專利名稱：金龜子綠僵菌固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵工程技術領域，具體地指一種用甘蔗渣作為培養(yǎng)基的金龜子綠僵菌固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)方法。
背景技術：
微生物防治害蟲最早可追溯到上世紀初，俄國人梅契尼可夫就利用綠僵菌防治金龜子幼蟲，但直到上世紀50年代，“以菌治蟲”的研究和生產(chǎn)才得到迅速發(fā)展?；瘜W防治雖具有防效高、速度快、防治譜廣、成本低、使用簡便等優(yōu)點，但由于化學殺蟲劑大規(guī)模地生產(chǎn)和無限制地大量使用，嚴重地污染了人類環(huán)境和農(nóng)林牧產(chǎn)品，危害了人畜健康和水資源，并使害蟲產(chǎn)生抗性，天敵消失，自然生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞。而微生物殺蟲劑具有對人畜安全、對天敵昆蟲無害、選擇性高、對生態(tài)系統(tǒng)影響小、不易產(chǎn)生抗藥性等特點，因此世界各國越來越強調(diào)應用昆蟲病原體作殺蟲劑。其中，金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)是一種廣譜蟲生真菌，具有寄主范圍廣、致病力強、對人、畜、農(nóng)作物無毒、無殘毒、菌劑易生產(chǎn)、后效期長等優(yōu)點，具有廣泛的應用前景。
目前，金龜子綠僵菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝研究較多，但固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝研究相對較少。供固態(tài)發(fā)酵的基質(zhì)通常有麩皮、米糠等。金龜子綠僵菌在此類基質(zhì)上進行生長、繁殖并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，會受到基質(zhì)的物理因素(底物顆粒大小、形狀、空隙率、纖維含量、黏度、顆粒之間擴散率等)和化學因素(聚合度、疏水性、結晶度及電化學性質(zhì)等)的影響，麩皮、玉米粉等混合培養(yǎng)基經(jīng)過高溫滅菌后，存在著粘度增加(影響傳質(zhì)傳熱)、疏松度不夠、孔隙率低、后續(xù)接種(過程控制)困難等情況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了解決上述現(xiàn)有技術中存在的不足之處，提供一種金龜子綠僵菌固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)方法。該方法采用甘蔗渣作為培養(yǎng)基原料及載體，克服了采用麩皮、米糠等混合培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中所遇到的疏松度不夠、孔隙率低、影響傳質(zhì)傳熱、過程控制較難等問題。
本發(fā)明通過如下技術方案來實現(xiàn)本發(fā)明所述金龜子綠僵菌固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)方法，包括配制金龜子綠僵菌孢懸液并接種在固態(tài)反應器中的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，收集金龜子綠僵菌分生孢子粉后干燥作為成品，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基主要原料為甘蔗渣，并配以一定的輔料及營養(yǎng)鹽，按重量份計包括如下成分組成甘蔗渣15～50份、玉米粉1～25份、水10～55份、硫酸銅0.001～0.01份、硫酸鎂0.01～0.2份、磷酸二氫鉀0.01～0.2份。
為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明，所述金龜子綠僵菌孢懸液首先在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種，再將所述固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種接種在固態(tài)反應器中的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)；所述固態(tài)發(fā)酵種子的接種量為固態(tài)反應器中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的1～15％；所述固態(tài)反應器中通入0～5vvm(m3空氣/m3培養(yǎng)基·min)的無菌空氣。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點和有益效果本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡單，設備條件要求不高，且甘蔗渣原料來源廣泛、集中、成分單一、質(zhì)量可控、不需分選處理，生產(chǎn)成本不高；培養(yǎng)時間縮短；發(fā)酵過程中甘蔗渣固體形態(tài)保持較好，疏松度較大，孔隙率較高，易于傳熱傳質(zhì)，有利于深層固態(tài)發(fā)酵中過程控制；發(fā)酵結束時，基料干燥后，孢子粉易與甘蔗渣分離易收集孢子；生產(chǎn)可以實現(xiàn)規(guī)?；蓽p緩對環(huán)境的污染。因此，本發(fā)明的生產(chǎn)工藝有著切實的經(jīng)濟效益和實用價值。
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發(fā)明做進一步地詳細說明。
在本發(fā)明的各實施例中，所用金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)為公知公用的菌種。
實施例一第一步 生產(chǎn)種的培養(yǎng)1、金龜子綠僵菌孢懸液的配制將保藏在PDA斜面的金龜子綠僵菌菌種活化，在27℃培養(yǎng)3天，產(chǎn)生大量橄欖綠色分生孢子。在超凈工作臺上用已滅菌的0.05％吐溫-80洗出孢子，轉(zhuǎn)移到無菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振蕩2小時，顯微鏡檢查，孢子分散即可，紗布過濾除去菌絲，調(diào)整分生孢子濃度至105～106孢子/ml。此金龜子綠僵菌孢懸液作為母種。
2、固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種的制備以20克甘蔗渣、1克玉米粉、15克水、0.01克KH2PO4、0.01克MgSO4、0.001克CuSO4混合成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為5.5，放入250ml的三角瓶中，用玻璃棒攪拌均勻，覆蓋八層紗布；121℃蒸汽滅菌30～45分鐘；冷卻后在超凈工作臺上接入孢懸液，于27℃、相對濕度60～70％的黑暗條件下培養(yǎng)3天，培養(yǎng)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種。
第二步 固態(tài)反應器中的培養(yǎng)在10L固態(tài)反應器中加入與前述相同配比的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為6.0，121℃蒸汽滅菌30～45分鐘。冷卻后，在黑暗培養(yǎng)室內(nèi)，將占固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的1％固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種接入反應器中，置于26℃、相對濕度60～70％的條件下，前12小時通入通氣率為0vvm、12～24小時通入通氣率為3vvm、24小時之后通入通氣率為2vvm的無菌空氣，進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)5天，產(chǎn)孢量達到1.2×109孢子/g干培養(yǎng)基。
第三步 80目過篩收集固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的金龜子綠僵菌分生孢子，將其放入真空干燥箱內(nèi)進行干燥，溫度設為25℃，干燥24小時后取出，測得其含水率為5.7％。
實施例二第一步 生產(chǎn)種的培養(yǎng)1、金龜子綠僵菌孢懸液的配制將保藏在PDA斜面的金龜子綠僵菌菌種活化，在27℃培養(yǎng)5天，產(chǎn)生大量橄欖綠色分生孢子。在超凈工作臺上用已滅菌的0.05％吐溫-80洗出孢子，轉(zhuǎn)移到無菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振蕩3小時，顯微鏡檢查，孢子分散即可，紗布過濾除去菌絲，調(diào)整分生孢子濃度至105～106個孢子/ml。此金龜子綠僵菌孢懸液作為母種。
2、固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種的制備以15克甘蔗渣、25克玉米粉、10克水、0.1克KH2PO4、0.05克MgSO4、0.01克CuSO4混合成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為6.5，放入250ml的三角瓶中，用玻璃棒攪拌均勻，覆蓋八層紗布；121℃蒸汽滅菌30～45分鐘；冷卻后在超凈工作臺上接入孢懸液，于27℃、相對濕度60～70％的光照條件下培養(yǎng)3天。
第二步 固態(tài)反應器中的培養(yǎng)在10L固態(tài)反應器中加入與前述相同配比的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為5.5，121℃蒸汽滅菌30～45分鐘。冷卻后，在黑暗培養(yǎng)室內(nèi)，將占固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的2％固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種接入反應器中，置于24℃、相對濕度60～70％的條件下，前12小時通入通氣率為0vvm、12～24小時通入通氣率為5vvm、24小時之后通入通氣率為1vvm的無菌空氣，進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)5天，產(chǎn)孢量達到4.0×109孢子/g干培養(yǎng)基。
第三步 80目過篩收集固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的金龜子綠僵菌分生孢子，將其放入真空干燥箱內(nèi)進行干燥，溫度設為24℃，干燥24小時后取出，測得其含水率為6.2％。
實施例三第一步 生產(chǎn)種的培養(yǎng)1、金龜子綠僵菌孢懸液的配制將保藏在PDA斜面的金龜子綠僵菌菌種活化，在27℃培養(yǎng)4天，產(chǎn)生大量橄欖綠色分生孢子。在超凈工作臺上用已滅菌的0.05％吐溫-80洗出孢子，轉(zhuǎn)移到無菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振蕩2小時，顯微鏡檢查，孢子分散即可，紗布過濾除去菌絲，調(diào)整分生孢子濃度至105～106個孢子/ml。此金龜子綠僵菌孢懸液作為母種。
2、固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種的制備以50克甘蔗渣、15克玉米粉、55克水、0.2克KH2PO4、0.1克MgSO4、0.005克CuSO4混合成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為6.0，放入250ml的三角瓶中，用玻璃棒攪拌均勻，覆蓋八層紗布；121℃蒸汽滅菌30～45分鐘；冷卻后在超凈工作臺上接入孢懸液，于27℃、相對濕度60～70％的黑暗條件下培養(yǎng)3天。
第二步 固態(tài)反應器中的培養(yǎng)在10L固態(tài)反應器中加入與前述相同配比的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為6.5，121℃蒸汽滅菌30～45分鐘。冷卻后，在光照條件下，將占固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的15％固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種接入反應器中，置于25℃、相對濕度60～70％的條件下，前12小時通入通氣率為0vvm、12小時之后通入通氣率為4vvm的無菌空氣，進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)4天，產(chǎn)孢量達到1.3×109孢子/g干培養(yǎng)基。
第三步 80目過篩收集固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的金龜子綠僵菌分生孢子，將其放入真空干燥箱內(nèi)進行干燥，溫度設為24℃，干燥24小時后取出，測得其含水率為5.9％。
實施例四第一步 生產(chǎn)種的培養(yǎng)
1、金龜子綠僵菌孢懸液的配制將保藏在PDA斜面的金龜子綠僵菌菌種活化，在27℃培養(yǎng)3天，產(chǎn)生大量橄欖綠色分生孢子。在超凈工作臺上用已滅菌的0.05％吐溫-80洗出孢子，轉(zhuǎn)移到無菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振蕩2小時，顯微鏡檢查，孢子分散即可，紗布過濾除去菌絲，調(diào)整分生孢子濃度至105～106個孢子/ml。此金龜子綠僵菌孢懸液作為母種。
2、固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種的制備以30克甘蔗渣、5克玉米粉、25克水、0.05克KH2PO4、0.2克MgSO4、0.008克CuSO4混合成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為7.5，放入250ml的三角瓶中，用玻璃棒攪拌均勻，覆蓋八層紗布；121℃蒸汽滅菌30～45分鐘；冷卻后在超凈工作臺上接入孢懸液，于24℃、相對濕度60～70％的黑暗條件下培養(yǎng)5天。
第二步 固態(tài)反應器中的培養(yǎng)在10L固態(tài)反應器中加入與前述相同配比的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為7.0，121℃蒸汽滅菌30～45分鐘。冷卻后，在黑暗培養(yǎng)室內(nèi)，將占固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的5％固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種接入反應器中，置于30℃、相對濕度60～70％的條件下，前12小時通入通氣率為0vvm、12小時之后通入通氣率為2.5vvm的無菌空氣，進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)3天，產(chǎn)孢量達到1.8×1010孢子/g干培養(yǎng)基。
第三步80目過篩收集固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的金龜子綠僵菌分生孢子，將其放入真空干燥箱內(nèi)進行干燥，溫度設為24℃，干燥24小時后取出，測得其含水率為5.8％。
實施例五第一步 生產(chǎn)種的培養(yǎng)1、金龜子綠僵菌孢懸液的配制將保藏在PDA斜面的金龜子綠僵菌菌種活化，在27℃培養(yǎng)3～5天，產(chǎn)生大量橄欖綠色分生孢子。在超凈工作臺上用已滅菌的0.05％吐溫-80洗出孢子，轉(zhuǎn)移到無菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振蕩2小時，顯微鏡檢查，孢子分散即可，紗布過濾除去菌絲，調(diào)整分生孢子濃度至105～106個孢子/ml。此金龜子綠僵菌孢懸液作為母種。
2、固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種的制備以25克甘蔗渣、7.5克玉米粉、45克水、0.08克KH2PO4、0.03克MgSO4、0.009克CuSO4混合成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為7.0，放入250ml的三角瓶中，用玻璃棒攪拌均勻，覆蓋八層紗布；121℃蒸汽滅菌30～45分鐘；冷卻后在超凈工作臺上接入孢懸液，于27℃、相對濕度60～70％的光照條件下培養(yǎng)3天。
第二步 固態(tài)反應器中的培養(yǎng)在10L固態(tài)反應器中加入與前述相同配比的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為6.0，121℃蒸汽滅菌30～45分鐘。冷卻后，在光照條件下，將占固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的4.5％固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種接入反應器中，置于30℃、相對濕度60～70％的條件下，前12小時通入通氣率為0vvm、12～24小時通入通氣率為2.5vvm、24小時之后通入通氣率為1vvm的無菌空氣，進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)5天，產(chǎn)孢量達到5.0×109孢子/g干培養(yǎng)基。
第三步80目過篩收集固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的金龜子綠僵菌分生孢子，將其放入真空干燥箱內(nèi)進行干燥，溫度設為24℃，干燥24小時后取出，測得其含水率為6.1％。
實施例六第一步 生產(chǎn)種的培養(yǎng)1、金龜子綠僵菌孢懸液的配制將保藏在PDA斜面的金龜子綠僵菌菌種活化，在27℃培養(yǎng)3天，產(chǎn)生大量橄欖綠色分生孢子。在超凈工作臺上用已滅菌的0.05％吐溫-80洗出孢子，轉(zhuǎn)移到無菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振蕩2小時，顯微鏡檢查，孢子分散即可，紗布過濾除去菌絲，調(diào)整分生孢子濃度至105～106個孢子/ml。此金龜子綠僵菌孢懸液作為母種。
2、固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種的制備以40克甘蔗渣、10克玉米粉、35克水、0.15克KH2PO4、0.15克MgSO4、0.003克CuSO4混合成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為5.5，放入250ml的三角瓶中，用玻璃棒攪拌均勻，覆蓋八層紗布；121℃蒸汽滅菌30～45分鐘；冷卻后在超凈工作臺上接入孢懸液，于26℃、相對濕度60～70％的黑暗條件下培養(yǎng)3天。
第二步 固態(tài)反應器中的培養(yǎng)在10L固態(tài)反應器中加入與前述相同配比的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為7.0，121℃蒸汽滅菌30～45分鐘。冷卻后，在黑暗培養(yǎng)室內(nèi)，將占固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的8％固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種接入反應器中，置于28℃、相對濕度60～70％的條件下，進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，通入0vvm的無菌空氣，培養(yǎng)3天，產(chǎn)孢量達到5×1010孢子/g干培養(yǎng)基。
第三步 80目過篩收集固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的金龜子綠僵菌分生孢子，將其放入真空干燥箱內(nèi)進行干燥，溫度設為24℃，干燥24小時后取出，測得其含水率為6.0％。
實施例七第一步 生產(chǎn)種的培養(yǎng)1、金龜子綠僵菌孢懸液的配制將保藏在PDA斜面的金龜子綠僵菌菌種活化，在27℃培養(yǎng)3天，產(chǎn)生大量橄欖綠色分生孢子。在超凈工作臺上用已滅菌的0.05％吐溫-80洗出孢子，轉(zhuǎn)移到無菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振蕩2小時，顯微鏡檢查，孢子分散即可，紗布過濾除去菌絲，調(diào)整分生孢子濃度至105～106孢子/ml。以此金龜子綠僵菌孢懸液直接作為生產(chǎn)種。
第二步 固態(tài)反應器中的培養(yǎng)在10L固態(tài)反應器中加入與前述相同配比的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為6.0，121℃蒸汽滅菌30～45分鐘。冷卻后，在黑暗培養(yǎng)室內(nèi)，將占固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的10％生產(chǎn)種接入反應器中，置于26℃、相對濕度60～70％的條件下，前12小時通入通氣率為0vvm、12～24小時通入通氣率為3vvm、24小時之后通入通氣率為5vvm的無菌空氣，進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)5天，產(chǎn)孢量達到8.0×109孢子/g干培養(yǎng)基。
第三步 80目過篩收集固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的金龜子綠僵菌分生孢子，將其放入真空干燥箱內(nèi)進行干燥，溫度設為25℃，干燥24小時后取出，測得其含水率為6％。
如上所述，即可較好地實現(xiàn)本發(fā)明。
權利要求
1.金龜子綠僵菌固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)方法，包括配制金龜子綠僵菌孢懸液并接種在固態(tài)反應器中的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，收集金龜子綠僵菌分生孢子粉后干燥作為成品，其特征是，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為甘蔗渣培養(yǎng)基，按重量份計包括如下成分組成甘蔗渣15～50份、玉米粉1～25份、水10～55份、硫酸銅0.001～0.01份、硫酸鎂0.01～0.2份、磷酸二氫鉀0.01～0.2份。
2.根據(jù)權利要求1所述的金龜子綠僵菌固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)方法，其特征是，所述金龜子綠僵菌孢懸液首先在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種，再將所述固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)種接種在固態(tài)反應器中的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。
3.根據(jù)權利要求1所述的金龜子綠僵菌固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)方法，其特征是，所述固態(tài)發(fā)酵種子的接種量為固態(tài)反應器中的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的1～15％。
4.根據(jù)權利要求1所述的金龜子綠僵菌固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)方法，其特征是，所述固態(tài)反應器中通入0～5vvm的無菌空氣。
全文摘要
本發(fā)明是一種金龜子綠僵菌固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)方法，包括配制金龜子綠僵菌孢懸液并接種在固態(tài)反應器中的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上進行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，收集金龜子綠僵菌分生孢子粉后干燥作為成品，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基主要原料為甘蔗渣，并配以一定的輔料及營養(yǎng)鹽，按重量份計包括如下成分組成甘蔗渣15～50份、玉米粉1～25份、水10～55份、硫酸銅0.001～0.01份、硫酸鎂0.01～0.2份、磷酸二氫鉀0.01～0.2份。本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡單，甘蔗渣原料成本不高；培養(yǎng)時間縮短；發(fā)酵過程中甘蔗渣固體形態(tài)保持較好，疏松度較大，孔隙率較高，易于傳熱傳質(zhì)，有利于深層固態(tài)發(fā)酵中過程控制；易收集孢子；生產(chǎn)可以實現(xiàn)規(guī)?；?，可減緩對環(huán)境的污染。
文檔編號C12N1/14GK1587375SQ20041005122
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月26日 優(yōu)先權日2004年8月26日
發(fā)明者吳振強, 裘暉, 張高賢, 李運南, 夏楓耿, 熊輝華 申請人:華南理工大學