專利名稱：棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白編碼序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學、酶學、生理學以及基因工程等領域。具體地，本發(fā)明涉及一種在棉花(Gossypium barbadense)中表達的乙烯響應元件綁定因子(Ethylene Response Element Binding Factor)蛋白編碼序列及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
背景技術：
植物激素乙烯調節(jié)植物多種脅迫反應和發(fā)育性適應。乙烯參與高等植物的多種生理過程，如促進番茄果實成熟，野生型擬南芥在乙烯處理后表現(xiàn)明顯的細胞膨大受阻，萌發(fā)的種子在乙烯處理后表現(xiàn)三種效應頂端彎曲增大，胚軸向光性膨脹，根瘤生長和細胞命運決定等。傷害，疾病，水淹，高鹽，干旱，低溫等環(huán)境脅迫都能誘導高等植物合成乙烯，通過乙烯信號傳導過程，誘導相應基因的轉錄，對外界環(huán)境脅迫產(chǎn)生響應，在高等植物中都發(fā)現(xiàn)了乙烯信號傳導過程。乙烯響應元件綁定因子(ERF1)，是乙烯信號傳導過程中的轉錄因子，它接受乙烯信號途徑中上游的信號，起始在啟動子區(qū)域含有GCC元件的相關抗性基因轉錄，在乙烯信號傳導過程中起著重要作用。
經(jīng)對現(xiàn)有技術文獻檢索中發(fā)現(xiàn)雜志《The Plant Cell(植物細胞)》，在2000，12393-404發(fā)表了文章“Arabidopsis ethylene-responsive element bindingfactors act as transcriptional activators or repressor of GCC box-mediated geneexpression(擬南芥乙烯響應元件綁定因子作為GCC盒調控基因表達的轉錄激活子或抑止子)”，該文獻雖然對乙烯信號途徑轉錄因子激活或者抑止目標基因的轉錄作用做了充分肯定，但截止目前的報道顯示該基因的轉基因煙草植株的抗病、成熟、耐鹽和溫度脅迫方面的效果沒有明顯提高，此外至今尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系文獻的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白編碼序列，使其在植物細胞抗病耐鹽上具有明顯的作用，能夠明顯提高植物細胞在病菌和滲透脅迫條件下的抗性，降低環(huán)境脅迫對植物的損害。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明所分離出的DNA分子包括編碼具有棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第46-642位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第46-642位的核苷酸序列雜交。
所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第46-642位的核苷酸序列。
本發(fā)明分離出的棉花抗病耐鹽類相關蛋白質多肽乙烯響應元件綁定因子，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽。
該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，該多肽能夠在鹽、低溫、水淹和脫落酸(ABA)處理下均能發(fā)揮作用，而這些逆境脅迫均可誘導植物體產(chǎn)生乙烯。并通過乙烯信號傳導過程，誘導相應基因的轉錄，抵御外界環(huán)境脅迫。
所述的DNA分子，包含在所提供的載體中，是一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
本發(fā)明用上述DNA分子轉化的宿主細胞，它是真核細胞。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其蛋白質分開。
在本發(fā)明中，術語“棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有棉花ERF1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第46-642位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第46-642位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中第46-642位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下(70％-85％一致性)，更佳的在高度嚴緊條件下(85％以上一致性)與SEQ ID NO.3中從核苷酸第46-642位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第46-642位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與天然的棉花EEF1相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發(fā)明中，術語“棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白或多肽”指具有棉花ERF1蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術語還包括具有與天然棉花ERF1相關相同功能的、SEQID NO.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括棉花ERF1蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的棉花ERF1多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與棉花ERF1相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用棉花ERF1多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“棉花ERF1保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。
表1


表280％ identity in 597nt overlapQuery280 tacagaggaataagacaaagaccatggggcaaatgggcagctgagattagagaccctcaa 339|||||||||||||| || ||||||||||| |||||||| ||||||||| | || |||||Sbjct333 tacagaggaataaggcagagaccatggggaaaatgggctgctgagattcgcgatcctcag 392Query340 aaaggcgttcgagtttggctcggtacctataacacagccgaagaagcgactcgagcctac 399|| || || || |||||||| ||||| | |||||||| || || || | |||||||Sbjct393 aagggtgtccgtgtttggcttggtacattcaacacagcagaggatgctgccagagcctat 452Query400 gatgaagcagccaagcgtatccgtggtgataaagccaagctcaacttccct 450||||| || || ||||| || |||||| | || ||||| ||||||||||||Sbjct453 gatgaggctgctaagcgcattcgtggtaacaaggccaaactcaacttccct 503Query棉花Ethylene Response Element Binding Factor的核酸序列Sbjct馬鈴薯Ethylene Response Element Binding Factor的核酸序列(AB085820)表2為本發(fā)明的棉花ERF1蛋白與馬鈴薯ERF蛋白的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。
表354％ identity in 198aa overlap，64％ similarity in 198aa overlapQuery1 MCGGAIISDFV-APKYDRKLTGDDLWSELDIFSDLLGFDNNGKSFVXXXXXXXXXXXXXX 177MCGGAIISD+ A + RKL+ DLW+ELD SD ++ S VSbjct1 MCGGAIISDYEPAGNFYRKLSARDLWAELDPISDYWS-SSSSSSTVENPYSAQSPVTHSV 59Query178 XXXXXLNKERSETIQKTSQVTKKVEKTQRT——RKNFYRGIRQRPWGKWAAEIRDPQKG 345+ +S ++K ++ T KVEK+ TRKN YRGIRQRPWGKWAAEIRDPQKGSbjct60 DKPKKSDSGKSNQLKKGNK-TVKVEKEKSTGPRQRKNKYRGIRQRPWGKWAAEIRDPQKG 118Query346 VRVWLGTYNTAEEATRAYDEAAKRIRGDKAKLNF--PQTPTKNQ 471VRVWLGT+NTAE+A RAYDEAAKRIRG+KAKLNF P P K QSbjct119 VRVWLGTFNTAEDAARAYDEAAKRIRGNKAKLNFPAPSPPAKRQ 162Query棉花Ethylene Response Element Binding Factor的氨基酸序列Sbjct馬鈴薯Ethylene Response Element Bindi ng Factor的氨基酸序列(BAC56862)表3為本發(fā)明的棉花ERF1蛋白與馬鈴薯ERF蛋白的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出。
發(fā)明棉花ERF1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然棉花ERF1相關多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的棉花ERF1多肽時，可以將棉花ERF1編碼序列可操作地連于表達調控序列，從而形成棉花ERF1蛋白表達載體。
如本發(fā)明所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。
還可用Northern印跡法技術分析棉花ERF1基因產(chǎn)物的表達，即分析棉花ERF1的RNA轉錄物在細胞中的存在與否和數(shù)量。
此外，本發(fā)明提供的可用作探針的核酸分子，該分子通常具有棉花ERF1核苷酸編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼棉花ERF1相關的核酸分子。
本發(fā)明的檢測樣品中是否存在棉花ERF1相關核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應于棉花ERF1相關核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的棉花ERF1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質的同源性基礎上，篩選棉花ERF1相關同源基因或同源蛋白。
為了得到與棉花ERF1相關基因相關的棉花cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選棉花cDNA文庫，這些探針是在低嚴謹條件下，用32P對棉花ERF1相關的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自棉花的文庫。構建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學領域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，PaloAlto，Cal.。這種篩選方法可以識別與棉花ERF1相關相關的基因家族的核苷酸序列。
本發(fā)明的棉花ERF1相關核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
利用本發(fā)明的棉花ERF1蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與棉花ERF1相關發(fā)生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種棉花乙烯響應元件綁定因子(ERF1)蛋白編碼序列，使其在植物細胞抗病耐鹽上具有明顯的作用，本發(fā)明具有實質性特點和顯著進步，本發(fā)明在植物細胞抗病耐鹽上具有明顯的作用，能夠明顯提高植物細胞在逆境條件下的抗性，降低環(huán)境脅迫對植物的損害。因此，本發(fā)明具有很大的應用價值。
具體實施例方式
下面結合實驗室試驗具體數(shù)據(jù)，以具體實施例來進一步闡述本發(fā)明下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1棉花ERF1基因的克隆
1.組織分離(isolation)將棉花種子置于37℃發(fā)芽24小時，然后播種于溫室中，待棉花葉片為3-5片時，準備抽取DNA或RNA。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(CTAB法)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)馬鈴薯ERF基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)RT-PCRPCR[EA001(SEQ ID NO.1)+EA002(SEQ ID NO.2)]得到163bp的片段，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(GenBank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知茄科植物如馬鈴薯(Solanum tuberosum)ERF基因的同源性很高，故初步認為它是一個ERF基因。
(2)3’-RACEPCR[AP+EA301(5’-TACAGAGGAATAAGACAAAG-3’)]得到EA3’(819bp)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(GenBank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知茄科植物如馬鈴薯(Solanum tuberosum)ERF基因的同源性很高，故初步認為它是一個與ERF相關的基因。
(3)5’-RACE第一輪PCR [AAP+EA501(5’-CGAGCCAAACTCGAACGCCT-3’)]第二輪PCR [(AUAP+EA502(5’-CTTTGTCTTATTCCTCTGTA-3’))得到EA5’(約344bp)(過程同(1))將測序結果的重疊區(qū)拼接，發(fā)現(xiàn)過程(1)得到的片段既是該基因的完整編碼區(qū)。
BLAST的結果證明從棉花中新得到的基因確為一個與馬鈴薯ERF相關的基因。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的棉花ERF1蛋白的全長編碼序列(SEQID NO.3)。
實施例2棉花ERF1基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的棉花ERF1全長cDNA的長度為1143bp，詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于46-642位核苷酸(597個核苷酸)。根據(jù)全長cDNA推導出棉花ERF1的氨基酸序列，共198個氨基酸殘基，分子量為22487.35道爾頓，等電點(pI)為9.82。詳細序列見SEQ ID NO.3。
將棉花ERF1的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發(fā)現(xiàn)它與馬鈴薯基因ERF(AB085820)在核苷酸水平上具有80％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它與馬鈴薯基因ERF(BAC56862)也有54％的相同性(附表3)。由此可見，棉花基因ERF1與馬鈴薯基因ERF無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性。馬鈴薯基因ERF(AB085820)已經(jīng)被證明在病原菌、高鹽脅迫條件下明顯增強表達，并發(fā)揮著重要的作用，可以認為棉花基因ERF1在抗病耐鹽方面也具有相似的作用。
實施例3棉花基因ERF1蛋白或多肽在煙草中進行真核細胞表達及轉基因植株的抗病耐鹽鑒定含目的基因(棉花基因ERF1)的表達載體的構建根據(jù)棉花基因ERF1的全長序列(SEQ ID NO.3)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將棉花基因ERF1 cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進一步克隆到雙元表達載體(如pBI121和改進的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術轉化模式植物煙草。
1.發(fā)苗種子用無菌水漂洗15-20分鐘，再用70％的乙醇消毒1分鐘，然后用0.1％升汞消毒10-12分鐘。最后再用無菌水沖洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸干，放入MS培養(yǎng)基。光照培養(yǎng)5天，待苗長到4-5厘米便可以剪苗。
2.剪苗剪取0.5-1厘米的下胚軸小片段放入預培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天。
預培養(yǎng)基MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)3.轉化共培養(yǎng)將預培養(yǎng)2天的下胚軸放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分鐘。接著取出放入預培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。
4.篩選培養(yǎng)共培養(yǎng)結束后，將外植體放入篩選培養(yǎng)基。2周繼代一次。2-4周有愈傷組織形成和芽的分化。待綠芽長到2厘米后，切下生根。
篩選培養(yǎng)基MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)生根培養(yǎng)基MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)5.轉化植株培養(yǎng)；待根系發(fā)達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
含棉花基因ERF1的轉基因煙草植株的抗病耐鹽鑒定鑒于編碼ERF，如馬鈴薯的ERF基因已被證明在抗病耐鹽方面發(fā)揮作用，而棉花基因ERF1轉錄水平與馬鈴薯的ERF具有較高的同源性，可進一步對含棉花基因ERF1的轉基因煙草植株進行抗病耐鹽鑒定。用病原菌、水淹、ABA和高溫(45℃)處理轉基因植株和轉基因植株的種子(3小時、7小時、12小時、24小時、48小時、72小時)后研究ERF1基因在轉基因植株中的表達情況以及各種處理對植株的生長情況。Northern blot分析結果證明，轉基因植株ERF1轉錄水平在病原菌、水淹、ABA和高溫處理后其表達量均有明顯變化，而對照非轉基因植株雖表達量也有變化，但明顯低于轉基因植株。此外非轉基因植株生長緩慢，最后在病原菌、水淹、ABA和高溫處理下枯萎而死，轉基因植物依然能正常生長，只是比未經(jīng)處理的植株生長稍慢。這證明棉花基因ERF1比馬鈴薯的ERF基因具有更有效的和更廣泛的抗逆境的功能，將可用于利用轉基因技術改良植物抗病耐鹽的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。
實施例4棉花基因ERF1在棉花中的拷貝數(shù)分析采用常規(guī)方法從棉花葉片中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用BamH、EcoRI、SacI和XbaI酶切DNA[20μg(微克)/樣品]后，將DNA轉至雜交膜(尼龍膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContentsCDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我們將ERF1基因編碼區(qū)標記為探針，然后進行雜交(于60℃雜交16小時)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分鐘。轉入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。結果(Southern blot)發(fā)現(xiàn)在雜交膜上不同酶切泳道上各出現(xiàn)二至五條雜交條帶，說明ERF1基因在棉花中是低拷貝基因。
實施例5棉花基因ERF1在病原菌、水淹、ABA和高溫脅迫條件下的不同時間處理的表達譜分析1.RNA的提取將生長了3-5片葉的棉花幼苗經(jīng)病原菌、水淹、ABA和高溫(45℃)處理(3小時、7小時、12小時、24小時、48小時、72小時)，然后用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計測OD260；RNA含量計算1 OD260＝40μg/ml。
3總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉入55℃水浴中。3)于通風櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過膠的條件下點樣，5V/cm電壓電泳5小時左右。
4.RNA尼龍膜上轉移1)轉移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤的膜準確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉移12-20小時。4)轉移后，將膜于80℃烘烤2小時。
5.膜上雜交信號的檢出1)將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA]，65℃下預雜交2小時。2)將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module標記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIGlabeled試劑盒說明書)。Northern雜交表明隨著病原菌、水淹、ABA和高溫處理時間的延長，ERF1的表達均有明顯變化，說明ERF1是逆境信號如病原菌、水淹、ABA和高溫等誘導表達的，在棉花抗病耐鹽中扮演重要的角色。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1AAT AAG (A/G)CA (A/G) AG ACC ATG TG(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性
(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2AGG GAA GTT GAG (C/T) TT GGC TT(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度1143bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3<110>上海交通大學<120>棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白編碼序列<160>2<170>Patentln version 3.1<210>1<211>1143<212>DNA<213>棉花(Gossypium barbadense)<220>
<221>CDS<222>(46)..(642)<223>
<400>1ccatctgaaa aaaaaacagg ttttctttta agataacacc caaaa atg tgt gga ggt 57Met Cys Gly Gly1gca att att tcc gat ttc gtc gcc ccc aaa tat gac cgg aaa ttg acc105Ala Ile Ile Ser Asp Phe Val Ala Pro Lys Tyr Asp Arg Lys Leu Thr5 10 15 20ggc gat gac ctt tgg tct gaa ctt gac ata ttc tcc gac ctc cta ggt153Gly Asp Asp Leu Trp Ser Glu Leu Asp Ile Phe Ser Asp Leu Leu Gly25 30 35ttc gac aac aat ggc aaa agc ttt gtc aat cat cag ttt cat aac aac201Phe Asp Asn Asn Gly Lys Ser Phe Val Asn His Gln Phe His Asn Asn40 45 50aac aac aac aag ctc att aat cca aaa gac aat caa ctt aac aaa gag249Asn Asn Asn Lys Leu Ile Asn Pro Lys Asp Asn Gln Leu Asn Lys Glu55 60 65aga agc gag acg att cag aag aca agc caa gtc act aaa aag gtt gaa297Arg Ser Glu Thr Ile Gln Lys Thr Ser Gln Val Thr Lys Lys Val Glu70 75 80aag act cag cga act cgg aaa aac ttt tac aga gga ata aga caa aga345Lys Thr Gln Arg Thr Arg Lys Asn Phe Tyr Arg Gly Ile Arg Gln Arg85 90 95 100
cca tgg ggc aaa tgg gca gct gag att aga gac cct caa aaa ggc gtt393Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Gln Lys Gly Val105 110 115cga gtt tgg ctc ggt acc tat aac aca gcc gaa gaa gcg act cga gcc441Arg Val Trp Leu Gly Thr Tyr Asn Thr Ala Glu Glu Ala Thr Arg Ala120 125 130tac gat gaa gca gcc aag cgt atc cgt ggt gat aaa gcc aag ctc aac489Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Arg Ile Arg Gly Asp Lys Ala Lys Leu Asn135 140 145ttc cct caa acg ccc acc aaa aat caa gca gct tca cca gct ctt act537Phe Pro Gln Thr Pro Thr Lys Asn Gln Ala Ala Ser Pro Ala Leu Thr150 155 160ctg ctt cct cct gct aag aaa agg tgc atc gtt ccc gga gtt aac tca585Leu Leu Pro Pro Ala Lys Lys Arg Cys Ile Val Pro Gly Val Asn Ser165 170 175 180acc gag ttt acc aga ctg gac tca cca cct ata tcc cta tgg gtt ctt633Thr Glu Phe Thr Arg Leu Asp Ser Pro Pro Ile Ser Leu Trp Val Leu185 190 195ggg gta tga gaagaagtga aagattataa gccgattgaa gtggtggaga682Gly Val
gtgagttgga gttgaaagaa caaatctgga gccttggaat catccctggg tttggagact742aaccatgaga ctatgactca gctgagtggt aacggtggga ctgacccact ggagctttgg802acacttgatg accccgtaac ccagtataag caacggcgct aacatgttca ttagtggggg862cgaaaattaa ataatagtta gcattaatca atgtttttgt gttacttagg gtttttttat922ttatgctatc atgcattata tatatatatg agaataaagg attaacgctt tgctcttgca982tggattagtt agcgttaatc aatatttgtg tttagggttt tttattatgt tgttatatat1042gtatatgctt atgactttca tgtttgtatc aatgcattag ttgcattata tatataagaa1102taaaggattt aacaaaaaaa aaaaaataaa aaaaaaaaaa a1143<210>2<211>198<212>PRT<213>棉花(Gossypium barbadense)<400>2Met Cys Gly Gly Ala Ile Ile Ser Asp Phe Val Ala Pro Lys Tyr Asp1 5 10 15Arg Lys Leu Thr Gly Asp Asp Leu Trp Ser Glu Leu Asp Ile Phe Ser20 25 30
Asp Leu Leu Gly Phe Asp Asn Asn Gly Lys Ser Phe Val Asn His Gln35 40 45Phe His Asn Asn Asn Asn Asn Lys Leu Ile Asn Pro Lys Asp Asn Gln50 55 60Leu Asn Lys Glu Arg Ser Glu Thr Ile Gln Lys Thr Ser Gln Val Thr65 70 75 80Lys Lys Val Glu Lys Thr Gln Arg Thr Arg Lys Asn Phe Tyr Arg Gly85 90 95Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro100 105 110Gln Lys Gly Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Tyr Asn Thr Ala Glu Glu115 120 125Ala Thr Arg Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Arg Ile Arg Gly Asp Lys130 135 140Ala Lys Leu Asn Phe Pro Gln Thr Pro Thr Lys Asn Gln AlaAla Ser145 150 155160Pro Ala Leu Thr Leu Leu Pro Pro Ala Lys Lys Arg Cys Ile Val Pro165 170 175Gly Val Asn Ser Thr Glu Phe Thr Arg Leu Asp Ser Pro Pro Ile Ser
180 185 190Leu Trp Val Leu Gly Val19權利要求
1.一種棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白編碼序列，其特征在于，所分離出的DNA分子包括編碼具有棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第46-642位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第46-642位的核苷酸序列雜交。
2.根據(jù)權利要求1所述的棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白編碼序列，其特征是，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白編碼序列，其特征是，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第46-642位的核苷酸序列。
4.根據(jù)權利要求1所述的棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白編碼序列，其特征是，所述的DNA分子，包含在所提供的載體中，是一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
5.根據(jù)權利要求4所述的棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白編碼序列，其特征是，用上述DNA分子轉化的宿主細胞，它是真核細胞。
全文摘要
一種棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白編碼序列，屬于基因工程領域。所分離出的DNA分子包括編碼具有棉花乙烯響應元件綁定因子蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第46－642位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第46－642位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明在植物抗病耐鹽方面具有明顯的作用，具有很大的應用價值，能夠明顯減少農(nóng)作物在干旱、鹽堿、高溫和病菌感染等環(huán)境脅迫條件下生物產(chǎn)量的損失。
文檔編號C12N15/29GK1603411SQ20041006733
公開日2005年4月6日 申請日期2004年10月21日 優(yōu)先權日2004年10月21日
發(fā)明者秦捷, 趙靜雅, 左開井, 唐克軒 申請人:上海交通大學