專利名稱：α－葡萄糖苷酶固定化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種α-葡萄糖苷酶固定化的工藝方法，屬有機化學酶化學工程技術領域。
背景技術：
據報道，日本、歐美和中國都很關注低聚異麥芽糖的工業(yè)化生產和相關研究工作，作為低聚異麥芽糖工業(yè)化生產關鍵酶制劑α-葡萄糖苷酶，倍受國內外食品工業(yè)界的重視。而由于α-葡萄糖苷酶的穩(wěn)定性和可控性欠佳，以及價格昂貴等問題，在一定程度上制約了低聚異麥芽糖的發(fā)展和應用。而酶工程的主要內容就是把游離酶固定化，稱為固定化酶。采用固定化酶技術，不但能降低成本，還能提高酶的耐酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、耐有機溶劑性及儲存穩(wěn)定性等，而且能增強工程可控性，因此與游離酶相比，具有明顯優(yōu)勢。
在固定化酶領域中，關鍵技術是交聯試劑與載體的選擇及其最佳匹配。目前普遍用于固定具有胺基功能載體的交聯試劑是戊二醛。但該交聯試劑存在一些如下問題在交聯反應中醛基與胺基所形成的C＝N席夫鍵易于水解，特別是在較高溫度時水解更嚴重，在固定化過程中，酶活性損失較大；在貯存中由于自動聚合而形成很多不同物質，性質不穩(wěn)定；另外戊二醛也是一種有毒物質，對操作者身體不利。國外報道有一種新型的交聯試劑-三羥甲基磷，可用于具有胺基功能的載體，交連反應在室溫下自動進行。據報道，用該三羥甲基磷交聯試劑固定化的酶有尿素酶、醇脫氫酶等，但未見用該試劑固定α-葡萄糖苷酶的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種α-葡萄糖苷酶的固定化的工藝方法。
本發(fā)明的一種α-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于以殼聚糖為載體，用三羥甲基磷交聯固定α-葡萄糖苷酶，該方法具有以下工藝步驟a.殼聚糖的預處理先制備高脫乙酰度殼聚糖，取一定量的殼聚糖，加入一定濃度的NaOH溶液，在130℃下攪拌反應時間5小時，然后水洗至中性，在105℃下干燥，經粉粹，過120目的篩，得到經預處理的殼聚糖，其脫乙酰度為93％；
b.三羥甲基磷的制備取等摩爾量的四羥甲基氯化磷和KOH，分別溶于水中，在室溫和劇烈攪拌下把KOH水溶液滴加到四羥甲基氯化磷水溶液中，滴加完畢則反應結束，得三羥甲基磷；c.交聯固定α-葡萄糖苷酶將前述經預處理過的殼聚糖迅速加入至上述的含有三羥甲基磷的反應液中，在室溫下反應8分鐘，然后過濾，并水洗殘留的四羥甲基氯化磷，然后再用pH6.0，含有1mM的巰基乙醇和0.5mM的EDTA的磷酸鉀緩沖液進行洗滌，最后加入濃度為0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶1ul；在5℃下進行固定化，時間為2小時；待固定化完畢，用PH6.8的磷酸鉀緩沖液洗出未交聯的α-葡萄糖苷酶，然后在采用考馬斯亮藍G-250法的監(jiān)測下，進一步用1M的NaCl水溶液洗盡未交聯的酶，接著再依次用水、PH6.8的磷酸鉀緩沖液洗滌，最后在4℃下保存存在于緩沖液中的固定化的α-葡萄糖苷酶。
固定α-葡萄糖苷酶的反應式如下所示 三羥甲基磷(THP)能與胺基物質發(fā)生Mannich反應，所以能與具有胺基功能的載體殼聚糖發(fā)生交聯反應，交聯反應在室溫下自動進行，所形成的P-CH2-N鍵非常穩(wěn)定，不水解，可長期保存。
上述工藝步驟中，磷酸鉀緩沖液中加入巰基乙醇是防止酶在溫度高和沖洗過程中失活，EDTA則是防止有重金屬毒害酶。
本發(fā)明以殼聚糖為載體，用三羥甲基磷交聯固定α-葡萄糖苷酶，克服了傳統使用的交聯劑戊二醛的不足，特別是在固定化過程中在較高溫度時，使酶活性損失減少，酶的復活回收率較高。另外，本發(fā)明方法固定的α-葡萄糖苷酶的耐酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、耐有機溶劑性及儲存穩(wěn)定性與游離的酶和用戊二醛作交聯劑固定的該酶相比，均有較大提高。
具體實施例方式
現將本發(fā)明的具體實施例敘述于后。
實施例一本實施例的具體工藝步驟如下a.殼聚糖的預處理先制備高脫乙酰度殼聚糖，取20g殼聚糖，加入350mL濃度為40％NaOH，在130℃下攪拌反應時間5小時，然后水洗至中性，在105℃干燥，經粉粹，過120目的篩，得預處理的殼聚糖，其脫乙酰度為93％。
b.三羥甲基磷(THP)的制備取等摩爾量的四羥甲基氯化磷(THPC)和KOH，分別溶于90mL和10mL的水中，在室溫和劇烈攪拌下，把KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完畢則反應結束。該反應液中所得到的三羥甲基磷(THP)的濃度為2.5mg/ml。
c.交聯劑固定α-葡萄糖苷酶將前述經處理過的殼聚糖70mg迅速加入于上述100ml含三羥甲基磷的反應液中(濃度為2.5mg/ml，則相當于250mg三羥甲基磷)，在室溫反應8分鐘。然后進行過濾，并用水洗殘留的三羥甲基磷(THP)，然后用pH6.0，含有1mM的巰基乙醇和0.5mM的EDTA的磷酸鉀緩沖液洗滌，，最后加入1ulα-葡萄糖苷酶(0.1U/mL)，在5℃下進行固定化，固化時間為2小時；待固定化完畢，用PH6.8的磷酸鉀緩沖液洗出未交聯的α-葡萄糖苷酶，然后在采用考馬斯亮藍G-250法的監(jiān)測下，進一步用1M的NaCl水溶液洗盡未交聯的酶，接著依次用水、PH6.8的磷酸鉀緩沖液洗，最后在4℃下保存存在于該緩沖液中的α-葡萄糖苷酶。
本發(fā)明實施例中，對殼聚糖的預處理，其脫乙酰度的高低及殼聚糖的顆粒大小均直接影響著α-葡萄糖苷酶的固定化，本實施例中，脫乙酰度為93％，粒度過120目篩是比較適宜的，它能使交聯劑載體的酶增多。
本實施例中，所用的四羥甲基氯化磷(THPC)和KOH是等摩爾量，KOH不能過量，過量的OH-會催化加速生成沒有固定化能力的(HOCH2)3P＝O (THPO)和殼聚糖-CH2(HOCH2)2P＝O，不利于固定化過程。本實施例中采用四羥甲基氯化磷(THPC)來制取三羥甲基磷(THP)，其原因是THPC是一種工業(yè)化大生產的阻燃劑，價格便宜，易于購得，可降低制造成本。
經實驗測定，本實施例中1μm游離α-葡萄糖苷酶(0.1u/ml)的OD(吸光度)為0.8，采用三羥甲基磷固定化的α-葡萄糖苷酶的OD為0.229，未被交聯固定的α-葡萄糖苷酶的OD為0.244，由計算而得固定化酶回收率為41.2％。
α-葡萄糖苷酶能水解底物PNPG產生對硝基苯酚(PNP)，PNP在400nm處有最大紫外吸收，所以α-葡萄糖苷酶的活性可通過測定PNP在400nm處的吸光度OD值來測定。本實施例中采用UV-260型等外分光光度計在400nm處測定PNP吸光度OD值。
通過實驗表明，三羥甲基磷交聯劑固定的α-葡萄糖苷酶具有較好的物理化學性能(1)有較強的耐酸堿能力，它在PH4.0條件下連續(xù)操作4小時，活性基本沒變化；在有底物PNPG的碳酸鈉溶液(0.1mol/L，PH＝10)中在37℃水浴下10分鐘，它的活性僅減少15％，而用戊二醛交聯固定的該酶其活性減少62％；游離的α-葡萄糖苷酶則馬上失活。
(2)耐有機溶劑能力強，它能在甲醇∶磷酸鉀(PH6.8)緩沖液＝1∶1中正常地水解底物PNPG，在甲醇∶磷酸鉀(PH6.8)緩沖液＝1∶2中水解底物PNPG的能力比正常情況下高58.5％。
(3)熱穩(wěn)定性劑儲存穩(wěn)定性高，固定化的α-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性劑儲存穩(wěn)定性要比游離α-葡萄糖苷酶高出很多，在160℃下的半衰期為17小時。
權利要求
1.一種α-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于以殼聚糖為載體，用三羥甲基磷交聯固定α-葡萄糖苷酶，該方法具有以下工藝步驟a.殼聚糖的預處理先制備高脫乙酰度殼聚糖，取一定量的殼聚糖，加入一定濃度的NaOH溶液，在130℃下攪拌反應時間5小時，然后水洗至中性，在105℃下干燥，經粉粹，過120目的篩，得到經預處理的殼聚糖，其脫乙酰度為93％；b.三羥甲基磷的制備取等摩爾量的四羥甲基氯化磷和KOH，分別溶于水中，在室溫和劇烈攪拌下把KOH水溶液滴加到四羥甲基氯化磷水溶液中，滴加完畢則反應結束，得三羥甲基磷；c.交聯固定α-葡萄糖苷酶將前述經預處理過的殼聚糖迅速加入至上述的含有三羥甲基磷的反應液中，在室溫下反應8分鐘，然后過濾，并水洗殘留的四羥甲基氯化磷，然后再用pH6.0，含有1mM的巰基乙醇和0.5mM的EDTA的磷酸鉀緩沖液進行洗滌，最后加入濃度為0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶1ul；在5℃下進行固定化，時間為2小時；待固定化完畢，用PH6.8的磷酸鉀緩沖液洗出未交聯的α-葡萄糖苷酶，然后在采用考馬斯亮藍G-250法的監(jiān)測下，進一步用1M的NaCl水溶液洗盡未交聯的酶，接著再依次用水、PH6.8的磷酸鉀緩沖液洗滌，最后在4℃下保存存在于緩沖液中的固定化的α-葡萄糖苷酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種α－葡萄糖苷酶固定化的工藝方法，屬有機化學酶化學工程技術領域。本發(fā)明的一種α－葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于以殼聚糖為載體，用三羥甲基磷交聯固定α－葡萄糖苷酶，該方法具有以下工藝步驟(1)殼聚糖的預處理，使脫去乙?；?，獲得高脫乙酰度的殼聚糖；(2)用四羥甲基氯化磷和KOH反應制取三羥甲基磷；(3)交聯固定α－葡萄糖苷酶將前述經預處理過的殼聚糖迅速加入至上述的含有三羥甲基磷的反應液中，在室溫下反應8分鐘，然后過濾，水洗、磷酸鉀緩沖液洗滌，最后加入濃度為0.1U/mL的α－葡萄糖苷酶1ul；在5℃下進行固定化，時間為2小時；待固定化完畢，在依次用水、磷酸鉀緩沖液洗滌，最后在4℃下保存好固定化的α－葡萄糖苷酶。
文檔編號C12N11/00GK1618959SQ200410067070
公開日2005年5月25日 申請日期2004年10月12日 優(yōu)先權日2004年10月12日
發(fā)明者雍克嵐, 呂敬慈, 盧大勝, 陳旭, 馮偲慜, 顧慧娟 申請人:上海大學