專利名稱：小粒徑窄分布青霉素酰化酶固定化載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種青霉素?；腹潭ɑd體的制備方法，具體地說涉及一種粒徑分布窄且粒徑小的珠狀的含環(huán)氧基的青霉素?；腹潭ɑd體的制備方法。
背景技術(shù)：
β-內(nèi)酰胺類抗生素(如半合成青霉素、半合成頭孢霉素等)是目前廣泛使用的半合成抗生素。6-氨基青霉烷酸(6-APA)是生產(chǎn)半合成青霉素的關(guān)鍵中間體。
目前，世界范圍內(nèi)有85％以上6-APA的生產(chǎn)是應(yīng)用固定于天然及合成樹脂載體上的青霉素?；复呋玫降?。青霉素?；?PA)是以固定化形式用于工業(yè)生產(chǎn)的極少數(shù)幾種酶之一。盡管固定化PA在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用已有二十多年了，但新型專門應(yīng)用于固定化PA的載體的合成研究仍具有一定的挑戰(zhàn)性。提高固定化酶的催化效率及降低載體的成本仍是人們不斷追求的目標(biāo)。
美國專利(US 4,511,694)公開了一種以正庚烷-四氯乙烯混合物作為分散相，采用聚合物乳化劑作為分散劑，至少以兩種以上的乙烯基化合物為聚合單體所制備的富含環(huán)氧基的珠狀載體。
世界專利(WO 9,940,122)公開了一種采用反相懸浮技術(shù)制備含環(huán)氧基的珠狀載體。具體來說是以環(huán)己烷為分散劑，以季胺鹽共聚物作為保護(hù)劑，在65-75℃由甲基丙烯酸縮水甘油酯等多種乙烯基化合物進(jìn)行交聯(lián)共聚所獲得的含環(huán)氧基的珠狀載體，但制備成本較高。
中國專利(CN 1408859A)也公開了一種采用反相懸浮技術(shù)制備含環(huán)氧基的珠狀載體的方法，使載體的制備成本有了明顯的降低，但是也還存在著粒徑大、分布寬的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種小粒徑窄分布青霉素?；腹潭ɑd體的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足。
本發(fā)明以表面活性劑作為分散劑，以乙烯基化合物為單體，采用反相懸浮技術(shù)進(jìn)行交聯(lián)聚合，以獲得小粒徑窄分布的珠狀青霉素?；腹潭ɑd體。制備方法包括以下步驟將含有表面活性劑的有機(jī)分散相加入到含有乙烯基化合物的甲酰胺溶液中，在引發(fā)劑的作用下，在惰性氣氛中聚合3-10小時，反應(yīng)溫度為40-80℃，反應(yīng)結(jié)束后，收集珠狀載體，然后采用常規(guī)的方法進(jìn)行純化，即可獲得小粒徑窄分布的青霉素?；腹潭ɑd體；所說的分散相選自環(huán)己烷、正庚烷或四氯乙烯中的一種或一種以上；所說的表面活性劑為司班-80、司班-60、硬脂酸鈣、聚乙二醇、十二烷基苯磺酸鈉中的一種或一種以上；所采用的乙烯基化合物為丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺或N，N’-亞甲基雙甲基丙烯酰胺中的兩種或兩種以上；所說的引發(fā)劑選自偶氮類引發(fā)劑(如偶氮二異丁腈)或過氧化物類引發(fā)劑(如過氧化二酰)中的一種，引發(fā)劑的加入量為乙烯基化合物的1-10％；所采用的常規(guī)純化方法是用親水性溶劑(如丙酮、乙醇、甲醇等)清洗固定化載體，再用疏水性溶劑(如正庚烷、苯等)清洗固定化載體；有機(jī)分散相中表面活性劑的重量濃度為1～50％；分散相的質(zhì)量為乙烯基化合物的1-50倍，表面活性劑的質(zhì)量為乙烯基化合物的1-20倍；
甲酰胺溶液中乙烯基化合物的重量濃度為10-90％；研究發(fā)現(xiàn)，分散劑用量、相比、分散介質(zhì)配比、引發(fā)劑用量、聚合反應(yīng)溫度對產(chǎn)物的粒徑分布均有不同程度的影響。在一定范圍內(nèi)，增加硬脂酸鈣用量、引發(fā)劑用量、提高反應(yīng)溫度、降低在分散相中正庚烷與四氯乙烯的配比，有利于得到小粒徑的珠狀聚合物。
在相同的條件下進(jìn)行固定化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，不同聚合條件和聚合物載體粒徑對制備的固定化酶活性均有不同程度的影響。
本發(fā)明公開的是采用反相懸浮技術(shù)制備粒度相對集中(窄分布)和顆粒較細(xì)的含環(huán)氧基的珠狀共聚物載體的方法，這對于獲得固定化酶活性均一和高活性的生物催化劑是十分必要的。
保持懸浮體系穩(wěn)定并獲得大小適當(dāng)且均勻的聚合物顆粒是懸浮聚合的關(guān)鍵之一。
本發(fā)明可采用文獻(xiàn)[Biochim.Biophys.Acta.，1972，276250-256]所公開的對二甲胺苯甲醛(PDAB)法，測定制備的固定化青霉素?；傅谋碛^活性。用標(biāo)準(zhǔn)篩網(wǎng)在干態(tài)下篩分共聚物，稱重，對共聚物粒徑分布進(jìn)行測定。
采用本發(fā)明的方法制備青霉素酰化酶固定化載體，粒徑細(xì)、粒度相對集中，合成成本低廉，用其制得的固定化酶活性高，易于控制反應(yīng)速率和反應(yīng)時間。如用本方法合成的載體固定青霉素?；负?，對于青霉素G鉀鹽催化水解制備6-APA反應(yīng)，表觀酶活可達(dá)798U/g以上(以干重計(jì))。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將109毫升正庚烷與35毫升四氯乙烯混合后加入到裝有溫度計(jì)、導(dǎo)氣管和攪拌機(jī)的四口燒瓶中，在攪拌、通氮條件下依次加入0.054克司班-60和8克硬脂酸鈣，加熱至55℃后，再加入4克N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺、2.5克甲基丙烯酸縮水甘油酯、0.54克偶氮二異丁腈、17.5毫升甲酰胺，控制攪拌轉(zhuǎn)速為400r/min，通氮聚合6小時。產(chǎn)物經(jīng)過濾、丙酮洗滌抽提后，真空干燥至恒重。用標(biāo)準(zhǔn)篩網(wǎng)在干態(tài)下篩分共聚物載體，稱重。合成樣品的粒度在80～120目的珠體所占的重量百分比為5.9％，以60-80目的珠狀共聚物固定化青霉素?；?，用于催化青霉素G鉀鹽水解制6-APA反應(yīng)，固定化酶的表觀活性為325U/g。
實(shí)施例2司班-60用量為0.13克，其余組分的用量和制備條件與實(shí)施例1相同。合成樣品的粒度在80～120目的珠體所占的重量百分比為19.2％，以60-80目的珠狀共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G鉀鹽水解制6-APA反應(yīng)，固定化酶的表觀活性為355U/g。
實(shí)施例3硬脂酸鈣用量為9.2克，其余組分的用量和制備條件與實(shí)施例1相同。合成樣品的粒度在80～120目的珠體所占的重量百分比為38.4％，以60-80目的珠狀共聚物固定化青霉素?；?，用于催化青霉素G鉀鹽水解制6-APA反應(yīng)，固定化酶的表觀活性為293U/g。
實(shí)施例4控制攪拌轉(zhuǎn)速為500r/min，其它合成條件與實(shí)施例1相同。合成樣品的粒度在80～120目的珠體所占的重量百分比為23.6％，以60-80目的珠狀共聚物固定化青霉素?；?，用于催化青霉素G鉀鹽水解制6-APA反應(yīng)，固定化酶的表觀活性為324U/g。
實(shí)施例5正庚烷用量為75毫升，四氯乙烯用量為24毫升，其余組分的用量和制備條件與實(shí)施例1相同。合成樣品的粒度在80～120目的珠體所占的重量百分比為30.8％，以60-80目的珠狀共聚物固定化青霉素?；?，用于催化青霉素G鉀鹽水解制6-APA反應(yīng)，固定化酶的表觀活性為332U/g。
實(shí)施例6正庚烷用量為72毫升，四氯乙烯用量為72毫升，其余組分的用量和制備條件與實(shí)施例1相同。合成樣品的粒度在80～120目的珠體所占的重量百分比為72.4％，以60-80目的珠狀共聚物固定化青霉素?；?，用于催化青霉素G鉀鹽水解制6-APA反應(yīng)，固定化酶的表觀活性為356U/g。
實(shí)施例7偶氮二異丁腈用量為0.41克，其余組分的用量和制備條件與實(shí)施例1相同。合成樣品的粒度在80～120目的珠體所占的重量百分比為11.2％，以60-80目的珠狀共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G鉀鹽水解制6-APA反應(yīng)，固定化酶的表觀活性為315U/g。
實(shí)施例8甲酰胺用量為25毫升，其余組分的用量和制備條件與實(shí)施例1相同。合成樣品的粒度在80～120目的珠體所占的重量百分比為15.2％，以不同粒徑的珠狀共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G鉀鹽水解制6-APA反應(yīng)，固定化酶的表觀活性如下表載體的粒徑(目)20～4040～6060～80 80～100 100～120固定化酶的表觀活性(U/g) 312 403 474 530 630實(shí)施例9聚合溫度為65℃，其余條件與實(shí)施例1相同。合成樣品的粒度在80～120目的珠體所占的重量百分比為27.1％，以60-80目的珠狀共聚物固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G鉀鹽水解制6-APA反應(yīng)，固定化酶的表觀活性為263U/g。
實(shí)施例10
正庚烷用量為96毫升，四氯乙烯用量為96毫升，甲酰胺用量為25毫升，攪拌轉(zhuǎn)速500rpm，其余條件與實(shí)施例2相同。合成樣品的粒度在80～120目的珠體所占的重量百分比為77.6％，以100-120目的珠狀共聚物固定化青霉素?；?，用于催化青霉素G鉀鹽水解制6-APA反應(yīng)，固定化酶的表觀活性為798U/g。
權(quán)利要求
1.一種小粒徑窄分布青霉素?；腹潭ɑd體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟將含有表面活性劑的有機(jī)分散相加入到含有乙烯基化合物的甲酰胺溶液中，在引發(fā)劑的作用下，在惰性氣氛中聚合3-10小時，反應(yīng)結(jié)束后，收集珠狀載體，然后采用常規(guī)的方法進(jìn)行純化，即可獲得小粒徑窄分布青霉素?；腹潭ɑd體；所說的分散相選自環(huán)己烷、正庚烷或四氯乙烯中的一種或一種以上；所說的表面活性劑選自司班-80、司班-60、硬脂酸鈣、聚乙二醇、十二烷基苯磺酸鈉中的一種或一種以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，反應(yīng)溫度為40-80℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所采用的乙烯基化合物為丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺或N，N’-亞甲基雙甲基丙烯酰胺中的兩種或兩種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說的引發(fā)劑選自偶氮類引發(fā)劑或過氧化物類引發(fā)劑中的一種，引發(fā)劑的加入量為乙烯基化合物的1-10％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所采用的常規(guī)純化方法是用親水性溶劑清洗固定化載體，再用疏水性溶劑清洗固定化載體；
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，有機(jī)分散相中表面活性劑的重量濃度為1～50％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，分散相的質(zhì)量為乙烯基化合物的1-50倍，表面活性劑的質(zhì)量為乙烯基化合物的1-20倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，甲酰胺溶液中乙烯基化合物的重量濃度為10-90％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小粒徑窄分布青霉素?；腹潭ɑd體的制備方法。包括以下步驟將含有表面活性劑的有機(jī)分散相加入到含有乙烯基化合物的甲酰胺溶液中，在引發(fā)劑的作用下，在惰性氣氛中聚合3－10小時，反應(yīng)結(jié)束后，收集珠狀載體，然后采用常規(guī)的方法進(jìn)行純化，即獲得小粒徑窄分布青霉素?；腹潭ɑd體。采用本發(fā)明的方法制備的青霉素酰化酶固定化載體，粒度相對集中，載體固定青霉素?；负?，用以催化水解青霉素G鉀鹽制備6－APA，表觀酶活可達(dá)798 U/g以上(以干重計(jì))，且制備成本低廉。
文檔編號C12N11/08GK1603406SQ200410067059
公開日2005年4月6日 申請日期2004年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月11日
發(fā)明者盧冠忠, 烏云高娃, 郭楊龍, 王筠松, 郭耘 申請人:華東理工大學(xué)