一種小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種固態(tài)發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]木霉(Trichoderma)屬于半知菌亞門,絲孢目,木霉屬真菌。兼具“木霉生物菌肥”,“木霉生物農(nóng)藥”,“木霉植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑”三大特性。世界各國(guó)紛紛將木霉菌應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。木霉菌生長(zhǎng)迅速,產(chǎn)孢需要大量的氧氣和營(yíng)養(yǎng)。小規(guī)模發(fā)酵,條件控制不好,常常導(dǎo)致發(fā)酵失敗。一是產(chǎn)孢量達(dá)不到需要,二是發(fā)酵后期自溶現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生,這些嚴(yán)重影響了后期田間試驗(yàn)菌肥效果的發(fā)揮。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有小規(guī)模發(fā)酵木霉菌存在產(chǎn)孢量少,發(fā)酵后期出現(xiàn)自溶現(xiàn)象的問(wèn)題,而提供了一種小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法。
[0004]一種小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法,按以下步驟進(jìn)行:
[0005]—、制備PDA斜面培養(yǎng)基并接種木霉菌,室溫培養(yǎng)4?6天,然后用滅菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)基上的木霉分生孢子,制備成濃度為10s?10 個(gè)孢子/mL的菌液;
[0006]二、按重量百分比稱取80%的稻殼、18%的麥麩、1 %的玉米面和1%的黃顯粉,加入自來(lái)水至濕度為180%,攪勻后裝入聚丙烯滅菌袋,然后于121°C滅菌2.5h,獲得滅菌后的發(fā)酵料;
[0007]三、無(wú)菌托盤中裝入150?160g滅菌后的發(fā)酵料,加入lmL步驟一中的菌液并拌勻,然后用保鮮膜封口,室溫,自然光下培養(yǎng)至木霉菌菌絲體布滿發(fā)酵料,然后用鑷子在保鮮膜表面扎孔,托盤的4個(gè)角,每個(gè)角扎兩個(gè)孔,待發(fā)酵料上布滿木霉分生孢子后,將孔擴(kuò)大2倍,繼續(xù)發(fā)酵至孢子全部散出,即完成小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵。
[0008]本發(fā)明中小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法,無(wú)需嚴(yán)格控制生產(chǎn)條件,操作簡(jiǎn)單,且無(wú)需大型設(shè)備,無(wú)需設(shè)立單獨(dú)的生產(chǎn)空間,適合于在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行小規(guī)模生產(chǎn);同時(shí)木霉菌產(chǎn)孢量少,發(fā)酵周期短,僅用10天左右即可完成,并且發(fā)酵后期不會(huì)出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。
[0009]本發(fā)明中小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法,采用的發(fā)酵料配比合理,營(yíng)養(yǎng)均衡,能夠滿足多數(shù)木霉菌的大量生長(zhǎng)繁殖,且成本低。采用托盤裝料后發(fā)酵,累疊擺放高至屋頂,充分利用室內(nèi)空間,占地面積小,通風(fēng)良好,托盤可反復(fù)使用,且不用購(gòu)買培養(yǎng)架,節(jié)約成本。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為實(shí)施例中托盤采用長(zhǎng)、寬的朝向互換上下累疊擺放的圖;
[0011]圖2為實(shí)施例中發(fā)酵10天后孢子全部散出的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】,還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0013]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法,按以下步驟進(jìn)行:
[0014]一、制備PDA斜面培養(yǎng)基并接種木霉菌,室溫培養(yǎng)4?6天,然后用滅菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)基上的木霉分生孢子,制備成濃度為10s?10 個(gè)孢子/mL的菌液;
[0015]二、按重量百分比稱取80%的稻殼、18%的麥麩、1%的玉米面和1%的黃豆粉,加入自來(lái)水至濕度為180%,攪勻后裝入聚丙烯滅菌袋,然后于121°C滅菌2.5h,獲得滅菌后的發(fā)酵料;
[0016]三、無(wú)菌托盤中裝入150?160g滅菌后的發(fā)酵料,加入lmL步驟一中的菌液并拌勻,然后用保鮮膜封口,室溫,自然光下培養(yǎng)至木霉菌菌絲體布滿發(fā)酵料,然后用鑷子在保鮮膜表面扎孔,托盤的4個(gè)角,每個(gè)角扎兩個(gè)孔,待發(fā)酵料上布滿木霉分生孢子后,將孔擴(kuò)大2倍,繼續(xù)發(fā)酵至孢子全部散出,即完成小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵。
[0017]本實(shí)施方式步驟二中發(fā)酵料裝入聚丙烯滅菌袋,裝料要緊實(shí),保證放入高壓鍋時(shí),能直立,滅菌袋與滅菌袋之間形成縫隙,保證在高壓鍋中的高壓熱空氣能夠均勻分布,滅菌均勻徹底。
[0018]本實(shí)施方式步驟二中配制好的發(fā)酵料必須馬上滅菌,避免雜菌生長(zhǎng),使發(fā)酵料的營(yíng)養(yǎng)改變;滅菌后的發(fā)酵料在1?2天之內(nèi)務(wù)必接菌,放置時(shí)間長(zhǎng),易污染。
[0019]本實(shí)施方式步驟二中滅菌后的發(fā)酵料若散發(fā)臭味或酸味,則是受到細(xì)菌或酵母菌污染,滅菌失敗。
[0020]本實(shí)施方式步驟三中無(wú)菌托盤:托盤用洗潔精刷洗一遍,流水徹底沖洗,托盤倒扣摞在一起,避免室內(nèi)雜菌落入,污染托盤,同時(shí),托盤壁上的水珠容易流出,很快晾干。
[0021]本實(shí)施方式步驟三中的操作環(huán)境要求清潔,徹底擦凈操作臺(tái),并將室內(nèi)地面拖擦干凈;戴上無(wú)菌一次性PE手套,將菌液與發(fā)酵料拌勻。
[0022]本實(shí)施方式步驟三中無(wú)菌托盤中裝入150?160g滅菌后的發(fā)酵料,原因是發(fā)酵料太薄容易失水變干,太厚菌絲體長(zhǎng)滿之后透氣性差,不容易產(chǎn)孢。
[0023]本實(shí)施方式步驟三中保鮮膜封口后,可以標(biāo)記接菌時(shí)間及菌種的編號(hào),便于后期觀察。
[0024]本實(shí)施方式步驟三中接菌后的托盤采用長(zhǎng)、寬的朝向互換上下累疊擺放。
[0025]本實(shí)施方式步驟三中扎孔目的是保證快速產(chǎn)孢需要的氧氣,促使分生孢子迅速萌發(fā),扎孔后即保證木霉生長(zhǎng)環(huán)境的透氣性,又不會(huì)產(chǎn)生雜菌污染;孔擴(kuò)大目的是使發(fā)酵產(chǎn)物盡快干燥,避免自溶現(xiàn)象發(fā)生。
[0026]本實(shí)施方式步驟三中完成小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵周期:春夏8?10天,秋冬為11?13天;發(fā)酵完成后利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子產(chǎn)量約16億個(gè)活孢子/克發(fā)酵產(chǎn)物;無(wú)雜菌污染。
[0027]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是,步驟一中PDA斜面培養(yǎng)基的配制:200g馬鈴薯、20g葡萄糖、15g瓊脂和1000mL水,裝入聚丙烯大試管中,每管20mL,115°C滅菌30min后擺斜面。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0028]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一或二不同的是,步驟一中木霉菌為棘抱木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536、加納木霉(Trichoderma ghanense)ACCC30153、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ACCC30588、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ACCC30371、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ACCC31959、綠木霉(Trichoderma virens)ACCC32490 或棘抱木霉(Trichoderma asperellum)CFCC88162。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一或二相同。
[0029]本實(shí)施方式中棘抱木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536,購(gòu)買自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心;加納木霉(Trichoderma ghanense)ACCC30153,購(gòu)買自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心;哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ACCC30588,購(gòu)買自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心;哈茨木霉(Trichoderma harzianum) ACCC30371,購(gòu)買自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心;哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ACCC31959,購(gòu)買自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心;綠木霉(Trichoderma virens) ACCC32490,購(gòu)買自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心;棘抱木霉(Trichoderma asperellum)CFCC88162,購(gòu)買自中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0030]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至三之一不同的是,步驟一中聚丙烯大試管的規(guī)格:3cm 口徑X24cm長(zhǎng)。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至三之一相同。
[0031]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至四之一不同的是,步驟一中制備PDA斜面培養(yǎng)基并接種木霉菌,室溫培養(yǎng)5天。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至四之一相同。
[0032]【具體實(shí)施方式】六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至五之一不同的是,步驟一中制備成濃度為109個(gè)孢子/mL的菌液。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至五之一相同。
[0033]【具體實(shí)施方式】七:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至六之一不同的是,步驟二中聚丙烯滅菌袋的規(guī)格:15CmX40Cm。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至六之一相同。
[0034]【具體實(shí)施方式】八:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至七之一不同的是,步驟三中無(wú)菌托盤中裝入155g滅菌后的發(fā)酵料。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至七之一相同。
[0035]【具體實(shí)施方式】九:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至八之一不同的是,步驟三中托盤的規(guī)格:口部外徑:長(zhǎng)X寬X高=42cmX29.5cmX6.5cm,底部?jī)?nèi)徑:長(zhǎng)*寬=36cmX23.5cm ;托盤的材質(zhì):厚度為1.5mm的透明亞克力。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至八之一相同。
[0036]采用以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果:
[0037]實(shí)施例:
[0038]小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法,按以下步驟進(jìn)行:
[0039]—、制備PDA斜面培養(yǎng)基并接種木霉菌,室溫培養(yǎng)5天,然后用滅菌水