專(zhuān)利名稱(chēng)：乙型肝炎和丙型肝炎嵌合抗原基因及其核酸疫苗的制作方法
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種乙型肝炎和丙型肝炎核酸疫苗。
背景技術(shù)：
引起病毒性肝炎的病原體主要是肝炎病毒，包括甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)，危害最為嚴(yán)重的是乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)。
近年的大樣本人群調(diào)查，HBsAg檢出率約10％，包括抗HBs和抗HBc的HBV流行率50％-60％?；悸始s為2770/10萬(wàn)，年發(fā)病率約為230/10萬(wàn)。累計(jì)現(xiàn)行的和既往的，我國(guó)已約有上一半以上人口經(jīng)受HBV感染。丙型肝炎病毒(HCV)感染呈世界性分布，在我國(guó)比HBV攜帶者為少，但健康人群中抗-HCV陽(yáng)性率可達(dá)0.7％-3.1％，在某些地區(qū)獻(xiàn)血員中甚至高達(dá)10％以上。而且慢性型發(fā)生率很高，約有50％患者轉(zhuǎn)為慢性。
HBV屬嗜肝DNA病毒。HBV基因組又由3200堿基對(duì)組成，為環(huán)狀部分雙股DNA，分為長(zhǎng)的負(fù)鏈(L)和短的正鏈(S)兩股。L鏈有4個(gè)開(kāi)放讀碼區(qū)(S、C、P、X區(qū))。S區(qū)又分為前S1、前S2兩區(qū)及S基因，分別編碼包膜上的前S1、前S2蛋白及HBsAg，三者合成為大分子蛋白；前S2蛋白與HBsAg合成為中分子蛋白；HBsAg為主蛋白。前S2區(qū)還編碼多聚人血清白蛋白受體(PHSA-R)。C區(qū)編碼HBcAg，前C區(qū)編碼HBeAg。P區(qū)編碼DNAP。X區(qū)編碼X抗原(HBxAg)。HCV屬黃病毒科，是單股正鏈RNA病毒。目前到少報(bào)道了16株HCV的全基因序列，由于基因型不同，分離的HCV基因組長(zhǎng)度也不一致，一般為9400-10000b以之間，編碼3010～3033個(gè)氨基酸的多蛋白前體。前體蛋白在蛋白酶的裂解作用下，生成成熟的病毒蛋白，包括位于病毒基因組的氨基端的核殼蛋白(C)和包膜蛋白(E1、E2)，位于羧基端的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1/E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b，)。
HBV共有10個(gè)亞型，主要為adr、adw、ayr、ayw等4個(gè)亞型。各地區(qū)的亞型分布不同，我國(guó)以adr和adw為主。HCV病毒株極易變異，不同的HCV株間核酸序列的同源性?xún)H為60％～92％。由于同類(lèi)病毒不同突變株之間核酸序列的同源性如小于80％則分屬不同的基因型，因此目前所獲得的HCV病毒株主要分為4個(gè)主要基因型(HCVI、II、III、IV)，中國(guó)HCV基因型以II型為主。
HBV和HCV的傳播途徑近似，兩者的混合感染較常見(jiàn)。由于HCV的輸血后感染和潛在的腸胃道外傳播且無(wú)有效的防治措施，HCV感染與HBV的混合感染還在繼續(xù)增加。目前的抗病毒治療對(duì)HBV感染效果差，對(duì)HCV感染更差，對(duì)兩者混合感染更不滿(mǎn)意。因此亟待同時(shí)針對(duì)HBV和HCV疫苗的出現(xiàn)。
HBV復(fù)制經(jīng)RNA中間體反轉(zhuǎn)錄，有反轉(zhuǎn)錄活性的DNA聚合酶并無(wú)校正功能，HBV是一種易于變異的病毒。慢性HCV感染每天可合成約1014個(gè)病毒粒子。這一高水平的復(fù)制再加上病毒RNA多聚酶缺乏校正功能，導(dǎo)致病毒快速出現(xiàn)突變和準(zhǔn)株。病毒基因組所有區(qū)域均可發(fā)生突變，其中包膜蛋白變異最大，尤其在E1區(qū)的氨基端存在一段高變序列稱(chēng)為高變區(qū)1(HVR1)。這些都你給HBV/HCV疫苗的研制帶來(lái)極大的困難。
基因疫苗的出現(xiàn)開(kāi)創(chuàng)了預(yù)防與治療傳染性疾病的新時(shí)代。DNA疫苗接種后，蛋白質(zhì)抗原在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，其加工處理過(guò)程與病原的自然感染過(guò)程相似。因此，可以表達(dá)出與病原體相似的抗原。同時(shí)，兩者的抗原提呈過(guò)程亦相同，因而，可以與自然感染一樣誘導(dǎo)接種動(dòng)物既產(chǎn)生細(xì)胞免疫又產(chǎn)生體液免疫。這是滅活疫苗和亞單位疫苗所不能比擬的。另外，DNA疫苗引發(fā)的免疫應(yīng)答持久。由于外源基因可以在體內(nèi)存在較長(zhǎng)時(shí)間，并不斷表達(dá)外源蛋白，可以有效持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)。傳染病基因疫苗的研究已證明，并不是所有病原體的基因片段構(gòu)建成的基因疫苗都能夠誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫應(yīng)答，而且每一種基因疫苗的免疫應(yīng)答能力也是千差萬(wàn)別的?；蛞呙缒軌蛘T導(dǎo)以細(xì)胞免疫為主的保護(hù)性免疫應(yīng)答是其區(qū)別于滅活疫苗與亞單位疫苗的重要標(biāo)志，也是普遍認(rèn)為基因疫苗為難治性傳染病治療方法最有前景的原因之一。
在HBV的基因疫苗研究中，常采用乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)的基因分別構(gòu)建表達(dá)載體，或構(gòu)建兩種蛋白的融合基因，都能誘導(dǎo)免疫接種小鼠出現(xiàn)特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。HCV基因疫苗的研究主要集中在核殼蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)等編碼基因區(qū)，但也有少數(shù)研究采用了包膜區(qū)E1和E2區(qū)進(jìn)行基因免疫。
新型疫苗的研究必須有新的戰(zhàn)略，HBV和HCV全基因組序列的測(cè)出使得二者基因疫苗的研究已展開(kāi)并逐步深入。在詳盡研究病毒分子結(jié)構(gòu)極其生物功能，分析病毒抑制宿主免疫應(yīng)答的分子的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)激活宿主免役細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的分子，從而在病毒基因水平上進(jìn)行人工剪切修飾及組合，去除抑制免疫應(yīng)答的組分，保留誘導(dǎo)編碼不同的保護(hù)性片段，重建成人工疫苗，則可提高免疫效果，抑制病毒突變的免疫逃逸。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供根據(jù)HCV抗原表位的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)、構(gòu)建最佳的HCV疫苗抗原，并選取HBV核心蛋白，開(kāi)發(fā)一種以HCV抗原表位為基礎(chǔ)，以HBV核心蛋白為載體分子的新型乙型肝炎和丙型肝炎嵌合抗原基因及其核酸疫苗。
本發(fā)明乙型肝炎和丙型肝炎嵌合抗原基因，其基因序列是gccaccatgt acaggatgca actcctgtct tgcattgcac taagtcttgc acttgtcaca 60aacagtgcag gcttcgccga cctcatgggg tacattccgc tcgtcggcgc ccccttggcc 120gccgctgcca agttcgtggc tgcctggacc ctgaaggccg ccgctacggg cgactttgac 180tcagtgatcg actgtaacgc cgccgctcag tacatcaagg ctaatagcaa attcatcgga 240atcaccgagc tggccgccgc tgaattcctt tggggcatgg acattgaccc gtataaagaa 300tttggagctt ctgtggagtt actctctttt ttgccttctg acttctttcc ttctattcga 360
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本發(fā)明優(yōu)選HCV基因組中六個(gè)高度保守的免疫優(yōu)勢(shì)表位，在此基礎(chǔ)上加入一個(gè)破傷風(fēng)類(lèi)毒素(TT)的輔助性T淋巴細(xì)胞表位基因及一個(gè)來(lái)源于惡性虐原蟲(chóng)環(huán)子孢子抗原的輔助性T淋巴細(xì)胞表位，各表位間用三個(gè)丙氨酸連接，同時(shí)在上述融合基因的5’端引入hIL-2ER信號(hào)肽引導(dǎo)序列，并優(yōu)化ATG前后堿基使之符合Kozak規(guī)則，并插入位點(diǎn)為EcoRI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，獲得乙型肝炎和丙型肝炎嵌合抗原基因----CEG-HBc。
本發(fā)明所述的HCV基因組中六個(gè)高度保守的免疫優(yōu)勢(shì)表位是1.HCV C129-144ggcttcgccg acctcatggg gtacattccg ctcgtcggcg cccccttg 482.HCV NS3439～449acgggcgact ttgactcagt gatcgactgt aac 33
3.HCV C132-140gacctcatgg ggtacattcc ggccgtc 274.HCV E2(614-622)aggctctggc actacccctg cactgtc 275.HCV NS41711-1732tgtgcctcac acctccctta catcgaacag ggaatgcagc tcgccgagca gttcaagcag aaggcg 666.HCV NS5(2422-2437)tcctatacat ggacaggcgc cttgatcacg ccatgtgctg cggaggag 48本發(fā)明的乙型肝炎和丙型肝炎嵌合核酸疫苗是將上述乙型肝炎和丙型肝炎嵌合抗原基因----CEG-HBc與核酸疫苗表達(dá)載體pVAXI重組，獲得乙型肝炎和丙型肝炎嵌合核酸疫苗----pVAXI-CEG-HBc。
本發(fā)明的乙型肝炎和丙型肝炎嵌合核酸疫苗基因序列是GACTCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA 60ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA 120ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT 180AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA 240CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC 300CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT 360ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT 420GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG 480TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC 540AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA 600GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT GGCTTATCGA 660AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG CGTTTAAACT TAAGCTTGGT 720
ACCGAGCTCG GATCCgccac catgtacagg atgcaactcc tgtcttgcat tgcactaagt 780cttgcacttg tcacaaacag tgcaggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 840ggcgccccct tggccgccgc tgccaagttc gtggctgcct ggaccctgaa ggccgccgct 900acgggcgact ttgactcagt gatcgactgt aacgccgccg ctcagtacat caaggctaat 960agcaaattca tcggaatcac cgagctggcc gccgctgaat tcctttgggg catggacatt 1020gacccgtata aagaatttgg agcttctgtg gagttactct cttttttgcc ttctgacttc 1080tttccttcta ttcgagatct cctcgacacc gcctctgctc tgtatcggga ggccttagag 1140tctccggaac attgttcacc tcaccataca gcactcaggc aagctattct gtgttggggt 1200gagttgatga atctggccac ctgggtggga agtaatttgg aagacccagc atccagggaa 1260ttagtagtca gctatgtcaa cgttaatatg ggcctaaaaa tcagacaact attgtggttt 1320cacatttcct gtcttacttt tggaagagaa actgttcttg agtatttggt gtcttttgga 1380gtgtggattc gcactcctcc cgcttacaga ccaccaaatg cccctatctt atcaacactt 1440ccggaaacta ctgttgttag acgccgaggc aggtccccta gaagaagaac tccctcgcct 1500cgcagacgaa ggtctcaatc accgcgtcgc agaagatctc aatctcggga atctcaatgt 1560ctcgaggccg ccgctgacct catggggtac attccggccg tcgccgccgc taggctctgg 1620cactacccct gcactgtcgc cgccgcttgt gcctcacacc tcccttacat cgaacaggga 1680atgcagctcg ccgagcagtt caagcagaag gcggccgccg cttcctatac atggacaggc 1740gccttgatca cgccatgtgc tgcggaggag gccgccgctt agtaaTCTAG AGGGCCCGTT 1800TAAACCCGCT GATCAGCCTC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC 1860TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT 1920GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG 1980CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC 2040
TCTATGGCTT CTACTGGGCG GTTTTATGGA CAGCAAGCGA ACCGGAATTG CCAGCTGGGG 2100CGCCCTCTGG TAAGGTTGGG AAGCCCTGCA AAGTAAACTG GATGGCTTTC TCGCCGCCAA 2160GGATCTGATG GCGCAGGGGA TCAAGCTCTG ATCAAGAGAC AGGATGAGGA TCGTTTCGCA 2220TGATTGAACA AGATGGATTG CACGCAGGTT CTCCGGCCGC TTGGGTGGAG AGGCTATTCG 2280GCTATGACTG GGCACAACAG ACAATCGGCT GCTCTGATGC CGCCGTGTTC CGGCTGTCAG 2340CGCAGGGGCG CCCGGTTCTT TTTGTCAAGA CCGACCTGTC CGGTGCCCTG AATGAACTGC 2400AAGACGAGGC AGCGCGGCTA TCGTGGCTGG CCACGACGGG CGTTCCTTGC GCAGCTGTGC 2460TCGACGTTGT CACTGAAGCG GGAAGGGACT GGCTGCTATT GGGCGAAGTG CCGGGGCAGG 2520ATCTCCTGTC ATCTCACCTT GCTCCTGCCG AGAAAGTATC CATCATGGCT GATGCAATGC 2580GGCGGCTGCA TACGCTTGAT CCGGCTACCT GCCCATTCGA CCACCAAGCG AAACATCGCA 2640TCGAGCGAGC ACGTACTCGG ATGGAAGCCG GTCTTGTCGA TCAGGATGAT CTGGACGAAG 2700AGCATCAGGG GCTCGCGCCA GCCGAACTGT TCGCCAGGCT CAAGGCGAGC ATGCCCGACG 2760GCGAGGATCT CGTCGTGACC CATGGCGATG CCTGCTTGCC GAATATCATG GTGGAAAATG 2820GCCGCTTTTC TGGATTCATC GACTGTGGCC GGCTGGGTGT GGCGGACCGC TATCAGGACA 2880TAGCGTTGGC TACCCGTGAT ATTGCTGAAG AGCTTGGCGG CGAATGGGCT GACCGCTTCC 2940TCGTGCTTTA CGGTATCGCC GCTCCCGATT CGCAGCGCAT CGCCTTCTAT CGCCTTCTTG 3000ACGAGTTCTT CTGAATTATT AACGCTTACA ATTTCCTGAT GCGGTATTTT CTCCTTACGC 3060ATCTGTGCGG TATTTCACAC CGCATACAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC 3120CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA GACAATAACC 3180CTGATAAATG CTTCAATAAT AGCACGTGCT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA 3240GGTGAAGATC CTTTTTGATA ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA 3300CTGAGCGTCA GACCCCGTAG AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG 3360
CGTAATCTGC TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA 3420TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA 3480TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC 3540TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG 3600TCTTACCGGG TTGGACTCAA GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC 3660GGGGGGTTCG TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT 3720ACAGCGTGAG CTATGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC 3780GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG 3840GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG 3900CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT 3960GGGCTTTTGC TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTT 3993....... .......... .....
本發(fā)明所述的抗原基因同時(shí)適合多種真核及原核表達(dá)載體。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為1、本發(fā)明得到新型HBV/HCV核酸疫苗具有同時(shí)預(yù)防和治療乙型肝炎和丙型肝炎的作用。
2、本發(fā)明得到新型HBV/HCV核酸疫苗為人工設(shè)計(jì)，在HCV表達(dá)產(chǎn)物中優(yōu)選的高度保守的免疫優(yōu)勢(shì)T/B細(xì)胞表位基因，刪除產(chǎn)生免疫抑制及免疫病理的基因序列。同時(shí)以HBV核心蛋白為載體分子，增強(qiáng)了疫苗的整體免疫效果。
3、本發(fā)明得到HCV復(fù)合多表位DNA疫苗引入了一個(gè)MHC非限制性的輔助性T淋巴細(xì)胞表位基因，增強(qiáng)了疫苗的細(xì)胞免疫及體液免疫水平。
4、本發(fā)明得到HCV復(fù)合多表位DNA疫苗抗原基因的5’端引入hIL-2 ER信號(hào)肽引導(dǎo)序列，增強(qiáng)了疫苗的細(xì)胞免疫水平。
5、本發(fā)明得到新型HBV/HCV核酸疫苗可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生針對(duì)所選表位的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
6、本發(fā)明得到HCV復(fù)合多表位DNA疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是安全的，無(wú)任何病理現(xiàn)象出現(xiàn)。
7、本發(fā)明得到HCV復(fù)合多表位DNA疫苗的基因序列來(lái)自中國(guó)流行株，該疫苗可進(jìn)一步作為我國(guó)防治乙型肝炎和丙型肝炎的DNA疫苗。
具體實(shí)施例方式1.抗原基因的獲得1.1 HCV多表位基因的合成1.1.1引物合成引物名CEG-1 F01；CEG-1 R01；CEG-1 F02；CEG-1 R02；CEG-1F03；CEG-1 R03；CEG-1 F04；CEG-1 R04；CEG-1 F05；CEG-1 R05。
1.1.2 Taq酶聚合反應(yīng)1.1.2.1 DNA鏈延伸反應(yīng)將上述合成的10條寡核苷酸片段中的F01和R01(frag.I-1)、F05和R05(frag.II-1)分別進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)。
在Microtube中調(diào)制下列反應(yīng)液引物1(0.010D/μl)5ul引物2(0.010D/μl)5ul10×LA BUffer10uldNTP 16ul
H2063ul94℃保溫5分鐘后，在10分鐘內(nèi)冷卻至55℃，加入TaKaRa LA Taq酶1μl后，保溫5分鐘，72℃保溫5分鐘。
此反應(yīng)液為DNA延伸液。
①如果DNA延伸液宣接進(jìn)行克隆時(shí)用DNA延伸液進(jìn)行乙醇沉淀，然后溶于100ul的TE Buffer中(此溶液稱(chēng)為PCR Frag.溶液)。
②如果需要用DNA延伸液進(jìn)一步進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，按下列條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。
1.1.2.2 PCR反應(yīng)分別取Frag.-I和Frag.-II反應(yīng)產(chǎn)物各1μl，前者以F02和R02(frag.I-2)，后者以F04和R04(frag.II-2)為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，各引物加量光密度值均為0.01，反應(yīng)體積100μl，PCR條件為94℃30s，55℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)。再分別取Frag.I-2FragII-2反應(yīng)產(chǎn)物各1μl，以F03和R03為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系及PCR條件為同前。反應(yīng)產(chǎn)物用乙醇沉淀后溶解于200μlTEBuffer中。
將上述所得的PCR產(chǎn)物回收，純化，與pMD18-T載體連接。連接產(chǎn)物命名為pMD18-T-CEG。
1.1.2.3 DNA序列測(cè)定使用F引物(M13-47)CGC CAG GGGT TTT CCC AGT CAC GAC對(duì)上述連接產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。
1.2 PCR擴(kuò)增HBV C區(qū)基因(HBc)1.2.1利用DNAStar軟件設(shè)計(jì)出上游引物P1GGCGAATTC CTTTGGGGCATGGACATTGA下游引物P2 AGGCTCGAG
ACATTGAGATTCCCGAGATTG分別引入EcoRI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，以HBVadr全序列DNA質(zhì)粒pKS-HBV為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在Microtube中調(diào)制下列反應(yīng)液pKS-HBV1μl引物P1(20pmol/μl) 0.5μl引物P2(20pmol/μl) 0.5μlpremix EX taq 25μlH2023μlPCR反應(yīng)條件為96℃10分鐘后，94℃60秒，55℃30秒，72℃45秒，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。
1.2.2上述所得的PCR產(chǎn)物回收，純化，與pMD18-T載體連接。連接產(chǎn)物命名為pMD18-T-HBc。
1.2.3 DNA序列測(cè)定使用F引物(M13-47)CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC對(duì)上述連接產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。
2.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)以無(wú)菌接種環(huán)刮取凍存于-70℃冰箱的大腸桿菌菌種，劃線(xiàn)接種于不含氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16h左右。挑取單一菌落，接種到100ml LB培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振搖培養(yǎng)到OD600＝0.4～0.6，在無(wú)菌條件下將細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到兩個(gè)無(wú)菌并以冰預(yù)冷的聚丙烯離心管中(以下操作均需無(wú)菌)，冰浴10min，使培養(yǎng)物冷卻到0℃；4℃、2000r/min離心10min，棄上清，以10ml用冰預(yù)冷的75mmol/L CaCl2、10mmol/L(pH6.5)溶液重懸沉淀，冰浴10min，4℃，2000r/min離心10min，棄上清，以2ml用冰預(yù)冷的，含15％(v/v)甘油的75mmol/L CaCl2、10mmol/L Tris·Cl(pH6.5)溶液重懸每管沉淀，用無(wú)菌吸頭將感受態(tài)細(xì)胞分裝于無(wú)菌微量離心管中，每管200μl；標(biāo)明菌株、體積和日期，置-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?br> 3.轉(zhuǎn)化將適量質(zhì)粒DNA(體積質(zhì)粒＜1μl，連接產(chǎn)物＜10μl，DNA＜50ng)加入200μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃水浴熱沖擊90s，冰浴冷卻2min；加入200μl 37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37℃150r/min振搖培養(yǎng)50min；取培養(yǎng)液涂布于含Amp(50μg/ml)的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)14～16h后，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落。
4.質(zhì)粒的提取4.1質(zhì)粒的小量制備(堿裂解法)挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，接種到2ml含50μg/ml Amp的LB培養(yǎng)液(下同)中，37℃250r/min振搖培養(yǎng)12～16h；將1.5ml轉(zhuǎn)入微量離心管中，12000r/min離心30s，棄上清。以200μl冰預(yù)冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl，pH8.0；10mmol/L EDTA，pH8.0)重懸沉淀，加入200μl新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，顛倒數(shù)次混勻，加入200μl用冰預(yù)冷的溶液III(3mol KAc，5mol/L冰乙酸)，顛倒混勻，4℃12000r/min離心10min，取上清，分別用等量飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提一次；加2倍體積冷無(wú)水乙醇，混合均勻，置-20℃30min，4℃12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌抽干。以20μl含終濃度20μg/ml RNA酶(無(wú)DNA酶)的TE(10mmol/LTris·HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0，下同)溶解沉淀，并于37℃水浴中作用30min，瓊脂糖凝膠電泳檢查或-20℃保存。
4.2質(zhì)粒的大量制備與純化將含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌接種于100ml LB培養(yǎng)液中，37℃250r/min振搖培養(yǎng)16～18h；冰浴10min，4℃4000r/min離心10min，棄上清，沉淀用20ml預(yù)冷的特殊TE(STE，10mmol/L Tris·Cl，pH8.0；50mmol/L EDTA，pH8.0)洗滌一次，4000r/min離心10min，棄上清；用4ml預(yù)冷的溶液I重懸沉淀，加8ml新配的溶液II充分混勻，冰浴10min后，加6ml預(yù)冷的溶液III中止反應(yīng)，冰浴10min，4℃7000r/min離心15min，取上清加0.6～0.7倍體積的異丙醇，37℃作用30min；4℃，7000r/min離心15min，棄上清，以適量TE(pH8.0)溶解沉淀后，加等體積的氯化鋰(5mol/L)充分混勻，8000r/min離心10min；取上清，加2倍體積100％冷乙醇，-20℃30min，4℃12000r/min離心10min；棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌并抽干。以適量TE(pH8.0)溶解沉淀，加無(wú)DNA酶的RNA酶(10mg/ml)至終濃度20μg/ml，37℃水浴30min；加等體積13％聚乙二醇溶液(PEG8000，2.5mol/L NaCl)，4℃靜置過(guò)夜；4℃12000r/min離心10min，棄上清；加400μlTE(pH8.0)溶解沉淀，用等體積酚、酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)、氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提一次，加0.1倍體積3MNaAC(pH5.2)，2倍體積100％冷乙醇，混勻后-20℃30min以上，4℃12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌并抽干，溶于適量TE(pH8.0)中，-20℃保存。
4.3質(zhì)粒DNA的定量以TE(pH8.0)為空白對(duì)照，用TZK-800Z型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。OD260＝1相當(dāng)于含質(zhì)粒大約50μg/ml，雙鏈DNA純品的OD260/OD280值為1.8，如樣品OD260/OD280值明顯低于1.8，則可能有蛋白質(zhì)或酚污染，需進(jìn)一步純化。
5.瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液(0.045mol/L Tris-硼酸，0.001mol/L EDTA)配0.8-1.2％(w/v)瓊脂糖凝膠溶液，加熱至瓊脂糖完全溶解后，加EB(10mg/ml)至終濃度0.5μg/ml；混勻倒入封固好的膠模中，插入相應(yīng)的梳子，梳子距底板1.0mm左右，待凝膠完全凝固，小心移去梳子，將凝膠放入裝有0.5×TBE電泳緩沖液的電泳槽中，取適量DNA樣品在封口膜上與適量體積加樣緩沖液(0.25％溴酚藍(lán)、0.25％二甲苯青FF、40％蔗糖)混勻，用微量加樣器將樣品加到梳孔中，以5v/cm的電壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至適當(dāng)位置，在長(zhǎng)波紫外燈下觀察結(jié)果和拍照。
6.DNA操作6.1限制性?xún)?nèi)切酶酶切反應(yīng)單酶切反應(yīng)將1.0μg質(zhì)粒DNA與適量水混勻，使其總體積為18μl，加入2-3單位限制性?xún)?nèi)切酶及1μl相應(yīng)的10×限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置最適反應(yīng)溫度水浴2～3h，瓊脂糖凝膠電泳檢查。對(duì)大量質(zhì)粒DNA的酶切反應(yīng)，相應(yīng)擴(kuò)大限制性?xún)?nèi)切酶用量和反應(yīng)體積，取少量反應(yīng)液電泳檢查，完全酶切后，-20℃保存，以備進(jìn)一步鑒定或回收片段之用。
雙酶切反應(yīng)選擇反應(yīng)活性等于或接近100％的同一緩沖系統(tǒng)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，若溫度或緩沖系統(tǒng)不同，則按先低溫后高溫，先低鹽后高鹽的順序進(jìn)行；或第一酶切完成后，酚/仿抽提，乙醇沉淀后，再進(jìn)行第二酶切反應(yīng)。
6.2 DNA片段的回收將酶切完全的含目的DNA片段的溶液與上樣緩沖液混合，加入適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠板中電泳至目的DNA片段完全分離，使用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit(Code No.D301)切膠回收載體和插入片段，溶于20ml的dH2O中，-20℃保存。
6.3外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)取0.5μg回收的載體DNA，加3～5倍摩爾量的外源DNA片段，2μl5×連接緩沖液加水定容至10ul，最后加入1 Weiss單位T4DNA連接酶，混勻并離心，16℃連接1～4h，取7μl連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。
6.4重組子的酶切篩選和鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。取單菌落接種于2ml AmpLB培養(yǎng)液中，小量制備質(zhì)粒DNA。選擇1～2種合適的限制性?xún)?nèi)切酶單獨(dú)或組合消化，瓊脂糖凝膠電泳分析。挑選酶切結(jié)果與預(yù)計(jì)相同者進(jìn)一步用2種以上的內(nèi)切酶消化，所有酶切結(jié)果均與預(yù)計(jì)完全相同者，即為目的重組質(zhì)粒。
7.重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-CEG-HBc的構(gòu)建7.1用BamHI和XbaI雙酶切pMD18-T-CEG，與用相同限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切的pVAXI載體片段相連接，構(gòu)建成pVAX1-CEG HCV重組質(zhì)粒。
7.2用EcoRI和XhoI雙酶切pMD18-T-HBc，與用相同限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切的pVAX1-CEG質(zhì)粒相連接，構(gòu)建成pVAX1-CEG-HBc重組重組表達(dá)質(zhì)粒。
8.重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定使用EcoRI/XhoI雙酶切鑒定質(zhì)粒pVAX1-CEG-HBc，瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)附圖
一，證明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。
9.重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞2.2.1接種細(xì)胞將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P815細(xì)胞和HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)。貼壁細(xì)胞用胰酶消化后，制備成3×105/ml細(xì)胞懸液，于3cm細(xì)胞培養(yǎng)板上加入3ml細(xì)胞懸液，于37℃、5％CO2下培養(yǎng)過(guò)夜。
2.2.2轉(zhuǎn)染取待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒5-10ug，加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基500ul混勻，溫育30分鐘，另取脂質(zhì)體溶液(Lipofectamine)2mg/ml 10ul，加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基500ul，混勻后溫育30分鐘，將上述兩種溶液逐滴加入，吹氣混勻，室溫下靜置30分鐘后，加入轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃、5％CO2下培養(yǎng)孵育10-12小時(shí)后，補(bǔ)加3ml含10％FBS的1640細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃、5％CO2下培養(yǎng)。
將獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒感染P815細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。于感染后48h收獲細(xì)胞，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。
10.重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)10.1間接免疫熒光鑒定表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)在6×30mm培養(yǎng)板中放入蓋玻片，傳代培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。次日，在500ml無(wú)血清MEM中加入10mg欲轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒，混勻。另取500ml無(wú)血清MEM，加入10ml轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectin Reagent)，混勻。將含有質(zhì)粒的500ml MEM逐滴加入含有轉(zhuǎn)染試劑的500ml MEM中，輕輕混勻，室溫靜置30分鐘。將長(zhǎng)成40％-60％單層HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)液MEM吸出，用無(wú)血清MEM洗兩次，加入上述含脂質(zhì)體包裹的質(zhì)粒的1ml MEM，于37℃、5％CO2感作16-18小時(shí)后補(bǔ)加3ml含5％小牛血清MEM，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。以上操作均需在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
取出蓋玻片，PBS(pH7.2)漂洗一次，冷丙酮同定10-15分鐘。PBS洗滌3次，與鼠抗HbcAg抗體反應(yīng)1.5小時(shí)，PBS洗滌3次，然后與異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG反應(yīng)2h，。PBS洗滌3次，在載玻片上滴一滴甘油緩沖液(50％甘油PBS)，將載有細(xì)胞的蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下，波長(zhǎng)495nm處觀察和拍照。
間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染重組核酸疫苗質(zhì)粒pVAX1-CEG-HBc的HeLa細(xì)胞，在核周?chē)凹?xì)胞漿中出現(xiàn)與特異性熒光抗體發(fā)生反應(yīng)的黃綠色熒光，而對(duì)照質(zhì)粒pVAXI轉(zhuǎn)染的細(xì)胞看不到黃綠色熒光。結(jié)果說(shuō)明，構(gòu)建的核酸疫苗質(zhì)粒表達(dá)了CEG-HBc蛋白。
10.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將轉(zhuǎn)染重組核酸疫苗質(zhì)粒pVAX1-CEG-HBc的HeLa細(xì)胞和P815細(xì)胞用1ml TEN(40mmol/L Tris.Cl pH7.5、1mmol/L EDTA，150mmol/LNaCl)洗脫，3000r/min離心5min，棄上清。沉淀細(xì)胞用50μl裂解緩沖液(10mmol/L Tris.Cl pH7.4、1mmol/L MgCl2、0.5％ NP40、20μg/ml DNase I)裂解，冰水浴30min，5000r/min離心5min，加等量2×SDS上樣緩沖液，沸煮3min，取30μl細(xì)胞裂解液與等量2×樣品緩沖液(100mmol/L Tris·Cl，pH6.8，4％ SDS，0.2％溴酚藍(lán)，20％甘油，使用前加入2.5％β-巰基乙醇)混勻，于12％凝膠進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
10.3免疫印跡(Western blot)經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，將其電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5％脫脂乳或3％牛血清白蛋白緩沖液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20)37℃封閉2h，洗滌緩沖液(10mmol/L Tris·ClpH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)洗滌3次，每次5~10min，分別用兔抗HCV CEG多表位抗原陽(yáng)性血清和鼠抗HbcAg抗體覆蓋膜上，室溫感作2h，洗滌3~5次，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG和羊抗鼠IgG室溫感作2h，洗滌3~5次后，每次5~10min，用10ml堿性磷酸酶緩沖液(100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris·ClpH9.5)加入66μl NBT(0.5g NBT，70％二甲基甲酰胺)，混勻后再加33μl BCIP(0.5gBCIP，100％二甲基甲酰胺)，顯色10~20min，用蒸餾水中止反應(yīng)。結(jié)果證實(shí)，表達(dá)產(chǎn)物可以與兔抗HCV CEG多表位抗原陽(yáng)性血清及抗HbcAg抗體發(fā)生反應(yīng)，證明重組核酸疫苗質(zhì)粒pVAX1-CEG-HBc能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞得以成功地表達(dá)。
11.HCV復(fù)合多表位DNA疫苗的實(shí)驗(yàn)免疫研究11.1核酸疫苗免疫小鼠BALB/c雌性小鼠36只，雌性，6～8周齡，屬SPF(III)級(jí)動(dòng)物，以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均具合格證書(shū)。隨機(jī)分三組，分別注射空質(zhì)粒pVAXI對(duì)照組、pVAXI-CEG-HBc免疫組及PBS免疫組。每只小鼠于雙側(cè)脛前肌直接注總?cè)萘繛?00μl(1μg/μl)的PBS質(zhì)粒溶液或100μl PBS溶液。共免疫三次，第一次、第二次時(shí)間間隔為25天。第二次、第三次時(shí)間間隔為20天。最后一次免疫后第7天摘眼球取血，頸椎脫臼處死，凝血分離血清供ELISA檢測(cè)抗HCV多表位抗原和抗HbcAg的IgG抗體。
11.2脾臟免疫學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)11.2.1脾臟單淋巴細(xì)胞懸液制備斷頭處死小鼠，無(wú)菌條件下取出脾臟，置于盛有RPMI 1640培養(yǎng)基的平皿中，用玻片研磨，200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾制成單細(xì)胞懸液，1500r/min，離心5min，棄上清。用Hanks液離心洗細(xì)胞兩次，重懸于含10％NBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)，調(diào)至2×107個(gè)/ml備用。
11.2.2脾細(xì)胞特異性CTL細(xì)胞毒活性檢測(cè)1)靶細(xì)胞的制備1.1)將H-2d限制性HCV識(shí)別表位多肽GlyPheAlaAspLeuMetGlyTyrIleProLeuVal GlyAlaProLeu和SerTyrThrTrpThrGlyAlaLeuIleThrProCysAlaAlaGluGlu與P815細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱共孵育2h，制備成相應(yīng)肽標(biāo)記的靶細(xì)胞。
1.2)靶細(xì)胞的制備采用脂質(zhì)體法將純化的真核表達(dá)質(zhì)粒pdisplay-HBc在LipofectinReagent包裹后轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)呈60％～80％單層的P815細(xì)胞，經(jīng)G418加壓篩選，制備成細(xì)胞表面能呈遞表達(dá)HBV core蛋白的靶細(xì)胞。
2)特異性CTL細(xì)胞毒活性檢測(cè)2.1)將GlyPheAlaAspLeuMetGlyTyrIleProLeuValGlyAlaProLeu、SerTyrThrTrpThrGlyAlaLeuIleThrProCysAlaAlaGluGlu兩種表位多肽及無(wú)關(guān)對(duì)照肽AlaGlyCysLysAsnPhePheTrpLysThr PheThrSerCys為體外刺激原，與小鼠的脾細(xì)胞于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱共孵育2h，加入絲裂霉素C至終濃度為40mg/L，培養(yǎng)2h后用PBS洗滌細(xì)胞4次，以除掉絲裂霉素。制備成相應(yīng)肽標(biāo)記的刺激細(xì)胞。制備免疫小鼠的脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107個(gè)/ml。靶細(xì)胞和刺激細(xì)胞各1ml加入60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，補(bǔ)加2ml RPMI1640，培養(yǎng)24h后加入IL2至終濃度10u/ml，繼續(xù)培養(yǎng)5天。2000r/min離心5min。沉淀以RPMI1640懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度至107個(gè)/ml。作為效應(yīng)細(xì)胞。以乳酸脫氫霉釋放法檢測(cè)CTL反應(yīng)。96微孔板上劃分好樣品、自然釋放及最大釋放孔，效靶細(xì)胞比例(E/T)為20∶1、50∶1、100∶1，每孔補(bǔ)加RPMI1640至200μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，效靶細(xì)胞于37℃5％CO2共同孵育4h，取上清50μl，加入LDH作用底物50μl，室溫、避光反應(yīng)30min后加50μl終止液終止反應(yīng)，490nm下測(cè)吸光度，計(jì)算公式如下殺傷活性(％)＝(實(shí)驗(yàn)孔OD值—靶細(xì)胞自然釋放孔OD值—效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔OD值)/(最大釋放管孔OD值—靶細(xì)胞自然釋放管孔OD值)×100％2.2)在穩(wěn)定表達(dá)HIVgag-gp105的P815細(xì)胞中加入絲裂霉素C至終濃度為40mg/L，培養(yǎng)2h，RPMI1640洗三次，調(diào)整細(xì)胞濃度至107個(gè)/ml，作為刺激細(xì)胞。制備免疫小鼠的脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107個(gè)/ml。靶細(xì)胞和刺激細(xì)胞各1ml加入60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，補(bǔ)加2ml RPMI1640，培養(yǎng)24h后加入IL2至終濃度10u/ml，繼續(xù)培養(yǎng)5天。以下步驟同2.1)。
結(jié)果表明1.pVAX1-CEG-HBc免疫組產(chǎn)生了針對(duì)所選表位GlyPheAlaAspLeuMetGlyTyrIleProLeuValGlyAla ProLeu和SerTyrThrTrpThrGlyAlaLeu IleThrProCysAlaAlaGluGlu的強(qiáng)CTL反應(yīng)，與pVAXI對(duì)照組、PBS對(duì)照組及不相關(guān)對(duì)照肽AGCKNFFWKTFTSC組相比，差異顯著(P＜0.01)。
2.在利用1.2)制備的靶細(xì)胞進(jìn)行的CTL殺傷實(shí)驗(yàn)表明，
2.在利用1.2)制備的靶細(xì)胞進(jìn)行的CTL殺傷實(shí)驗(yàn)表明，pVAX1-CEG-HBc免疫組的CTL殺傷率均明顯高于pVAXI對(duì)照組和PBS對(duì)照組(P＜0.01)。
11.3 ELISA法測(cè)定免疫小鼠血清中特異性抗體11.3.1抗HCV-CEG特異性抗體以大腸桿菌表達(dá)的CEG蛋白包被，二抗為HRP-兔抗鼠IgG，1∶10000稀釋。在酶聯(lián)免疫儀450nm測(cè)量各孔OD值，將酶標(biāo)儀測(cè)得的OD450值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明，pVAX1-CEG-HBc免疫組抗體水平明顯高于pVAXI對(duì)照組和PBS對(duì)照組，差異顯著(P＜0.01)。
11.3.1抗HBc Ag特異性抗體ELISA試劑盒中的包被抗原為HBc Ag，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體。在酶聯(lián)免疫儀450nm測(cè)量各孔OD值，將酶標(biāo)儀測(cè)得的OD450值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明，pVAX1-CEG-HBc免疫組的抗體水平與pVAXI對(duì)照組和PBS對(duì)照組，存在極其顯著的差異(P＜0.01)。
合成CEG基因所需引物的具體序列CEG-1 F01GGATCCGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGCACEG-1 R01GCCAAGGGGGCGCCGACGAGCGGAATGTACCCCATGAGGTCGGCGAAGCCTGCACTGTTTGTGACAAGTGCEG-1 F02CTCGTCGGCGCCCCCTTGGCCGCCGCTGCCAAGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAAGGCCGCCGCTACGGCEG-1 R02CTTGATGTACTGAGCGGCGGCGTTACAGTCGATCACTGAGTCAAAGTCGCCCGTAGCGGCGGCCTTCAGGCEG-1 F03CCGCCGCTCAGTACATCAAGGCTAATAGCAAATTCATCGGAATCACCGAGCTGGCCGCCGCTGAATTCGATATCCCEG-1 R03AGCCTAGCGGCGGCGACGGCCGGAATGTACCCCATGAGGTCAGCGGCGGCCTCGAGGATATCGAATTCAGCGGCGCEG-1 F04GCCGTCGCCGCCGCTAGGCTCTGGCACTACCCCTGCACTGTCGCCGCCGCTTGTGCCTCACACCTCCCTTCEG-1 R04GGCCGCCTTCTGCTTGAACTGCTCGGCGAGCTGCATTCCCTGTTCGATGTAAGGGAGGTGTGAGGCACAACEG-1 F05AGTTCAAGCAGAAGGCGGCCGCCGCTTCCTATACATGGACAGGCGCCTTGATCACGCCATCEG-1 R05TCTAGATTACTAAGCGGCGGCCTCCTCCGCAGCACATGGCGTGATCAAGGCGCCT
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎和丙型肝炎嵌合抗原基因，其基因序列是gccaccatgt acaggatgca actcctgtct tgcattgcac taagtcttgc acttgtcaca 60aacagtgcag gcttcgccga cctcatgggg tacattccgc tcgtcggcgc ccccttggcc 120gccgctgcca agttcgtggc tgcctggacc ctgaaggccg ccgctacggg cgactttgac 180tcagtgatcg actgtaacgc cgccgctcag tacatcaagg ctaatagcaa attcatcgga 240atcaccgagc tggccgccgc tgaattcctt tggggcatgg acattgaccc gtataaagaa 300tttggagctt ctgtggagtt actctctttt ttgccttctg acttctttcc ttctattcga 360gatctcctcg acaccgcctc tgctctgtat cgggaggcct tagagtctcc ggaacattgt 420tcacctcacc atacagcact caggcaagct attctgtgtt ggggtgagtt gatgaatctg 480gccacctggg tgggaagtaa tttggaagac ccagcatcca gggaattagt agtcagctat 540gtcaacgtta atatgggcct aaaaatcaga caactattgt ggtttcacat ttcctgtctt 600acttttggaa gagaaactgt tcttgagtat ttggtgtctt ttggagtgtg gattcgcact 660cctcccgctt acagaccacc aaatgcccct atcttatcaa cacttccgga aactactgtt 720gttagacgcc gaggcaggtc ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag acgaaggtct 780caatcaccgc gtcgcagaag atctcaatct cgggaatctc aatgtctcga ggccgccgct 840gacctcatgg ggtacattcc ggccgtcgcc gccgctaggc tctggcacta cccctgcact 900gtcgccgccg cttgtgcctc acacctccct tacatcgaac agggaatgca gctcgccgag 960cagttcaagc agaaggcggc cgccgcttcc tatacatgga caggcgcctt gatcacgcca 1020tgtgctgcgg aggaggccgc cgcttagtaa 1050... ... ......... .........
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎和丙型肝炎嵌合抗原基因，其特征在于優(yōu)選HCV基因組中六個(gè)高度保守的免疫優(yōu)勢(shì)表位，在此基礎(chǔ)上加入一個(gè)破傷風(fēng)類(lèi)毒素(TT)的輔助性T淋巴細(xì)胞表位基因及一個(gè)來(lái)源于惡性虐原蟲(chóng)環(huán)子孢子抗原的輔助性T淋巴細(xì)胞表位，各表位間用三個(gè)丙氨酸連接，同時(shí)在上述融合基因的5’端引入hIL-2 ER信號(hào)肽引導(dǎo)序列，并優(yōu)化ATG前后堿基使之符合Kozak規(guī)則，并插入位點(diǎn)為EcoRI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，獲得乙型肝炎和丙型肝炎嵌合抗原基因----CEG-HBc。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丙型肝炎多表位抗原基因，其特征在于所述的HCV基因組中六個(gè)高度保守的免疫優(yōu)勢(shì)表位是1.HCV C129-144ggcttcgccg acctcatggg gtacattccg ctcgtcggcg cccccttg 482.HCV NS3439～449acgggcgact ttgactcagt gatcgactgt aac 333.HCV C132-140gacctcatgg ggtacattcc ggccgtc 274.HCV E2(614-622)aggctctggc actacccctg cactgtc 275.HCV NS41711-1732tgtgcctcac acctccctta catcgaacag ggaatgcagc tcgccgagca gttcaagcag aaggcg 666.HCV NS5(2422-2437)tcctatacat ggacaggcgc cttgatcacg ccatgtgctg cggaggag 48
4.一種乙型肝炎和丙型肝炎嵌合核酸疫苗，其特征在于將上述乙型肝炎和丙型肝炎嵌合抗原基因----CEG-HBc與核酸疫苗表達(dá)載體pVAXI重組，獲得乙型肝炎和丙型肝炎嵌合核酸疫苗----pVAXI-CEG-HBc。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的乙型肝炎和丙型肝炎嵌合核酸疫苗，其基因序列是GACTCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA 60ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTGA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA 120ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT 180AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA 240CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC 300CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT 360ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT 420GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG 480TCTCCACCCC AFTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC 540AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA 600GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT GGCTTATCGA 660AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG CGTTTAAACT TAAGCTTGGT 720ACCGAGCTCG GATCCgccac catgtacagg atgcaactcc tgtcttgcat tgcactaagt 780cttgcacttg tcacaaacag tgcaggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 840ggcgccccct tggccgccgc tgccaagttc gtggctgcct ggaccctgaa ggccgccgct 900acgggcgact ttgactcagt gatcgactgt aacgccgccg ctcagtacat caaggctaat 960agcaaattca tcggaatcac cgagctggcc gccgctgaat tcctttgggg catggacatt 1020gacccgtata aagaatttgg agcttctgtg gagttactct cttttttgcc ttctgacttc 1080tttccltcta tlcgagatct cctcgacacc gcctctgctc tgtatcggga ggccttagag 1140tctcgggaac attgttcacc tcaccataca gcactcaggc aagctattct gtgttggggt 1200gagttgatga atctggccac ctgggtggga agtaatttgg aagacccagc atccagggaa 1260ttagtagtca gctatgtcaa cgttaatatg ggcctaaaaa tcagacaact attgtggttt 1320cacatttcct gtcttacttt tggaagagaa actgttcttg agtatttggt gtcttttgga 1380gtgtggattc gcactcctcc cgcttacaga ccaccaaatg cccctatctt atcaacactt 1440ccggaaacta ctgttgttag acgccgaggc aggtccccta gaagaagaac tccctcgcct 1500cgcagacgaa ggtctcaatc accgcgtcgc agaagatctc aatctcggga atctcaatgt 1560ctcgaggccg ccgctgacct catggggtac attccggccg tcgccgccgc taggctctgg 1620cactacccct gcactgtcgc cgccgcttgt gcctcacacc tcccttacat cgaacaggga 1680atgcagctcg ccgagcagtt caagcagaag gcggccgccg cttcctatac atggacaggc 1740gccttgatca cgccatgtgc tgcggaggag gccgccgctt agtaaTCTAG AGGGCCCGTT 1800TAAACCCGCT GATCAGCCTC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC 1860TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT 1920GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG 1980CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC 2040TCTATGGCTT CTACTGGGCG GTTTTATGGA CAGCAAGCGA ACCGGAATTG CCAGCTGGGG 2100CGCCCTCTGG TAAGGTTGGG AAGCCCTGCA AAGTAAACTG GATGGCTTTC TCGCCGCCAA 2160GGATCTGATG GCGCAGGGGA TCAAGCTCTG ATCAAGAGAC AGGATGAGGA TCGTTTCGCA 2220TGATTGAACA AGATGGATTG CACGCAGGTT CTCCGGCCGC TTGGGTGGAG AGGCTATTCG 2280GCTATGACTG GGCACAACAG ACAATCGGCT GCTCTGATGC CGCCGTGTTC CGGCTGTCAG 2340CGCAGGGGCG CCCGGTTCTT TTTGTCAAGA CCGACCTGTC CGGTGCCCTG AATGAACTGC 2400AAGACGAGGC AGCGCGGCTA TCGTGGCTGG CCACGACGGG CGTTCCTTGC GCAGCTGTGC 2460TCGACGTTGT CACTGAAGCG GGAAGGGACT GGCTCCTATT GGGCGAAGTG CCGGGGCAGG 2520ATCTCCTGTC ATCTCACCTT GCTCCTGCCG AGAAAGTATC CATCATGGCT GATGCAATGC 2580GGCGGCTGCA TACGCTTGAT CCGGCTACCT GCCCATTCGA CCACCAAGCG AAACATCGCA 2640TCGAGCGAGC ACGTACTCGG ATGGAAGCCG GTCTTGTCGA TCAGGATGAT CTGGACGAAG 2700AGCATCAGGG GCTCGCGCCA GCCGAACCGT TCGCCAGGCT CAAGGCGAGC ATGCCCGACG 2760GCGAGGATCT CGTCGTGACC CATGGCGATG CCTGCTTGCC GAATATCATG GTGGAAAATG 2820GCCGCTTTTC TGGATTCATC GACTGTGGCG GGCTGGGTGT GGCGGACCGC TATCAGGACA 2880TAGCGTTGGC TACCCGTGAT ATTGCTGAAG AGCTTGGCGG CGAATGGGCT GACCGCTTCC 2940TCGTGCTTTA CGGTATCGCC GCTCCCGATT CGCAGCGCAT CGCCTTCTAT CGCCTTCTTG 3000ACGAGTTCTT CTGAATTATT AACGCTTACA ATTTCCTGAT GCGGTATTTT CTCCTTACGC 3060ATCTGTGCGG TATTTCACAC CGCATACAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC 3120CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA GACAATAACC 3180CTGATAAATG CTTCAATAAT AGCACGTGCT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA 3240GGTGAAGATC CTTTTTGATA ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA 3300CTGAGCGTCA GACCCCGTAG AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG 3360CGTAATCTGC TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA 3420TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA 3480TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC 3540TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG 3600TCTTACCGGG TTGGACTCAA GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC 3660GGGGGGTTCG TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT 3720ACAGCGTGAG CTATGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC 3780GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG 3840GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG 3900CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT 3960GGGCTTTTGC TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTT 3993....... .......... ......
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的丙型肝炎多表位抗原基因，其特征在于所述的抗原基因同時(shí)適合多種真核及原核表達(dá)載體。
全文摘要
一種乙型肝炎和丙型肝炎嵌合抗原基因及其核酸疫苗，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種乙型肝炎和丙型肝炎核酸疫苗。本發(fā)明是HBVadr核心蛋白的編碼基因與從HCV基因中優(yōu)選的六個(gè)高度保守的優(yōu)勢(shì)T/B細(xì)胞表位基因嵌合，再插入一個(gè)破傷風(fēng)類(lèi)毒素(TT)的輔助性T淋巴細(xì)胞表位基因以及一個(gè)來(lái)源于惡性虐原蟲(chóng)環(huán)子孢子抗原的輔助性T淋巴細(xì)胞表位基因，同時(shí)在上述融合基因的5’端引入hIL－2 ER信號(hào)肽引導(dǎo)序列，最后與安全性核酸疫苗表達(dá)載體pVAXI構(gòu)建成新型HBV/HCV核酸疫苗。小鼠實(shí)驗(yàn)證明，該疫苗免疫BALB/c小鼠后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生表位特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫。本發(fā)明所構(gòu)建的新型HBV/HCV核酸疫苗可進(jìn)一步應(yīng)用于我國(guó)預(yù)治乙型肝炎和丙型肝炎。
文檔編號(hào)C12N15/51GK1690206SQ200410010808
公開(kāi)日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2004年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月21日
發(fā)明者李子健, 尹一子, 高越, 趙健琦 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)第一醫(yī)院