA的改良形式，它們是從內(nèi)源模板演化而來。
合成和純化siRNA的方法是此領(lǐng)域中所熟知的。介導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞的方法也是此領(lǐng)域中所熟知的。SiRNA可以通過細(xì)胞外的介導(dǎo)進(jìn)入體腔，空隙，哺乳動物循環(huán)系統(tǒng)，或通過口服。口服介入的方法包括直接將RNA和哺乳動物的食物混合，或通過工程技術(shù)，將經(jīng)工程改造后可表達(dá)RNA的物種作為食物，然后喂食給實驗動物。例如，食用細(xì)菌，如乳酸乳球菌，可以通過轉(zhuǎn)化生產(chǎn)dsRNA(間WO93/17117，WO97/14806)。血管或血管外環(huán)境，血液或淋巴系統(tǒng)即腦髓液也是注射RNA的位點。
siRNA也可以在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)，例如來源于編碼siRNAs的載體。此類載體在以下有所論述，例如，Paul et al(2002)NatureBiotechnology 29505；Xia et al.(2002)Nature Biotechnology 201006；aeng et al.(2002)Mol.Cell 91327，thijn et al.(2002)Science 296550；BMCBiotechnol.2002 Aug 28；2(1)15；Lee et al.92002)Nature Biotechnology 19500；mmccmcanus et al.92002)RNA 8842；Miyagishi et al.(2002)Nature Biotechnology 19497；Sui et al.(2002)PNAS 995515；Yu et al.(20020PNAS 996047；Shi et al.(2003)Trends Genet.19()9；Gaudilliere et al.(2002)J Biol Chem.277(48)45442；US2002/0182223；US 2003/0027783；WO 01/36646；WO03/006477。也有商業(yè)化的載體供應(yīng)。例如，pSilencer可從Gene Therayp Systems，Inc.獲得，pSUPERRNAi系統(tǒng)可從Oligoengine獲得。
反義鏈核酸，核酸酶，及三重核苷酸可以作為siRNAs作用于基因上的同樣區(qū)域。制備，純化或介導(dǎo)這些核酸進(jìn)入細(xì)胞或物體的方法是此領(lǐng)域所熟知的。
在某一方面，一種試劑，如一個小分子，是通過合理的藥物設(shè)計而被鑒定的。該方法使用三維坐標(biāo)資料庫，其中包含蛋白質(zhì)疾病相關(guān)異構(gòu)體的至少一個配基，如蛋白質(zhì)疾病相關(guān)異構(gòu)體特異的表位。合理的藥物設(shè)計方案包括計算機相關(guān)的方法，來鑒定結(jié)合蛋白質(zhì)表位的試劑，包括(1)提供一個計算機模型應(yīng)用軟件，一套分子或分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，分子或分子復(fù)合物包含表位上的至少一個配基；(2)提供一個計算機模型應(yīng)用軟件，一套試劑或化學(xué)物的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)；(3)測定化學(xué)物是否可以結(jié)合分子或分子復(fù)合物。測定是否結(jié)合分子或分子復(fù)合物的更適宜的方法，包括在化學(xué)物和分子或分子復(fù)合物之間提供一個合適的操作，通過計算機分析合適的操作的結(jié)構(gòu)，以量化化學(xué)物和分子或分子復(fù)合物之間的關(guān)聯(lián)程度。該方法包括對化學(xué)物文庫的篩選。該方法還包括提供和合成化學(xué)物，并分析其與表位的結(jié)合能力。也包括測定化學(xué)物是否是表位的抑制物或?qū)刮?，例如，通過測定化學(xué)物能否治療或預(yù)防表位相關(guān)的疾病。可選地，該方法進(jìn)一步包括了測定化學(xué)物是否適合用于診斷方法。
這里還提供了一種方法，制備結(jié)合蛋白質(zhì)的疾病相關(guān)表位的試劑，例如，通過計算機相關(guān)方法設(shè)計，并通過化學(xué)或酶合成該化學(xué)物，如上所述。
此發(fā)明還提供了一種設(shè)備，其包含了分子或分子復(fù)合物和化學(xué)物間形成的復(fù)合物的表現(xiàn)情況，如結(jié)合了的抗體。其中一種設(shè)備是在其記憶中包括了復(fù)合物表現(xiàn)情況的計算機。在某一方面，計算機包含一個可機器識別的記憶存儲介質(zhì)，其包含的數(shù)據(jù)存儲材料，是由機器識別的包含復(fù)合物的原子坐標(biāo)的數(shù)據(jù)編碼的。計算機可能還包括一個貯存處理機器可識別的數(shù)據(jù)指令的工作記憶，其主要處理設(shè)備連接工作記憶和用于處理代表復(fù)合物三維空間的機器可識別數(shù)據(jù)的機器可識別數(shù)據(jù)貯存介質(zhì)。計算機也可以包含連接顯示三維空間表示的中央處理設(shè)備的顯示。
治療的效用那些這里描述的或這里描述得到的藥劑，如抗體，可以用于疾病的治療或防治，其中該試劑，例如抗體的存在對于一個特異分子是收益的。在有些情況下，抗體用來做目標(biāo)藥劑，如作為特殊細(xì)胞的毒素。例如，可以用特定綁定癌細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)的抗體釋放的一種癌細(xì)胞毒素殺死癌細(xì)胞。在另外情況下，這種目標(biāo)抗體不綁定存在于正常細(xì)胞的蛋白質(zhì)。如，我們可以用綁定特定的疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)的異構(gòu)體或拼接變異體的抗體，如在癌細(xì)胞中本質(zhì)上僅存在于疾病的蛋白異構(gòu)體。當(dāng)然，如果異構(gòu)體出現(xiàn)在位于身體不同部位的正常組織，抗體可能會綁定該異構(gòu)體，假設(shè)目標(biāo)抗體并不殺死所有正常組織的細(xì)胞。
除了在外顯子中的疾病相關(guān)異構(gòu)體的目標(biāo)序列，藥劑(如抗體)也可以綁定并不于疾病相關(guān)的在蛋白異構(gòu)體中未發(fā)現(xiàn)的外顯子-外顯子結(jié)合點。藥劑還可以綁定并不在正常的蛋白質(zhì)異構(gòu)體中發(fā)現(xiàn)的與疾病相關(guān)的三維表位。除了綁定線性表位的藥劑之外(continguous氨基酸)，基于蛋白質(zhì)異構(gòu)體的結(jié)晶數(shù)據(jù)，綁定三維空間表位不綁定線性表位的藥劑也能被制備。
在某些情況下，單一的藥劑如抗體，被注射入病人體。在另些情況下，眾多的抗體被注射入病人體。抗體可以是針對相同抗原的不同抗體，如抗原的不同的表位，或抗體可以是針對不同抗原的抗體。特定的治療可以包括兩種計劃的結(jié)合。不同的抗體可以根據(jù)這里描述的方法來制備。如，與特定的疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)的核酸的眾多多肽，能被注射入宿主動物來制備單克隆抗體。
這里也提供包含編碼疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體的表位的核酸序列的DNA疫苗，這種疫苗可用于防治或治療如癌的疾病。表位可以是10-15或8-12個來源于疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體的線性或非線性序列的短小多肽的氨基酸殘余。表位可以橫跨兩個外顯子的連接位點，這種連接點對與疾病相關(guān)的特殊蛋白質(zhì)異構(gòu)體是唯一的，并且不存在于正常主體或疾病主體的正常組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體中。在某種特定情況下，DNA疫苗編碼兩個或更多來源于單一蛋白質(zhì)異構(gòu)體的或多個蛋白質(zhì)異構(gòu)體的表位并且可以用于這樣如特定的疾病指示的結(jié)合。DNA疫苗也可以是與載體蛋白(如血清蛋白，SEAP或其他分泌多肽或蛋白質(zhì))融合，編碼特殊序列的表位，如編碼10-15個氨基酸。DNA疫苗可用于在這里進(jìn)一步描述的疾病的防治與治療?？煞滦У?，DNA疫苗包括編碼或鑒定這里描述的多肽的核酸序列。
被綁定的蛋白質(zhì)異構(gòu)體和相關(guān)的疾病在這里進(jìn)一步被描述，如表1，2和3。
治療性的抗體也可以綁定與蛋白質(zhì)G連接的受體(GPCRS)。事實上，目前被標(biāo)記的藥物有60％綁定不同GPCRS，并且目前沒有有效的方法用于提高針對這些受體的抗體。因此，如這里所述，可制備位于那些受體胞外區(qū)域的短小序列抗體。
能被抗體綁定的致病的疾病和蛋白質(zhì)的例子包括細(xì)菌，病毒，微等離子和寄生蟲的感染。病毒包括流行性感冒病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，肝炎病毒(如肝炎病毒C)和冠狀病毒(如嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS-CoV))，引起肺結(jié)核的結(jié)核菌和引起瘧疾的瘧原蟲。
抗體可以是多克隆的或單克隆的，整個分子或分子片段。許多保留整個抗體綁定活性的抗體片段被典型地使用。這種抗體片段非限制性的包括Fab，F(xiàn)ab2，F(xiàn)ab’，F(xiàn)ab’2和單鏈Fv(scFv)。
裸露的或非絡(luò)合的，單克隆抗體能用于治療。一種可能的機制是宿主效應(yīng)機制的補充，如抗體覆蓋的腫瘤細(xì)胞單克隆抗體上具有的抗體依賴的細(xì)胞細(xì)胞毒性，和噬菌作用/白細(xì)胞郁滯。多項在動物和病人中的研究表明了當(dāng)單克隆抗體與白介素2結(jié)合并補充其功能效應(yīng)時的抗腫瘤效應(yīng)。一個示例是針對非何杰金淋巴瘤的抗CD-20抗體retuximab。
通常，另一種利用裸露單克隆抗體的機制策略是其對于惡性細(xì)胞生長和分化的抑制。這可以通過阻止腫瘤生長和分化刺激分子的通路而完成。示例包括herceptin(赫賽汀)和抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體C-225。
抗體或其片段可以和一種檢測標(biāo)簽相聯(lián)合，連接，匹配，結(jié)合，或其他任何連接。與測定標(biāo)簽間的連接可以是共價或非共價的；牢固的連接是較適宜的。檢測標(biāo)簽可以直接與特異針對目標(biāo)的抗體相連接，或可以通過一個第二部分進(jìn)行連接，如通過特異針對一抗的二抗，通過蛋白A或通過生物素/抗生物素蛋白或生物素/鏈酶親和素型連接。在抗體特異結(jié)合目標(biāo)的同時或隨后，檢測標(biāo)簽可以被釋放。這些檢測標(biāo)簽包括放射同位素或放射核酸，熒光基團(tuán)，化學(xué)發(fā)光染料，生物發(fā)光復(fù)合物，磁性微粒，酶標(biāo)，底物，輔助因子，抑制子和其他類似物。見，指，導(dǎo)這些標(biāo)簽使用的專利，U.S.Pat.Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；4,366,241。標(biāo)簽可以在物體中對細(xì)胞進(jìn)行追蹤和放射?？梢允褂梅乔秩爰夹g(shù)進(jìn)行檢測的標(biāo)簽是更適宜的，雖然內(nèi)窺鏡也可以用來測定被檢測的標(biāo)簽的位置。
抗體可與其他功能部分結(jié)合。當(dāng)與毒素，藥物或前藥物如化學(xué)治療試劑或放射核酸結(jié)合時，該抗體可被稱為“免疫毒素”。適合與抗體結(jié)合的試劑包括capecitabine，mitoxantrone(米托蒽醌)，aflotoxin，阿霉素，環(huán)磷酰胺，5-氟尿嘧啶，irinotecan，絲裂霉素，紫杉醇，cisplatinum，假單胞菌毒素，金環(huán)蛇毒素，篦麻毒素。正如這里進(jìn)一步闡述的，這些試劑可以共價結(jié)合抗體，或通過帶有特異結(jié)合配對成分的連接基團(tuán)進(jìn)行連接，如生物素/抗生物素，生物素/鏈霉親和素，抗體/抗原。出于這些治療目的，多肽和其他試劑，也可以和細(xì)胞毒素試劑和化學(xué)治療試劑相結(jié)合，而該多肽可與已經(jīng)鑒定的目標(biāo)物質(zhì)之一，如與一種疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體特異結(jié)合。
抗體與細(xì)胞毒素或標(biāo)簽之間的連接可以通過許多異種雙功能交叉連接無物完成，如雙功能蛋白結(jié)合試劑，如N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)丙酸鹽(SPDP)，碳化二亞胺戊二醛，巰醇亞胺(TT)，imidoesters雙功能派生物(如二甲基adipimidate HCL)，活性脂(如二琥珀酰亞胺底物)，醛(如戊二醛)，疊氮復(fù)合物(如疊(p-疊氮基苯甲?；?己二胺)，疊-重氮派生物(如疊-(p-diazoniumbenzoyl)-ehtylenediamine)，二異氰酸化物(如2，6-二異氰酸甲苯)，和雙-活性氟復(fù)合物(如1，5-雙氟-2，4-二硝基苯)。例如，篦麻毒素抗毒素可以通過以下方法制備，Vitetta etal.Science，2381098(1987).Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methylaiethylene triaminepentaacetic acid(MX-DTPA)是一種螯合試劑，可以將放射核酸與抗體相連接。見WO94/11026。它們可以通過合成或重組制備。
抗毒素，包括單鏈分子，可以通過重組方法制備。許多生產(chǎn)抗毒素的方法是該領(lǐng)域中所熟知的，并且可以在“單克隆抗體-毒素結(jié)合瞄準(zhǔn)魔力子彈，”Thorpe et al.(1982)Monoclonal Antibodies in Clinical Medinine，Academic Press，pp.168-190；vitatta，Science(1987)2381098-1104；和Winter，Milstein(1991)，Nature 349293-299。
許多細(xì)胞毒素試劑都適宜作為抗毒素被使用。毒素試劑包括，但不僅限于，放射核酸，如碘-131，釔-90，錸-188，鉍-212；許多化學(xué)治療試劑，如長春地辛，氨甲蝶呤，阿霉素，cisplatinum；細(xì)胞毒素蛋白如核糖體抑制蛋白，如美洲商陸抗病毒蛋白，假單胞菌外毒素A，篦麻毒素，白喉毒素，篦麻毒素A鏈，等，或在細(xì)胞表面具備活性的試劑，如磷脂酶(例如，磷脂酶C)。通常見，“Chimeric Toxins，”O(jiān)lsnes和Phil Pharmac.ther.，15355-381(1981)；和“Monoclonal Antibodies for Cancer Detection andTherapy，”等。Baldwin和Byers，pp.159-179，224-266，AcademicPress(1985)。
另一方面，抗體可以和一個受體連接(如鏈霉親和素)，形成抗體-受體聯(lián)合物并施用于病人作為腫瘤預(yù)定位運用，隨后用洗滌試劑從循環(huán)系統(tǒng)中除去未結(jié)合的聯(lián)合物，然后施用與細(xì)胞毒素試劑(如放射核酸)結(jié)合的“配基”(如抗生物素蛋白)?？贵w也可以與前藥物激活酶連接，該酶可以使前藥物(如肽基化學(xué)治療試劑，間WO81/01145)轉(zhuǎn)變?yōu)榫呋钚缘目鼓[瘤藥物。見，例如，WO88/07378和U.S.Pat.No.4,975,278。相應(yīng)地，免疫聯(lián)合物的鎂成分可以包括一種酶，其能以上述過程作用于一種前藥物，是其轉(zhuǎn)變成更具活性的，細(xì)胞毒性的形式。此發(fā)明中的方法使用的酶包括，但不僅限于，可將包含磷酸的前藥物轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤幬锏膲A性磷酸酶；可將包含硫酸鹽的前藥物轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤幬锏腶rylsulfatase；可將非-毒性5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤藥物，5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨(基)酶；可將含多肽的前藥物轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤幬锏牡鞍酌?，如沙雷氏菌蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，羧基肽酶，組織蛋白酶(如B和L)；丙氨酰羧基肽酶，具有轉(zhuǎn)變含有D-氨基酸替代物前藥物的功能；碳水化合物-裂解酶如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨(糖)酸苷酶，可將含糖基化前藥物轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤幬?；?內(nèi)酰胺酶，可以將來源于β-內(nèi)酰胺的藥物轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤幬?；青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，可以將藥物的胺氮替換為苯氧乙?；虮揭阴?，從而轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤幬??？蛇x地，具備酶活性的抗體，在此領(lǐng)域中稱為“抗體酶”，可以用于將前藥物轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂苫钚运幬?見，例，Massey，Nature328457-458(1987))?？贵w-抗體酶聯(lián)合物可以如此所述被制備，并用于將抗體酶介導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中。
利用此領(lǐng)域中熟知的技術(shù)，如使用異相雙功能交聯(lián)試劑，可以將酶共價地和抗體結(jié)合?？蛇x地，可以通過此領(lǐng)域中熟知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建酶/抗體融合物，此發(fā)明中，該融合物至少包括抗體的抗原-結(jié)合區(qū)域及其連接的酶活性功能配基。(見，例，Neuberger et al.，nature，312604-608(1984))。
這里論述的抗體和其他試劑可以用于病人的治療，當(dāng)其與化學(xué)治療試劑或方法(如手術(shù))聯(lián)用時?！奥?lián)用”并不需要同時使用。例如，綁定了疾病相關(guān)蛋白質(zhì)表位的試劑可以同時或連續(xù)地與化學(xué)治療試劑聯(lián)用。在某一方面，每一試劑在任何一天都可以用于病人治療。
腫瘤的化學(xué)治療可以通過抑制DNA合成來完成，或直接地，或非直接地抑制三磷酸脫氧核糖核酸前體的生物合成，以阻止DNA復(fù)制和隨后的細(xì)胞裂解。(見，例如，Gilman et al.，Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Basis of Therapeutics，Eighth Ed.(Pergamom Press，New York，1990))。這些包含烷[烴]化劑的試劑，如亞硝基脲，抗-代謝物，氨甲蝶呤和羥基脲，和其他試劑，如etoposides，campathecins，bieomycin，doxorubicin，daunorubicin，等，雖然不特異針對細(xì)胞周期，但由于其對于DNA復(fù)制的影響，都在S階段殺死細(xì)胞。其他試劑，特別是秋水仙素和長春藤堿，如長春堿和長春新堿，影響微管的裝配，并導(dǎo)致有絲分裂的停滯?；瘜W(xué)治療方案通常包括運用化學(xué)治療試劑來提高治療的效果。
在某種特定情況下，這里敘述的試劑將用于那些對于先前的治療無反應(yīng)或僅有有限反應(yīng)的病人的治療。例如，一種試劑可以用于一位腫瘤病人，化學(xué)治療對于他沒有產(chǎn)生有效的效果。這樣，作為已經(jīng)接受了化學(xué)治療的病人，他可以應(yīng)用這里論述的方法。
用此領(lǐng)域中的任何方法，可以將抗體介導(dǎo)入病人體內(nèi)。通常包括靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下的，腫瘤內(nèi)的注射或灌輸?？贵w被特異設(shè)計成水溶形式，使其保持正常結(jié)構(gòu)和抗體結(jié)合能力，并對于病人是藥物可接受的。期望的形式是無菌的并無熱源的。
抗體能以藥物復(fù)合物形式施用于病人，其包含了一些具治療效果的抗體和一個藥物可接受的載體(附加的)和/或稀釋液。例如，對于固體腫瘤，包含抗體的復(fù)合物可以注射入腫瘤、或腫瘤的周圍。對于血液腫瘤，如白血病，復(fù)合物可以輸入血液或骨髓。作為治療的抗體的起效量依賴于作治療的疾病的類型，疾病的發(fā)展階段和病人的年齡。
適合注射治療的藥物成分可以包含一種或多種抗體，其可與一種或多種藥物可接受的成分相結(jié)合，如無菌等滲水或非水溶液，分散劑，懸浮劑，或乳化劑，或在使用前能溶解入無菌注射劑或分散劑的注射無菌粉末，它們可以包含糖，乙醇，抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑，溶質(zhì)，提供與血液等滲的環(huán)境期望所易接受的，或混懸或增稠劑。這些成分也包括佐劑，如防腐劑，濕潤劑，乳化劑和分散劑。為防止復(fù)合物受微生物影響，可以加入許多抗細(xì)菌和抗真菌試劑，如paraben，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸，和類似物。在復(fù)合物中加入等滲試劑如糖，氯化鈉，和類似物也是合適的。另外，通過加入可延遲吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和凝膠，來延長注射藥物制劑的吸收時間。
在一些情況下，為了延長藥物的作用時間，在皮下或肌肉內(nèi)注射時，通過設(shè)計來減緩抗體的吸收。這可以通過使用具備低水溶性的結(jié)晶懸浮液體或無定形材料實現(xiàn)。隨之，抗體的吸收速度依賴于分解速度，而其依賴于結(jié)晶的大小和結(jié)晶的形態(tài)?？蛇x地，可以通過將抗體溶解或懸浮在油相中，來減緩注射-治療抗體的吸收。
抗體的微囊形式包含于可生物降解的聚合物，如聚交酯-聚糖脂之中，可以制備出注射存儲庫形式。依賴于抗體結(jié)合聚合體的速度和使用的聚合體的自然特異性，抗體釋放的速度可以被控制。其他生物可降解聚合物的例子包括聚原酸酯和聚合(酐)。也可以通過將人體組織可接受的脂質(zhì)體或微乳液包裹抗體，可以制備注射存儲庫形式。
作為預(yù)防應(yīng)用，包含抗體或其雞尾酒的成分可以給予受到疾病發(fā)展階段的病人的治療，以提高病人的抵抗力。其使用量定義為“疾病預(yù)防起效量”。在使用中，精確的用量依賴于病人的健康程度和綜合免疫水平，通常在每劑量0.1到100mg的范圍內(nèi)，特別是每人1到10mg。
在一些治療方法中，與單獨使用抗體相比，第二種試劑(例如，白介素)以可以激活細(xì)胞效應(yīng)的用量，與抗體聯(lián)合使用作為治療，可增強對于惡性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。白介素-2作為治療的劑量可以是約500000U/kg。
除了使用抗體之外，其他治療方法包括給予病人一種試劑。至少使用這些試劑的意義與使用抗體相同。例如，和抗體結(jié)合表位的過程向類似，一條多肽可以被設(shè)計并結(jié)合于一個表位。結(jié)合疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的異構(gòu)體或表位的多肽或其他分子，siRNA，反義鏈，核酸酶，或三重核酸或特異針對疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體的顯性陰性突變，都可以給予患有疾病的病人治療。包含這些試劑的藥物復(fù)合物的治療方法，包括了這里敘述的抗體的，和其他在此領(lǐng)域所熟知的方法。
這里敘述的方法，特別是表位的篩選方法，也可以被用于鑒定用于疫苗使用的多肽和其編碼核酸。在某一方面，針對疾病如癌癥或一種病源疾病的DNA疫苗，通?；趯δ繕?biāo)疾病蛋白編碼基因上表位篩選的結(jié)果。例如，大量覆蓋了整個目標(biāo)蛋白的多肽，或其編碼的核酸，與載體相融合，給予宿主動物治療后以激發(fā)其體內(nèi)的免疫反應(yīng)。通過測定被免疫動物的抗血清，可以鑒定表位多肽的免疫原性。裝載表位多肽的融合蛋白，或目標(biāo)異構(gòu)體全長蛋白的一個片段，可以通過上述的方法用于檢測抗血清的滴度?；谶@些結(jié)果可以設(shè)計疫苗。特別地，疫苗可以包含多肽或其編碼核酸，它們在宿主動物中已經(jīng)生產(chǎn)出抗體。特別地，針對某多肽的高滴度血清表明此多肽具有特別好的免疫原性。幾種高免疫原性的表位，無論其來源于單一目標(biāo)蛋白異構(gòu)體或幾種蛋白異構(gòu)體，都可以被聯(lián)合選擇并應(yīng)用，作為針對一種給定疾病的聯(lián)合疫苗。
為了測定DNA疫苗的效力，該疫苗可以對實驗動物模型進(jìn)行免疫。在此領(lǐng)域中，針對許多疾病，例如針對人類腫瘤的動物模型是熟知的。在一個例證中，無論在接受DNA疫苗免疫之前或之后，該動物將被接種人腫瘤。通過實驗動物中腫瘤的減小情況可以反映該疫苗的保護(hù)性或積極效果。不受特異過程的限制，腫瘤-特異的DNA疫苗可以激發(fā)任一或全部身體的免疫反應(yīng)，例如，細(xì)胞免疫和體液免疫。
這里也提供了一種制備疫苗，如DNA疫苗的方法，以應(yīng)對某疾病，包括(1)鑒定疾病相關(guān)蛋白的一個或多個表位，(2)制備包含一個或多個表位的氨基酸序列的多肽，或?qū)⒕幋a一個或多個表位的核酸序列插入一個表達(dá)載體。在目標(biāo)蛋白中鑒定表位的放債將在此進(jìn)一步敘述。“疾病相關(guān)蛋白”或“與疾病相關(guān)的蛋白”指某些蛋白，通過作用其本身可以進(jìn)行疾病治療或預(yù)防。
包含至少一個疾病相關(guān)蛋白表位，如一個外顯子結(jié)合點表位的多肽，及其編碼的核酸，也可以被用于治療的目的。多肽本質(zhì)上也可以由疾病相關(guān)蛋白表位構(gòu)成。該表位可以是已經(jīng)鑒定為疾病相關(guān)的表位。多肽可以用于，例如，疫苗應(yīng)用，來保護(hù)病人，以使特異表位相關(guān)的疾病不再發(fā)展。多肽也可以用于疾病患者的治療，例如，癌癥。這樣，如上所述，多肽可以和DNA疫苗以類似的方法使用。
多肽可以是5到30，5到20，5到15，或5到10個氨基酸長度。多肽也可以是50個氨基酸長度，或至少40，30，20，10個氨基酸長度。多肽可以包含單個或多個表位，如2，3，5個表位。
示范的多肽包含一個表位，如疾病相關(guān)表位，其包含在SEQID Nos2，4，6，8，10，11，13，或15-25中的任一個。表位可以包含SEQ ID Nos2，4，6，8，10，11，13，或15-25中任何一個中的外顯子結(jié)合點區(qū)。多肽可以由，或本質(zhì)上由一個表位或一個外顯子-連接構(gòu)成。多肽可以包含或本質(zhì)上由蛋白質(zhì)上的表位或外顯子-連接構(gòu)成，此多肽不包含全長蛋白質(zhì)。
多肽可以有自然-發(fā)生的氨基酸，或非-自然發(fā)生的氨基酸構(gòu)成?？梢允荄-或L-型氨基酸。多肽的虛擬縮氨酸也可以被使用。例如，多肽可以包含反相氨基酸。反相氨基酸可以是D鏡像體。不同的氨基酸可以是一個內(nèi)在多肽，一個附屬多肽或一個轉(zhuǎn)運基團(tuán)。一個內(nèi)在的多肽可以包含果蠅觸角足蛋白(ant)的42-58位氨基酸。
多肽可以包含在治療或藥物成分中，包括，例如，治療性的可接受載體。一個或多個多肽，或其派生物或類似物可包括在內(nèi)。其他分子或試劑也可以包含在復(fù)合物中，如提高免疫應(yīng)答的試劑。
其他成分，例如，治療成分，可以包含至少一條核酸，其編碼疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體，例如，一個疾病相關(guān)的外顯子結(jié)合點表位。一個核酸的例證是這里所敘述的編碼一條多肽的核酸。
一條核酸可以是15到120，或15到90，或15到60，15到45個核苷酸長度。一條核酸也可以至多為120，90，60，45核苷酸長度，核酸可以是DNA或修改的DNA。核酸的例證包括，由SEQ IN Nos1，3，5，7，9，12所列出的核酸序列本質(zhì)上構(gòu)成或構(gòu)成的。在特定情況下，核酸可以包含或本質(zhì)上由SEQ IND Nos1，3，5，7，9，12中列出的核酸序列構(gòu)成，附帶條件為這些核酸不包含SEQ IND Nos1，3，5，7，9，12中自然-發(fā)生的全長蛋白質(zhì)。
核酸可以進(jìn)一步包含一個或多個轉(zhuǎn)錄控制元素，如啟動子和終止子。核酸可以是載體，如表達(dá)載體。載體可以是病毒載體，如腺病毒或腺病毒相關(guān)病毒(AAV)載體。這里還包括了含有所述核酸的細(xì)胞。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)藥物操作，在藥物成分中，單獨或和藥物可接受載體，賦形劑或稀釋液聯(lián)合使用的治療方法，可以對哺乳動物，尤其是人類進(jìn)行治療?？梢灾苯訉M織，如腫瘤組織進(jìn)行治療?？蛇x地，治療方法可以通過口服或注射進(jìn)行，包括靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，直腸和局部。
治療方法的毒性和治療性效果可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏羞M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)藥物程序來測定，例如，測定LD50(50％數(shù)量死亡的劑量)和ED50(50％產(chǎn)生療效的劑量)。毒性和療效劑量間的比例作為治療指標(biāo)，可以表示為LD50/ED50的比值。治療指標(biāo)較大的試劑是跟合適的。當(dāng)具有毒副作用的試劑被使用時，應(yīng)當(dāng)注意設(shè)計一種藥物傳輸系統(tǒng)，使試劑準(zhǔn)確針對所影響的組織位置，例如，使對于正常細(xì)胞的潛在的損害最小化，從而減少副作用。
在細(xì)胞培養(yǎng)方法和動物研究中得到的數(shù)據(jù)可以用于人的劑量范圍。治療的劑量最好處在包括ED50并毒性較少或無毒性的循環(huán)濃度范圍之內(nèi)。在此范圍內(nèi)，依賴于劑量形式和治療的路徑，用藥劑量可以有交大變動。
對于任何治療而言，治療的有效劑量可以通過最初的細(xì)胞培養(yǎng)實驗進(jìn)行評估。如同在細(xì)胞培養(yǎng)中測定，通過動物實驗可以得到劑量，將反映包括IC50的循環(huán)血漿濃度范圍(例如，獲得半數(shù)最高抑制癥狀的實驗治療濃度)。這些信息可以用于測定人類精確的起效劑量。
治療所用的劑量將依賴于所治療的疾病的程度或情況和其他臨床因素，例如人類或動物的重量和情況及藥物治療的路徑。當(dāng)對人類和動物進(jìn)行治療時，治療用量可以從0.5mg/千克到500mg/千克之間。其他的用量范圍可以是從1mg/千克到100mg/千克之間；2mg/千克到50mg/千克之間；2mg/千克到10mg/千克之間。依賴于治療藥物在特殊動物和人類中的半衰期，治療的頻率可以是每天數(shù)次或每周一次。應(yīng)用于人類和動物的治療方法也將需要了解。單獨或聯(lián)合進(jìn)行治療的方法，可以同時地或長時期地進(jìn)行。
包含藥劑的藥物成分可以制成適合口服的形式，例如，藥片，片劑，止咳糖，水或油溶液，分散粉末或顆粒，乳劑，硬或軟膠囊，糖漿或西也劑。藥物生產(chǎn)商可以通過此領(lǐng)域中熟知的技術(shù)制備用于口服的藥物成分，該藥物成分可以選擇包含以下試劑甜味劑，調(diào)味劑，增色劑，保存劑，以使藥物更優(yōu)化及具備良好口感。無毒的適合于藥物制備的藥物可接受賦形劑，可與活性成分(例如治療劑)聯(lián)合包含在藥片中。這些賦形劑可以是例如，惰性稀釋液，如碳酸鈣，碳酸鈉，乳糖，磷酸鈣或磷酸鈉；粒化和崩解劑，如微結(jié)晶纖維素，交聯(lián)羧甲基纖維素鈉，玉米淀粉，或褐藻酸；結(jié)合劑，如淀粉，凝膠，聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯樹膠，和潤滑劑，例如，硬脂酸酶，硬脂酸和云母。藥片可以是裸露的或用此領(lǐng)域中熟知的技術(shù)進(jìn)行包裹，以避免藥物的不好的口感，或減緩其在腸胃中的分解和吸收速度，使其發(fā)揮長期的穩(wěn)定效力。例如，水溶性的味道屏蔽材料如hydroxypropylmethl-纖維素或羥丙基纖維素或緩釋試劑如乙基纖維素，乙酸丁酸纖維素都可以被使用。
為制備藥劑的口服形式，可以將藥物活性成分與固體稀釋劑混合并包裹在硬凝膠膠囊中，固體稀釋劑的例子有，碳酸鈣，磷酸鈣或瓷土，或?qū)⒒钚猿煞峙c水溶性載體混合并包裹在軟凝膠膠囊，水溶性載體的例子有聚乙二醇或油介質(zhì)，例如花生油，石蠟油，或橄欖油。
水懸液中可以包含與賦形劑混合的活性材料，使之適合于水懸液的生產(chǎn)。這些賦形劑是懸浮試劑，例如羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羥基甲基纖維素-纖維素，藻酸鈉，聚乙烯吡咯烷酮，黃芪樹膠，阿拉伯樹膠；分散劑或濕潤劑事業(yè)是自然發(fā)生的磷脂，例如卵磷脂，或氧雜環(huán)烷脂肪酸的濃縮產(chǎn)物，例如聚氧乙烯硬脂酸鹽，或帶有長鏈脂肪乙醇的環(huán)氧乙烷濃縮產(chǎn)物，例如heptadecaethylene-oxycetanol，或來源于脂肪酸的部分醇化的環(huán)氧乙烷濃縮產(chǎn)物，及己糖醇，例如聚氧乙烯山梨醇油基化合物，或來源于脂肪酸和己糖醇酐的部分醇化的環(huán)氧乙烷濃縮產(chǎn)物，例如聚乙烯山梨聚糖油酸基化合物。水懸液還可以包含一種或多種防腐劑，如乙烷基，或n-苯基p-羥基安息香酸鹽，一種或多種增色劑，一種或多種調(diào)味劑，及一種或多種甜味劑，如蔗糖，糖精或天(門)冬氨酰苯丙氨酸甲酯。
油懸液可以通過將活性藥物成分懸浮在植物油中制成，例如花生油，橄欖油，芝麻油或椰子油，或在礦物油如液體石蠟中制成。油懸液可以包含增稠劑，如蜂蠟，硬石蠟或十六(烷)醇，。上述的甜味劑，及調(diào)味劑也可以加入其中使其具備較好的口感。這些成分可以通過加入抗-氧化劑，如丁基化羥基苯甲醚或α-維生素E。
分散粉末和顆粒通過水的加入，使之適合于水懸液的制備，并提供了與分散劑或濕潤劑，懸浮劑和一種或多種防腐劑相混合的活性成分。合適的分散劑或濕潤劑和懸浮劑的例子在前面已經(jīng)敘述了。更多的賦形劑，如甜味劑，調(diào)味劑和著色劑，也可以使用。這些成分可以通過加入抗-氧化劑如抗壞血酸維生素C進(jìn)行儲存藥物成分可以以水包油乳劑的形式存在，油相可以是植物油，如橄欖油或落花生油，也可以是礦物油，如液體石蠟或其混合物。合適的乳化劑可以是自然-產(chǎn)生的磷脂，如大豆卵磷脂，從脂肪酸或己糖醇酐中提取的脂或偏脂，如山梨聚糖油酸基化合物，和上述的偏脂與環(huán)氧乙烷的濃縮產(chǎn)物，如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。乳劑也可以包含甜味劑，調(diào)味劑，防腐劑和抗氧化劑。
糖漿和西也劑可以制成甜味劑，例如丙三醇，丙烯丙三醇，山梨(糖)醇或蔗糖。這些配方也可以包含緩和劑，防腐劑，調(diào)味劑和著色劑，抗氧化劑。
藥物成分可以是注射的無菌水溶液形式?？山邮艿慕橘|(zhì)和溶劑是水，Ringer’s液，等滲氯化鈉溶液。
無菌的注射制備物也可以是水包油微乳液，其中活性藥物成分溶解在油相中。例如，活性藥物成分首先溶解在大豆油和卵磷脂混合物中。油相被加入水和甘油混合物，并被制成微乳化劑。
注射溶液或微乳化劑可以通過局部注射進(jìn)入病人的血液。可選地，通過某種方法給予病人溶液或微乳化劑的治療，使其混合物保持一個恒定的循環(huán)濃度，將是更適合的。為了維持這一恒定濃度，可以使用一種連續(xù)的靜脈內(nèi)輸送裝置。示例是Deltec CADD-PLUSTM5400型靜脈內(nèi)泵。
藥物成分可以制成注射水劑或油懸液用于肌肉內(nèi)或皮下注射。這種懸液可以通過此領(lǐng)域中熟知的方法，利用上述合適的分散劑或濕潤劑，懸浮劑，進(jìn)行配制。這種無菌的注射制備物可以是一種含有無菌注射溶液或懸液的無-毒素、注射-可接受的稀釋液或溶劑，例如含有溶液的1，3-丁烷二醇。此外，無菌，不易發(fā)揮的油通常作為溶劑或懸液被使用?；诖四康?，任何柔和的不揮發(fā)油都可以被利用，包括合成的單一或二倍甘油酯。此外，脂肪酸乳油酸也可用于注射劑的制備。
治療劑也可以藥栓形式在直腸內(nèi)給予藥物治療。這些成分可以通過將藥物和合適的非-刺激性賦形物混合制備，該賦形物在通常溫度下是固態(tài)，而在直腸內(nèi)的溫度下是液態(tài)，從而在直腸內(nèi)可融化并釋放藥物。這些材料包括可可油，甘油凝膠，氫化蔬菜油，大量不同分子量的聚乙二醇和聚乙二醇脂肪酸脂混合物。
基于局部應(yīng)用，包含治療劑的奶油，油膏，凝膠劑，溶劑或懸浮劑等都可以被使用。對于此應(yīng)用的目的，局部應(yīng)用包括口腔洗劑和含漱劑。
治療劑可以鼻內(nèi)吸收的形式給予治療，通過合適的鼻內(nèi)介質(zhì)或輸送裝置在鼻內(nèi)使用，或通過使用這些此領(lǐng)域熟知的透皮小片進(jìn)行透皮吸收。為了以這種透皮輸送系統(tǒng)形式進(jìn)行治療，治療的劑量，當(dāng)然，在劑量控制過程中其持續(xù)性要強于間歇性。
這里使用的術(shù)語“成分”規(guī)定為包括一種產(chǎn)物，其包含了特定有效成分的特定數(shù)量，如同任何產(chǎn)品，其源于特定量的特定的有效成分相結(jié)合的，直接或非直接的結(jié)果。
一種試劑或成分，例如，一種治療成分，可以被包含在一種裝置中，使試劑可以用于病人的治療，例如，注射器，支架或管子。
治療方法可以包括給予病人注射藥劑，該病人被檢測為患有特殊的疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體引起的疾病。此方法包括首先對病人進(jìn)行診斷，確定其是否患有可用這里所述方法進(jìn)行治療的疾病，例如，癌癥。包括這里所述的診斷方法都可以被使用。
診斷應(yīng)用抗體可以應(yīng)用于診斷方法，以測定例如，在特定細(xì)胞，組織，或體液如血清中的抗原。在某一方面，一份生物學(xué)樣本從患有或懷疑患有疾病(例如癌癥)的病人身上獲得，并且測定一種或多種癌癥相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體的含量。癌癥相關(guān)的異構(gòu)體的含量可以表明病人患有或容易患有癌癥。相似地，抗體可以用于測定在病人中或體內(nèi)任何組織或細(xì)胞或樣本中病原體的含量。
診斷方法包括使用兩中或更多抗體，其中，例如，僅有一種抗體特異針對疾病-相關(guān)蛋白，對于特異地清楚第診斷是不充足的?？蛇x地，一種抗體可以是特異針對疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體的，第二種抗體是特異針對蛋白質(zhì)正常形態(tài)的，其由編碼疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體的同一基因編碼。在樣本測定中，兩種或更多抗體可以同時或分別使用。
在“治療劑”章節(jié)中敘述的同樣的抗體和其他試劑可以用于診斷實驗。
此領(lǐng)域中許多熟知的診斷實驗技術(shù)都可以使用，如在異源或同源情況下操作的競爭結(jié)合實驗，直接或非直接三明治實驗和免疫沉淀反應(yīng)。(Zola，Monoclonal AntibodiesL a Manual of techniques，CRC Press，Inc.91987)pp.147-158)。免疫組化測定，例如，對于外科手術(shù)樣本或活組織的檢查也可以進(jìn)行。此外，在體外實驗中，如MRI，CAT掃描，PET掃描，電子束CT掃描，SPECT成像，γ成像，血管造影術(shù)，血管內(nèi)超聲，正電子放射X線斷層攝影術(shù)(Renee M Moadel，et al.，Breast Cancer Res 2003，5R199-R205)，放射性或熒光檢測也可以是診斷方法的一部分。
「以用檢測基團(tuán)如上所述，用于診斷實驗的抗體或其他試劑可，可檢測的信標(biāo)記。該檢測基團(tuán)應(yīng)該能夠產(chǎn)生，無論直接或間接性同位素，如號。例如，檢測基團(tuán)可以是上述的一種，一種放射物，如異硫氰3H，14C，32P，35S，125I，一種熒光或化學(xué)發(fā)光復(fù)合性磷酸酶，β酸熒光素，若丹明，或蟲螢光素，或一種酶，如堿抗體于檢測基-半乳糖苷酶或辣根過氧(化)物酶。此領(lǐng)域中任何以及Hunter et團(tuán)連接的方法都可以應(yīng)用，包括這里敘述的方法nistry，131014al.，Nature，144945(1962)；David et al.，Biochegnl)；Nygren，J.(1974)；Pain et al.，J.immunol.Meth.，40219(1981)。Histochem.and Cytochem.，30407(1982)中所論述的診斷方法包括將病人的生物樣品與一種試劑向連接，該試劑可以特異結(jié)合疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體，隨后測定該試劑和生物樣品的結(jié)合情況，當(dāng)結(jié)合發(fā)生時則表明存在疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體，因此病人患有或容易患有該疾病。
測定樣品(例如，一種生物樣品如體液或細(xì)胞或組織)中抗原的存在情況的方法，包括(1)在適合抗原/抗體復(fù)合物形成的條件下，將樣本與固相連接，該固相表面包含固定于特定位置的抗體集合物，(2)在適合抗原/抗體復(fù)合物形成的條件下，將融合蛋白集合物與固相表面相連，每一個融合蛋白包含一個與固相表面的抗體特異接合的多聚肽，以及一個載體蛋白，(3)測定固相表面的每一個特定位置上載體蛋白的存在情況，若在某特定位置有載體蛋白的缺失或減少，則表明具有在特定位置與抗體接合的抗原，即表明樣本中具有抗原。該固相表明可以是抗體陣列，其已有商業(yè)化供給或通過此領(lǐng)域中的方法制備。固相表明可以包含至少10，100，1000，10000，100000個抗體。具備該領(lǐng)域技術(shù)的人員可以識別其他與抗體相似的可以使用的分于，假若該分子可特異結(jié)合蛋白質(zhì)。圖3顯示了一個示范性的方法。固相表明可以包含特異結(jié)合一種抗原，或不同抗原的抗體的集合物?？乖梢允羌膊?相關(guān)抗原，如癌-相關(guān)或病原體相關(guān)抗原。
除抗體之外，其他分子或分子復(fù)合物或試劑，只要其特異識別疾病相關(guān)蛋白質(zhì)異構(gòu)體，都可以用于診斷實驗。示例的試劑，如多肽或其派生物，例如，虛擬縮肽，在這里將進(jìn)一步敘述。
抗體也可以用于從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中或自然源中親和純化抗原。此過程中，運用此領(lǐng)域中熟知的方法，抗體將被固定在合適的支持物上，如交聯(lián)葡聚糖樹脂或濾紙。固定的抗體接著與含有將純化抗原的樣品接觸，接著該支持物用合適的溶液沖洗，去除樣品中除抗原外的其他與固定抗體結(jié)合的物質(zhì)。最后，該支持物用另一種沖洗，使抗原從抗體上釋放出來。
Kits目前的發(fā)明提供了試劑盒，如診斷和治療試劑盒，以及制備和/或篩選抗體的試劑盒。例如，一種試劑盒可以包含一種或多種成分，例一種藥物成分，如這里所述以及可選地說明其用途。試劑盒還可以包含一種或多種裝置來完成這些成分的治療過程。例如，一種試劑盒主體可以包含一種藥物成分和注射器或?qū)Ч?，以完成藥物對于腫瘤的動脈直接注射。在另一方面，試劑盒主體可以包含預(yù)-灌裝安瓿瓶，其中含有蛋白異構(gòu)體的特異抗體結(jié)構(gòu)，可選地做成藥物或凍干形式，并通過輸送裝置使用。
試劑盒可以包含帶有標(biāo)簽的容器。合適的容器包括，瓶子，小瓶，和試管。容器可以由多種材料制備成，如玻璃或塑料。容器可以裝有一種藥物成分，包括有效進(jìn)行治療或非-治療應(yīng)用的抗體，如上所述。容器上的標(biāo)簽?zāi)鼙砻魉幬锍煞值奶厥庵委熁蚍?治療應(yīng)用，也可以表明其體內(nèi)或體外的應(yīng)用方法，如上所述。試劑盒可以包含一種上述的容器，和一種或多種其他容器，其含有適合于商業(yè)或使用者的標(biāo)準(zhǔn)的材料，如緩沖液，稀釋液，濾器，針，注射器，和含有說明書的包裝盒。
一個示范性的試劑盒是治療或診斷試劑盒，其包含一種包括了外顯子結(jié)合點的的表位的抑制子，例如，該表位被鑒定為疾病相關(guān)的表位。
該發(fā)明已經(jīng)進(jìn)行了概括性的描述，參考下列的例子將加深對此發(fā)明的理解，這些例子僅出于說明此發(fā)明的某一特定方面和情況的目的，并非意圖限定該發(fā)明。
范例例1制備特異結(jié)合VEGF的疾病相關(guān)異構(gòu)體的單克隆抗體血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)已經(jīng)被鑒定為在生理和病理情況下介導(dǎo)血管生成的一種重要的因素。人VEGF基因由8個外顯子構(gòu)成，對應(yīng)于下列cDNA的核酸序列，其來源于GenBank Accession Number P15692和NM_003376，及專利SEQ ID NO14.。SEQ ID NO14編碼的氨基酸序列在SEQ ID NO15列出。
人VEGF編碼序列NT外顯子11-66 23aa外顯子267-108 14aa外顯子3109-31569aa外顯子4316-39225aa
外顯子5393-42 10aa外顯子6423-54240aa外顯子7543-67444aa外顯子8675-69 24aa總和231aa信號肽 26aa通過選擇性拼接，至少4中VEGF的異構(gòu)體被發(fā)現(xiàn)，分別包含206，189，165，121氨基酸，表示為VEGF206，VEGF189，VEGF165，VEGF121。形態(tài)206，165，121的陣列在圖4中表示。4種異構(gòu)體共享VEGF同樣的155個N末端氨基酸殘基。在生物藥效率上不同于VEGF165和VEGF121，較長的形態(tài)(VEGF206和VEGF189)是矩陣綁定，較短的形態(tài)是可自由擴(kuò)散的。這些形態(tài)表達(dá)的位置是多變的VEGF165和VEGF121在肺癌和結(jié)腸中表達(dá)量顯著提高；VEGF189在正常肺中表達(dá)；VEGF206作為precursor，在任何組織中都難以檢測到(Houck K A，F(xiàn)errara N，Winer j，Cachianes G，Li B，Leung DW.，Mol Endocrinol.1991Dec；5(12)L1806-14))。VEGF165和121的核酸序列由基因庫提供，編號為AAM0318/AF486837-1和AAF19659/AF214570-1。
綁定在癌組織中表達(dá)的兩種異構(gòu)體的單克隆抗體的制備見下面(圖5)。兩種異構(gòu)體的每種核酸核酸序列將與編碼鼠SEAP的核酸序列一起插入表達(dá)載體。對VEGF-165特異抗體而言，5’cta tct cgt tct gtt ctt tta ggg aca ccc gga acg agt ctc 3’(SEQ ID NO1)編碼下列的氨基酸序列DRARQE/NPCGPCSE(SEQ ID NO2)；對VEGF-121特異抗體而言，5’cta tct cgt tct gttctt ttt aca ttc ggc tcc gcc 3’(SEQ ID NO3)編碼下列氨基酸序列DRARQE/KCDKPRR(SEQ ID NO4)。/代表2個外顯子之間的連接位點。融合蛋白或是SEAP多肽或是多肽SEAP。這些序列的變異體也能被使用，如環(huán)繞外顯子結(jié)合點的但是與所列序列有一或更多個氨基酸不同的序列，尤其是在N和C末端。異構(gòu)體的氨基酸序列在圖4列出，任何環(huán)繞在外顯子結(jié)合點的序列能被使用，如包括在連接處末端或其他位置的3，5，7，10或15個氨基酸序列。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟載體被轉(zhuǎn)染入鼠。選則性地，包括連接SEAP的VEGF多肽的蛋白質(zhì)能在COS細(xì)胞中合成并注射入老鼠。抗-血清滴度在免疫后一到兩周時被測定。具有高滴度的動物被用于分離脾細(xì)胞。用脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞紙幣腫瘤細(xì)胞將根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行。
利用高通量ELISA方案，存在于雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體將被測定其抗原結(jié)合情況。相應(yīng)地，96孔培養(yǎng)板中雜交瘤的培養(yǎng)上清被轉(zhuǎn)移至96-孔或384-孔化驗板，其中預(yù)先-包含了羊抗-鼠IgG(或兔抗-鼠)。在384-孔規(guī)格下，每次實驗可使用5到10微升的培養(yǎng)基。在室溫下孵育30分鐘后，化驗板將被沖洗去除未結(jié)合的抗體。SEAP-表位融合蛋白將被加入孔中并在室溫下孵育30分鐘。未結(jié)合的SEAP-表位融合將被清洗?？乖?抗體結(jié)合情況將通過加入堿性磷酸酶底物并在檢測器上測量進(jìn)行測定。高SEAP活性表明存在識別VEGF表位的抗體。
抗-VEGF165和-121抗體將通過標(biāo)準(zhǔn)免疫化學(xué)方法證實，如利用重組VEGF-165和VEGF-121蛋白進(jìn)行的Western blotting?？筕EGF-165預(yù)期將特異結(jié)合VEGF-165，但不與其他VEGF異構(gòu)體結(jié)合，如VEGF-121和全長VEGF206。抗VEGF-121預(yù)期將特異結(jié)合VEGF-121，但不與其他VEGF異構(gòu)體結(jié)合。
這些抗體可用于測定從培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系中，如非-小細(xì)胞肺癌，和冰凍腫瘤組織切片中制備的蛋白質(zhì)樣品，例如，通過腫瘤組織冰凍切片上的免疫-組化實驗。根據(jù)先前敘述的程序，抗體的生物學(xué)活性可以通過內(nèi)皮細(xì)胞中有絲分裂發(fā)生實驗測定(Hiratska et al.Proc Natl.acad.Sci.WSA.959349-54(1998)，Shibuya et al.Curr Top In Micro & Immu.23759-83(1999))。具有中和活性的抗-VEGF165或-121抗體可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF介導(dǎo)的功能。
例2制備包含VEGF疾病相關(guān)異構(gòu)體的DNA疫苗帶有上述的特異表位序列的針對VEGF165和VEGF121的DNA疫苗可以在實驗動物中開展。原則上，編碼特異表位的寡聚核酸將被插入表達(dá)載體，并在體內(nèi)產(chǎn)生分泌多肽。表達(dá)載體可以包含一個編碼序列，其編碼的分泌蛋白作為一種載體蛋白可以促進(jìn)表位多肽的表達(dá)和/或分泌。載體蛋白的選擇可以是血清白蛋白或其他分泌多肽，或細(xì)胞因子。針對給定疾病的DNA疫苗，例如結(jié)腸癌，其構(gòu)成的表位序列可以來源于VEGF-165，寡聚核酸5’gat aga gca aga caa gaa aat ccc tgt gg cct tgc tca gag 3’(SEQ IN NO1)編碼以下氨基酸序列DRARQE/NPCGPCSE(SEQID NO2)；以及來源于VEGF-121，寡聚核酸5’gat aga gcaaga caa gaa aaa tgt gac aag ccg agg cgg3’(SEQ ID NO3)編碼以下氨基酸序列DRARQE/KCDKPRR(SEQ ID NO4)，“/”表示兩個外顯子之間的結(jié)合位點。這些不同的序列也可以被使用，例如編碼連續(xù)氨基酸的序列形成的外顯子結(jié)合點，但與這里所列的序列有一個或多個核酸的不同，特別是在5’和3’末端。人VEGF的核酸序列見SEQ ID NO14(GenBank AccessionNo.NM_003376)，及任何編碼包含外顯子結(jié)合點連續(xù)氨基酸的序列都可以使用，例如，在連接的一端或另一端包含10，20，30，或50個核苷酸的序列。
如前所述，針對癌癥相關(guān)VEGF異構(gòu)體的DNA疫苗作為血管生成抑制子可以在動物模型中進(jìn)行試驗。特別地，這些抗-VEGF異構(gòu)體疫苗將用于給定的人腫瘤轉(zhuǎn)移試驗，針對VEGF165和121異構(gòu)體中的任一種或兩種進(jìn)行治療。理想地，這些抗-VEGF異構(gòu)體疫苗可以用于早期診斷腫瘤病人的治療，通過抑制血管生成因子如VEGF165和/或VEGF121的活性，而阻止腫瘤的擴(kuò)散。
例3特異結(jié)合ErbB-2疾病相關(guān)異構(gòu)體的單克隆抗體的制備大量的抗-ErbB-2(鼠蛋白)或抗-Her2(人蛋白)抗體已經(jīng)被分離，其中一種抗體，4D5，是一種鼠科抗體，其用于產(chǎn)生治療性的人源化形式抗體herceptin。這中人源化的抗體已經(jīng)證明其在治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的效果(Schaller et al.J.Cancer Res.Clin.Oncol.125520(1999)和Shak et al.Herceptin MultinationalInvestigator Group.Semin Oncol.2671(1999))。然而，既然c-erbB-2也顯示了在其他組織中的生理功能，針對HER2抗體的副作用包括心力衰竭，其是許多死亡的起因(Horton et al.CancerControl.9(6)499-507(2002)。具報道，4D5的表位存在于胞外區(qū)域(ECD)529-627氨基酸之間(Sliwkowski et al.Semin Oncol.2660(1999)。Her2(或HER2)的核酸序列在GenBank編號PO4626和NM_004448及有提供。SEQ IN NO16編碼的氨基酸序列羅列于SEQ IN NO17。
針對Her2疾病相關(guān)異構(gòu)體單克隆抗體的制備方法如下。為了針對特殊的在其ECD缺少16個氨基酸的HER2-拼接異構(gòu)體(氨基酸634到649)(“拼接”或“HER2拼接異構(gòu)體1”)，下列序列將被作為多肽使用INCTHS/PLTS(SEQ ID NO6)(”/”表示外顯子結(jié)合點)。為了針對特異的在ECD缺失12個氨基酸的HER2(ECD DEL)異構(gòu)體(氨基酸636到647)(“ECD DEL”或“HER2拼接異構(gòu)體2”)，下列序列將被作為多肽使用CTHSCV/ASPLT(SEQ ID NO8)(“/”表示外顯子結(jié)合點)。這些序列的變異體也能被使用，如包含一個外顯子結(jié)合點，但與這里所列的序列，特別是在N-和C-末端有一個或多個氨基酸不同的序列。人HER2的氨基酸序列羅列于SEQ ID NO17并在圖8中表示，并且包含一個外顯子結(jié)合點的序列都可以被使用，例如，包含結(jié)合點的某端或另一端的3，5，7，10，或15個氨基酸的序列。
如上所述，單克隆抗體可以按照VEGF抗體的方法得到，無論通過雜交瘤技術(shù)或噬菌體顯示技術(shù)。
HER2多肽的抗體將被測試其針對HER2異構(gòu)體的特異性抗體將預(yù)期結(jié)合兩種表達(dá)兩升高的異構(gòu)體，而不結(jié)合野生型或其他HER2異構(gòu)體?？?HER2(拼接)和抗-HER2(ECD DEL)將在來源于乳腺癌的腫瘤組織芯片和非-小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上進(jìn)行試驗。這些腫瘤細(xì)胞表達(dá)HER2(拼接)和/或HER2(EDC DEL)，通過免疫-組化試驗測定抗體的正信號。正常組織入心臟組織應(yīng)該不表達(dá)這些HER2的變異的異構(gòu)體。HER2異構(gòu)體的特異抗體的中和活性可以根據(jù)先前所述的測序，在動物模型中進(jìn)行檢測。(Schalleret al.J.Cancer Res.Clin.Oncol.125520(1999))。
例4ErbB-2疾病相關(guān)異構(gòu)體DNA疫苗的制備針對HER2(拼接)和/或HER2(EDC DEL)的DNA疫苗可以用于乳腺癌和卵巢癌的治療和預(yù)防，如同上述的抗-VEGF異構(gòu)體疫苗。包含以下核酸序列的DNA載體將被制備5’atc aac tgc acc cac tcc/cct ctg acg tcc3’(SEQ IN NO5)(HER2拼接)和5’tgc acc cac tcc tgt gtg/gcc agc cct ctg acg3’(SEQ ID NO7)(HER2 ECD DEL)。這些序列的變體也可以使用，例如，編碼連續(xù)氨基酸的一個外顯子結(jié)合點的序列，但與這里所列的序列有一個或多個核苷酸的不同，特別在5’和3’端。人HER2核酸序列羅列于SEQ ID NO14(GenBank編碼NM_004448)，任何包含一個外顯子結(jié)合點的編碼連續(xù)氨基酸的序列都可以使用，例如，在junction某端或另一端包含1O，20，30，50個核苷酸的序列。
此疫苗可以在抑制的動物模型中試驗。
例5特異結(jié)合前列腺特異抗原(PSA)的前列腺癌相關(guān)異構(gòu)體的單克隆抗體的制備PSA，其由hKLK3基因編碼，是用于針對和監(jiān)控前列腺癌病人最有力的工具。然而，它的弱點在大量報道中已有體現(xiàn)(見，例如，Stamey.T.A.N Eng.J.Med，317909-917(1987)；Arai)；Arai，.，J.Urol.，1441415-1419(1990)；Catalona，W.J.，Eng.J.med，3241156-1161(1987)；Heuze-Vourc’h，N，Eur J Biochem 268(16)；4408-13(2001)；tanaka，T，Cancer Res.60(1)56-9(2000)；Heuze Vourc’h，N，Eur J Biochem 270(4)706-14(2003))。作為差別抗原最佳特點，PSA不是一種腫瘤-特異蛋白。PSA作為與幾種分子混合的形式存在于血清中。hKLK3基因的選擇性拼接導(dǎo)致在良性和惡性前列腺腫瘤中自由-PSA的分子異質(zhì)性。特定的拼接形式顯示了其于前列腺癌的密切相關(guān)性。(見Tanaka.T，Cancer Res.610(1)56-9(2000)；Heuze-Vourc’h，N，Eur J Biochem 270(4)706-14(2003))。這些PSA的分子類型可用于更好的診斷產(chǎn)品和治療藥物。
特異識別一種特殊的PSA異構(gòu)體的單克隆抗體可通過下列方法制備。該PSA異構(gòu)體是選擇性拼接的結(jié)果，其從成熟PSA上缺失了44個氨基酸(氨基酸45-88)。異構(gòu)體PSA-delta44的表位設(shè)計如下所示。為了綁定PSA-delta44的異構(gòu)體，缺失的結(jié)合點生成序列作為多肽AHCIR/KPGDD(SEQ ID NO10)或HCIR/KPGDDS(SEQ ID NO11)被使用(“/”代表結(jié)合點)。多肽與載體蛋白結(jié)合。結(jié)合的多肽通過雜交瘤技術(shù)或抗菌素顯示技術(shù)作為免疫原產(chǎn)生單克隆抗體。
此外，編碼上述氨基酸序列的核酸將合成5’gcc cac tgcatc agg/agg cca ggt gat gac 3’(SEQ ID NO9)。合成的寡核酸鏈被綁入表達(dá)載體產(chǎn)生帶有PSA-delta44的表位的融合蛋白和載體蛋白。這樣的表達(dá)載體表達(dá)的融合蛋白，如多肽(HCIR/KPGDDS)-SEAP能用于免疫老鼠產(chǎn)生雜交瘤。特異識別PSA-delta44的單克隆抗體根據(jù)陽性綁定免疫原多肽(HCIR/KPGDDS)-SEAP被篩選。SEAP讀出器提供被抗原綁定的PSA-delta44表位的陽性測定。
這一領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)可這些序列的變異體能被使用，如基于人PSA的核酸和氨基酸序列，其PSA的人mRNA的原始序列的基因庫的編碼為X05332和蛋白質(zhì)的原始序列為CAA28947。這些序列分別列在SEQ ID NO18和19中。
綁定PSA的特異抗體的異構(gòu)體由前列腺癌病人的血清樣本被確認(rèn)。從健康組獲得的血清樣本用于作為陰性對照。
正常的PSA(劃線部分表示在PSA-delta44中缺失的范圍。)PSA-delta44(黑體字母表示綁定PSA-delta44的抗體的表位。字母間的“/”表示缺失后的間接位點。)例6特異綁定PDGFRβ融合蛋白的單克隆抗體的制備這個例子描述了另一種ADAPI抗體，其作為一種治療性的試劑能用于綁定引起惡性疾病的蛋白質(zhì)突變體，這些惡性疾病與編碼血小板起源生長因子β受體，PDGFRβ的基因中染色體的移位有關(guān)。染色體移位，包括band 5q31-35(其屬于PDGFRβ基因定位處)出現(xiàn)某些血液類疾病。如PDGFRβ/HCMOGT-1t(5；17)(q33；p11.2)的移位被發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)在青少年脊髓(炎)白血病中(Morerio C.等人，2004 Cancer Research 642649-51)。在急性骨髓性的白血病(AML)中，作為染色體移位(q33；q32)的結(jié)果，PDGFRβ與CEV14形成融合蛋白(Abe A等人，1997 Blood 904271-77)。
CEV14-PDGFRβ融合基因被發(fā)現(xiàn)與攻擊性白血病進(jìn)程相關(guān)，這就表明這種融合蛋白有致瘤的潛能。
CEV14-PDGFRβ，t(5；14)(q33；q32)融合基因在AML病人的復(fù)發(fā)階段出現(xiàn)，這種病人在起始的診斷中只有單獨的染色體移位，t(7；11)。在CEV14-PDGFRβ，t(5；14)(q33；q32)融合基因出現(xiàn)后，標(biāo)記嗜曙紅血球增多的白血病進(jìn)程，結(jié)合染色體治療是無效的。DNA分析顯示，在5q33位置PDGFRβ基因的重組并不出現(xiàn)在初始診斷中。這種移位導(dǎo)致異常的轉(zhuǎn)錄，使在5q33的PDGFRβ基因與位于14q32的新基因CEV14融合。
用于治療和診斷的ADAPI抗體，能基于圍繞在融合基因CEV14-PDGFRβ，t(5；14)(q33；q32)的斷裂點的編碼序列生長。這種抗體特異識別融合蛋白CEV14-PDGFRβ能對AML有特異的治療作用。針對CEV14-PDGFRβ抗體的抗原決定簇序列可以用30個鄰近的核酸序列或10個包括下列融合蛋白CEV14-PDGFRβ區(qū)域的斷裂點序列的氨基酸序列構(gòu)建。(融合蛋白的斷裂點用“/”表示)在CEV14和PDGFRβ融合蛋白之間的核酸序列(CEV14在左或上游或5’末端；PDGFRβ在右或下游或3’末端)
AGA AGA AAT TGA AGA ACT TAA AAG ACA AA/CCTT GCC CTT TAA GGT GGT GGT GAT CTC(SEQ ID NO14)在CEV14和PDGFRβ融合蛋白之間的氨基酸序列EQIEELKR QT/LPFKVVVIS(SEQ ID NO15)目前的發(fā)明將需要試驗，除非有細(xì)胞生物學(xué)，細(xì)胞培養(yǎng)，分子生物學(xué)，轉(zhuǎn)基因生物學(xué)，微生物學(xué)，DNA重組和免疫學(xué)的常用技術(shù)指導(dǎo)并且在這一領(lǐng)域的技術(shù)之內(nèi)。這些技術(shù)都在文獻(xiàn)有所描述。見如，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，ed.by Sambrook，F(xiàn)ritsch and Maniatis(Cold Spring HarborLaboratory Press1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed，1984)；Mullis et al.U.S.Patent No4683195；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture OfAnimal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical GuideTo Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods InEnzymology(Academic Press，inc.，N.Y.)；Gene Transfer VectorsFor Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；Methods In Enaymology，Vols.154and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，VolumeI-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；AntibodiesALaboratory Manual，and Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.(1987)，Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
參考整合所有這里涉及的出版物，基因庫編碼和專利作為整體被參考整合，正如通過參考整合每一單獨的出版物或?qū)＠惶囟ǖ睾蛦为毜仃U明。以免爭議，目前的應(yīng)用，包括定義都受控制。
等效性盡管主體發(fā)明的特定方面已經(jīng)被討論，但是上述特例只具闡述性并無限制性。發(fā)明的許多變更將明顯變?yōu)檫@一領(lǐng)域的技術(shù)，通過上面說明的評論和下面的聲明。發(fā)明的整個范圍和整個等效性的范圍和說明書及變異體將通過參考聲明被定義。
序列表<110>常小迦<120>基于VEFG，HER-2，PSA蛋白質(zhì)異構(gòu)體的用于診斷和治療的疾病的特效試劑<130>IGA-003.25<160>6<170>PatentIn version 3.0<210>14<211>1723<212>DNA<213>homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(1039)..(1686)<400>14tcgcggaggc ttggggcagc cgggtagctc ggaggtcgtg gcgctggggg ctagcaccag 60cgctctgtcg ggaggcgcag cggttaggtg gaccggtcag cggactcacc ggccagggcg120ctcggtgctg gaatttgata ttcattgatc cgggttttat ccctcttctt ttttcttaaa180catttttttt taaaactgta ttgtttctcg ttttaattta tttttgcttg ccattcccca240cttgaatcgg gccgacggct tggggagatt gctctacttc cccaaatcac tgtggatttt300ggaaaccagc agaaagagga aagaggtagc aagagctcca gagagaagtc gaggaagaga360gagacggggt cagagagagc gcgcgggcgt gcgagcagcg aaagcgacag gggcaaagtg420agtgacctgc ttttgggggt gaccgccgga gcgcggcgtg agccctcccc cttgggatcc480cgcagctgac cagtcgcgct gacggacaga cagacagaca ccgccccaag ccccaagctac 540cacctcctcc ccggccggcg gcggacagtg gacgcggcgg cgagccgcgg gcaggggccg600gagcccgcgc ccggaggcgg ggtggagggg gtcggggctc gcggcgtcgc actgaaactt660ttcgtccaac ttctgggctg ttctcgcttc ggaggagccg tggtccgcgc gggggaagcc720gagccgagcg gagccgcgag aagtgctagc tcgggccggg aggagccgca gccggaggag780ggggaggagg aagaagagaa ggaagaggag agggggccgc agtggcgact cggcgctcgg840aagccgggct catggacggg tgaggcggcg gtgtgcgcag acagtgctcc agccgcgcgc900gctccccagg ccctggcccg ggcctcgggc cggggaggaa gagtagctcg ccgaggcgcc960gaggagagcg ggccgcccca cagcccgagc cggagaggga gcgcgagccg cgccggcccc 1020
ggtcgggcct ccgaaacc atg aac ttt ctg ctg tct tgg gtg cat tgg agc1071Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser1 5 10ctt gcc ttg ctg ctc tac ctc cac cat gcc aag tgg tcc cag gct gca1119Leu Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala15 20 25ccc atg gca gaa gga gga ggg cag aat cat cac gaa gtg gtg aag ttc1167Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe30 35 40atg gat gtc tat cag cgc agc tac tgc cat cca atc gag acc ctg gtg1215Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val45 50 55gac atc ttc cag gag tac cct gat gag atc gag tac atc ttc aag cca1263Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro60 65 70 75tcc tgt gtg ccc ctg atg cga tgc ggg ggc tgc tgc aat gac gag ggc1311Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly80 85 90ctg gag tgt gtg ccc act gag gag tcc aac atc acc atg cag att atg1359Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met95 100 105cgg atc aaa cct cac caa ggc cag cac ata gga gag atg agc ttc cta1407Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu110 115 120cag cac aac aaa tgt gaa tgc aga cca aag aaa gat aga gca aga caa1455Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln125 130 135gaa aaa aaa tca gtt cga gga aag gga aag ggg caa aaa cga aag cgc1503Glu Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg140 145 150 155aag aaa tcc cgg tat aag tcc tgg agc gtt ccc tgt ggg cct tgc tca1551Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser160 165 170gag cgg aga aag cat ttg ttt gta caa gat ccg cag acg tgt aaa tgt1599Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys175 180 185tcc tgc aaa aac aca gac tcg cgt tgc aag gcg agg cag ctt gag tta1647Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu190 195 200aac gaa cgt act tgc aga tgt gac aag ccg agg cgg tga gccgggcagg1696Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg205 210 215aggaaggagc ctccctcagg gtttcgg 1723
<210>15<211>215<212>PRT<213>homo sapiens<400>15Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu1 5 10 15Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly20 25 30Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln35 40 45Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu50 55 60Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu65 70 75 80Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro85 90 95Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His100 105 110Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys115 120 125Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val130 135 140Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr145 150 155 160Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His165 170 175
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<221>CDS<222>(151)..(3918)<400>16aattctcgag ctcgtcgacc ggtcgacgag ctcgagggtc gacgagctcg agggcgcgcg 60cccggccccc acccctcgca gcaccccgcg ccccgcgccc tcccagccgg gtccagccgg120agccatgggg ccggagccgc agtgagcacc atg gag ctg gcg gcc ttg tgc cgc 174Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg1 5tgg ggg ctc ctc ctc gcc ctc ttg ccc ccc gga gcc gcg agc acc caa 222Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln10 15 20gtg tgc acc ggc aca gac atg aag ctg cgg ctc cct gcc agt ccc gag 270Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu25 30 35 40acc cac ctg gac atg ctc cgc cac ctc tac cag ggc tgc cag gtg gtg 318Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val45 50 55cag gga aac ctg gaa ctc acc tac ctg ccc acc aat gcc agc ctg tcc 366Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser60 65 70ttc ctg cag gat atc cag gag gtg cag ggc tac gtg ctc atc gct cac 414
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Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys20 25 30Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His35 40 45Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr50 55 60Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65 70 75 80Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu85 90 95Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr100 105 110Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro115 120 125Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser130 135 140Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln145 150 155 160Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn165 170 175Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys180 185 190His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser195 200 205Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys210 215 220Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu245 250 255His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val260 265 270Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg275 280 285Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu290 295 300Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln305 310 315 320Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys325 330 335Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu340 345 350Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys355 360 365Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp370 375 380Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe385 390 395 400Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro405 410 415Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg420 425 430Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu435 440 445Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asr Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val465 470 475 480Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr485 490 495Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His500 505 510Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys515 520 525Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys530 535 540Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys545 550 555 560Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys565 570 575Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp580 585 590Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu595 600 605Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln610 615 620Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys625 630 635 640Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val Ser645 650 655Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly660 665 670Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg675 680 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly690 695 700Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu705 710 715 720Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys725 730 735Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile740 745 750Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu755 760 765Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg770 775 780Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu785 790 795 800Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg805 810 815Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly820 825 830Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala835 840 845Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe850 855 860Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp865 870 875 880Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg885 890 895Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val900 905 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala915 920 925Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro930 935 940Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met945 950 955 960Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe965 970 975Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu980 985 990Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu995 1000 1005Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr1010 1015 1020Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly1025 1030 1035Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg1040 1045 1050Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu1055 1060 1065Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser1070 1075 1080Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu1085 1090 1095Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser1100 1105 1110Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val1115 1120 1125
Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro1130 1135 1140Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro1145 1150 1155Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Ala Lys Thr Leu1160 1165 1170Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly1175 1180 1185Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala1190 1195 1200Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp1205 1210 1215Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro1220 1225 1230Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr1235 1240 1245Leu Gly Leu Asp Val Pro Val1250 1255<210>18<211>1466<212>DNA<213>homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(44)..(829)<400>18agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtgtc acc atg tgg gtc ccg55Met Trp Val Pro1
gtt gtc ttc ctc acc ctg tcc gtg acg tgg att ggt gct gca ccc ctc103Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu5 10 15 20atc ctg tct cgg att gtg gga ggc tgg gag tgc gag aag cat tcc caa151Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln25 30 35ccc tgg cag gtg ctt gtg gcc tct cgt ggc agg gca gtc tgc ggc ggt199Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly40 45 50gtt ctg gtg cac ccc cag tgg gtc ctc aca gct gcc cac tgc atc agg247Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg55 60 65aac aaa agc gtg atc ttg ctg ggt cgg cac agc ctg ttt cat cct gaa295Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe His Pro Glu70 75 80gac aca ggc cag gta ttt cag gtc agc cac agc ttc cca cac ccg ctc343Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu85 90 95 100tac gat atg agc ctc ctg aag aat cga ttc ctc agg cca ggt gat gac391Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp105 110 115tcc agc cac gac ctc atg ctg ctc cgc ctg tca gag cct gcc gag ctc439Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu120 125 130acg gat gct gtg aag gtc atg gac ctg ccc acc cag gag cca gca ctg487Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu135 140 145ggg acc acc tgc tac gcc tca ggc tgg ggc agc att gaa cca gag gag535Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu150 155 160ttc ttg acc cca aag aaa ctt cag tgt gtg gsc ctc cat gtt att tcc583Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser165 170 175 180aat gac gtg tgt gcg caa gtt cac cct cag aag gtg acc aag ttc atg631Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met185 190 195ctg tgt gct gga cgc tgg aca ggg ggc aaa agc acc tgc tcg ggt gat679Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp200 205 210tct ggg ggc cca ctt gtc tgt aat ggt gtg ctt caa ggt atc acg tca727Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser215 220 225
tgg ggc agt gaa cca tgt gcc ctg ccc gaa agg cct tcc ctg tac acc 775Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr230 235 240aag gtg gtg cat tac cgg aag tgg atc aag gac acc atc gtg gcc aac 823Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn245 250 255 260ccc tga gcacccctatcaacccccta ttgtagtaaa cttggaacct tggaaatgac 879Procaggccaaga ctcaagcctc cccagttcta ctgacctttg tccttaggtg tgaggtccag 939ggttgctagg aaaagaaatc agcagacaca ggtgtagacc agagtgtttc ttaaatggtg 999taattttgtc ctctctgtgt cctggggaat actggccatg cctggagaca tatcactcaa 1059tttctctgag gacacagata ggatggggtg tctgtgttat ttgtggggta cagagatgaa 1119agaggggtgg gatccacact gagagagtgg agagtgacat gtgctggaca ctgtccatga 1179agcactgagc agaagctgga ggcacaacgc accagacact cacagcaagg atggagctga 1239aaacataacc cactctgtcc tggaggcact gggaagccta gagaaggctg tgagccaagg 1299agggagggtc ttcctttggc atgggatggg gatgaagtaa ggagagggac tggaccccct 1359ggaagctgat tcactatggg gggaggtgta ttgaagtcct ccagacaacc ctcagatttg 1419atgatttcct agtagaactc acagaaataa agagctgtta tactgtg1466<210>19<211>261<212>PRT<213>homo sapiens<400>19Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly1 5 10 15Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu20 25 30Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala50 55 60His Cys Ile Arg Asn Lys ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu65 70 75 80Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe85 90 95Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg100 105 110Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu115 120 125Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln130 135 140Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile145 150 155 160Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu165 170 175His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val180 185 190Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr195 200 205Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln210 215 220Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro225 230 235 240Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr245 250 255Ile Val Ala Asn Pro260
權(quán)利要求
1.一種治療性的組合物，其包括表位抑制子和藥物可接受的載體，該表位包含一個經(jīng)測定是一種疾病相關(guān)的表位的外顯子結(jié)合點。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的治療性的組合物，其中抑制子是特定綁定表位的抗體，該表位在SEQ ID NO2，4，6，8，10，11，13或15-25之一列出。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中的治療性的組合物，其中抗體是單克隆抗體。
4.一種治療性的組合物，其包括核酸和藥物可接受的載體，該核酸包括編碼與疾病相關(guān)的外顯子結(jié)合點表位。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中的治療性的組合物，其中核酸序列編碼與疾病相關(guān)的外顯子結(jié)合點表位，該表位包含在SEQ ID NO2，4，6，8，10，11，13或15-25之一中。
6.一種表達(dá)載體，其包括編碼與疾病相關(guān)的表位的核酸序列，該表位包含在SEQ ID NO2，4，6，8，10，11，13或15-25之一中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體進(jìn)一步包含編碼載體蛋白的核酸序列。
8.一種治療性的組合物，其包括多肽和藥物可接受的載體，所述多肽包括編碼與疾病相關(guān)的外顯子結(jié)合點表位多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8中的治療性的組合物，其中的多肽包含編碼與疾病相關(guān)的表位，該表位包含在SEQ ID NO2，4，6，8，10，11，13或15-25之一中。
10.一種siRNA綁定編碼表位的核酸序列，該表位是從SEQ IDNO2，4，6，8，10，11，13或15-25組中選擇的氨基酸序列。
11.一種核酸序列，其編碼權(quán)利要求10中的siRNA。
12.一種載體，其包含權(quán)利要求11中的核酸。
13.一種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求11中的siRNA。
14.一種治療性的組合物，其包含權(quán)利要求10中的siRNA或編碼這種siRNA的核酸和藥物可接受載體。
15.一種治療性的試劑盒，其包括表位抑制子和第二種藥劑或用于治療性方式的必須裝置，該表位被測定是與疾病相關(guān)的表位的外顯子結(jié)合點。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含使用說明書或注射抑制子的設(shè)備。
17.一種診斷試劑盒，其包含表位抑制子和第二種藥劑或用于治療性方式的必須裝置，該表位被測定是與疾病相關(guān)的表位的外顯子結(jié)合點。
18.一種測定主體是否有可能在主體中形成與的疾病相關(guān)的異構(gòu)體VEGF的方法，包括(i)來源于主體的樣本與特定綁定表位的抗體相互作用，該表位在SEQ ID NO2或4列出；(ii)測定與樣本綁定的抗體，若抗體綁定樣本表明主體有與疾病相關(guān)的異構(gòu)體VEGF。
19.一種測定主體是否有或可能產(chǎn)生與疾病相關(guān)的異構(gòu)體HER-2的方法，包括(i)來源于主體的樣本與特定綁定表位的抗體相互作用，該表位在SEQ ID NO6或8列出；(ii)測定與樣本綁定的抗體，若抗體綁定樣本表明主體有與疾病相關(guān)的異構(gòu)體HER-2。
20.一種測定主體是否有或可能產(chǎn)生與疾病相關(guān)的異構(gòu)體PSA的方法，包括(i)來源于主體的樣本與特定綁定表位的抗體相互作用，該表位在SEQ ID NO10、11或13列出；(ii)測定與樣本綁定的抗體，若抗體綁定樣本表明主體有與疾病相關(guān)的異構(gòu)體PSA。
21.一種測定主體是否有或可能產(chǎn)生與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的方法，包括(i)來源于主體的樣本與，根據(jù)聲明29的方法鑒定的，特定綁定與疾病相關(guān)的表位的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的抗體相互作用；(ii)測定與樣本綁定的抗體，若抗體綁定樣本表明主體有與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。
22.已經(jīng)被鑒定與疾病相關(guān)的外顯子結(jié)合點表位的抑制子在制備治療該疾病的藥物中的應(yīng)用。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的應(yīng)用，制備癌癥藥物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的應(yīng)用，進(jìn)一步包含給患者注射另一種化學(xué)治療的藥劑。
25.特定綁定在SEQ ID NO2或4，SEQ ID NO6或8，SEQ ID NO10、11或13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQID NO20-21，SEQ ID NO22-24，或SEQ ID NO25所列表位的抗體在制備治療VEGF，HER-2，PSA，PDGFR β；PSMA；CD86；泌乳刺激素或胰島素受體的異構(gòu)體相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
26.與根據(jù)權(quán)利要求29的方法鑒定的疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的外顯子結(jié)合點表位特定結(jié)合的抗體在制備用于治療蛋白質(zhì)異構(gòu)體相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
27.一種從眾多抗體中，鑒定目標(biāo)蛋白的抗體的方法，包括i.提供互不相同的眾多抗體，其中至少有一種抗體特定綁定的融合蛋白至少包含連接載體蛋白的目標(biāo)蛋白的一部分；ii.眾多抗體與固相表面相連，用以得到覆蓋抗體的固相表面，即不同抗體位于不同的固相表面；iii.覆蓋抗體的固相表面與融合蛋白連接；iv.分析測定載體蛋白的存在性研究，若存在載體蛋白表明有目標(biāo)蛋白的抗體存在。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，目標(biāo)蛋白包括蛋白質(zhì)異構(gòu)體或足以引發(fā)抗體對它的反應(yīng)的其中一部分。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，蛋白質(zhì)異構(gòu)體是與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，融合蛋白由哺乳動物的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，目標(biāo)蛋白包括濾過性毒菌引起的蛋白。
32.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，載體蛋白包括分泌的堿性磷酸酶或足以保證酶活性的其中一部分。
33.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，載體蛋白包括辣根過氧化物酶或足以保證酶活性的其中一部分。
34.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，載體蛋白包括β-半乳糖苷酶或足以保證酶活性的其中一部分。
35.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，載體蛋白包括熒光素酶或足以保證酶活性的其中一部分。
36.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，載體蛋白包括IgG-Fc(γ鏈)。
37.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，抗體連接的固相表面包含蛋白質(zhì)A瓊脂糖。
38.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，抗體連接的固相表面包含蛋白質(zhì)G瓊脂糖。
39.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，用于測定載體蛋白存在的分析屬化學(xué)發(fā)光分析。
40.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，用于測定載體蛋白存在的分析屬熒光分析。
41.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，用于測定載體蛋白存在的分析屬比色分析。
42.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，在(iii)和(iv)之間進(jìn)一步包括洗脫步驟，用于移去未綁定的融合蛋白。
43.一種從眾多抗體中鑒定綁定蛋白異構(gòu)體的抗體的方法，包括i.提供互不相同的眾多抗體，其中至少有一種抗體特定綁定的融合蛋白至少包含連接載體蛋白的蛋白異構(gòu)體的一部分；ii.眾多抗體與固相表面相連，用以得到覆蓋抗體的固相表面，即不同抗體位于不同的固相表面；iii.覆蓋抗體的固相表面與融合蛋白連接；iv.分析測定載體蛋白的存在性研究，若存在載體蛋白表明有綁定蛋白異構(gòu)體的抗體存在。
44.一種產(chǎn)生眾多綁定目標(biāo)蛋白的單克隆抗體的方法，包括i.給宿主注射眾多融合蛋白或編碼融合蛋白的核酸，每一融合蛋白至少包含目標(biāo)蛋白和載體蛋白的一部分；ii.從宿主細(xì)胞中獲得產(chǎn)生眾多單克隆抗體的細(xì)胞；iii.根據(jù)聲明1的方法篩選細(xì)胞，獲得綁定目標(biāo)蛋白的眾多單克隆抗體。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，目標(biāo)蛋白包括蛋白質(zhì)異構(gòu)體或足以引起抗體對其產(chǎn)生反應(yīng)的其中一部分蛋白質(zhì)異構(gòu)體。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，蛋白質(zhì)異構(gòu)體是與疾病相關(guān)的。
47.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，目標(biāo)蛋白包括濾過性毒菌引起的蛋白或足以引起抗體對其產(chǎn)生反應(yīng)的其中一部分。
48.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，載體蛋白包括分泌的堿性磷酸酶或足以保證酶活性的其中一部分。
49.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，載體蛋白包括辣根過氧化物酶或足以保證酶活性的其中一部分。
50.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，載體蛋白包括β-半乳糖苷酶或足以保證酶活性的其中一部分。
51.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，載體蛋白包括熒光素酶或足以保證酶活性的其中一部分。
52.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，載體蛋白包括IgG Fc(γ鏈)。
53.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，宿主是老鼠，雞，兔子，山羊，綿羊，馬，駱駝，猴子和人。
54.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，眾多指至少3種。
55.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，眾多指至少10種。
56.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，眾多指至少100種。
57.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，眾多指至少1000種。
58.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，核酸是一表達(dá)載體。
59.一種產(chǎn)生眾多綁的單克隆抗體的方法，其中至少一種單克隆抗體綁定與疾病相關(guān)的蛋白異構(gòu)體，包括i.給宿主注射眾多融合蛋白或編碼融合蛋白的核酸，每一融合蛋白至少包含與疾病相關(guān)的蛋白異構(gòu)體和載體蛋白的一部分；ii.從宿主脾細(xì)胞中獲得產(chǎn)生眾多單克隆抗體的細(xì)胞；iii.根據(jù)聲明1的方法篩選細(xì)胞，獲得綁定與疾病相關(guān)的蛋白異構(gòu)體的一種單克隆抗體。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，至少有一種融合蛋白包括血管的內(nèi)皮生長因子(VEGF)異構(gòu)體165多肽DRARQENPCGPCSE(SEQ ID NO2)或VEGF121多肽DRARQEDCDKPRR(SEQ ID NO4)。
61.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，至少有一種融合蛋白包括HER-2結(jié)合異構(gòu)體1多肽INCTHSPLTS(SEQ ID NO6)或HER-2結(jié)合異構(gòu)體2多肽CTHSCVASPLT(SEQ ID NO8)。
62.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，至少有一種融合蛋白包括SEQ ID NOs16，16或17-19之一。
63.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，至少有一種融合蛋白包括SEQ ID NOs20-25之一。
64.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，載體蛋白包括分泌的堿性磷酸酶或足以保證酶活性的其中一部分。
65.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，載體蛋白包括辣根過氧化物酶或足以保證酶活性的其中一部分。
66.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，載體蛋白包括β-半乳糖苷酶或足以保證酶活性的其中一部分。
67.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，載體蛋白包括熒光素酶或足以保證酶活性的其中一部分。
68.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，載體蛋白包括IgG Fc(γ鏈)。
69.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，宿主是老鼠，雞，兔子，山羊，綿羊，馬，駱駝，猴子和人。
70.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，眾多指至少3種。
71.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，眾多指至少10種。
72.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，眾多指至少100種。
73.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，眾多指至少1000種。
74.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，核酸是一表達(dá)載體。
75.一種從眾多抗體中，分離特異綁定與編碼抗體的核酸相關(guān)的目標(biāo)蛋白的抗體的方法，包括i.至少部分目標(biāo)蛋白連接到固相表面的突起，獲得覆蓋蛋白的突起；ii.在形成抗原/抗體復(fù)合物的適當(dāng)條件下，覆蓋蛋白的突起與編碼抗體的核酸相關(guān)的眾多抗體相連；iii.分離與突起相連的抗體，于是分離了針對目標(biāo)蛋白的抗體。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，與編碼抗體的核酸相關(guān)的抗體是抗菌素。
77.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，進(jìn)一步包括從突起中分離抗體的方法。
78.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，進(jìn)一步包括在步驟(ii)和(iii)之間的洗脫步驟。
79.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，眾多的蛋白質(zhì)與眾多的突起相連，不同的蛋白質(zhì)與不同的突起相連。
80.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，固相表面至少包含10突起。
81.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，固相表面至少包含100突起。
82.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，固相表面至少包含1000突起。
83.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，至少部分目標(biāo)蛋白與鑰孔嘁血藍(lán)素(KLH)相關(guān)。
84.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，至少部分目標(biāo)蛋白與分泌的堿性磷酸酶(SEAP)相關(guān)。
85.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，至少部分目標(biāo)蛋白與IgG Fc(γ鏈)相關(guān)。
86.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，至少部分目標(biāo)蛋白與谷光甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)相關(guān)。
87.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，至少部分目標(biāo)蛋白與多聚組氨酸標(biāo)簽相關(guān)。
88.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，固相表面包括生物素或鏈霉親和素。
89.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，固相表面包括鎳。
90.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，固相表面包括谷胱甘肽。
91.一種在樣品中測定抗原存在的方法，包括(i)在形成特異抗原/抗體復(fù)合物的條件下，樣品與在其表面特定位置上包含多種抗體的固相表面相連；(ii)在形成特異抗原/抗體復(fù)合物的條件下，進(jìn)一步固相表面與眾多融合蛋白相連，每一融合蛋白包括特異綁定位于固相表面上的抗體的多肽和載體蛋白；(iii)在固相表面每一特定位置測定載體蛋白的存在性，若在特定位置無載體蛋白表明在特定位置有抗原特異綁定抗體，也就是在樣本中存在抗原。
92.根據(jù)權(quán)利要求91的方法，固相表面至少包括100種抗體。
93.根據(jù)權(quán)利要求91的方法，固相表面至少包括1000種抗體。
94.根據(jù)權(quán)利要求91的方法，固相表面是一抗體組，每一抗體位于抗體組的特定位置。
95.根據(jù)權(quán)利要求91的方法，載體蛋白是酶或足以保證酶活性的其中一部分并且此方法進(jìn)一步包括與固相表面連接的酶的底物。
96.一種鑒定目標(biāo)蛋白表位的方法，包括i.提供編碼眾多融合蛋白的眾多核酸，每一融合蛋白包括目標(biāo)蛋白的6-15個氨基酸多肽和載體蛋白，這些多肽包括不同的目標(biāo)蛋白序列；ii.給宿主動物注射眾多的核酸；iii.從宿主獲得血清；iv.根據(jù)聲明1的方法測定在血清中存在的綁定目標(biāo)蛋白多肽的抗體數(shù)量。
97.根據(jù)權(quán)利要求96的方法，多肽包括目標(biāo)蛋白的交錯序列。
98.根據(jù)權(quán)利要求96的方法，蛋白質(zhì)是細(xì)胞的表面受體并且融合蛋白包括位于受體胞外領(lǐng)域的氨基酸序列。
99.根據(jù)權(quán)利要求96的方法，目標(biāo)蛋白包括與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。
100.根據(jù)權(quán)利要求96的方法，多肽有8-12個氨基酸組成。
101.一種鑒定目標(biāo)蛋白表位的方法，包括i.提供編碼眾多融合蛋白的眾多核酸，每一融合蛋白包括目標(biāo)蛋白的6-15個氨基酸多肽和載體蛋白，這些多肽包括不同的目標(biāo)蛋白序列；ii.給宿主動物注射眾多的核酸；iii.從宿主細(xì)胞制備大量產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞；iv.根據(jù)聲明1的方法掃描細(xì)胞，鑒定綁定目標(biāo)蛋白的抗體，若存在綁定多肽的抗體，表明此多肽對應(yīng)于目標(biāo)蛋白的表位。
102.根據(jù)權(quán)利要求96的方法，目標(biāo)蛋白包括與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。
103.根據(jù)權(quán)利要求96的方法，多肽有8-12個氨基酸組成。
104.一種制備治療疾病的DNA疫苗的方法，包括i.根據(jù)聲明96的方法鑒定一種或更多與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)表位；ii.轉(zhuǎn)染編碼一種或更多表位的核酸序列進(jìn)入表達(dá)載體，以此來制備治療疾病的DNA疫苗。
105.一種制備治療疾病的DNA疫苗的方法，包括i.根據(jù)聲明96的方法鑒定一種或更多與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)表位；制備包括一種或更多表位的氨基酸序列的多肽，以此來制備治療疾病的DNA疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供制備和篩選抗體的方法?？梢园▽⒃S多抗原和編碼抗原的核酸注射入宿主的方法。也可以包括對載體蛋白質(zhì)使用抗原的融合蛋白質(zhì)在制備和/或篩選抗體制劑的方法。可以是用于同時制備和/或篩選大量的不同的抗體的方法。本發(fā)明還提供用于治療、防止或診斷與蛋白質(zhì)的異構(gòu)體相關(guān)的疾病或發(fā)展為疾病的可能的治療和診斷的方法。
文檔編號C12N15/11GK1849137SQ200480025763
公開日2006年10月18日 申請日期2004年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月8日
發(fā)明者常小迦 申請人:阿托金有限公司