專利名稱：用核移植制備產(chǎn)組織型纖溶酶原激活劑突變體轉(zhuǎn)基因山羊的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥用蛋白的方法，特別公開了一種利用核移植制備在奶中生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑突變體轉(zhuǎn)基因奶山羊的方法。
背景技術(shù)：
人組織型纖溶酶原激活劑(tissue-plasminogen activator，t-PA)突變體(t-PAm)是本申請單位已獲得專利的新型蛋白(軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所中國專利號ZL93109234.5)。它對血栓中存在的纖維蛋白—纖溶酶原復合物有高度親和力，能迅速形成纖維蛋白-t-PAm-纖溶酶原復合物，激活纖溶酶原形成纖溶酶，水解血栓中的纖維蛋白(劉士輝、黃培 堂等，組織型纖溶酶原激活劑突變體的構(gòu)建、表達及特性分析。中國科學(B)，1995，4399)。然而由于t-PAm本身結(jié)構(gòu)的復雜，有較多的二巰鍵和糖基化位點，原核表達系統(tǒng)不易獲得有活性的t-PAm，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)雖能合成有活性的重組t-PAm，但表達效率較低，生產(chǎn)工藝繁瑣，周期長成本高。通過建立轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器來生產(chǎn)t-PAm可有效解決這些問題。將t-PAm基因定位整合到哺乳動物基因組中，在乳腺特異性表達啟動子的調(diào)控下可使t-PAm基因在乳腺組織中表達，不會在體內(nèi)造成蓄積而產(chǎn)生危害，并且t-PAm基因的表達產(chǎn)物在翻譯后可被修飾而具有原有的生物活性。另外，從乳汁中提取外源蛋白相對簡單，加之轉(zhuǎn)基因動物的表達特性能較穩(wěn)定地遺傳給后代。這樣無論是系統(tǒng)的建立，還是系統(tǒng)的維持和擴大，在成本上與原核系統(tǒng)或組織培養(yǎng)系統(tǒng)相比，乳腺個體表達系統(tǒng)都具有較多優(yōu)點(Hennighausen L.The prospectsfor domesticating milk protein genes.J Cellular Biochem.1992，49325～332.)。
隨機整合載體構(gòu)建相對容易，轉(zhuǎn)基因制備選擇的方法較多，但在轉(zhuǎn)基因動物建立的過程中，由于基因表達調(diào)控本身的復雜性以及外源基因在動物基因組中整合的隨機性，使得外源基因在宿主動物體內(nèi)的表達水平大多停留在一個較低水平，并且個體間表達水平差異很大。為此，國內(nèi)外學者對影響外源基因在體內(nèi)表達的各種調(diào)控成分進行了大量的研究。雖然，大多研究表明這些人工拼接的調(diào)控成分能對外源基因的表達效率有一定的正效應(yīng)影響，但無法得到生物自身內(nèi)源性調(diào)控元件原有功能的正常體現(xiàn)。另外，轉(zhuǎn)基因動物個體間所存在的表達水平的較大差異，主要歸因于外源基因在基因組中隨機整合而帶來的“位置效應(yīng)”。多數(shù)學者認為，即使使用現(xiàn)今所有的已知功能的生物學元件來構(gòu)建乳腺組織特異性表達載體或選用現(xiàn)今所有的基因?qū)爰夹g(shù)都無法克服轉(zhuǎn)基因表達的“位置效應(yīng)”。而外源基因在基因組中定位整合卻能全面解決并克服這一難題。將外源基因定位整合到家畜體細胞的乳蛋白基因座，由轉(zhuǎn)基因體細胞通過核移植技術(shù)生產(chǎn)乳腺生物反應(yīng)器動物，能夠充分利用內(nèi)源乳蛋白基因固有的高效表達調(diào)控機制。這是當今轉(zhuǎn)基因乳腺生物反應(yīng)器動物生產(chǎn)的最理想模式，它在一定程度上避開了乳用家畜胚胎干細胞建系這一難題(Piedrahita JA.Targeted modification of the domestic animal genome.Theriogenology，2000，53105～116.McCreath KJ，Howcroft J，Campbell KHS，et al.Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from culturedsomatic cells.Nature，2000，4051066～1069.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是以t-PAm基因為目的基因，分別構(gòu)建了隨機整合和基因打靶載體，利用隨機整合和基因打靶技術(shù)把t-PAm整合到山羊胎兒成纖維細胞DNA上或定位敲入到山羊胎兒成纖維細胞的β-酪蛋白基因座中，并通過體細胞核移植來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，從而達到乳腺生產(chǎn)t-PAm的目的。開發(fā)具有高特異性與親和力的、半衰期長的新型t-PA藥物，以達到應(yīng)用臨床、治療疾病的目的。為提供一種可產(chǎn)業(yè)化的利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)組織型纖溶酶原激活劑突變體的方法，本發(fā)明的發(fā)明人采取了以下技術(shù)方案。
本發(fā)明還包括從奶山羊分別克隆出β-酪蛋白5’調(diào)控序列和3’序列，構(gòu)建成隨機整合載體構(gòu)建、顯微注射和經(jīng)精子轉(zhuǎn)移制備轉(zhuǎn)基因羊。首先用奶山羊的β-酪蛋白5’調(diào)控序列和3’序列構(gòu)建成pGBC載體，然后在pGBC上連接ploxP-neo，以便用于轉(zhuǎn)染羊胎兒成纖維細胞后的篩選。然后在β-酪蛋白的ATG前插入目的基因t-PAm，達到利用山羊奶蛋白β-酪蛋白的調(diào)控序列調(diào)控t-PAm在轉(zhuǎn)基因山羊的乳腺表達的目的。
本發(fā)明的發(fā)明人還在克隆奶山羊β-酪蛋白基因序列的基礎(chǔ)上，對t-PAm基因突變體進行亞克隆，并在起始密碼子ATG前引入堿基突變形成ClaI酶切位點。然后將t-PAm基因和β-酪蛋白基因5`端和3`端序列插入到pLoxPneo通用打靶載體中。從而構(gòu)建了含有β-酪蛋白基因5`調(diào)控序列、3`終止序列、pCMV-neo標記基因和pSV40-tk標記基因的打靶載體pGBC4-tPAm。該載體可用NotI內(nèi)切酶進行線性化，然后用于細胞轉(zhuǎn)染，該載體全長16.8kb，其中同源臂總長8.7kb。
手術(shù)取出關(guān)中奶山羊妊娠35天的胚胎，利用胰酶消化法制備山羊胎兒成纖維細胞，在5％CO2和37℃條件下培養(yǎng)。
含t-PAm隨機整合表達載體電擊轉(zhuǎn)染山羊成纖維細胞，在G418培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)，得到存活的細胞克隆，提取基因組DNA后PCR擴增t-PAm全長檢測，獲得克隆陽性細胞，其生長良好陽性細胞用于核移植。
含t-PAm的打靶載體經(jīng)電穿孔法和脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染成纖維細胞，并用含G418和GANC的細胞篩選培養(yǎng)液培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染12天后開始挑選抗性細胞克隆。利用PCR和Southern雜交等方法鑒定轉(zhuǎn)染陽性細胞。其中，用P1和P2引物進行第一輪PCR篩選，用P3和P4引物進行第二輪PCR篩選。用探針1和探針2分別進行兩輪Southern雜交鑒定，以篩選中靶細胞克隆。
采集屠宰山羊卵巢卵泡中的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)，進行卵母細胞培養(yǎng)，通過顯微操作去除位于第一極體處的中期染色體和部分細胞質(zhì)。去核卵母細胞作為核移植受體細胞。用細胞質(zhì)內(nèi)直接注射法將中靶細胞核移植到去核MII期卵母細胞卵周隙中。對卵母細胞和供核細胞復合體做短期恢復培養(yǎng)后移入電融合液中進行電融合。融合胚經(jīng)激活后體外培養(yǎng)，培養(yǎng)至桑葚胚或囊胚時期仍然發(fā)育良好的胚胎移植到同期發(fā)情羊的子宮中，以獲得轉(zhuǎn)基因克隆羊(詳細過程見附圖4)。
利用基因打靶與核移植技術(shù)，本發(fā)明可得到在β-酪蛋白基因座上定位整合t-PAm基因的轉(zhuǎn)基因克隆山羊。
生產(chǎn)的人組織型纖溶酶原激活劑突變體為522個氨基酸的蛋白，其氨基酸序列見序列表1。用于調(diào)控t-PAm在山羊乳腺表達的β-酪蛋白5’端序列見序列表2。


圖1隨機整合載體1示意2體細胞基因打靶載體示意3隨機整合載體2示意4轉(zhuǎn)基因羊制備示意5卵母細胞體外成熟培養(yǎng)、核移植過程和胚胎體外培養(yǎng)圖6陽性細胞與個體鑒定所用引物、探針的位置具體實施方式
材料和方法1、試劑與培養(yǎng)基所有試劑購自Sigma-Aldrich公司；所用內(nèi)切酶、分子生物學方面的試劑購于Promega公司；培養(yǎng)基購自Gibco公司。
2、隨機整合載體構(gòu)建通過山羊的同源序列合成PCR引物，分段克隆關(guān)中奶山羊β-酪蛋白基因5’端調(diào)控序列，總長度為6200bp，3’端為第7外顯子終止密碼后6Kb，5’端和3’端引入酶切位點，并在5’端前引入2.4Kb的兩個β球蛋白絕緣子序列，構(gòu)建成pGBC載體，將3’端后面位點切開，Klenow酶補平并脫磷處理。將pLoxP中的Xhol位點切開，補平后自連，以去掉Xhol位點。然后將ploxP-neo用Not1和Sal1切下，平端處理后與pGBC載體連接。將改構(gòu)后的pGBCN載體中的Xhol位點切開，補平并進行脫磷處理。將突變體t-PAm DNA用Kpn1和HindIII切下并處理為平端，連接到改構(gòu)后的pGBCN載體上。并通過EcoR V酶切、PCR對其是否連入以及連入的方向性進行鑒定，從中篩選出了一個正向連接的陽性克隆，測序顯示正確無誤。這一表達載體命名為pGBCN-tPAm(見圖1)。這一載體的3’端也連接了neor基因，能用于隨機整合山羊成纖維細胞的篩選。
3、打靶載體構(gòu)建將克隆關(guān)中奶山羊β-酪蛋白基因5`調(diào)控序列，總長度為6200bp，與ptPAm利用ClaI酶切位點進行連接。分別克隆了關(guān)中奶山羊β-酪蛋白基因第7外顯子和第8、9外顯子，GBC5-tPA連接獲得pGBC5-tPAm-EX7，pEX8-9和ploxP，連接獲得ploxP-EX8-9。把GBC5-tPAm-EX7切下插入到ploxP-EX8-9中，獲得pGBC4-tPAm。該載體可以用NotI位點進行切割，用于細胞的定點整合。
將改構(gòu)的質(zhì)粒ploxP-1中的tk基因切下，與pBC3-neo連接，獲得質(zhì)粒pBC3-neo-tk。pBC5-tPA與pBC3-neo-tk的連接，獲得質(zhì)粒pGBC2-tPAm。該載體可以用NotI位點進行切割，刪除掉原核序列，用于細胞的隨機轉(zhuǎn)染。
4、從屠宰場取到的卵巢獲取卵母細胞采集屠宰山羊卵巢表面直徑為1-5mm卵泡中的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)，在體視顯微鏡下分級收集，A級和B級的COCs在D-PBS中洗滌3次。30mm培養(yǎng)皿中以100-200枚/3ml D-M199培養(yǎng)液中成熟培養(yǎng)。5％CO2，38.5℃和飽和濕度條件下成熟培養(yǎng)18-24小時后，放置D-PBS(0.2％透明質(zhì)酸酶)中去除成熟卵母細胞表面的卵丘細胞，并洗滌。將脫掉卵丘細胞的卵母細胞放置于體視顯微鏡下檢查第一極體的排放。選擇排放第一極體的卵母細胞在室溫下放置30min后，在M2培養(yǎng)液中短期培養(yǎng)后，去核前移入CB+M2培養(yǎng)液中，在顯微鏡下將位于第一極體處的中期染色體和部分細胞質(zhì)去除。去核細胞洗滌后培養(yǎng)1-2小時，以作為核移植受體細胞。
5、山羊胎兒成纖維細胞的分離與培養(yǎng)；取受精后35天的山羊胚胎，將胚胎組織剪成小塊，用含0.25％胰酶和1mM EDTA的PBS在37℃培養(yǎng)30分鐘，分散細胞。然后用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)洗一次。在5％CO2和37℃條件下培養(yǎng)，用10％FBS的DMEM高密度地培養(yǎng)胚胎成纖維細胞用于轉(zhuǎn)染或冷凍保存。當大量細胞生長擴散后開始換液，以后每3-5天換液一次。當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面時，用含胰蛋白酶和EDTA的PBS消化液消化細胞。消化后用吸管吹打使其快速懸浮，懸浮液離心后用培養(yǎng)液洗滌細胞沉淀，并繼續(xù)接種，進行傳代培養(yǎng)。
核供體細胞培養(yǎng)到長滿，不補充培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16天。培養(yǎng)3天時，用增殖細胞核抗原(PCNA)檢測仍為陽性，10天后檢測為陰性，繼續(xù)培養(yǎng)6天，細胞進入G0期。用Giemsa染色確定每一細胞的正常核型。
6、電擊轉(zhuǎn)染按常規(guī)復蘇胚胎成纖維細胞，培養(yǎng)3-5天。用0.25％胰蛋白酶消化細胞，用10％FCS的DMEM培養(yǎng)基洗一次，用Hepes緩沖鹽水懸浮細胞，計數(shù)細胞，取107細胞，1000RPM離心，去上清。用0.8ml含有0.5pmol/ml載體DNA的Hepes緩沖鹽水懸浮細胞。轉(zhuǎn)移細胞懸浮液到電擊池。電擊條件240V、600μFD。電擊后的細胞分散到96孔板上，用無選擇劑的10％FCS DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，隨機整合細胞篩選使用含G418的培養(yǎng)基；打靶細胞篩選換成G418和GANC篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)12天后開始挑選克隆，一傳三復制。一塊用于PCR篩選和DNA提??；兩塊用于保存。保存方法用0.05％胰蛋白酶消化，凍存在50μl凍存液內(nèi)，細胞數(shù)大約為1000-2000。
用表達Cre重組酶質(zhì)粒pCMV-Cre脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染中靶細胞克隆，挑選抗性基因刪除的細胞克隆進行增殖。提取基因組DNA，PCR鑒定，并且進行酶切消化后Southern雜交，篩選正確打靶的細胞克隆。
7、隨機整合和中靶細胞的核移植及培養(yǎng)發(fā)育中靶成纖維細胞在核移植前在含0.5％FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)2-10天。核移植前用0.25％胰蛋白酶消化，消化的細胞洗滌后放置于H-M199中。核移植前將供核細胞加入到含10％PVP注核液中，注入前用注核針抽吸供核體細胞使其破膜形成核胞體。每一去核卵母細胞中注入一個核胞體，完成后立即洗滌細胞并繼續(xù)培養(yǎng)。
8、移植核的活化重構(gòu)胚胎體外培養(yǎng)3-6小時后，用離子酶素激活4-5min，立即放入6-DMAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)3小時，然后轉(zhuǎn)入mCR1aaBSAFBS中與卵丘細胞單層共培養(yǎng)。將激活的胚胎在5％CO2，38.5℃和飽和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液為mcR1aaBSAFBS。培養(yǎng)48小時后檢查胚胎卵裂率，培養(yǎng)到第9天檢查囊胚發(fā)育率。培養(yǎng)期間每隔48小時半量更換培養(yǎng)液。
9、重構(gòu)胚的胚胎移植培養(yǎng)至桑葚胚或囊胚時期仍然發(fā)育良好的胚胎移植到同期發(fā)情羊的子宮中，以獲得轉(zhuǎn)基因克隆羊。
10、PCR和Southern印跡鑒定方法提取細胞DNA或采取羔羊的耳組織，用組織DNA提取試劑盒，提取DNA。以基因鑒定引物P15`-CTAATTCCATCAGAAGCTGACTCTAGC-3`；P25`-AGAATCTGAGAAAGACTCTGATGCTGG-3`
P35`-GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC-3`P45`-CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-3`進行PCR，出現(xiàn)PCR產(chǎn)物者為陽性動物；分別用Eco81I，Bst98I等酶切電泳后做Southern印跡和雜交。
11、t-PAm的表達量和活性進行檢測利用纖溶蛋白-瓊脂糖-平板法，有活性的tPAm能激活纖溶酶原成為纖溶酶，纖溶酶能消化瓊脂糖平板上的纖溶蛋白形成透明圓圈。通過與標準t-PAm纖溶活力的對比就可以測定t-PAm的表達量。
利用western blot進一步分析和鑒定t-PAm的活性。
12、生理生化檢查對檢查陽性的羔羊，進行生理生化檢查，判斷其健康情況。
結(jié)果1、pBCN-tPAm載體的構(gòu)建。在pGBC載體上連接ploxP-neo用于將來轉(zhuǎn)染羊胎兒成纖維細胞后的篩選。將改構(gòu)后的pGBCN載體中的Xhol位點切開，補平并進行脫磷處理。將突變體t-PAm DNA用Kpn1和HindIII切下并處理為平端，連接到改構(gòu)后的pGBCG載體上。并通過EcoRV酶切、PCR對其是否連入以及連入的方向性進行鑒定，從中篩選出了一個正向連接的陽性克隆，測序顯示正確無誤。并且試驗顯示可用Sal1和AatII切去原核序列。這一表達載體命名為pGBCN-tPAm(圖1)。
2、t-PAm表達載體的轉(zhuǎn)染將pGBCN-tPAm載體線形化，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)染成山羊胎兒纖維細胞，得到了多個存活的細胞克隆，最終數(shù)十個細胞克隆能大量擴增，提取基因組DNA后PCR擴增t-PA全長檢測，24個細胞克隆陽性，其中10個PCR和Southern blot檢測陽性，用于核移植。
3、基因打靶載體的構(gòu)建利用關(guān)中奶山羊基因組DNA進行PCR擴增得到山羊beta-casein基因5’端調(diào)控區(qū)和外顯子7-9序列。按圖2構(gòu)建基因打靶載體。
在這一載體中的5’端同源臂序列長度為6.3kb、3’端同源臂序列2.4kb。在3’同源臂后連接有tk基因。其中還包含t-PAm cDNA，1.7kb?？剐曰驗閜CMV調(diào)控的neor，位于第7內(nèi)含子內(nèi)。pGBC4-tPAm載體全長16.8kb。該載體可以利用NotI酶切線性化，用于基因的定位整合。
另外構(gòu)建載體pGBC2-tPAm。5’端調(diào)控序列長度為6.3kb、3’端序列7.1kb。在3’端后連接有增強子序列。其中還包含t-PAmcDNA1.7kb。抗性基因為pCMV調(diào)控的neor，位于tPAcDNA后反向連接。PGBC2-tPAm載體全長26kb。該載體可以用NotI位點進行切割，刪除掉原核序列，用于細胞的隨機轉(zhuǎn)染(圖3)。
4、細胞轉(zhuǎn)染與鑒定復蘇胚胎成纖維細胞，培養(yǎng)3-5天后用于基因打靶。打靶后的細胞培養(yǎng)在10％FCS DMEM培養(yǎng)基中24h，然后換成含G418和GANC的培養(yǎng)基。培養(yǎng)12天后，一傳三復制。按圖6的部位序列設(shè)計兩對引物，進行PCR，其產(chǎn)物長度與設(shè)計長度一致者為陽性。P1與P2引物擴增產(chǎn)物為2.4kb，P3和P4引物擴增產(chǎn)物為1.7kb。
PCR鑒定為陽性的細胞克隆，繼續(xù)進行Southern blot試驗，分別用Bst98I和Eco81I酶細胞DNA，用圖6標示部位的序列作探針，其顯影片段與理論推測一致的細胞為基因打靶陽性細胞，將其擴增，凍存?zhèn)溆谩?br> 5、核移植和胚胎的體外培養(yǎng)采集屠宰山羊卵巢獲取卵母細胞并體外成熟培養(yǎng)，培養(yǎng)液為M199、10％FCS、FSH、LH和EGF(SIGMA)等，卵母細胞成熟培養(yǎng)24h后去除卵丘細胞，經(jīng)去除第一極體和原核的MII期卵母細胞用做核受體。經(jīng)0.5％FBS饑餓2-5d的轉(zhuǎn)基因體細胞用做核供體。核移植后的重構(gòu)胚在0.28M甘露醇、0.1mM MgSO4和0.05mM CaCl2電融合液中1.2kv/cm 40μs電擊一次。30分鐘后檢查融合情況，融合胚用5μM ionomycin處理5分鐘，2mM 6-DMAP處理4h。然后轉(zhuǎn)移到CR1aa培養(yǎng)液中與單層卵丘細胞共培養(yǎng)，36h后檢查卵裂情況。
手術(shù)法將發(fā)生卵裂并形態(tài)正常的轉(zhuǎn)基因克隆胚(2-細胞期以上)移植到同期發(fā)情處理的山羊輸卵管中(見圖4)。受體山羊手術(shù)后觀察其返情情況，2個情期內(nèi)沒有發(fā)情的視為妊娠。
6、受體山羊制備和胚胎移植受體山羊為文登奶山羊。受體山羊在胚胎移植前15天注射PG進行同期發(fā)情處理，發(fā)情的受體山羊埋植陰道拴，在胚胎移植前2天撤栓，受體山羊次日發(fā)情，發(fā)情的第2天進行克隆胚胎的胚胎移植。移植的胚胎處于2-或4-細胞期(圖5)，通過輸卵管傘進行移植到黃體發(fā)育好的一側(cè)的輸卵管中或雙側(cè)輸卵管中，單側(cè)移植8-10枚胚胎或每側(cè)移植4-5枚胚胎。
7、新生羔羊的鑒定采取克隆羔羊的血液或取耳組織，提取DNA，作為模板，如圖3用兩對基因鑒定引物進行PCR，擴增片段長度與預(yù)期結(jié)果相同者為陽性。對PCR陽性羔羊的DNA酶切后進行Southernblot試驗，用鑒定細胞(見圖6)相同的探針雜交。雜交陽性者應(yīng)有10.8kb的條帶。
8、產(chǎn)物的鑒定當轉(zhuǎn)基因克隆羊性成熟并能繁育后代后進行配種，產(chǎn)生后代后對其乳汁進行t-PAm活性檢測。由于山羊乳腺原本不表達t-PAm，所以可以進行tPA的纖溶試驗和Western blot分析。另外，采用酶切肽圖和質(zhì)譜分析，進一步鑒別t-PAm的結(jié)構(gòu)和功能。
人組織型纖溶酶原激活劑突變體(t-PAm)氨基酸序列<110>OrganizationName中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所Application Project-------------------<120>Title用核移植制備產(chǎn)組織型纖溶酶原激活劑突變體轉(zhuǎn)基因山羊的方法<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>522<212>prt<213>
Sequence<400>PreSequenceStringRSYQVICRDE KTQMIYQQHQ SWLRPVLRSN RVEYCWCNSG RAQCESKPEA EECSEPRCFN 60GGTCQQALYF SDFVCQCPEG FAGKCCEIDT RATCYEDQGI SYRGTWSTAE SGAECTNWQS120SALAQKPYSG RRPDAIRLGL GNHNYCRNPD RDSKPWCYVF KAGKYSSEFC STPACSEGNS180DCYFGQGSAY RGTHSLTESG ASCLPWNSMI LIGKVYTAQN PSAQALGLGK HNYCRNPDGD240AKPWCHVLKN RRLTWEYCDV PSCSTCGLRQ YSQPQFRIKG GLFADIASHP WQAAIFAERF300LCGGILISSC WILSAAHCFQ ERFPPHHLTV ILGRTYRVVP GEEEQKFEVE KYIVHKEFDD360DTYDNDIALL QLKSDSSRCA QESSVVRTVC LPPADLQLPD WTECELSGYG KHEALSPFYS420ERLKEAHVRL YPSSRCTSQH LLNRTVTDNM LCAGDTRSGG PQANLHDACQ GDSGGPLVCL480NDGRMTLVGI ISWGLGCGQK DVPGVYTKVT NYLDWIRDNM RP 522
山羊b-酪蛋白5’端DNA序列<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所<120>用核移植制備產(chǎn)組織型纖溶酶原激活劑突變體轉(zhuǎn)基因山羊的方法<130>
<140>
<160>1<211>6212<212>DNASequenceName山羊b-酪蛋白5’端序列Sequence<400>1gcaaggagag aaaagaaagc cttcctcact gattaatgca aagaaataga ggaaaacaat 60agaatgggaa agactagaga gctcttcaag caaattagag atatcaaggg aacatttcac120gcaaagatgg gcacaataaa ggacagaaat tttatggagg agttgctgat ggagagggag180gcctggcgtg ctgcgattca tggggtcgca aagagtcgga cacaactgag cgactgaatt240gaactgaact gaactggaca aagcagaaga tattaagaag aggtggtaag aatacacaga300agaacaatat aaaaaagatc ttcatgaccc agataaccac gatgatgtga tcactcacct360agagccagac accctggaat gcaaagtcaa gcggccttag aaagcctcac tatgaacaaa420gctagtggag gtgatggaat tccagttgag ctatttcaaa tcttaaaagg tgatgctgtg480aaagtgctgc actcaatatg tcagcaaatt tggaaaacta agcggtggcc acaggactgc540cacaatccca aagaaaagca atgacaaaga atgttcaaac acccacatga ttgcactcat600ctcacatgct agcaaaataa ctctcaaaat tctccaagcc aggcttcaac agtacgtgga660ccatgaactt ccagatgttc aagctggatt tagaaaaggc agaggaacca gagatcaaat720tgccaacatc cattggatca tcaaaaaagc acgagaattc cagaaaaaca tctgctttat780tgactacgct aaagcctttg attgtgtgga tcacaataaa ctgtggaaaa ttctttagga840gatgggaata ccagaccact ttacctgcct cctgagaaat ctgtatacag gtccagaagc900agcagttaga actggacatg gaacgacaga ctggttccaa actgcgaaag gggtacatca960aggaatattc attggaagga ttgatgctga agctgaaact cctatacttt ggccacctaa 1020tgtgaagatc tgactcattg gaaaggactc caatgctggg aaagattgaa ggcaggagaa 1080gaggatgaca gaggatgaga tggttggatg ggatcactga ctcaatggac atgagtttga 1140gtaagctcca ggggttggtg gtggacagga aagcctggcg tgctgcagtc cacaaggtca 1200caaagattcg gacatgactg agtgactgaa ctgatactga tgtgctcaac aaatgtatct 1260tgaacttgtg tgaagttcta tggtcacatg taaaggaaga ataatcagga ttagctgtgt 1320gtcttatgaa tcagggttct gagttttatg tgttcatagt atctgctggt tcacaaaaca 1380tttttcttat tctctggttc ttgatttact ttataaagta atcttaatag ttatacttca 1440catagatagg aaattattat atttggataa tctcatggaa aggattaaat actccatcta 1500tacgagtaat gctgaactat ctactcctac ctaataattt gtcagaattc actaattctg 1560tgttatattg tttctaaatc tgaatcatta tatgaatcct cagtattttg ttttccttcc 1620tctatatttt ggaatttatt aaacagtgct tcaaataatt tttaggaaac tgaagttttt 1680agtaacagct ctatctctaa atagctttag tatcttgaaa aagtaataca aattctcaca 1740tccttaattt cctcttctct aaaatatctt taaaatattc tatgaatgat atctcttaat 1800atttattttt ttggcaatcc aacacagctt atgggatctt agttccccag tgaaggatta 1860tatccatgcc aactgcaatg aaagtacaaa atcctaaact ggactcacca gggatttccc 1920aatatctcct ctagttctta tttctgaata tttttggtcc ctttattgta ctcttcatcc 1980aacttttcta ttgatttctt tcttgaggat attatttact tggtttcagc tagaaatata 2040tgcaaatctc aggactgcat atttaagatt cattggccaa tatgggaaaa aacctttggc 2100tgaacaaatc atgcttataa aaaatagtac tagagcatct tactttgact atatcttgct 2160cctcattcag ggttatctaa tacaatttcc ccatatgaaa ttcttttgca ttataaaaat 2220ggaagctctt aggtaacatt gcaaaaattc gagttgctca tatggcactt tgcttcttac 2280tggtcattgt gttccgaggc ttacctggac agtggtacct gatgtcatct taaattgctg 2340gctttttgat tttccattgg ataagcttct ttctttagta tattgttaag gatttccttg 2400atcgagattt tacctacttt tctggtccaa ttggtgagag acagtcataa ggaaatgctg 2460
山羊b-酪蛋白5’端DNA序列tgtttattgc acaatatgta aagcatcttc ctgagaaaat aaaagggaaa tgttgaatgg2520gaaggatatg ctttcttttg tattcctttt ctgagaaatc agactttttc acctgtggcc2580ttggccacca aaagctaaca agtaaaggca tatgaagtag ccaaggcctt ttctagttat2640atctatgaca ctgagttcat ttcatcattt attttcctga cttcctcctg ggtccatatg2700agcagtctta gaatgaatat tagctgaata atccaaatac atagtagatg ttgatttggg2760ttttctaagt caatccaaga cttgtatgac agtaagatgt attaccatcc aacacacatc2820tcagcatgat ataaatgcaa ggtatattgt gaagaaaaat ttttaattat gtcaaagtgc2880ttactttaga aggtcatcta tctgtcccaa agctgtgaat atatatattg aaggtaatga2940atagatgaag ctaaccttgt aaaaatgagt agtgtgaaat acaactacaa ttatgaacat3000ctgtcactaa agaggcaaag aaacttgaag attgcttttg caaatgggct cctattaata3060aaaagtactt ttgaggtctg gctcagactc tattgtagta cttagggtaa gaccctcctc3120ctgtatgggc tttcattttc tttcttgctt ccctcatttg cccttccatg aatactagct3180gataaacatt gactataaaa gatatgaggc caaacttgag ctgtcccatt ttaataaatc3240tgtataaata atatttgttc tacaaaagta ttatctaaat aaatgttacc ttctgtctta3300aaatccctca acaaatcccc actatctaga gaataagatt gacattccct ggaatcacag3360catgctttgt ctgccattat ctgacccctt tctctttctc tcttctcacc tccatctact3420cctttttcct tgcaattcat gacccagatt cactgtttga tttggcttgc atgtgtgtgt3480gctgagctgc gtctgactgt tatcaacccc atgaatgata gtccaccagg ctctactgtc3540catgaaattt tccagtcaag aatactggag tggattgcat ttcctactcc atttgattaa3600tttagtgact tttaaatttc tttttccata ttcgggagcc tattcttcct ttttagtcta3660tactctcttc actcttcagg tctaaggtat catcgtgtgc ttgttagctt gttactttct3720ccattatagc ttaagcacta acaactgttc aggttggcat gaaattgtgt tctttgtgtg3780gcctgtatat ttctgttgtg tattagaatt taccccaaga tctcaaagac ccactgaata3840ctaaagagac ctcattgtgg ttacaataat ttggggactg ggccaaaact tccgtgcatc3900ccagccaaga tctgtagcta ctggacaatt tcatttcctt tatcagattg tgagttattc3960ctgttaaaat gctccccaga atttctgggg acagaaaaat aggaagaatt catttcctaa4020tcatgcagat ttctaggaat tcaaatccac tgttggtttt atttcaaacc acaaaattag4080catgccatta aatactatat ataaacagcc gctaaatcag atcattatcc attcagcttc4140tccttcactt cttctcctct actttggaaa aaaggtaaga atctcagata taatttcagt4200gtatctgcta ctcatcttta ttttggacta ggttaaaatg tagaaagaac ataattgctt4260aaaatagatc ttaaaaataa gggtgtttaa gataaggttt acactatttt cagcagatat4320gttaaaaaat agaagtgact ataaagactt gataaaaatt atagtgactg caaatgtttt4380aggaatataa taagatataa taacagtggt tgctattttc tttagcacaa gactagtcaa4440caggctgtat taaaagatct tttcttgaat taaatatttt caatttgatt aaacctacct4500cagccataaa ggcaagcaca tttcatttat actatgggga tttgaataat tattactgaa4560gaagccctac caacaaaaag tttatagagc tatcatattt agtcaagaga taaagagggt4620tgttaggata tatatgctat ttgaaaggta tttataaaag aagagtatat ttatcaaaat4680ttctcagaac atccaaattt caagtttatc atttatctta caatatttca aaaatattaa4740aatagataca tgaaatacag aagtaaatta aagagaaagt attttacttg gtaaaaaaat4800tctaggttgg acagagagtg ccaggaaaca aaaacaatga aaaatgtgac ctgacaggaa4860ttatagctca aagtatagta gtaagtaatg aaatggctta aaaattggta tataaaatgc4920tagttataaa ataaacaaaa tgcaataata tcctccctac atgtaatgaa ttctaggtat4980tatgctcttt tttgaagtct tgacaataaa aattttttta gaagtttata ggcatcttga5040ataaagtgaa acaaattaag aattagtatc catgagaaaa atatagaaca gattttccta5100atttagtttg aaaatctggg attgaagatg tgtgtcaaga gatgttggtg gcaagaacat5160ttttttttca agaacttata aaaatgcaac aaaacaaacc atttaataca ttttggtcaa5220aatcaataat gtattttatt ttatgctcca aggagcataa aattggggac tgggcaagag5280aaactgacac cctggtaaat taccaagaga taagtacaca gttctatgta gagaaaataa5340gcatagtgta tgatctctaa aattatgtga gacaaaggag agatgacatt aggcatgtgg5400ggatgaagac tgagtagaga agaaacaatc taatcagtcc aagaaaacat ctcgatcagt5460ggaacaaata gaagaaatgc taaaatgaaa cagaagtctt actggaaata aaagatatgc5520ataagacaaa aattcatgaa aatcacttag tttagcagag aaaagataaa aataaagtat5580gaccttcttc atatacattg tttgatcata tgcacctcaa taaaactgag tctccaacag5640aaatgaaaca ttaatatttt gttcactgct ctaatcccag aatctaagcg atatctggca5700ataaaaataa taaatatata ttttttaata aatgaatcaa ccacttaatt tttctgtaaa5760tatctgtaac ttctcttctg tctttccaaa aacacccata agtactgtga atgagatgaa5820
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1.利用核移植制備產(chǎn)組織型纖溶酶原激活劑突變體轉(zhuǎn)基因山羊的方法，包括以下步驟(1)奶山羊的β-酪蛋白基因5’端和3’端序列克隆與鑒定；(2)隨機整合山羊細胞的乳腺表達載體的構(gòu)建；(3)基因打靶載體的構(gòu)建；(4)分離培養(yǎng)奶山羊胎兒成纖維細胞；(5)轉(zhuǎn)染奶山羊胎兒成纖維細胞；(6)隨機整合與同源重組的細胞鑒定；(7)核移植和胚胎的激活與體外培養(yǎng)；(8)轉(zhuǎn)基因山羊及乳腺表達產(chǎn)物的鑒定。
2.權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活體突變體的方法，其特征在于包括以下步驟(1)從奶山羊的組織DNA中克隆β-酪蛋白基因5’端和3’端序列，并進行序列分析；(2)使用的人組織型纖溶酶原激活體突變體為中國發(fā)明專利(ZL93109234.5)保護產(chǎn)品，插入到奶山羊的β-酪蛋白基因翻譯起始位點，構(gòu)建完整的基因打靶載體和隨機整合載體；(3)分離奶山羊胚胎成纖維細胞，進行體外培養(yǎng)，將(2)所述兩種載體分別導入到奶山羊成纖維細胞中；(4)確證奶人組織型纖溶酶原激活體突變體插入在細胞的β-酪蛋白基因中和檢測隨機整合載體整合在細胞里；(5)將已鑒定的奶山羊成纖維細胞的核移植到去核奶山羊卵中；(6)通過激活和體外培養(yǎng)后，選擇成活的移核胚移植到代孕山羊的輸卵管；(7)對出生的小羊進行基因分析和鑒定；(8)對性成熟的轉(zhuǎn)基因奶山羊交配受孕和后代繁殖，測定人組織型纖溶酶原激活體突變體的表達。
3.利用奶山羊的β-酪蛋白基因構(gòu)建的隨機整合和打靶載體。
4.利用3項的載體制備轉(zhuǎn)基因動物和在轉(zhuǎn)基因山羊乳腺表達的人組織型纖溶酶原激活體突變體(t-PAm)。
全文摘要
利用山羊奶蛋白β－酪蛋白的調(diào)控序列調(diào)控改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑突變體基因(t－PAm)在轉(zhuǎn)基因山羊的乳腺表達。構(gòu)建隨機整合載體(pGBCN－tPAm和pGBC2－tPAm)和β－酪蛋白基因打靶載體(pGBC4－tPAm)。在構(gòu)建中利用了來自關(guān)中奶山羊的β－酪蛋白調(diào)控序列和3’端序列，考慮到用于細胞轉(zhuǎn)染，在載體的3’端也連接了neo
文檔編號C12N15/12GK1659959SQ20041000455
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月24日
發(fā)明者沈偉, 楊正田, 鄧繼先, 潘慶杰 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所