專利名稱：家蠶絲腺生物反應(yīng)器及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種蛋白異源表達(dá)系統(tǒng)，更具體地說(shuō)，是關(guān)于一種絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)帶動(dòng)外源基因在家蠶絲腺特異分泌表達(dá)的家蠶絲腺生物反應(yīng)器及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
一個(gè)好的真核蛋白的異源表達(dá)系統(tǒng)，應(yīng)當(dāng)具有表達(dá)量高，所表達(dá)真核蛋白能被正確地修飾、折疊、定位，便于下游純化等特征，其中純化的問(wèn)題是最難的。現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。其中，大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白量多，成本低，但所表達(dá)外源蛋白在修飾、折疊等方面不能滿足要求。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在所表達(dá)蛋白的功能修飾方面是最好的，在表達(dá)大分子量真核蛋白方面優(yōu)勢(shì)明顯，但該系統(tǒng)耗時(shí)耗資，表達(dá)量不高，不易大規(guī)模生產(chǎn)。桿狀病毒與昆蟲(chóng)細(xì)胞組成的系統(tǒng)表達(dá)量高，所表達(dá)蛋白也修飾折疊正常而具有正確的功能，桿狀病毒對(duì)哺乳動(dòng)物不感染因而安全性也好。但在培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)成本偏高。
家蠶是一種能吐絲的經(jīng)過(guò)家養(yǎng)馴化的鱗翅目經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)。數(shù)千年來(lái)，經(jīng)過(guò)不同目的的人工篩選育種，已得到了許多吐絲量大、個(gè)體大等具有不同特性的經(jīng)濟(jì)品系。在中國(guó)這樣的蠶業(yè)比較發(fā)達(dá)的國(guó)家，為了滿足制絲工業(yè)的需要，已經(jīng)發(fā)展出了規(guī)范化的家蠶規(guī)模飼養(yǎng)模式。這不僅保障了蠶絲業(yè)的正常發(fā)展，也方便了對(duì)家蠶其它用途的開(kāi)發(fā)。由于家蠶有巨大的蛋白合成能力，它被認(rèn)為是用來(lái)進(jìn)行高附加值的異源蛋白表達(dá)的良好載體。在這方面，已經(jīng)有兩種不同的技術(shù)路線取得了成功。一個(gè)是以家蠶轉(zhuǎn)基因?yàn)榇淼姆€(wěn)定的外源基因表達(dá)品系的培育。這當(dāng)中有為建立系統(tǒng)而進(jìn)行的綠色熒光蛋白報(bào)告基因在不同組織的表達(dá)，也有重組人膠原蛋白的表達(dá)(T.Tamura，et al.Nat.Biotech.，2000，1881-84；Tomita M，et al.Nat.Biotech，2003，2152-56；Imamura M，et al.Genetics，2003，1651329-1340；Thomas JL，et al.Insect Biochem Mol Biol，2002，32247-253)。另一個(gè)是以攜帶高附加值的異源蛋白基因表達(dá)框架的重組家蠶核型多角體病毒接種家蠶幼蟲(chóng)或蛹，從感染的蟲(chóng)體收獲重組蛋白的蠶體生物反應(yīng)器的技術(shù)路線。這當(dāng)中已有人α-干擾素、人乙型肝炎病毒表面抗原、人生長(zhǎng)激素、酸性和堿性纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和牛γ-干擾素等許多種異源蛋白得到了成功表達(dá)(Maeda S，et al.Nature，1985，315592-594；Higashihashi N，et al.J Virol Methods，1991，35159-167；Kadonookuda K.，et al.Biochemicaland Biophysical Research Communication，1995，213389-396；Wu X，et al.Protein Expr Purif，2001，21192-200；Shi X，et al.Biotechnol Appl Biochem，1996，24245-249；Murakami K，etal.Cytokine，2001，1318-24)。兩種路線中，家蠶轉(zhuǎn)基因品系的培育的技術(shù)難度較大。
昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(Baculovirus Expression Vector System，BEVS)是繼大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)后建立起來(lái)的又一高效表達(dá)系統(tǒng)。它利用攜帶高附加值蛋白基因高效表達(dá)框架的重組桿狀病毒對(duì)昆蟲(chóng)或其細(xì)胞系高效感染的能力，在感染后的宿主個(gè)體或培養(yǎng)細(xì)胞中大量表達(dá)目的蛋白。因?yàn)橛米鞅磉_(dá)載體的桿狀病毒基因組上不僅可以在一些不影響感染復(fù)制功能的區(qū)段插入長(zhǎng)達(dá)10kb的外源DNA片段，這些區(qū)段在一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)也可以缺失掉或被外源DNA片段取代。BEVS自1983年建立以來(lái)[11]，已有近千種外源基因在該系統(tǒng)得到了表達(dá)。目前該系統(tǒng)所用重組桿狀病毒主要是重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(rAcMNPV)和重組家蠶核型多角體病毒(rBmNPV)。前者宿主秋粘蟲(chóng)個(gè)體很小，一般是以秋粘蟲(chóng)(Spodopterda frugperda)培養(yǎng)細(xì)胞-rAcMNPV配合成一個(gè)系統(tǒng)使用。重組家蠶核型多角體病毒則主要是與家蠶幼蟲(chóng)或蛹配合在一起使用，走蠶體生物反應(yīng)器的路線。
在利用培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞和桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白時(shí)，一個(gè)簡(jiǎn)化純化步驟的策略是使表達(dá)的外源蛋白分泌于培養(yǎng)基中，從而減少與目標(biāo)蛋白混合在一起的雜蛋白量(Tessier，D.C.，et al.Gene，1991，8177-183；O’Reilly，D.R.，Miller，L.K.，and Luchow，V.A.Baculovirus expression vectors.1992，W.H.Freeman and Company，New York)。
家蠶絲腺是典型的外分泌腺體。它是由功能高度特化為合成、分泌絲蛋白的巨核細(xì)胞所圍成的單層細(xì)胞管壁的管狀器官。絲腺合成并分泌到絲腺腔里的蛋白共兩類，即絲素蛋白與絲膠蛋白。絲素蛋白在后部絲腺合成，由重鏈、輕鏈和P25三種蛋白分子以6∶6∶1的比例構(gòu)成，難溶于水(Cong-Zhao Zhou，et al.Nucleic Acids Research，2000，28(12)2413-2419；Inoue S，et al.J Biol Chem，2000，275(51)40517-28)。
絲膠主要由ser1和ser2兩個(gè)基因在中部絲腺經(jīng)過(guò)選擇性剪接各產(chǎn)生的4種和2種分子構(gòu)成，可水溶(Michaille J.J.，et al.Biochimie，1986，681165-1173；Michaille J.J.，et al.Gene，1990，86177-184)。某些家蠶品種絲腺合成的絲蛋白構(gòu)成的蠶繭干重可達(dá)0.5克。一般絲膠占絲蛋白的30％，以ser1表達(dá)產(chǎn)物為主。由于絲腺合成、分泌絲蛋白的巨大能力，它被看作是一種極巨潛力的優(yōu)良生物反應(yīng)器(Louis Marie Houdebine.Transgenic Research，2000，9305-320)。而且，由于絲腺腔中只含有絲素蛋白和絲膠蛋白，其性質(zhì)比較特殊，很容易與其他目的蛋白質(zhì)分開(kāi)，將對(duì)于后分離純化帶來(lái)極大方便。這一優(yōu)點(diǎn)將是已有的表達(dá)系統(tǒng)所不及的。
如上面所述，在家蠶體內(nèi)表達(dá)外源蛋白基因通常用重組BmNPV，而且一般認(rèn)為，AcMNPV對(duì)家蠶是不感染的，除非其p143基因被BmNPV的p143基因部分取代(Maeda S，et al.J Virol，1993，676234-6238；Croizier G，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1994，9148-52)。本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，p143基因不突變的AcMNPV也能夠感染一些家蠶的經(jīng)濟(jì)品系(Guo T.et al.Archives of Virology，2004，Sep 21[Epub ahead of print])。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，p143基因不突變的AcMNPV也能夠感染一些家蠶的經(jīng)濟(jì)品系，而且被感染蠶所顯示的病癥與被重組BmNPV感染所顯示的病癥相似。也就是說(shuō)，也有可能利用普通的重組AcMNPV病毒感染某些品系的家蠶幼蟲(chóng)或蛹而構(gòu)成家蠶生物反應(yīng)器。由于商業(yè)化的AcMNPV構(gòu)建和使用比較方便，我們利用AcMNPV建立絲腺專一的分泌表達(dá)系統(tǒng)，也適宜于BmNPV重組病毒。
本發(fā)明的目的就在于利用AcMNPV能感染部分家蠶品系的能力以及絲腺合成、分泌蛋白的巨大能力，從而提供一種家蠶絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)帶動(dòng)的家蠶絲腺生物反應(yīng)器。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種上述家蠶絲腺生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的家蠶絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)帶動(dòng)的家蠶絲腺生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法如下a、構(gòu)建含有絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)的DNA片段、絲膠-1基因polyA信號(hào)位點(diǎn)的序列、以及外源目的基因的絲腺特異分泌表達(dá)質(zhì)粒；b、采用合適的內(nèi)切酶切下絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)帶動(dòng)的外源目的基因表達(dá)框，插入病毒表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座供體質(zhì)粒；c、將克隆有絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)帶動(dòng)的外源目的基因表達(dá)框的轉(zhuǎn)座供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入病毒表達(dá)系統(tǒng)專用的菌株；d、抽提菌株的病毒DNA，導(dǎo)入載體細(xì)胞，裝配成具有感染、復(fù)制能力的重組病毒質(zhì)粒，并對(duì)病毒進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增；e、以得到的重組病毒接種家蠶，構(gòu)建成家蠶絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)帶動(dòng)的家蠶絲腺生物反應(yīng)器。
本發(fā)明構(gòu)建的家蠶絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)帶動(dòng)的家蠶絲腺生物反應(yīng)器，由于目標(biāo)蛋白是分泌在絲蛋白中，而絲蛋白中蛋白種類只有約10種，因此，分離純化非常方便；而且，家蠶作為高等真核生物，其絲腺一般都能正確表達(dá)、修飾真核蛋白。


圖1為絲膠1基因(ser1基因)啟動(dòng)子及其信號(hào)肽編碼區(qū)的PCR克隆產(chǎn)物經(jīng)加A處理后的凝膠電泳示意圖。
圖2為用于重組病毒的供體質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。
圖3為絲膠1基因啟動(dòng)子及其信號(hào)肽編碼區(qū)引導(dǎo)的egfp在絲腺表達(dá)分布情況及EGFP的分泌情況示意圖。
圖4為感染重組病毒的蠶所吐繭絲蛋白及絲腺腔液態(tài)絲蛋白中EGFP存在情況的Western雜交檢測(cè)結(jié)果示意圖。
圖5A為EGFP初提物的離子交換分離純化峰圖。
圖5B為EGFP初提物的離子交換分步收集物的熒光光譜掃描結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1、絲膠1基因(ser1基因)啟動(dòng)子及其信號(hào)肽編碼區(qū)的PCR克隆分別參考GeneBandTM/EMBL Data Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中索引號(hào)為M64781的序列和Garel等的發(fā)表論文(Garel A.，et al.Insect Biochem.Molec.Biol.1997，27469-477)，設(shè)計(jì)兩引物引物15′gaaattcttagctacatctagcccag 3′；引物25′gcatgcctgcaggtgaccgaaagcttttacgc 3′；以200ng家蠶品種54A的基因組DNA(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所(江蘇，鎮(zhèn)江))為模板，PCR克隆含有ser1基因啟動(dòng)子的5′旁側(cè)序列與為信號(hào)肽編碼的外顯子1、內(nèi)含子1及外顯子2部分序列的DNA片段；因?yàn)槠屋^長(zhǎng)，所用DNA聚合酶為L(zhǎng)A Taq(TaKaRaBiotechnology Co.，Ltd.)；PCR反應(yīng)體系如下25μl中含引物1和引物2各20pmol；各dNTP終濃度0.4mM；54A基因組DNA 200ng；MgCl2終濃度1.5mM；10×PCR reaction buffer 2.5μl；LA Taq 1.25U。
PCR反應(yīng)條件為
94℃變性5分鐘，25循環(huán)的94℃變性30秒，60℃退火30秒，68℃延伸150秒，循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸10分鐘。
PCR產(chǎn)物加入適量雙蒸水調(diào)整體積到0.5ml，加入等體積酚氯仿(平衡酚與氯仿等體積混合物)，充分振蕩，12000g離心10分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管，加入1/10體積3M NaAc(pH＝5.2)，兩倍體積無(wú)水乙醇，充分振蕩，12000g離心10分鐘得到DNA沉淀。用70％乙醇洗滌一次，瞬時(shí)離心，吸除乙醇。將回收片段溶解至10μl，加入10×PCRreaction buffer 2.5μl，2.5mM dATP 2μl，普通taq酶1.25U，適量雙蒸水至總體積25μl。72℃水浴10分鐘進(jìn)行加A處理。然后進(jìn)行低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1所示。電泳后，割下含有約3700bp大小DNA條帶的位置的膠塊放入一1.5ml離心管。加入適量雙蒸水調(diào)整體積到0.5ml，置于65℃水浴10分鐘使膠塊融化。取出離心管，加入等體積平衡酚，充分振蕩，12000g離心10分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管，加入等體積酚氯仿(平衡酚與氯仿等體積混合物)，充分振蕩，12000g離心10分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管，加入等體積氯仿，充分振蕩，12000g離心10分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管。加入1/10體積3M NaAc(pH＝5.2)，兩倍體積無(wú)水乙醇，充分振蕩，12000g離心10分鐘得到DNA沉淀。用70％乙醇洗滌一次，瞬時(shí)離心，吸除乙醇。然后將得到的回收片段克隆進(jìn)T載體pUCm-T(博彩生物技術(shù)公司)，得到的質(zhì)粒命名為pSerp-T，用Bgl II和SphI從質(zhì)粒pSerp-T切下含絲膠1基因啟動(dòng)子及其信號(hào)肽編碼區(qū)段的DNA片段，經(jīng)測(cè)序其具有如SEQ ID NO1所示的序列。
實(shí)施例2、含絲膠1基因polyA信號(hào)位點(diǎn)的序列的克隆設(shè)計(jì)如下引物引物35′tctagaggttccagcacaagtggaggagc 3′；引物45′cgatgacacctcaacggggtgtgag 3′；用引物3和4以200ng家蠶54A基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增得到含有絲膠1基因polyA信號(hào)位點(diǎn)的序列。
PCR反應(yīng)體系如下25μl中含相應(yīng)兩引物各20pmol；各dNTP終濃度0.2mM；模板DNA；MgCl2終濃度1.5mM；10×PCR reaction buffer 2.5μl；高保真Taq DNA聚合酶1.25U。
PCR反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘，25循環(huán)的94℃變性30秒，60℃退火30秒，68℃延伸30秒，循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸10分鐘。
所得到的片段經(jīng)加A處理后克隆進(jìn)T-載體(Promega)，得到的質(zhì)粒命名為pSer3-T，經(jīng)測(cè)序其具有如SEQ ID NO2所示的序列。
實(shí)施例3、外源目的基因—綠色熒光蛋白egfp基因的克隆設(shè)計(jì)如下引物引物55′aagcttgtcgacagatctgcatgcatggtgagcaagggcg 3′；引物65′ggtaccggatccttacttgtacagctcgtc 3′；用引物5和6以10ng質(zhì)粒pEGFP-N1(Clontech)為模板PCR擴(kuò)增得到綠色熒光蛋白egfp基因片段。
PCR反應(yīng)體系如下25μl中含相應(yīng)兩引物各20pmol；各dNTP終濃度0.2mM；模板DNA；MgCl2終濃度1.5mM；10×PCR reaction buffer 2.5μl；高保真Taq DNA聚合酶1.25U。
PCR反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘，25循環(huán)的94℃變性30秒，60℃退火30秒，68℃延伸30秒，循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸10分鐘。
所得到的片段經(jīng)加A處理后克隆進(jìn)T-載體(Promega)，得到的質(zhì)粒命名為pEGFP-T，經(jīng)測(cè)序其具有SEQ ID NO3所示的序列。
實(shí)施例4、絲腺特異分泌表達(dá)質(zhì)粒pSerpEGFP的構(gòu)建以EcoR I和Kpn I雙酶切質(zhì)粒pSer3-T，得到含絲膠1基因polyA信號(hào)位點(diǎn)的序列，插入質(zhì)粒pUC19(Gibco BRL公司)的相應(yīng)位點(diǎn)。所得到的質(zhì)粒用Hind III和Kpn I雙酶切，電泳回收其3300bp片段。
用Hind III和Kpn I雙酶切質(zhì)粒pEGFP-T，得到750bp綠色熒光蛋白egfp基因小片段，與上一步驟得到的3300bp的片段連接，得到質(zhì)粒pEGFPser3。
用Bgl II和Sph I雙酶切質(zhì)粒pSerp-T，切出含絲膠1啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)的DNA片段，將其插入pEGFPser3中位于egfp基因5′的相應(yīng)位點(diǎn)，得到絲腺特異分泌表達(dá)質(zhì)粒pSerpEGFP。經(jīng)序列測(cè)定其具有SEQ ID NO4所示的序列。
實(shí)施例5、重組病毒制備有關(guān)重組病毒制備方法參照Bac-to-Bac Baculovirus Expression System instructionmanual(Invitrogen life technologies)，主要步驟如下
1、用于重組病毒的供體質(zhì)粒的構(gòu)建以EcoR I和Bgl II雙酶切質(zhì)粒pSerpEGFP，從中切出egfp基因的表達(dá)框架；以EcoRI和BamH I雙酶切質(zhì)粒pFFa2(Guo et al，Archives of Virology，Published online21，September，2004)，回收其4600bp片段，然后與egfp基因的表達(dá)框架連接，得到供體質(zhì)粒pFFa2-serpegfp，過(guò)程示意見(jiàn)圖2。
2、供體質(zhì)粒向病毒基因組的轉(zhuǎn)座重組2.1、制備含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml慶大霉素、10μg/ml四環(huán)素和25μg/ml氯霉素的LB細(xì)菌固體培養(yǎng)平板和含3ml同樣濃度抗生素LB液體的細(xì)菌培養(yǎng)試管。
2.2、CaCl2法制備DH10BacΔEGT(Guo et al，Archives of Virology，Published online21，September，2004)感受態(tài)細(xì)胞。方法參照《分子克隆》(Sambrook J et al.Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)。
2.3、取200μl凍存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴融化后，加入1μl約100ng供體質(zhì)粒DNA冰浴30min，42℃處理90s，冰浴2min。然后轉(zhuǎn)移到含3ml LB細(xì)菌液體培養(yǎng)基的試管以250～300rpm在37℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。
2.4、在三個(gè)含有四種抗生素的LB平板上各圖布50μl溶于二甲基甲酰胺的100mg/ml的X-gal和10μl 200mg/ml的IPTG水溶液。然后將上一步培養(yǎng)4小時(shí)后的菌液離心，保留約300μl LB溶液將所得菌體懸浮。然后在每個(gè)平板表面分別均勻圖布5μl，50μl和250μl。
2.5、37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，至有清晰的蘭白斑克隆出現(xiàn)。
3、重組病毒基因組DNA(Bacmid)的分離3.1、用接種環(huán)挑10個(gè)左右清晰的白斑，在新配制的含有四種抗生素、圖布有X-gal和IPTG的LB平板上劃線培養(yǎng)。
3.2、挑劃線后長(zhǎng)出的白色單克隆接種于含四種抗生素的液體LB試管，37℃以250-300rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。
3.3、將1.5ml上步培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至一1.5ml離心管，14000g離心1分鐘。
3.4、吸去上清，以堿裂解法小量提取質(zhì)粒所用溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA)200μl懸浮菌體沉淀；然后加入200μl溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，緩緩顛倒離心管混勻，室溫放置5分鐘；緩緩加入200μl預(yù)冷的溶液III(3mol/L NaAc，5mol/L HAc pH4.8)，輕緩顛倒離心管混合幾次，冰上放置5～10分鐘。
3.5、14000g離心10min。上清轉(zhuǎn)移至新離心管，并加入540μl異丙醇，緩緩顛倒離心管混勻，冰上放置5～10分鐘，或-20℃過(guò)夜保存。
3.6、14000g室溫離心15分鐘。吸除上清，加入500μl 70％乙醇，顛倒離心管數(shù)次洗滌沉淀。14000g室溫離心5分鐘，吸盡上清，室溫放置5分鐘左右適當(dāng)干燥沉淀。
3.7、以40μl TE溶解沉淀DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.8、重組Bacmid的PCR鑒定。
所用引物對(duì)一對(duì)為M13正向和反向引物(上海生物工程公司)，另一對(duì)為egfp正向引物(實(shí)施例1.2，引物3)和M13反向引物。同時(shí)用M13正、反引物擴(kuò)增，如果出現(xiàn)約300bp片段，則說(shuō)明重組病毒不純或沒(méi)有重組。如果M13正、反引物擴(kuò)增沒(méi)有300bp片段出現(xiàn)，而目的基因特異的引物和M13反向引物能擴(kuò)增出大小為2000bp的片段則說(shuō)明所得到的重組病毒DNA是純的而且發(fā)生了正確重組。
PCR反應(yīng)體系的建立和循環(huán)設(shè)置參照實(shí)施例1.2。
4、重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞4.1、Sf-9細(xì)胞培養(yǎng)取出液氮中凍存的sf-9細(xì)胞(GIBCO BRL)，迅速置27℃水中，迅速搖晃。完全融化后轉(zhuǎn)移至一15ml細(xì)胞離心管，緩慢滴加PBS至總體積10ml左右。800rpm離心5分鐘，棄去上清。細(xì)胞沉淀用含胎牛血清及抗生素的Grace’s培養(yǎng)基(GIBCO BRL)懸浮，轉(zhuǎn)移至25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基加至5ml，27℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每?jī)商鞊Q液一次或傳代。傳代時(shí)先吸除原來(lái)的培養(yǎng)基，加入5ml新鮮培養(yǎng)基，用移液器吸培養(yǎng)液輕輕吹打使部分貼壁細(xì)胞脫落。根據(jù)吹打下來(lái)的細(xì)胞多少將它們重新鋪于一個(gè)或幾個(gè)新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，每瓶培養(yǎng)基補(bǔ)至5ml，27℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。原瓶可再加5ml培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
4.2、用Lipofectin Reagent(GIBCO BRL)將重組Bacmid導(dǎo)入Sf-9細(xì)胞4.2.1、在細(xì)胞培養(yǎng)用12孔板中按每孔1ml加入從細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好的培養(yǎng)瓶中輕緩吹打下來(lái)的4×105個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液，靜置培養(yǎng)至少1小時(shí)，令貼壁。
4.2.2、在1.5ml離心管中準(zhǔn)備兩種溶液，A經(jīng)PCR鑒定為純的重組bacmid DNA 3μl溶于200μl無(wú)抗生素和胎牛血清的Grace’s培養(yǎng)基(GIBCO BRL)；B1μl Lipofectin Reagent溶于200μl無(wú)抗生素和胎牛血清的Grace’s培養(yǎng)基。將兩者振蕩混勻，室溫放置20分鐘。然后將兩者混合，振蕩混勻，室溫放置30分鐘。
4.2.3、吸除12孔板中培養(yǎng)細(xì)胞的原培養(yǎng)液，并用0.5ml無(wú)血清和抗生素的Grace’s培養(yǎng)基輕微搖晃、吸凈以洗去原殘留培養(yǎng)基。將上步的AB混合液加入孔中，27℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5小時(shí)。
4.2.4、吸凈培養(yǎng)孔中的AB混合液，加入含胎牛血清及抗生素的Grace’s培養(yǎng)基1ml，27℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)左右。
4.2.4、觀察細(xì)胞形態(tài)，有病毒大量擴(kuò)增復(fù)制時(shí)細(xì)胞漲大變圓，有成串融合的趨勢(shì)。此時(shí)收獲培養(yǎng)液于1.5ml離心管，500g離心5分鐘，上清移于一新的離心管中得到初次擴(kuò)增的病毒。4℃黑暗保存，亦可放-70℃保存。
4.3、病毒的大量擴(kuò)增、純化、保存及滴度測(cè)定4.3.1、大量擴(kuò)增向細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好、貼壁細(xì)胞幾乎鋪滿瓶壁的25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入20μl初次擴(kuò)增的病毒培養(yǎng)液。約48小時(shí)后可以收獲病毒。
4.3.2、大量擴(kuò)增病毒的純化收獲的病毒先以500g離心10分鐘除去細(xì)胞碎片，所得上清在Avanti J-E離心機(jī)JA-21轉(zhuǎn)頭(BECKMAN COULTER)以35000g，4℃離心60分鐘。立即吸除上清，沉淀以含抗生素及胎牛血清的1/5原體積的Grace’s培養(yǎng)液重懸。4℃黑暗保存。
4.3.3滴度測(cè)定在細(xì)胞培養(yǎng)用96孔板中接種103個(gè)Sf-9細(xì)胞，靜置培養(yǎng)1小時(shí)以上使貼壁。
用細(xì)胞培養(yǎng)基將大量擴(kuò)增的病毒做10倍梯度稀釋，具體方法是取10只1.5ml離心管，每管加入900μl含抗生素及胎牛血清的Grace’s培養(yǎng)基，取100μl大量擴(kuò)增病毒液加入第一管混勻，從其中取100μl加入第二管混勻，從第二管取出100μl加入第三管混勻，依次稀釋到第10管，即得到了大量擴(kuò)增病毒的10-1-10-10的梯度稀釋。
順次吸去96孔板各孔中原有培養(yǎng)基。立即加入從10-3起的每種稀釋梯度的病毒液100μl，每個(gè)稀釋梯度加10孔。這樣，從10-3到10-10，每種梯度有10個(gè)平行的感染孔。培養(yǎng)板置27℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6-7天，觀察各個(gè)梯度的感染情況。
按Tissue Culture Infectious Dose 50(TCID50)的方法(參照Qbiogene“adenovator vectorsystem”)計(jì)算病毒滴度。即T＝101+d(s-0.5)，即得到100μl病毒原液中病毒粒子數(shù)。其中，d為稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)值，此處為L(zhǎng)og10，等于1。S為各稀釋梯度的10個(gè)孔中被病毒感染孔數(shù)占十個(gè)孔總數(shù)的百分比的和。本實(shí)驗(yàn)因?yàn)榭梢灶A(yù)見(jiàn)10-1和10-2會(huì)全部感染，兩者皆以1計(jì)。以本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)為例，在10-6梯度及更高梯度接種的十個(gè)孔均感染；在10-7梯度接種的十個(gè)孔中有5個(gè)感染，在10-8梯度接種的十個(gè)孔中有3個(gè)感染；10-9和10-10梯度接種的十個(gè)孔均未見(jiàn)感染，則S＝1+1+1+1+1+1+0.5+0.3+0+0＝6.8。100μl的滴度為T＝101+1(6.8-0.5)＝107.3，即100μl病毒原液中病毒粒子數(shù)約為2×107個(gè)。
本方法只有在陰性對(duì)照細(xì)胞狀態(tài)仍然良好，且至少最低稀釋梯度的十個(gè)孔沒(méi)有一個(gè)被感染的的情況下才適用。
實(shí)施例6、重組病毒向家蠶的接種及絲腺熒光觀察家蠶54A(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所)于25℃桑葉飼養(yǎng)，5齡起蠶時(shí)接種病毒。測(cè)定滴度后的病毒以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至每毫升108PFU。以50μl微量進(jìn)樣器吸取病毒懸浮液按每頭蠶10μl皮下注射，使病毒進(jìn)入蠶體液。無(wú)egfp表達(dá)框架的重組病毒AcFFa2ΔEGT(Guoet al，Archives of Virology，Published online21，September，2004)作為陰性對(duì)照同時(shí)注射。注射后的蠶桑葉喂養(yǎng)，一天噴一至兩次蠶用抗生素“克蠶菌”(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所)以防蠶細(xì)菌感染。
飼養(yǎng)約5天后觀察，注射病毒的蠶出現(xiàn)食葉量減少、軀體癱軟少?gòu)椥?、爬行時(shí)腹足萎縮無(wú)力、節(jié)間膜較多重疊等典型重組病毒感染癥狀。此時(shí)解剖蠶體，從中取出絲腺在PBS(PH7.0)中洗去黏附組織碎片。然后規(guī)則地?cái)[在載玻片上，置熒光顯微鏡(LeicaMZFLIII)下觀察拍照，如圖3所示，絲腺呈現(xiàn)EGFP綠色熒光，中部絲腺的中部熒光明顯強(qiáng)于后部絲腺。
實(shí)施例7、EGFP初提物的制備、FPLC初步純化和熒光光譜測(cè)定1、EGFP初提物的制備解剖出的絲腺迅速在雙蒸水中漂洗除去黏附碎片組織，用干凈剪刀剪下中部絲腺另置于一冰冷干凈平皿，按一對(duì)絲腺1ml加入冰冷的雙蒸水。數(shù)分鐘后即會(huì)有大量絲蛋白涌出，此時(shí)小心除凈絲腺壁組織。剩下的即為絲蛋白和白光下看不見(jiàn)的egfp蛋白。將凝膠狀絲蛋白搗碎使充分水溶。吸取液體部分于1.5ml離心管，-20℃凍存。約1小時(shí)后取出，室溫溶解后立即用干凈吸頭伸入管中挑出形成的不溶固體部分棄去。也可離心將固體沉淀下來(lái)，轉(zhuǎn)移上清至一新的離心管。再次-20℃凍為固體后用冷凍抽干(SpeedVac Savant)的方法濃縮至原體積的1/5。所得濃縮液再-20℃凍存，約1小時(shí)后取出室溫溶解并立即離心除去析出的固體部分。將這樣得到的來(lái)自約5對(duì)絲腺的上清部分合在一起，-20℃凍為固體后用冷凍抽干的方法濃縮至適合下一步上柱的體積。濃縮液再次-20℃凍，室溫溶解后立即離心除去析出的固體。上清-20℃凍存為下一步上柱純化用。
2、EGFP的FPLC初步純化配制溶液A20mM Tis-HCl，pH7.5；溶液B含0.4M NaCl的溶液A。
在FPLC system(Pharmacia)上裝配1ml HiTrap DEAE column(Pharmacia)離子交換柱。將上一步濃縮液0.4ml上樣，以0-30％的B洗脫液洗脫12分鐘，然后用50％洗脫液洗脫10分鐘，最后以100％B洗脫液洗脫6分鐘以清洗交換柱。洗脫時(shí)按1ml每管收集洗脫液。洗脫峰峰圖見(jiàn)圖5A。
3、熒光光譜掃描將一管上步收集的洗脫液加入熒光比色杯，在熒光分光光度計(jì)(Hitachi F-4010)上以480nm激發(fā)波長(zhǎng)從500nm到550nm掃描測(cè)定所收集蛋白的發(fā)射峰。在510nm出現(xiàn)發(fā)射峰的管中即有EGFP蛋白的存在。見(jiàn)圖5B，出現(xiàn)發(fā)射峰的收集管a，b，c，d與圖5A對(duì)應(yīng)，b管具有最強(qiáng)發(fā)射，說(shuō)明EGFP主要集中于b管。
實(shí)施例8、SDS-PAGE凝膠電泳即蛋白免疫印跡1、SDS-PAGE凝膠電泳配制如下儲(chǔ)存液A、30％丙烯酰胺母液，Arc∶Bis＝29∶1；B、1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8；C、0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8；D、10％SDS；10％過(guò)硫酸銨(APS)；E、5×樣品緩沖液4.0ml重蒸水，1.0ml 0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)緩沖液，0.80ml甘油，1.6ml 10％(w/v)SDS，0.4ml巰基乙醇，0.2ml 0.1％(w/v)溴酚藍(lán)，總體積8ml；F、濃縮電泳緩沖液(5×)取15g Tris，72g甘氨酸，5g SDS，用水溶解至1000ml，pH為8.3(不用調(diào)pH值)。
按照如下配方制膠10％分離膠配方4.02ml重蒸水，2.50ml 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)，100μl 10％SDS，3.33ml 30％丙烯酰胺母液。室溫脫氣15分鐘，加入50μl 10％過(guò)硫酸銨(新鮮配制)和5μlTEMED。
4.0％濃縮膠配方3.0ml重蒸水，1.25ml 1.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)，50μl 10％SDS，0.67ml 30％丙烯酰胺母液。室溫脫氣15分鐘，加入25μl10％過(guò)硫酸銨(新鮮配制)和5μlTEMED。
取重組病毒感染后在絲腺特異表達(dá)EGFP的蠶所吐繭絲適量，浸于100℃雙蒸水10分鐘，制備得到感染蠶繭絲可溶蛋白部分。所得蛋白溶液與絲腺流出物蛋白部分以及相應(yīng)對(duì)照蛋白經(jīng)10％SDS-PAGE電泳，本步操作參照Laemmli發(fā)表論文(Laemmli U.K，Nature，1970，227680-685)，電泳后進(jìn)行下一步。
2半干式電轉(zhuǎn)移本步操作參照《蛋白質(zhì)化學(xué)研究技術(shù)與進(jìn)展》(夏其昌主編，科學(xué)出版社，1997)。
配制如下緩沖液
陽(yáng)極緩沖液I0.3mol/L Tris，10％甲醇，pH10.4；陽(yáng)極緩沖液II25mmol/L Tris，10％甲醇，pH10.4；陰極緩沖液25mmol/L Tris，40mmol/L 6-氨基己酸，10％甲醇，pH9.4(用40mmol/L甘氨酸代替6-氨基己酸)。
將PVDF膜(Immobilon-P，Millipore)先在100％甲醇中潤(rùn)濕2～3秒，再用超純水漂洗2～3分鐘，然后在陽(yáng)極緩沖液II中平衡15分鐘。電泳結(jié)束后將凝膠在陰極緩沖液中平衡5分鐘。在半干式電轉(zhuǎn)移儀上，由陽(yáng)極至陰極依次放在陽(yáng)極緩沖液I中浸過(guò)的與膠同樣大小的Whatman 3mm濾紙4張，在陽(yáng)極緩沖液II中浸過(guò)的與膠同樣大小的Whatman 3mm濾紙2張，PVDF膜，凝膠，在陰極緩沖液中浸過(guò)的與膠同樣大小的Whatman 3mm濾紙6張。1mA/cm電轉(zhuǎn)移90分鐘。完畢后膜在TTBS中稍事漂洗，即可進(jìn)行下一步Western blot的封閉步驟。
3、Western雜交上一步轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Immobilon-P，Millipore)上的蛋白以GFP免疫大鼠單克隆抗體GFP(B-2)sc-9996(Santa Cruz)和偶聯(lián)辣根過(guò)氧化酶的綿羊抗大鼠二抗A-6782(Sigma)進(jìn)行Western雜交檢測(cè)。Western雜交檢測(cè)的步驟如下將轉(zhuǎn)移結(jié)束后的蛋白印跡膜(如為風(fēng)干后的膜則先在甲醇中浸潤(rùn))放入TTBS溶液中(TTBS20m mol/L Tris-HCl pH7.5；137m mol/L NaCl；0.05％Tween-20)漂洗2分鐘。將膜置于5ml封閉緩沖液，室溫輕輕搖動(dòng)孵育1小時(shí)(封閉緩沖液含5％脫脂奶粉的TTBS)。將膜置于5ml一抗緩沖液(一抗緩沖液含1/2000體積一抗的封閉緩沖液)，輕輕室溫?fù)u動(dòng)一小時(shí)。除去一抗緩沖液，用TTBS溶液洗滌3次，每次5分鐘。加入5ml二抗緩沖液(二抗緩沖液含1/2000體積二抗的封閉緩沖液)，室溫輕輕搖動(dòng)孵育1小時(shí)。除去二抗緩沖液，用TTBS溶液洗滌3次，每次5分鐘。將洗好的膜置于一干凈平皿，將化學(xué)發(fā)光試劑(含pH9.0的0.1M Tris.Cl 4ml，68mM肉桂酸8μl，以100mg/ml溶于DMSO的Luminol(Gibicol BRL)15μl)均勻加在膜的表面反應(yīng)1分鐘。用鑷子提起膜將膜面液體流去，然后迅速置于預(yù)先準(zhǔn)備好的塑料膜之間，置于X光片片夾內(nèi)進(jìn)行X光片的曝光。適當(dāng)時(shí)間取出X光片進(jìn)行顯影、定影。結(jié)果如圖4所示，感染蠶絲腺腔及所吐繭絲蛋白中均有EGFP的存在，而對(duì)照蠶沒(méi)有。
雖然以上僅列舉了以綠色熒光蛋白egfp基因?yàn)橥庠茨康幕驑?gòu)建的家蠶絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)帶動(dòng)的家蠶絲腺生物反應(yīng)器，但是通過(guò)采用合適的酶切位點(diǎn)構(gòu)建表達(dá)其他外源目的基因的家蠶絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)帶動(dòng)的家蠶絲腺生物反應(yīng)器，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)、且非常容易做到的，因此此處不再一一列舉。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>家蠶絲腺生物反應(yīng)器及其構(gòu)建方法<130>041431N<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3691<212>DNA<213>silkworm<220>
<221>gene<222>(1)..(3691)<223>
<400>1ccagtcttga aattcttagc tacatctagc ccagactgta agagtttctt aggagcttta60gaagttaaag aagtaccttt gtgttgctga tccttctata tcatctggtc ctagtaaagg120tactctctta taatctcctt cctaattcct tacctgctat ttatcgattg taggtcgtct180tggaaaccag taccactgta caaactcgcg ccccattagt aacgtgattt gaacggccaa240ccaattgatg ttttaatgca attaatatcg tatctttaac cccaacgtgg ttctgcgtta300actaagtgct caccgctgtc aacagcaata aaaccatttt tgaaataata acatcattac360actaacatag tgagctagtc gcaaaatgta tgtagagaga aaacaaacct tctttggggt420gttgagagga aatcgctgga ttagaactat cgtgaagacc attcactgat cctgtgtact480taaattcgcg gattcagcat taagcgccgg atctcagttc catcgtaatc ccagttaaag540aggtgaaatt agctatcact tcgatatctg ttctgaaagc aatgttccac ttgtaaaagc600ataagcggtc agaaaccttg ttaaccaata gagccaaata tagttaacac aatagaaatt660
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1.一種家蠶絲腺生物反應(yīng)器，用于表達(dá)外源目的基因，其特征在于，所述反應(yīng)器以家蠶為載體，以絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼序列為調(diào)控元件。
2.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)器，其特征在于，所述反應(yīng)器克隆有含絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)的DNA片段、外源目的基因編碼序列、絲膠-1基因polyA信號(hào)位點(diǎn)的序列的絲腺特異分泌表達(dá)質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求1或2所述的反應(yīng)器，其特征在于，所述外源目的基因?yàn)榫G色熒光蛋白egfp基因。
4.如權(quán)利要求2所述的反應(yīng)器，其特征在于，所述含有絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)的DNA片段具有SEQ ID NO1所示的序列。
5.如權(quán)利要求3所述的反應(yīng)器，其特征在于，所述構(gòu)建的絲腺特異分泌表達(dá)質(zhì)粒具有SEQ ID NO4所示的序列。
6.一種家蠶絲腺生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟a、構(gòu)建含有絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)的DNA片段、外源目的基因編碼區(qū)序列、絲膠-1基因polyA信號(hào)位點(diǎn)的序列的絲腺特異分泌表達(dá)質(zhì)粒；b、采用合適的內(nèi)切酶切下絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)帶動(dòng)的外源目的基因表達(dá)框，插入病毒表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座供體質(zhì)粒；c、將克隆有絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼序列帶動(dòng)的外源目的基因表達(dá)框的轉(zhuǎn)座供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入病毒表達(dá)系統(tǒng)專用的菌株；d、抽提菌株的病毒DNA，導(dǎo)入載體細(xì)胞，裝配成具有感染、復(fù)制能力的重組病毒顆粒，并對(duì)病毒進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增；e、以得到的重組病毒接種家蠶，構(gòu)建成由家蠶絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼序列帶動(dòng)外源基因表達(dá)的家蠶絲腺生物反應(yīng)器。
7.如權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟a包括含絲膠-1基因啟動(dòng)子及其信號(hào)肽編碼區(qū)段的DNA片段的克隆、含絲膠1基因polyA信號(hào)位點(diǎn)的序列的克隆、外源目的基因編碼區(qū)的克隆，以及用合適的內(nèi)切酶將三者連接起來(lái)。
8.如權(quán)利要求6或7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述外源目的基因?yàn)榫G色熒光蛋白egfp基因。
9.如權(quán)利要求6中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述含有絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)的DNA片段具有SEQ ID NO1所示的序列。
10.如權(quán)利要求8所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建的絲腺特異分泌表達(dá)質(zhì)粒具有SEQ ID NO4所示的序列。
11.一種絲腺特異分泌表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述表達(dá)質(zhì)粒由含有絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼序列的DNA片段、含有絲膠-1基因polyA信號(hào)位點(diǎn)的序列、以及綠色熒光蛋白egfp基因構(gòu)建而成。
12.如權(quán)利要求11所述的絲腺特異分泌表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述含有絲膠-1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)的DNA片段具有SEQ ID NO1所示的序列。
13.如權(quán)利要求11或12所述的絲腺特異分泌表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述構(gòu)建的絲腺特異分泌表達(dá)質(zhì)粒具有SEQ ID NO4所示的序列。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種家蠶絲膠－1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)帶動(dòng)的家蠶絲腺生物反應(yīng)器，通過(guò)構(gòu)建由含有絲膠－1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)的DNA片段、外源目的基因、含有絲膠－1基因polyA信號(hào)位點(diǎn)序列的表達(dá)框構(gòu)成的絲腺特異分泌表達(dá)質(zhì)粒，再將表達(dá)框架亞克隆進(jìn)病毒表達(dá)系統(tǒng)的供體質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化DH10BacΔEGT感受態(tài)細(xì)胞，抽提重組病毒DNA，導(dǎo)入載體細(xì)胞包裝成重組病毒質(zhì)粒，大量擴(kuò)增病毒，最后注射家蠶。本發(fā)明構(gòu)建的家蠶絲膠－1基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽編碼區(qū)帶動(dòng)的家蠶絲腺生物反應(yīng)器，由于目標(biāo)蛋白是分泌在絲蛋白中，而絲蛋白中蛋白種類只有約10種，因此，分離純化非常方便；而且，家蠶作為高等真核生物，其絲腺一般能正確表達(dá)、修飾真核蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/86GK1786176SQ20041008920
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2004年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月8日
發(fā)明者陸長(zhǎng)德, 郭秀洋 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院