專利名稱：：調(diào)節(jié)基因的組合物和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因調(diào)控、基因治療和轉(zhuǎn)基因生物領(lǐng)域。更具體說，本發(fā)明涉及通過外部的RNA干擾系統(tǒng)來調(diào)控基因表達的方法。相關(guān)技術(shù)說明RNA干擾(RNAi)是RNA多核苷酸通過內(nèi)源性細胞加工特異性阻抑其序列對應(yīng)于該RNA的基因表達的一種現(xiàn)象(Brummelkamp等，2002；Gevroe和Silver，2002；Barton和Medzhitov，2002；Xia等，reviewedinSharp，2001)。該現(xiàn)象廣泛傳播并看來是進化上保守的(Barton和Medzhitov，2002；Sui等，2002)。許多研究現(xiàn)已證明RNAi存在于許多生物中是一種天然發(fā)生的細胞活動(Sharp，2001)。所述RNAi通路還不完全了解。然而在許多系統(tǒng)中，小的干擾性RNA分子(siRNA)看來在體內(nèi)是通過RNA酶III內(nèi)切核酸酶消化而產(chǎn)生的。這種消化吸收產(chǎn)生了長約21-23個核苷酸(堿基)的分子，雖然分子的大小可大至30個堿基。然后這些相對較短的RNA介導(dǎo)了對應(yīng)的RNA信使和轉(zhuǎn)錄物降解(Sui等，2002；Sharp，2001)。理論上稱為RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)的RNAi核酸酶復(fù)合體，可通過堿基配對相互反應(yīng)幫助小的dsRNA識別互補的mRNA。siRNA與其底物反應(yīng)后，mRNA靶向RISC中也許是通過RISC中存在的酶而被降解(Montgomery等，1998)。這些通路認(rèn)為是生物體用來阻抑病毒感染、轉(zhuǎn)座子跳躍和類似現(xiàn)象和調(diào)控內(nèi)源基因表達的(Hutvagner等，2001；Sharp，2001；Waterhouse等，2001；Zamore，2000)。雖然dsRNA阻抑基因表達的完全機制尚不清楚，但研究經(jīng)驗表明RNAi在大多數(shù)生物中是有效和重要的。RNAi的普遍存在促進了將這種天然的基因調(diào)控系統(tǒng)開發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)椴倏v基因表達工具的方法和組合物。利用RNAi操縱基因表達的一個最吸引人方面包括它的靶特異性。RNAi對介導(dǎo)該現(xiàn)象的RNA多核苷酸序列是特異的。因此可將設(shè)計的與能阻抑其表達的基因(靶基因)序列充分對應(yīng)的RNA多核苷酸序列導(dǎo)入細胞中。存在此設(shè)計恰當(dāng)?shù)腞NA時，激活了RNAi通路，導(dǎo)致對靶基因的阻抑或調(diào)節(jié)。然而，利用RNAi作為工具來操縱基因表達需要在細胞中導(dǎo)入siRNA或表達。目前在細胞中導(dǎo)入siRNA調(diào)節(jié)靶基因表達的方法包括將siRNA(或前體RNA)直接注射或灌注入細胞、用游離載體(如質(zhì)粒、腺病毒等)轉(zhuǎn)染細胞和將表達siRNA的表達盒永久性導(dǎo)入細胞基因組內(nèi)。直接給予哺乳動物細胞siRNA或前體RNA的一個主要障礙是內(nèi)源性抗病毒反應(yīng)，該反應(yīng)能識別長30個核苷酸(nt)以上的RNA聚核苷酸，并在它們能有效誘導(dǎo)表達的RNAi調(diào)節(jié)前降解它們。Elbashir等(2001)描述了以下發(fā)現(xiàn)，即長21個堿基的雙鏈RNA能有效逃避這種抗病毒反應(yīng)，因而可用于特異性調(diào)節(jié)哺乳動物細胞中的基因表達。關(guān)于抗病毒反應(yīng)的另一種方法是將siRNA表達盒加入載體中，然后轉(zhuǎn)染入細胞來轉(zhuǎn)錄適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)RNA類別的RNAi(見Sui等，2002；Xia等，2002；Barton和Medzhitov，2002)?？捎玫妮d體包括質(zhì)粒(Brummelkamp等，2002；Sui等，2002)和病毒衍生的載體(見例如Xia等，2002；Barton和Medzhitov，2002；Devroe和Silver，2002)。已證明這些目前已知的系統(tǒng)在特異性調(diào)節(jié)外源和內(nèi)源性基因時是有效的(見例如Sui等，2002；Xia等，2002)。病毒載體的另一優(yōu)點是它們能使sIRNA表達構(gòu)建物穩(wěn)定整合到細胞基因組中，得以產(chǎn)生特定基因受特異性阻抑的細胞系。另外，某些病毒載體可用于體內(nèi)轉(zhuǎn)化細胞，從而可直接操縱體內(nèi)和整個生物的基因表達。就穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞和生物表達特定siRNA構(gòu)建物而言，一個挑戰(zhàn)是避免這些構(gòu)建物提供的siRNA產(chǎn)物異源組成型表達引起的細胞或生物毒性或活力降低。Tiscornia等(2003)證明了可用慢病毒載體組成型表達整合在各種哺乳動物系統(tǒng)中的siRNA。此研究得以產(chǎn)生能降低特異性基因表達的細胞系，和產(chǎn)生靶基因產(chǎn)物表達減少的敲減(knockdown)小鼠。然而如上所述，siRNA組成型表達的主要障礙在于發(fā)育早期時其頻繁發(fā)生會導(dǎo)致早期死亡。這就取消了發(fā)育期的基因表達操縱而進入生物的成年期。因此，該領(lǐng)域需要通過載體攜帶的siRNA來調(diào)節(jié)和控制基因表達的系統(tǒng)，而載體中該siRNA分子本身的表達可受到控制。siRNA的受控胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄有許多應(yīng)用，包括例如，為研究治療目的，使細胞產(chǎn)生胞內(nèi)或分泌性內(nèi)源基因產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)受到控制；產(chǎn)生“條件性敲減”的轉(zhuǎn)基因動物，如產(chǎn)生人類疾病(如糖尿病、免疫缺陷病等)的臨床前動物模型；或作為治療研究的細胞/器官來源，以及用于農(nóng)業(yè)食品工業(yè)中和植物中的類似目的；作為siRNA臨床應(yīng)用，如抗病毒治療和遺傳方法的安全裝置，目的是控制例如，激素分泌過多所致的疾病。發(fā)明概述本發(fā)明涉及含有通過控制siRNA的表達來控制基因表達的有用的系統(tǒng)的組合物和方法。本發(fā)明提供外部可調(diào)控的系統(tǒng)，通過控制RNA干擾來操縱內(nèi)源或外源基因的調(diào)節(jié)。該外部可調(diào)控系統(tǒng)可通過(改變)條件和組織特異性方式和/或定位方式調(diào)節(jié)。在具體實施方案中，本發(fā)明包括一種外部施加的試劑，如藥物或一種或多種其它化合物，來調(diào)節(jié)編碼siRNA的核苷酸序列的表達。在具體實施方案中，本發(fā)明涉及一種多核苷酸構(gòu)建物。其含有編碼操作性連接于一外部可調(diào)控啟動子的siRNA的區(qū)域，該構(gòu)建物也可定義為一種載體。載體的非限制性例子包括慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、MLV載體、AAV載體、質(zhì)粒載體或腺病毒載體。外部可調(diào)控啟動子可以是一種阻抑型啟動子，從而可通過外部施加的試劑下調(diào)編碼siRNA的表達?？赏ㄟ^外部施加藥物下調(diào)編碼siRNA的表達。在具體實施方案中，該阻抑型啟動子受Tet阻抑物的調(diào)節(jié)，和/或定義為還含有至少一個tet0序列。該阻抑型啟動子可受lacI阻抑物的調(diào)節(jié)，或該阻抑型啟動子可來自ANB1、HEM13、ERG11、OLE1、GAL1、GAL10、ADH2或TETR基因。在具體實施方案中，外部可調(diào)控的啟動子是一種誘導(dǎo)型啟動子，從而可通過外部施加的試劑上調(diào)編碼siRNA的表達。誘導(dǎo)型啟動子可受Cu2+、Zn2+、四環(huán)素、四環(huán)素類似物、蛻皮激素、糖皮質(zhì)激素、三苯氧胺或lac操縱子誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)。該啟動子可受蛻皮激素、糖皮質(zhì)激素或三苯氧胺的誘導(dǎo)。在具體實施方案中，該誘導(dǎo)型啟動子是噬菌體誘導(dǎo)型啟動子、營養(yǎng)物誘導(dǎo)型啟動子、溫度誘導(dǎo)型啟動子、輻射誘導(dǎo)型啟動子、金屬誘導(dǎo)型啟動子、激素誘導(dǎo)型啟動子、類固醇誘導(dǎo)型啟動子、或它們的組合。輻射誘導(dǎo)型啟動子的例子包括fos啟動子、jun啟動子或erg啟動子。可用于本發(fā)明考慮范圍的基因表達調(diào)節(jié)系統(tǒng)，包括可利用孕酮、雌激素和/或蛻皮激素的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。在一個優(yōu)選的實施方案中，該系統(tǒng)包括(a)一多核苷酸構(gòu)建物，其含有操作性連接于至少一個編碼siRNA的多核苷酸的聚合酶III依賴型啟動子；(b)一多核苷酸，其編碼含有DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域的藥物誘導(dǎo)型阻抑融合蛋白質(zhì)；和(c)一可結(jié)合的多核苷酸，其可被(b)所述融合蛋白的結(jié)合域結(jié)合并定位，從而轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域可發(fā)揮作用而阻抑(a)所述多核苷酸構(gòu)建物的轉(zhuǎn)錄；(d)一個或多個含有(a)、(b)和(c)所述構(gòu)建物的載體；和(e)一種化合物，可將其施加于細胞以控制上述融合蛋白的表達，或控制所述融合蛋白通過其結(jié)合域與所述可結(jié)合的多核苷酸序列結(jié)合。在具體實施方案中，編碼所述融合蛋白的多核苷酸與一誘導(dǎo)型啟動子操作性相連。在其它和優(yōu)選的實施方案中，該啟動子是一種組成型啟動子。在一具體實施方案中，該組成型啟動子是EF-1α啟動子。在其它實施方案中，該啟動子是組織特異性啟動子。本發(fā)明的各種多核苷酸和多核苷酸序列可以是一種多核苷酸分子或其一部分，或它們可位于或組成在不同的多核苷酸分子中。不同的多核苷酸和多核苷酸序列，如果位于同一分子中，它們可以是相互毗連、毗鄰、靠近或接近。這些序列的排列使得能轉(zhuǎn)錄性調(diào)節(jié)siRNA編碼的多核苷酸，該領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難構(gòu)想這種排列。此外，本發(fā)明的實施例公開了相關(guān)序列的具體空間排列。在本發(fā)明具體實施方案中，通過采用含多核苷酸和多肽組分二者的特殊系統(tǒng)產(chǎn)生對表達的控制。在前核和真核細胞中，對DNA上特定位點具有親和力的多肽能調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄性表達。通過與基因中特定位點DNA的相互反應(yīng)，某些稱為阻抑物的多肽，例如可使該DNA不能接近RNA聚合酶而阻止了轉(zhuǎn)錄。已廣泛地特征分析了DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，以確定這些多肽是否確實能接觸DNA分子，關(guān)于阻抑的那些實施例是否通過直接結(jié)合機制與其相互反應(yīng)而影響基因表達。這些多肽的某些非限制性例子包括那些含有結(jié)構(gòu)性基序α-螺旋-轉(zhuǎn)角-α-螺旋(H-T-H)的多肽。這些蛋白質(zhì)可作為二聚體或三聚體與具有大致對稱回文序列的特定操縱子序列中的DNA結(jié)合。在B-形DNA的主要溝槽二位點中和附近各單體的二個毗鄰α-螺旋發(fā)生接觸，是DNA與這些蛋白質(zhì)之間介面中的主要特征。能以這種方式結(jié)合的蛋白質(zhì)在H-T-H區(qū)中具有序列相似性，但在其它區(qū)域中相似程度不同。這組蛋白包括，例如噬菌體溫度阻抑型蛋白和Cro蛋白，細菌代謝阻抑蛋白如GalR、LacI、LexA和TrpR，細菌激活劑蛋白CAP和激活劑/抑制劑雙功能蛋白AraC，細菌轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒TetR蛋白，酵母菌交配型調(diào)節(jié)蛋白MATal和MATα2和真核同源框(homeobox)蛋白。其它阻抑物與H-T-H結(jié)合蛋白序列同源很少或無，沒有H-T-H結(jié)合基序。觀察到此組的某些蛋白質(zhì)，如沙門傷寒菌噬菌體P22Mnt蛋白質(zhì)(VERS87a)和大腸桿菌TyrR阻抑蛋白(DEFE86)中，能與含有大致對稱回文序列的操縱子相結(jié)合。此組的其它蛋白能結(jié)合部分對稱(沙門傷寒菌噬菌體P22Arc蛋白VERS87b；大腸桿菌Fur蛋白DEL087；質(zhì)粒R6Kpi蛋白質(zhì)FILU85)或非對稱性(噬菌體Mu阻抑物KRAU86)的操縱子序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，與野生型相比，本發(fā)明所用的阻抑物和/或DNA結(jié)合域可包含突變，只要該突變不會有害地影響這些組分的各自功能，本發(fā)明的方法和組合物中可采用這些突變的組分。在其它具體實施方案中，上述(e)的化合物可調(diào)節(jié)該融合蛋白的表達。7在其它具體實施方案中，(e)所述化合物通過該融合蛋白的結(jié)合域，可調(diào)節(jié)該融合蛋白與可結(jié)合性多核苷酸序列的結(jié)合。在具體的優(yōu)選實施方案中，該融合蛋白的結(jié)合域可結(jié)合的多核苷酸序列是四環(huán)素操縱子(tet0)序列，(b)所述該融合蛋白含有融合于人Kox-1的典型KRAB阻抑結(jié)構(gòu)域(tTR-KRAB)的四環(huán)素阻抑物(tTR)的DNA結(jié)合域，(c)的底物是強力霉素。在一具體實施方案中，KRAB不是來自Kox-1而是來自另一個含鋅指蛋白的KRAB結(jié)構(gòu)域。因此，在一實施方案中，采用人Kox-1蛋白的KRAB阻抑結(jié)構(gòu)域作為轉(zhuǎn)錄阻抑物(Theisen等，1990；Margolin等，1994；Pengue等，1994；Witzgall等，1994)。在另一實施方案中，采用一種KRAB協(xié)同阻抑物KAP-1，其中KRAB(Friedman等，1996)用作同一融合蛋白的一部分或分別提供?；蛘撸琄AP-1可單獨與鋅指蛋白一起應(yīng)用。在本發(fā)明的內(nèi)容中，考慮能介導(dǎo)上述元件(a)、(b)和(c)輸送和整合到靶細胞、組織或生物基因組中的任何載體都屬于本發(fā)明范圍。在具體實施方案中，(b)所述載體是慢病毒載體、MLV載體、AAV載體、質(zhì)粒載體或腺病毒(Adv或Ad)載體。在具體實施方案中，(b)所述載體是慢病毒載體。在實施方案中，(b)所述載體是慢病毒載體，其它實施方案包括其中含有(b)所述融合蛋白的結(jié)合域可結(jié)合的多核苷酸序列，和操作性連接有編碼siRNA多核苷酸序列的啟動子的載體，編碼siRNA的多核苷酸序列包含在該慢病毒3’-長末端重復(fù)序列的U3區(qū)中。該系統(tǒng)的其它實施方案中，編碼該融合蛋白的多核苷酸包含在與含(a)所述構(gòu)建物的載體不同的第二種載體中。在具體實施方案中，該第二種含有該融合蛋白編碼多核苷酸的載體是慢病毒載體、MLV載體、AAV載體、質(zhì)粒載體或腺病毒(Adv或Ad)載體。在優(yōu)選實施方案中，含有該融合蛋白編碼多核苷酸的第二載體是慢病毒載體。在具體實施方案中，(a)(i)所述聚合酶III-依賴型啟動子是U6或H1啟動子。在具體實施方案中，(a)(i)所述聚合酶III-依賴型啟動子是U6啟動子。在具體優(yōu)選實施方案中，(a)所述多核苷酸編碼的siRNA形成一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾(即個sihRNA)。然而，特別考慮本發(fā)明中除子條件性表達(轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄/翻譯)siRNA分子(敲除分子)外，可采用本文所述方法和組合物來表達任何其它外源性核酸序列(“感興趣的序列”)。因此，可用任何其它感興趣序列來實施本文所述有關(guān)siRNA的任何實施方案。另外，認(rèn)為本發(fā)明覆蓋了本文所述各多核苷酸或多核苷酸序列，或與其它多核苷酸或多核苷酸序列的組合。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明系統(tǒng)中所述的任何載體。例如，本發(fā)明包括的載體或表達構(gòu)建物含有編碼藥物可調(diào)控(如藥物誘導(dǎo)型)的阻抑事例蛋白，該蛋白含有DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域，和/或相同或不同的載體或表達構(gòu)建物含有該融合蛋白結(jié)合域可結(jié)合及定位的多核苷酸，從而該轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域可發(fā)揮作用而阻抑感興趣基因的表達。在具體實施方案中，該融合蛋白含有融合于人Kox-1的KRAB阻抑結(jié)構(gòu)域(tTR-KRAB)的四環(huán)素阻抑物(tTR)的DNA結(jié)合域，其可結(jié)合tet0序列。該tet0序列可位于相同或不同的表達構(gòu)建物或載體上。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明還涉及操作性連接于一示范性Ttr-KRAB-反應(yīng)啟動子的多核苷酸。通常該Ttr-KRAB-反應(yīng)啟動子含有一個操作性連接于至少一個tet操縱子(tet0)序列的最小啟動子。例如，可按照Saeger和Heinemann主編的《Protein-NucleicAcidInteraction》(Macmillan，London，1989，第10卷，143-162頁)一書中Hillen&Wissmann著的“TopicsinMolecular和StructuralBiollogy”中的方法獲得該tet0序列，此文內(nèi)容納入本文作參考?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的其它tet0序列也可從Genbank和/或Waters，S.H等(1983)NuclAcidRes.116089-6105；Hillen，W和Schollmeier，K.(1983)NuclAcidRes.11525-539；Stuber，D和Bujard，H.(1981)ProcNatlAAcadSciUSA78167-171；Unger，B等(1984)NuclAcidRes.127693-7703；和Tovar，K等(1988)MolGenGenet.21576-80中所述方法獲得，這些文獻的內(nèi)容全部納入本文作參考。在某些實施方案中，可采用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的tet操縱子序列的拷貝，采用更多數(shù)目的這種序列能增加調(diào)節(jié)的范圍。除了該示范性Ttr-KRAB-融合蛋白可作為外部藥物誘導(dǎo)型阻抑融合蛋白外，可利用其它含有不同結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。在本發(fā)明的實施方案中，利用DNA結(jié)合域作為藥物誘導(dǎo)型可調(diào)控的融合蛋白的一部分，該DNA結(jié)合域可包含，例如四環(huán)素阻抑物(tTR)的DNA結(jié)合域，或GAL4或LexA的此種結(jié)構(gòu)域的序列。在本發(fā)明的實施方案中，利用一種阻抑結(jié)構(gòu)域作為外部藥物誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)器性融合蛋白的一部分，該阻抑結(jié)構(gòu)域是Kruppel-相關(guān)盒結(jié)構(gòu)域(KRAB)。然而，其它阻抑結(jié)構(gòu)域包括EDR或SID轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域?？勺鳛檗D(zhuǎn)錄阻抑物的其它優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域包括，例如MAD(見Sommer等，1998；Gupta等，1998；Queva等，1998；Larsson等，1997；Laherty等，1997；和Cultraro等，1997)；FKHR(forkheadinehapdosarcomagene；Ginsberg等，1998；Epstein等，1998)；EGR-1(早期生長反應(yīng)基因產(chǎn)物-1；Yan等，1998；和Liu等，1998)；ets2阻抑因子阻抑結(jié)構(gòu)域(EDR；Sgouras等，1995)；和MADsmSIN3相互作用結(jié)構(gòu)域(SID；Ayer等，1996)。其它實施方案中，可采用上述任何系統(tǒng)和構(gòu)建物產(chǎn)生細胞和轉(zhuǎn)基因動物?？梢詶l件性方式控制這些轉(zhuǎn)基因動物來顯示敲減的表型。在本發(fā)明的某些實施方案中，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將本發(fā)明的核酸導(dǎo)入哺乳動物細胞中。因此，在某些實施方案中，該哺乳動物細胞含有(a)第一多核苷酸序列，其含有操作性連接于至少一個編碼siRNA的核酸區(qū)段的聚合酶III-依賴型啟動子；(b)編碼一條件性阻抑融合蛋白的第二多核苷酸序列，該融合蛋白含有DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域；和(c)上述(b)中的融合蛋白結(jié)合域可結(jié)合并定位的第三多核苷酸序列，這樣，此轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域可發(fā)揮作用而阻抑(a)所述核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄。在具體實施方案中，該條件性阻抑融合蛋白是藥物誘導(dǎo)型蛋白。此外，在其它實施方案中，所述細胞除(a)、(b)和/或(c)以外，還含有(d)第四多核苷酸序列，該序列可被切除從而阻止聚合酶III-依賴啟動子的轉(zhuǎn)錄；和/或(e)第五多核苷酸序列，該序列在一可調(diào)控啟動子的控制下。此酶和可切除序列將在以下進一步詳述。在本發(fā)明的實施方案中，所述哺乳動物細胞含有某些核酸構(gòu)建物。本發(fā)明的一方面，上述融合蛋白結(jié)合域可結(jié)合的第三多核苷酸序列是四環(huán)互操縱子(tet0)序列，(b)所述的融合蛋白含有融合于人Kox-1的KRAB阻抑結(jié)構(gòu)域的四環(huán)素阻抑物(tTR-KRAB)的DNA結(jié)合域，因而該融合蛋白受強力霉素的控制。該系統(tǒng)也可用于執(zhí)行除任何siRNA分子外的任何感興趣基因的條件性表達?？紤]本發(fā)明所用的哺乳動物細胞包括未分化細胞，如卵母細胞或受精的卵母細胞。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，用這些細胞來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。因此在某些實施方案中，本發(fā)明包括其細胞為本文所述哺乳動物細胞的能顯示靶基因條件性敲減的轉(zhuǎn)基因動物。特別考慮可創(chuàng)立與本文所述非限制性示范性Ttr-KRAB系統(tǒng)一起應(yīng)用的奠基細胞系或動物。因此，本發(fā)明包括能表達Ttr-KRAB或任何條件性敲減/表達系統(tǒng)(能條件性表達感興趣的敲減分子或其它基因或蛋白質(zhì))的細胞和轉(zhuǎn)基因動物。在實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物的一個或多個細胞含有編碼條件性阻抑融合蛋白的多取核苷酸序列，該融合蛋白含有四環(huán)素阻抑物的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域及人Kox-1的KRAB阻抑結(jié)構(gòu)域(tTR-KRAB)。tTR-KRAB或其它可調(diào)節(jié)系統(tǒng)的表達可以是條件性的、可誘導(dǎo)的、組織特異性的或局部可利用的(如施加于局部)?？衫玫旎毎蚣毎?，來導(dǎo)入含有在轉(zhuǎn)錄融合蛋白調(diào)節(jié)元件(效應(yīng)器多核苷酸)如tTR-KRAB控制下的感興趣序列的核酸序列?；蛘呖捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，包括使奠基轉(zhuǎn)基因動物與效應(yīng)器轉(zhuǎn)基因動物(其細胞含有效應(yīng)器多核苷酸)交配，或?qū)⑿?yīng)器多核苷酸導(dǎo)入奠基轉(zhuǎn)基因動物的轉(zhuǎn)基因細胞中，利用奠基轉(zhuǎn)基因動物來創(chuàng)立同時含有敲減/表達構(gòu)建物和該效應(yīng)器多核苷酸的動物。在其它實施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物具有(a)第一多核苷酸序列，其含有操作性連接于至少一個編碼siRNA的核酸區(qū)段的聚合酶III-依賴型啟動子；(b)編碼一條件性阻抑融合蛋白的第二多核苷酸序列，該融合蛋白含有DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域；和(c)上述(b)中的融合蛋白結(jié)合域可結(jié)合并定位的第三多核苷酸序列，這樣，此轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域可發(fā)揮作用而阻抑(a)所述核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄。此外，在本發(fā)明的某些實施方案中，可利用能控制siRNA轉(zhuǎn)錄的聚合酶III-啟動子的tTR-KRAB所介導(dǎo)的阻抑，來創(chuàng)立條件性敲減動物?？衫蒙鲜鰳?gòu)建物來轉(zhuǎn)染或感染性細胞、干細胞、或任何其它可用于創(chuàng)立轉(zhuǎn)基因動物的未分化細胞。本發(fā)明其它方面涉及一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)中存在的可切除核酸片段的酶通過切除介導(dǎo)，進而控制RNA干擾。特別考慮也可以執(zhí)行所述的關(guān)于條件性敲減某基因的實施方案，和其它調(diào)節(jié)方法來敲減某基因，包括利用組織特異性啟動子和/或利用Cre重組酶。因此，除用某可調(diào)控的阻抑融合蛋白控制調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的表達(如siRNA的表達)水平外，本發(fā)明可利用該系統(tǒng)的一種以上調(diào)節(jié)水平，如用外部藥物調(diào)節(jié)控制該可調(diào)控的阻抑融合蛋白質(zhì)。因此在本發(fā)明的某些實施方案中，存在一種可調(diào)節(jié)靶細胞中siRNA表達的系統(tǒng)，所述靶細胞含有可受調(diào)節(jié)(即可調(diào)節(jié))的含有表達盒的表達構(gòu)建物，所述表達盒含編碼siRNA的核酸區(qū)段?？蓪⒃摵怂釁^(qū)段置于啟動子控制下，編碼該siRNA的區(qū)段和該啟動子之間有一可切除片段，在該啟動子可能影響該siRNA轉(zhuǎn)錄前需要切除。適當(dāng)?shù)拿缚衫迷撈嗡谐稽c來切除該片段，因此，該片段是“可切除片段”此外，在某些實施方案中，稱為“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物”的其活性可受調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子(“可調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物”)，可調(diào)節(jié)此啟動子。該可調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物是此系統(tǒng)的另一組分，可用編碼它的多核苷酸在系統(tǒng)中提供。本發(fā)明的諸組分包括各種核酸分子，包括區(qū)段、片段、盒和構(gòu)建物。這些核酸分子可以是RNA或DNA。然而，外部因子可調(diào)節(jié)任何或所有這些分子。這些核酸分子可至少、最多、或包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、77、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、或1000個連續(xù)核苷酸可堿基對。在某些實施方案中，表達構(gòu)建物是病毒載體，雖然可以是非病毒載體如質(zhì)粒。病毒載體可以是一種整合型病毒，如逆轉(zhuǎn)錄病毒可腺伴隨病毒。在某些實施方案中，該表達構(gòu)建物是逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別是慢病毒。術(shù)語“siRNA表達構(gòu)建物”指能表達siRNA分子的核酸分子。術(shù)語“可調(diào)節(jié)的siRNA表達構(gòu)建物”指與給定細胞類型中或所有細胞中的組成型表達相反，siRNA的表達可受到調(diào)節(jié)。術(shù)語“表達構(gòu)建物”理解為包括該構(gòu)建物是載體。術(shù)語“表達盒”理解為指一種核酸區(qū)域，其包括被表達的核酸和參與其表達的控制區(qū)，包括但不限于啟動子和增強子。術(shù)語“可調(diào)控的啟動子區(qū)域”指可調(diào)控某啟動子區(qū)域以修飾或改變該啟動子的表達。表達的修飾可以是正面或負面。表達的負修飾指該啟動子的表達可能被消除、減弱、限制或局限。表達的正修飾指該啟動子的表達可能增加、增強或放大?！皢幼訁^(qū)”指能控制和調(diào)節(jié)遠端或毗鄰基因、cDNA或其它編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄速度的核酸區(qū)域。在本發(fā)明的某些實施方案中，核酸分子包含一種或多種作為標(biāo)記的肽的編碼序列。該標(biāo)記可用于監(jiān)測可測試核酸或其一部分是否已整合入另一核酸、是否轉(zhuǎn)染或?qū)肓思毎蛏矬w，或被切除?？紤]本發(fā)明的核酸分子、系統(tǒng)和生物可含有1、2、3、4、5或更多種標(biāo)記多肽，或編碼標(biāo)記多肽的核酸。如上所述，可利用不同的標(biāo)記多肽來監(jiān)測不同事情。除siRNA編碼核酸區(qū)段外，本發(fā)明涉及含有一個或多個能修飾或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的區(qū)段或元件的啟動子。調(diào)節(jié)可以是正面或負面調(diào)節(jié)。負調(diào)節(jié)指阻抑、降低或消除啟動子的轉(zhuǎn)錄。同樣，正調(diào)節(jié)指促進、增強或誘導(dǎo)含上述元件或區(qū)段的啟動子的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明某些實施方案中，所述啟動子含有的元件可阻抑或誘導(dǎo)該啟動子的轉(zhuǎn)錄功能。在本發(fā)明一具體方面，能在轉(zhuǎn)錄水平或蛋白水平起調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物可識別該元件。在具體實施方案中，該元件是tet操縱子，其能結(jié)合含識別該元件的DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄阻抑物。在本發(fā)明其它實施方案中，該啟動子是聚合酶III-依賴型啟動子，即其轉(zhuǎn)錄功能需要聚合酶III。在某些實施方案中，啟動子可控制空間和/或時間性表達。因此考慮本發(fā)明所用啟動子是組織特異性或發(fā)育特異性(只在特定發(fā)育階段或時期啟動轉(zhuǎn)錄)啟動子，而在其它實施方案中，啟動子是誘導(dǎo)型或組成型啟動子。本發(fā)明的多肽可外源性表達。這些多肽可以是天然產(chǎn)生的、野生型、多態(tài)性或突變產(chǎn)生的。在本發(fā)明具體實施方案中，多肽是融合或嵌合蛋白。嵌合蛋白是含有二種或多種多肽一起或無聯(lián)系部分的多肽。多肽的無聯(lián)系部分指含有可認(rèn)為是相同功能或活性的氨基酸區(qū)域。融合蛋是嵌合蛋白的一種，此蛋白中第一多肽或其一部分端對端連接于第二多肽或其一部分。在本發(fā)明具體實施方案中，有一種嵌合蛋白是可調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。某些情況下該可調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物是一種融合蛋白，其DNA結(jié)合域來自一種多肽，其轉(zhuǎn)錄阻抑或激活結(jié)構(gòu)域來自另一多肽，該可調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，例如可通過結(jié)合某藥物而受到負面調(diào)節(jié)或修飾。在其它實施方案中，該可調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物可受到四環(huán)素或四環(huán)素類似物，如強力霉素的負調(diào)節(jié)?！八沫h(huán)素類似物”是與四環(huán)素(Tc)密切相關(guān)能結(jié)合tet阻抑物，其Ka值至少為106M-1的許多化合物的任何一種。優(yōu)選四環(huán)素類似物的結(jié)合親和力約為109M-1或更高如109M-1。四環(huán)素類似物的例子包括但不限于在R.K.Blackwood等編輯的《實驗性藥物手冊78》(HandbookofExperimentalPharmacology78)(SpringerVerlag，Berlin-NewYork，1985)中Hlavka和Boothe著的“四環(huán)素”；L.A.Mitscher“四環(huán)素抗生素的化學(xué)”，MedicinalResearch9，Dekker，NewYork，1978；NoyeeDevelopmentCorporation，“四環(huán)素制備工藝”ChemicalProcessReviewsParkRidge，N.J.，第2卷，1969；R.C.Evans，“四環(huán)素的技術(shù)學(xué)”，BiolchemicalReferenceSeries1，QuadranglePress，NewYork，1986；和H.F.Dowling，“四環(huán)素”，AntibiolticsMonographs，no.3，MedicalEncyclopedia，NewYork，1955；中所述的那些，這些文獻各自的內(nèi)容全納入本文作參考。四環(huán)素類似物的非限制性例子包括無水四環(huán)素、強力霉素、氯代四環(huán)素、環(huán)氧四環(huán)素等。與Tc相比，某些Tc類似物，如無水四環(huán)素和環(huán)氧四環(huán)素的抗生素活性降低。本領(lǐng)域知道本發(fā)明所用的四環(huán)素或四環(huán)素類似物的濃度，或可用標(biāo)準(zhǔn)方法測定。在具體實施方案中，所用強力霉素的濃度高于約10ng/ml(Gossen等，1995)。術(shù)語“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物”指具有能直接或間接影響轉(zhuǎn)錄活性的多肽或蛋白質(zhì)，這些活性包括但不限于核酸結(jié)合活性、轉(zhuǎn)錄激活活性和/或轉(zhuǎn)錄阻抑活性。另外，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物在本發(fā)明某些實施方案中可以是“可調(diào)節(jié)的”，意指，可以調(diào)節(jié)，即阻抑、消除、降低、增強、活化或改變其活性。調(diào)控也可以是暫時性或范圍有限的?？紤]到這種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的活性可受到，例如，一種或多種以下轉(zhuǎn)錄；翻譯；mRNA半衰期；蛋白的半衰期；翻譯后修飾；定位、核酸或多肽的結(jié)合特異性、分解速率或親和力；和/或轉(zhuǎn)錄活性等變化的調(diào)節(jié)或修飾。負調(diào)節(jié)或修飾指降低或消除活性，而正調(diào)節(jié)或修飾指點提高或誘導(dǎo)活性。例如，轉(zhuǎn)錄掏物的負調(diào)節(jié)可導(dǎo)致減少存在的阻抑作用?？烧{(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的表達。將其表達置于可調(diào)節(jié)啟動子，如組織特異性或誘導(dǎo)型啟動子的控制下。術(shù)語“可誘導(dǎo)的”指只在對特異性刺激的反應(yīng)中可被激活的活性，與“組成型”活性相反。在本文的啟動子中，術(shù)語“可誘導(dǎo)的”指只能在某些條件下促進轉(zhuǎn)錄的啟動子，不象組成型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子可理解為在允許的條件下才表達。術(shù)語“組織特異性”指只在特定組織中才存在活性，與普遍存在的啟動子相反。在本發(fā)明的某些實施方案中，只是在或部分由于啟動子與待轉(zhuǎn)錄的核酸區(qū)段之間存在物理屏障或障礙才實現(xiàn)這種調(diào)節(jié)。在某些情況下這種屏障或障礙，例如通過切除形成或構(gòu)成此屏障或障礙全部或部分的核酸區(qū)域才能去除。因此，在某些實施方案中，在啟動子與可轉(zhuǎn)錄核酸序列之間安置一可切除片段。更具體說，該片段可防止siRNA編碼核酸區(qū)域受該可調(diào)節(jié)啟動子區(qū)的控制。一旦被切斷，該siRNA編碼區(qū)段就被置于該可調(diào)節(jié)啟動子區(qū)的控制下?！翱汕谐巍敝赣捎谝环N或多種酶反應(yīng)，如涉及Cre的重組酶的酶作用，可被生理去除的核酸區(qū)。本發(fā)明的一具體方面，該可切除片段至少二個側(cè)接的loxP位點，使該片段可被Cre重組酶切除。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知此loxP位點序列功能是作為Cre重組酶的識別位點。切除/重組系統(tǒng)的另一個例子是可用于本發(fā)明的眾所周知的flt/frt系統(tǒng)。此外，該系統(tǒng)另一種水平的調(diào)節(jié)可能是酶或多肽表達的調(diào)節(jié)，這些酶或多肽控制著在啟動子控制下的感興趣核酸序列，即siRNA編碼核酸序列。換句話說，這些酶或多肽是條件性使用的。術(shù)語“條件性使用”指所述酶或多肽只在特定條件下可利用。，在某些實施方案中，Cre重組酶-編碼的多核苷酸受組織特異性或誘導(dǎo)型啟動子的控制。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，其它方法也可控制表達。本發(fā)明其它實施方案包括含有但不限于上述核酸的載體或細胞。特別考慮可將本發(fā)明的核酸包含在一表達構(gòu)建物或載體中。然后可將該表達構(gòu)建物或載體導(dǎo)入細胞中。在某些情況下，所述細胞含有i)包括siRNA編碼核酸片段和可調(diào)控啟動子區(qū)的表達盒，ii)編碼可調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的多核苷酸。在其它實施方案中，所述細胞可含有可條件性利用的Cre酶，此酶能催化切斷位于siRNA編碼核酸片段一可調(diào)控啟動子區(qū)之間的可切除片段。具體考慮所述細胞是前核細胞或真核細胞、某些情況下是哺乳動物細胞，如狗、貓、牛、羊、豬、馬、鼠類、兔類或豬細胞。人是本發(fā)明方法和組合物應(yīng)用特別要考慮的生物。另外，所述細胞可以是分化細胞，在某些情況下，是未分化細胞，如卵子細胞、受孕卵子細胞或精子細胞?？刹捎梦捶只毎麃斫⒑斜景l(fā)明可調(diào)控系統(tǒng)的動物。本發(fā)明另一方面涉及含有編碼可誘導(dǎo)能阻抑整合入宿主細胞中本發(fā)明至少一種siRNA表達的誘導(dǎo)型阻抑物的DNA分子的真核宿主細胞；和/或含有其siRNA操作性連接于一內(nèi)部可調(diào)控啟動子(如能對該誘導(dǎo)型阻抑物反應(yīng)，不論直接或間接反應(yīng)，的啟動子)的DNA分子的真核宿主細胞。例如，該誘導(dǎo)型阻抑物可直接影響此啟動子附近的序列，從而再影響此啟動子本身的活性。宿主細胞可以是哺乳細胞(如人的細胞)?；蛘?，宿主細胞可以是酵母菌、真菌或昆蟲細胞(如可將誘導(dǎo)型阻抑物或siRNA編碼DNA整合到昆蟲細胞中的桿狀病毒基因內(nèi))。同源重組的優(yōu)選宿主細胞類型是胚胎干細胞，可用它來產(chǎn)生非人動物攜帶體，例如整合入動物染色體中預(yù)定位置的tTR-KRAB-編碼序列。宿主細胞也可含有操作性連接于一典型tTR-KRAB反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄啟動子的siRNA。可將該操作性連接于一典型tTR-KRAB反應(yīng)性啟動子的siRNA整合入宿主細胞的DNA中，隨機(如導(dǎo)入外源基因)或預(yù)定(同源重組時使內(nèi)源基因靶向)的位置?？蓪⑦B接于tTR-KRAB反應(yīng)性啟動子的基因?qū)胨拗骷毎?，與編碼siRNA的DNA分開，或者，可利用本發(fā)明的“一次命中”靶向載體將tTR-KRAB編碼序列和tTR-KRAB反應(yīng)性啟動子整合入宿主細胞DNA中的預(yù)定位置?？墒顾拗骷毎c四環(huán)素或四環(huán)素類似物接觸，來阻抑操作性連接于tTR-KRAB反應(yīng)性啟動子的siRNA在本發(fā)明宿主細胞中的表達。因此，本發(fā)明還涉及含編碼sIRNA分子的可調(diào)節(jié)表達盒與編碼可調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因動物。在具體實施方案中，本發(fā)明包括能顯示以組織特異性方式條件性敲除靶基因的轉(zhuǎn)基因動物，該動物的細胞含有i)在一可調(diào)控啟動子區(qū)控制下的siRNA編碼核酸區(qū)段，其中此siRNA對應(yīng)于靶基因；ii)編碼可調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的多核苷酸；和iii)可條件性利用的Cre重組酶。然而，特別考慮可以除外本發(fā)明的組織特異性方面，或可以除外Cre重組酶水平的控制。因此，在某些實施方案中，動物不含有受組織特異性控制的核酸和/或Cre重組酶及或可切除片段。短語“靶基因的可條件性敲除”指某靶基因的表達可以條件方式消除或基本消除。本發(fā)明的其它方面包括本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的妊娠、及所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物的性細胞和其它轉(zhuǎn)基因細胞。本發(fā)明的其它方法包括采用上述試劑創(chuàng)立或產(chǎn)生能顯示條件性敲除靶基因的轉(zhuǎn)基因動物的方法。為此，可將具有條件性調(diào)節(jié)siRNA表達的第一種轉(zhuǎn)基因動物與其性別不同的第二種動物交配此外，也可以條件或組織特異性方式調(diào)節(jié)這類動物(的基因表達)，方法包括a)獲得具有在組織特異性啟動子調(diào)控下的Cre重組酶編碼多核苷酸的第一種轉(zhuǎn)基因動物；b)獲得具有i)在一可調(diào)控啟動子區(qū)控制下的siRNA編碼核酸區(qū)段，其中該sIRNA對應(yīng)于靶基因；和ii)編碼該可調(diào)控多肽調(diào)節(jié)物的多核苷酸的第二種轉(zhuǎn)基因動物；和c)使性別相反的第一種和第二種動物交配。在某些實施方案中，獲得第二種轉(zhuǎn)基因動物可通過d)用i)可調(diào)控的siRNA表達構(gòu)建物，其含有siRNA編碼核酸區(qū)段和可調(diào)控啟動子區(qū)(該區(qū)段與啟動子區(qū)之間有一可切除片段)；和ii)該可調(diào)控siRNA表達構(gòu)建物的可調(diào)節(jié)多肽調(diào)節(jié)物的編碼多核苷酸，來轉(zhuǎn)染未分化的哺乳動物細胞；e)如果細胞是單倍體基因組則使其受精；和f)將產(chǎn)生的胚胎移植到雌性動物中由該雌性動物產(chǎn)生第二種轉(zhuǎn)基因動物。在某些情況下，未分化細胞是未受精的卵母細胞、受精的卵母細胞、胚胎干細胞、桑椹胚或胚泡中的細胞。此外，所用方法也可能涉及培養(yǎng)細胞然后轉(zhuǎn)染和/或移植。另外，這類方法可能涉及與本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物交配。本發(fā)明在某些方面涉及調(diào)節(jié)細胞中某基因的表達，例如通過制備或提供編碼操作性連接于一外部可控制啟動子的siRNA，其中siRNA由能下調(diào)此基因表達的構(gòu)建物所編碼，然后部通過該外部可調(diào)控啟動子從外部調(diào)節(jié)編碼的siRNA表達。該外部可調(diào)控啟動子可以是阻抑型啟動子，從而可通過外部施加的試劑，如外部施加的藥物下調(diào)該編碼的siRNA的表達。在具體實施方案中，該阻抑型啟動子含有至少一個tet0序列；另外，該方法也可包括提供編碼能阻抑siRNA表達的誘導(dǎo)型阻抑物的多核苷酸的步驟。在本發(fā)明的一具體方面，編碼該阻抑物的多核苷酸也定義為藥物誘導(dǎo)型阻抑融合蛋白，其含有DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域，其中該融會蛋白的結(jié)合域可結(jié)合該多核苷酸構(gòu)建物，因此該轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域可發(fā)揮阻抑siRNA轉(zhuǎn)錄的作用。在本發(fā)明的具體實施方案中，有一種研究基因產(chǎn)物在細胞中的功能的方法，該方法通過向細胞提供i)含操作性連接于一外部可調(diào)控啟動子的siRNA編碼區(qū)的多核苷酸構(gòu)建物，其中該約建物編碼的siRNA可下調(diào)編碼該基因產(chǎn)物的基因表達；和ii)編碼能阻抑此siRNA表達的誘導(dǎo)型阻抑物的多核苷酸；和iii)通過該外部可調(diào)控啟動子從外部調(diào)節(jié)編碼的siRNA的表達。該外部可調(diào)控啟動子可以是阻抑型啟動子，從而可通過外部施加的試劑，如外部施加的藥物下調(diào)該編碼的siRNA的表達。本文所述的方法和組合物可用于治療目的，如控制細胞被免疫系統(tǒng)識別的能力。要這樣做，可通過下調(diào)移植抗原，如MHCI抗原，例如通過下調(diào)β2微球蛋白，來降低成本或阻抑免疫系統(tǒng)對細胞的識別，合細胞更順從細胞移植。在本發(fā)明一個方面，下調(diào)β2微球蛋白可導(dǎo)致包含它的整個復(fù)合體下調(diào)。特別考慮到本發(fā)明的方法和裝置的實施方案可采用本發(fā)明的其它方法和裝置。在權(quán)利要求中所用的術(shù)語“或”指“和/或”，除非標(biāo)明指另外或其它相互排斥的東西，雖然公布了支持物，但此定義僅指其它和“和/或”。本申請書中，術(shù)語“約”用于表示一個值，和采用的裝置或方法測定此值得到的標(biāo)準(zhǔn)差。按照專利法，詞語“一個”當(dāng)在本發(fā)明權(quán)利要求書和說明書中與詞“包含”一起用時指一個或多個。附圖簡述以下組成本發(fā)明一部分的附圖進一步顯示了本發(fā)明的某些方面內(nèi)容。通過參考一個或多個這些附圖，結(jié)合本文提供的具體實施方案的詳細描述可更佳地了解本發(fā)明》圖1可調(diào)節(jié)siRNA合成的慢病毒載體。圖2強力霉素通過Tet-KRAB介導(dǎo)的對siRNA產(chǎn)生的阻抑誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)了GFP的表達。GFP表達平均值表示在垂直軸上。水平軸的8段顯示各構(gòu)建物被轉(zhuǎn)染入表達GFP的對照(Co)細胞中。Co(對照)段沒有被構(gòu)建物轉(zhuǎn)染但經(jīng)受了處理。各段中的4個短劃顯示各構(gòu)建物的GFP表達對照處理(Co四組中各組的第一個短劃)；WPXL-KEAB處理，表示細胞用WPXL-KRAB共轉(zhuǎn)染(四個中的第二個短劃)；強力霉素處理(DOX；四個中的第三短劃)；和WPXL-KRAB+DOX，包括用WOXK-KRAB共轉(zhuǎn)染細胞和用強力霉素處理細胞。圖3A-3B用于以dox-誘導(dǎo)型siRNA條件性阻抑基因的慢病毒的系統(tǒng)。(圖3A)所用的慢病毒載體質(zhì)粒的模式圖。將含(LV-H)或不含(pLV-TH)上游tet0序列的H1啟動子、H1-siRNA(LV-His)和tet0-H1-siRNA(LV-THis)盒克隆到pWPXL的3’U3區(qū)域內(nèi)。所有載體都含有在EF-1α啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的內(nèi)部標(biāo)記cDNA。(圖3B)siRNA慢病毒載體的雙拷貝設(shè)計。逆轉(zhuǎn)錄時，利用其3’同源序列作為模板，合成5’LTR的U3區(qū)，導(dǎo)致先前已整合入轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞基因組中的siRNA盒成雙。圖3中的構(gòu)建一般見圖1中所述。圖4A-4Bdox-可控制轉(zhuǎn)錄阻抑物的作用模型。(圖4A)缺少dox時，tTR-KRAB結(jié)合于tet0并阻抑Hi-介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)錄，而使細胞靶基因正常表達(“打開”)。(圖4B)在存在dox時，tTR-KRAB不能結(jié)合tet0，因此產(chǎn)生siRNA從而下調(diào)它們的靶基因(“關(guān)閉”)。siRNA載體中含有的內(nèi)部標(biāo)記提供了一種“反向”監(jiān)視系統(tǒng)，因為存在dox它“打開”，缺少dox時它“關(guān)閉”。圖5A-5B用dox-誘導(dǎo)型的siRNA調(diào)節(jié)GFP表達。(圖5A)以組成型(LVHsi)或調(diào)節(jié)(LV-THis)方式，用對照慢病毒載體(LVTH)或用產(chǎn)生GFP-特異性siRNA的載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶表達EF-1α啟動子GFP(Hela-GFP)的單拷貝慢病毒載體，如表明的有或沒有LV-tTR-KRAB。截短形式的神經(jīng)生長因子受體(ΔNGFR)作用是siRNA載體中的內(nèi)部報導(dǎo)物。這類似于圖2中提供的資料。(圖5B)條件性表達內(nèi)部標(biāo)記基因。在存在或不存在dox時培養(yǎng)用LV-This/GFP和LV-tTR-KRAB雙重轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hela-GFP細胞，然后用NGFR特異性單克降抗體Ab作FACS分析。圖6用dox或誘導(dǎo)的siRNA調(diào)節(jié)內(nèi)源基因。左如材料和方法中所述下調(diào)用所示慢病毒載體感染的p53.MCF-7細胞。用抗p53、GFP或肌動蛋白(作對照)的單克降抗體作Western印跡分析。右下調(diào)核纖層蛋白A/C。用核纖層蛋白特異性siRNA載體和抗體在Hela細胞中進行同一實驗。圖7A-7Bdox-誘導(dǎo)的RNA干擾的動力學(xué)和劑量反應(yīng)。(圖7A)如材料和方法中所述，用LV-This/p53和LV-tTR-KRAB共轉(zhuǎn)導(dǎo)MCF-7細胞。5天后加入濃度5μg/ml的dox。收獲細胞立即進行dox處理(泳道“0”)然后在標(biāo)明時間點處理；wt，非轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。(圖7B)如圖1轉(zhuǎn)導(dǎo)后5天，將細胞置于含以下濃度dox(μg/ml)的培養(yǎng)液中0(泳道1)、0.0005(泳道2)、0.001(泳道3)、0.002(泳道4)、0.004(泳道5)、0.008(泳道6)、0.016(泳道7)、0.063(泳道8)、0.25(泳道9)、1(泳道10)、5(泳道11)；wt，非轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。再5天后進行全細胞提取物的Western印跡分析。圖8H1啟動子的Cre-介導(dǎo)的激活。將從表達Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠靶組織中取回的受精卵母細胞，用tet-siRNA慢病毒載體(及LV-tTR-KRAB)轉(zhuǎn)導(dǎo)。去除靶組織中的LoxP-側(cè)接的EF-1α-MARKER盒，得以條件性產(chǎn)生siRNA。圖9Cre介導(dǎo)的切除后H1啟動子的序列。將LoxP序列插入到近前端序列元件(PSE)和轉(zhuǎn)錄起始位點之間的H1啟動子中，取代wt序列(wt遠端保守)。修飾(*)LoxP序列(核心元件)以容納TATA盒。插入GFP-特異性發(fā)夾序列作為例子。圖10A-10B目前的系統(tǒng)分析突變基因表型的應(yīng)用。目前系統(tǒng)的特性可相互排除野生型細胞基因或其突變型的條件性表達。(圖10A)在缺少藥物時，突變體表達和siRNA合成受到阻抑(野生型打開)。(圖10B)存在藥物時，由于siRNA的作用wt基因表達式下調(diào)，突變型轉(zhuǎn)錄。圖11藥物-可控制的轉(zhuǎn)基因作用和藥物-可控制的敲減的闡述性示范實施方案。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種條件性阻抑哺乳動物細胞基因(表達)的系統(tǒng)。本發(fā)明涉及應(yīng)用藥物-可誘導(dǎo)的RNA干擾來開發(fā)基因敲減動物，任選地可通過慢病毒載體介導(dǎo)。本發(fā)明提出可用藥物可誘導(dǎo)的RNA干擾作用，來產(chǎn)生其基因功能可受外部調(diào)節(jié)的敲減動物。慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因作用提供了創(chuàng)立基因修飾生物的有效和省時的工具(Lois等，2002)。也可利用慢病毒載體輸送的RNA干擾作用，使轉(zhuǎn)基因小鼠中的基因沉默(Rubinson等，2003)。此輸送模式的遍在性提示其非常廣泛的用途，因為慢病毒載體可轉(zhuǎn)導(dǎo)包括干細胞的廣泛靶細胞，可用于產(chǎn)生若干種類的轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明技術(shù)采用以下系統(tǒng)四環(huán)素反式阻抑子(tTR-KRAB)介導(dǎo)的聚合酶III活性的藥物誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)；和慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因作用。本文所述系統(tǒng)明顯優(yōu)于目前采用的條件性敲減法。首先，與傳統(tǒng)的Cre-loxP介導(dǎo)敲除法相比，縮短了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的時間(省錢、省力、省時)。第二，提供了所產(chǎn)生敲減小鼠的可逆表型。第三，在發(fā)育或成年過程中靶基因可關(guān)閉好幾次(Cre介導(dǎo)的切除導(dǎo)致不可逆表型)。第四，能從小鼠以外的不同種動物產(chǎn)生條件性敲減動物。I.RNA干擾本發(fā)明提供的siRNA能在細胞中存在靶基因并不穩(wěn)定表達時，調(diào)節(jié)，特別是減弱靶基因的表達。表達的調(diào)節(jié)器可部分或完全阻抑基因的功能，甚至在對主要靶基因的反應(yīng)中上調(diào)其它次級靶基因或增強這些基因的表達?；虮磉_的減弱包括基因功能、轉(zhuǎn)錄加工或轉(zhuǎn)錄物的翻譯部分或完全受到阻抑或阻抑。RNA干擾的含意是，基因表達的調(diào)節(jié)通過蛋白質(zhì)與RNA(具體包括可作為“向?qū)А盧NA的小dsRNA)的復(fù)合物發(fā)生。siRNA之所以有效認(rèn)為是它的核苷酸序列充分對應(yīng)于靶基因核苷酸序列的至少一部分。雖然本發(fā)明不受其作用機制假說的限制，但更偏向認(rèn)為siRNA中的核苷酸序列基本上相同于靶基因序列的至少一部分。靶基因一般指含有編碼基因產(chǎn)物如多肽區(qū)域的多核苷酸，或?qū)υ摱嚯牡谋磉_極為重要的具有調(diào)節(jié)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯、或其它加工作用的多核苷酸區(qū)，或含有多肽編碼區(qū)和操作性連接的調(diào)節(jié)表達區(qū)二者的多核苷酸。本文中操作性連接指相對于多矛核苷酸序列，啟動子被置于正確發(fā)揮功能的位置和/或朝向，從而能控制該序列的起始和/或表達。靶基因可以在是染色體內(nèi)(基因組)或染色體外?？梢允羌毎麅?nèi)源的功可以是外來基因(轉(zhuǎn)基因)?？蓪⑼鈦砘蛘系剿拗骰蚪M中，或可存在于染色體外遺傳性結(jié)構(gòu)如質(zhì)?；蛘沉Ｉ?。靶基因也可衍生自能感染生物或細胞的病原體，如病毒、細菌、真菌或原蟲。靶基因可以是病毒或不能誘導(dǎo)干擾素應(yīng)答的前病毒基因，如逆轉(zhuǎn)錄病毒基因。靶基因可以是蛋白質(zhì)編碼基因或非蛋白質(zhì)編碼基因，如編碼核糖體RNA、剪接體RNA、tRNA等的基因?？砂邢蚣毎腥魏未磉_的基因。靶基因宜為參與對疾病有重要意義的細胞活動或與之相關(guān)的，或用于研究目的特別感興趣的基因。因此，例如以下是可用于本發(fā)明方法調(diào)節(jié)或減弱靶基因表達的可能的靶基因分類發(fā)育中的基因(如粘附分子、細胞周期蛋白抑制劑、Wnt家族成員、Pax家族成員、Winged螺旋家族成員、Hox家族成員、細胞因子/淋巴因子和它們的受體、生長和分化因子和它們的受體、神經(jīng)遞質(zhì)和它們的受體)；癌基因(如ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES)；腫瘤阻抑基因(如APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53和WT1)；和酶(如ACP脫飽和酶和hycroxylases、ADP-葡萄糖pyrophorylases、ATP酶、醇脫氫酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、過氧化氫酶、纖維素酶、環(huán)氧化酶、脫羧酶、糊精酶、酯酶、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、半纖維素酶、整合酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、激酶、乳糖酶、脂酶、脂氧合酶、溶菌酶、果膠酯酶、過氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、支鏈淀粉酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、拓撲異構(gòu)酶、木聚糖酶)。siRNA的核苷酸序列由其靶基因的核苷酸序列確定。siRNA含有與靶基因至少一部分基本相同的核苷酸序列。優(yōu)選，siRNA所含有核苷酸序列與靶基因的至少一部分完全相同。當(dāng)然，當(dāng)RNA序列DNA序列作比較時“相同的”RNA序列含有的是枋糖核苷酸，而DNA序列含的是脫氧核糖核苷酸，另外，RNA序列通常含尿嘧啶的位置在DNA序列中含的是胸腺嘧啶。siRNA含雙鏈結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾結(jié)構(gòu)或sihRNA)，其序列“基本上相同于”靶基因的至少一部分?！嗤绫绢I(lǐng)域所知，是一種或多種多核苷酸(或多肽)序列之間通過序列比較所確定的關(guān)系。在專業(yè)上，相同性也指兩多核苷酸序列之間通過核苷酸編號的匹配所確定的序列相關(guān)的程度。相同性不難計算。見例如ComputationalMolecularBiollogy，1988，Biolcomputinginformatics和GenomeProjects，1993；和WO99/32619，WO01/68836，WO00/44914和WO01/36646中所述的方法，它們的內(nèi)容納入本文作參考。已有測定二核苷酸序列之間相同性的許多方法，此術(shù)語是本領(lǐng)域熟知的。通常設(shè)計的測定相同性的方法要產(chǎn)生最大程度的核苷酸序列匹配，也常駐機構(gòu)用計算機程序?qū)嵤Ｏ嚓P(guān)領(lǐng)域技術(shù)坐吃山空不難獲得這類程序。例如GCG程序包(Devereux等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，1998)和CLUSTAL(Higgins等，1992；Thompson等，1994)。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得可比較不同長度的二多核苷酸的較長片段的全長。或者，比較較小的區(qū)域。通常比較同樣長度的序列以最終估計它們在實施本發(fā)明中的用途。優(yōu)選用作siRNA的和靶基因的至少15個連續(xù)核苷酸的dsRNA之間序列100％相同，雖然具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高相同性的dsRNA也可用于本發(fā)明。與靶基因至少一部分基本相同的siRNA也可以是dsRNA，其中二條互補鏈之一(就自身互補RNA而言，其二條自身互補部分之一)或與靶基因所述部分的序列相同，或相對而言于靶基因該部分核苷酸序列含有一個或多個插入、缺失或單點突變。因此，siRNA技術(shù)具有能耐受序列變異(預(yù)計可能因基因突變、菌株多態(tài)性或進化多樣性所致)的性能。II.siRNA構(gòu)建物的受控表達siRNA表達構(gòu)建物(或任何其它感興趣的序列)的受控表達可通過許多該領(lǐng)域技術(shù)人員已知的系統(tǒng)實現(xiàn)。如本發(fā)明文中所述，啟動子操縱了多核苷酸轉(zhuǎn)錄的起始。這類多核苷酸可含有編碼siRNA的序列。能發(fā)動轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動子是至少能對誘導(dǎo)物的存在或作用部分起反應(yīng)的啟動子，所述誘導(dǎo)物可以是其作用能誘導(dǎo)該啟動子發(fā)動轉(zhuǎn)錄的一種化合物或蛋白質(zhì)。A.啟動子術(shù)語“啟動子”本文用于指能調(diào)節(jié)某編碼區(qū)，如基因表達的任何序列。例如，啟動子可以是組成型、誘導(dǎo)型、阻抑型或組織特異性啟動子。“啟動子”是一種控制序列，能控制某多核苷酸序列區(qū)域的轉(zhuǎn)錄啟動和速度。它可含有可調(diào)控的蛋白質(zhì)和分子，如RNA聚合酶或其它轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合的遺傳元件。短語“操作性相連接”指啟動子相對于某核酸序列以正確的功能位置和/或朝向控制著該序列的轉(zhuǎn)錄啟動和/或表達。啟動子可以和或不和“增強子”一起使用，增強子指參與核酸序列轉(zhuǎn)錄活動的順式作用調(diào)節(jié)序列。啟動子可以是與某基因或序列天然相連接，可以通過分離位于編碼區(qū)段和/或外顯子上游5’端的非編碼序列獲得。這種啟動子可稱為“內(nèi)源性啟動子”。類似的，增強子可以攻玉天然與某核酸序列相連接，位于該序列的下游或上游?；蛘?，可通過將編碼的核酸區(qū)段置于重組或異源啟動子(指在其天然環(huán)境下通常不與該核酸序列相連接)的控制下來獲得某些好處。重組或異源性增強子也指在其天然環(huán)境中不與該核酸序列相連接有增強子。這類啟動子或增強子可啟動子或增強子、分離自任何其它前核、病毒或真核細胞的啟動子功增強子、“天然”不存在的啟動子功增強子、即含有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的不同元件的，和/或能改變表達的突變的啟動子功增強子。除用合成法產(chǎn)生啟動子和增強子的核酸序列外，可采用重組克隆和/或核酸擴增技術(shù)，包括PCRTM與本文所述組合物來產(chǎn)生這類序列(見美國專利4,683,202和5,928,906，各納入本文作參考)。此外，考慮也可采用能指導(dǎo)所述序列在非細胞核細胞器，如線粒體、葉綠體等內(nèi)轉(zhuǎn)錄和/或表達的控制序列。在具體實施方案中，本發(fā)明所用的啟動子是一種外部可控制的啟動子，可定義為PolI、PoiII或PoiIII啟動子之任何一種(條件型、組織特異型、可調(diào)控型、組成型等)，它們通過條件性阻抑融合蛋白的結(jié)合域操作性連接于至少一個多核苷酸序列，所述阻抑融合蛋白含有DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域，二結(jié)構(gòu)域的位置使轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域能阻抑siRNA或cDNA或基因的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)型啟動子的特征是當(dāng)存在誘導(dǎo)物，或受誘導(dǎo)物影響，或與其接觸時，與不存在誘導(dǎo)物，或不受其影響，或其不接觸此啟動子時，誘導(dǎo)型啟動子可導(dǎo)致額外的轉(zhuǎn)錄活性。誘導(dǎo)物可以是內(nèi)源性的，或一般是外源性的化合物或蛋白質(zhì)，給予此化合物或蛋白質(zhì)能激活對該誘導(dǎo)型啟動子的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)物，即化合物或蛋白質(zhì)的前身，其自身可以是處在誘導(dǎo)型或阻抑性啟動子控制下的某多核苷酸的轉(zhuǎn)錄或表達產(chǎn)物。誘導(dǎo)型啟動子的例子包括但不限于四環(huán)素、金屬硫蛋白、蛻皮激素、哺乳動物病毒(臺腺病毒晚期啟動子；和小鼠乳腺腫瘤病毒長末端重復(fù)序列(MMTV-LTR))和其它類固醇反應(yīng)性啟動子雷帕霉素反應(yīng)性啟動子等。本發(fā)明的誘導(dǎo)型啟動子能在真核宿主生物中發(fā)揮功能。優(yōu)選的實施方案包括哺乳動物誘導(dǎo)型啟動子，但也可采用設(shè)計能在真核宿主中發(fā)揮功能的其它生物的誘導(dǎo)型啟動子及合成的啟動子。本發(fā)明誘導(dǎo)型啟動子的重要功能特征是它們接觸外部施加的物質(zhì)，如環(huán)境誘導(dǎo)因子時而被最大誘導(dǎo)。合適的環(huán)境誘導(dǎo)因子包括接觸熱、各種類固醇類化合物、二價陽離子(包括Cu2+和Zn2+)、半乳糖、四環(huán)素、IPTG)異丙基β-D硫代半乳糖苷)，及其它天然產(chǎn)生的和合成的誘導(dǎo)因子和無緣無故的誘導(dǎo)物。重要的是要注意本發(fā)明某些模式中，該環(huán)境誘導(dǎo)信號可能對應(yīng)于去除上列任何一種因子，不論其是否在非誘導(dǎo)狀態(tài)中不斷施加。真核啟動子的誘導(dǎo)型可通過本發(fā)明方法所包括的二種機制獲得。適合的誘導(dǎo)型啟動子依賴于轉(zhuǎn)錄激活劑，進而依賴于環(huán)境誘導(dǎo)因子。另外，誘導(dǎo)型啟動子可被其本身受環(huán)境誘導(dǎo)因子滅活的轉(zhuǎn)錄阻抑物所阻抑。因此，因此誘導(dǎo)型啟動子，可以是受能正面激活轉(zhuǎn)錄活化劑的環(huán)境因子誘導(dǎo)的啟動子，或是受負面調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄阻抑物的環(huán)境因子所阻抑的啟動子。本發(fā)明的誘導(dǎo)型啟動子包括受潛伏的轉(zhuǎn)錄激活劑(其受環(huán)境誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo))作用控制的啟動子。優(yōu)選例子包括酵母菌基因CUP1、CRS5和SOD1的銅誘導(dǎo)型啟動子它們受酵母菌ACE1轉(zhuǎn)錄激活劑的銅依賴型激活(見Strain和Culotta，1996；Hottiger等，1994；Lapinska等，1993；和Gralla等，1991)?；蛘?，可用酵母菌基因CTT1(編碼胞質(zhì)過氧化氫酶T)的銅誘導(dǎo)型啟動子，其功能不依賴于ACE1轉(zhuǎn)錄激活劑(Lapinska等，1993)。有效誘導(dǎo)這些基因的銅的濃度應(yīng)適當(dāng)?shù)停杀淮蠖鄶?shù)細胞體系，如酵母菌和果蠅細胞所耐受。或者，本發(fā)明可采用兵其它天然產(chǎn)生的誘導(dǎo)型啟動子包括類固醇誘導(dǎo)型基因的啟動子(見Oligino等，1998，GeneTher.5491-6)；酵母菌的半乳糖誘導(dǎo)型啟動子(見Johnston，1987，MicrobiollRev.51458-76；Ruzzi等，1987，MolCellBioll.7991-7)；和各種熱激基因啟動子。許多真核轉(zhuǎn)錄激活劑已顯示在廣大范圍的真核宿主細胞中具有功能，例如，在酵母菌中鑒定到的誘導(dǎo)型啟動子也適合用于哺乳動物宿主細胞。例如，已根據(jù)可誘導(dǎo)的含GAL-4結(jié)合位點的哺乳動物啟動子的GAL-4雌激素受體融合蛋白，開發(fā)了哺乳動物細胞的獨特合成性轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)系統(tǒng)(Braselmann等，1993，ProcNatlAAcadSciUSA.901657-61)。這些和其它對轉(zhuǎn)錄激活劑起反應(yīng)要依賴于特定誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)型啟動子，適合用于本發(fā)明。本發(fā)明的誘導(dǎo)型啟動子還包括可受阻抑物阻抑的啟動子，所述阻抑物可因環(huán)境誘導(dǎo)因子的作用而被滅活。例子包括可在轉(zhuǎn)錄上阻抑經(jīng)工程改造摻入了適當(dāng)?shù)淖枰治?結(jié)合操縱子序列的真核啟動子。用于本發(fā)明的優(yōu)選的阻抑物對生理上良性誘導(dǎo)因子的滅活作用很敏感。因此，當(dāng)利用lac阻抑物蛋白來控制經(jīng)工程改造含有l(wèi)ac0操縱子序列的真核啟動子的表達時，用IPTG處理宿主細胞會引起lac阻抑物從該經(jīng)工程改造的啟動子上脫離下來，從而發(fā)生轉(zhuǎn)錄。類似的，當(dāng)采用tet阻抑物來控制經(jīng)工程改造含有tet0操縱子序列的真核啟動子的表達時，用四環(huán)素處理宿主細胞將引起tet阻抑物從該經(jīng)工程改造的啟動子上脫離下來，從而發(fā)生轉(zhuǎn)錄。一種或多種生理條件，如pH的變化、溫度、輻射、滲透壓、鹽濃度、細胞表面結(jié)合和一種或多種外源因子或內(nèi)源因子的濃度都誘導(dǎo)型啟動子。外源性因子包括氨基酸和氨基酸類似物、糖和多糖、核酸、轉(zhuǎn)錄激活劑和阻抑物、細胞因子、毒素、石油化合物、含金屬的化合物、鹽、離子、酶底物類似物和它們的組合。在具體實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子在對環(huán)境條件的變化，如化學(xué)物質(zhì)、金屬、輻射或營養(yǎng)物濃度的變化，或pH的變化的反應(yīng)中，被激活或受到阻抑。誘導(dǎo)型啟動子可以是噬菌體誘導(dǎo)型啟動子、營養(yǎng)物誘導(dǎo)型啟動子、溫度誘導(dǎo)型啟動子、輻射誘導(dǎo)型啟動子、金屬誘導(dǎo)型啟動子、激素誘導(dǎo)型啟動子、類固醇誘導(dǎo)型啟動子和/或它們的雜交物和組合。在某些實施方案中，特別是癌癥基因治療中，所用的啟動子是離子射線誘導(dǎo)型啟動子，通過接觸離子射線，如UV或X-線，誘導(dǎo)了位于癌細胞中的基因表達。射線誘導(dǎo)型啟動子包括非限制性例子的fos啟動子、c-jun啟動子、或Egr-1啟動子的至少一個CArG結(jié)構(gòu)域。誘導(dǎo)型啟動子的例子包括一些基因如細胞色素P450基因、熱激蛋白基因、金屬硫蛋白基因、激素誘導(dǎo)型基因的啟動子，如雌激素啟動子等。誘導(dǎo)型啟動子可以是Zn2+金屬硫蛋白啟動子、金屬硫蛋白-1啟動子、人金屬硫蛋白IIA啟動子、lac啟動子、小鼠乳腺瘤病毒早期啟動子、小鼠乳腺瘤病毒LTR啟動子、丙糖脫氫酶啟動子、單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子、猿病毒40早期啟動子或逆轉(zhuǎn)錄病毒骨髓增殖性肉瘤病毒啟動子。誘導(dǎo)型啟動子的例子包括哺乳動物probasin啟動子、乳白蛋白啟動子、GRP78啟動子、或細菌四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子。其它例子包括熱激蛋白、類固醇激素、重金屬、佛波酯、腺病毒EIA元件、干擾素和血清誘導(dǎo)型啟動子。用于體內(nèi)的誘導(dǎo)型啟動子包括那些對生物相容性物質(zhì)，如在給定動物組織中常遇到的那些物質(zhì)起反應(yīng)的啟動子。一個例子是人PAI-1啟動子，它是腫瘤壞死難因子可誘導(dǎo)的。其它合適的例子有細胞色素P450基因啟動子，各種毒素和其它因子如熱激蛋白基因可誘導(dǎo)的啟動子、各種應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動子、激素可誘導(dǎo)基因，如雌激素基因啟動子等。顯然，重要的是采用能有效指導(dǎo)所述DNA區(qū)段在選擇用于表達的細胞、細胞器和生物中表達的啟動子和/或增強子。分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員一般知道蛋白質(zhì)表達所用的啟動子、增強子和細胞類型。例如見Sambrook等(1989)，其內(nèi)容納入本文作參考。所用啟動子可以是組成部分性、組織特異性、誘導(dǎo)型，和/或在適當(dāng)條件下用來指導(dǎo)引入的DNA區(qū)段高水平表達，如有利于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)和/或肽。啟動子可以是異源的或內(nèi)源的。在某些實施方案中，本發(fā)明所用啟動子是組織特異性啟動子。本發(fā)明考慮的啟動子包括條件性啟動子。條件性啟動子是一種只在某種條件下才有活性的啟動子。例如，當(dāng)存在一種特定物質(zhì)，如化學(xué)化合物時該啟動子失活或受阻抑。當(dāng)所述物質(zhì)不再存在時，該啟動子的轉(zhuǎn)錄被激活或去阻抑。條件性啟動子的例子包括受甲硫氨酸調(diào)節(jié)的啟動子Met23，調(diào)節(jié)作用以甲硫氨酸濃度為函數(shù)(KerjanP等，1986)，或受半乳糖調(diào)節(jié)的啟動子GAL1或GAL10，調(diào)節(jié)作用以半乳糖濃度為函數(shù)(Johnston和Davis，1984)，但不限于此。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物中采用外部刺激可調(diào)控的啟動子。外部刺激可調(diào)控啟動子的例子包括，例如，PL啟動子、PR啟動子、Pre啟動子、Prm啟動子、P’R啟動子、T7晚期啟動子、trp啟動子、tac啟動子、lac啟動子、gal啟動子、ara啟動子或recA啟動子。在具體實施方案中，本發(fā)明中采用這些啟動子中的操縱子序列。表1列出了本發(fā)明用于調(diào)節(jié)基因表達的元件/啟動子。此表不想詳盡描述參與啟動表達的所有可能的元件，而只是示范性的。表2提供了可誘導(dǎo)元件的例子，它們是在對特定刺激反應(yīng)時可被激活的核苷酸序列區(qū)域。此表不想詳盡描述參與啟動表達的所有可能的元件，而只是示范性的。阻抑型啟動子是一種能對阻抑物的存在或作用至少部分起反應(yīng)的啟動子，所述阻抑物是作用為阻抑啟動子，從而可降低、阻抑或阻抑在該啟動子影響下的多核苷酸轉(zhuǎn)錄的化合物或蛋白質(zhì)。阻抑型啟動子的特征是，在阻抑物存在、影響下，或接觸時，可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活動水平比該阻抑物不存在時，或不受其影響不接觸時降低。阻抑物可以是內(nèi)源性的，或通常是外源性給予的具有阻抑該阻抑型啟動子活性的化合物或蛋白質(zhì)。阻抑物，即化合物或蛋白質(zhì)，原先自身可能是在誘導(dǎo)型啟動子或阻抑型啟動子控制下的多核苷酸轉(zhuǎn)錄或表達的產(chǎn)物。在具體實施方案中，編碼條件性阻抑融合蛋白的多聚核苷酯分子，和/或編碼siRNA的多核苷酸也含有一操作性相連的啟動子。該啟動子可以是可誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子，在某些實施方案中，這類啟動子的例子包括Boshart等(1985)所述的巨細胞病毒啟動子IE、遍在性表達型啟動子如HSV-Tk(McKnight等，1984)和β-肌動蛋白啟動子(如Ng等，1985所述的人β-肌動蛋白啟動子)、及能與控制區(qū)聯(lián)合使轉(zhuǎn)基因整合位點獨立表達的啟動子(Grosveld等1987)、及組織特異性啟動子如白蛋白啟動子(肝臟特異性，Pinkert等，1987)、淋巴樣特異性啟動子Calame和Eaton，1988)、具體是T-細胞(Winoto和Baitimore，1989)和免疫球蛋白(Banerji等，1983；Queen和Balimore，1983)啟動子、神經(jīng)元特異性啟動子(如神經(jīng)纖絲啟動子Byrne和Ruddle，1989)、胰腺行異性啟動子(Edlund等，1985)或乳腺特異性啟動子(牛奶乳清啟動子，美國專利4,873,316和歐洲專利申請出版物264,166)及受發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子，如小鼠hox啟動子(Kessel和Cruss，Science.249374-379，1990)或甲胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman，GenesDev.3537-546，1989)，以上各文獻內(nèi)容納入本文作參考。優(yōu)選在各自細胞類型中啟動子是組成型的。組織特異性啟動子或元件的鑒定及特征分析其活性的試驗是該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這類區(qū)域的例子包括人LIMK2基因(Nomoto等，1999)、促生長素阻抑素受體2基因(Kraus等，1998)、小鼠附睪視黃酸結(jié)合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)小鼠α-2(XI)膠原(Lareyre等，1999)、DIA多巴胺受體基因(Lee等，1997)、胰島素樣生長因子II(Wu等，1997)、人血小板內(nèi)皮細胞粘附分子-1(Almendro等，1996)和SM22α啟動子。在某些實施方案中將采用組織特異性啟動子和/或可調(diào)控元件。可用于本發(fā)明表達載體中的這類組織特異性啟動子的其它例子，包括大腸上皮細胞特異性的肝脂肪酸結(jié)合(FAB)蛋白基因、對胰細胞特異性的胰島素基因、transphyretin、α1-抗胰蛋白酶、纖溶酶原激活物抑制劑1型(PA-1)、肝細胞特異性的載脂蛋白AI和LDL受體基因、少突膠質(zhì)細胞特異性的髓鞘堿性蛋白(MBP)基因、膠質(zhì)細胞特異性的膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)基因、特異性靶向眼睛的視蛋白和神經(jīng)細胞特異性的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)基因的啟動子。本發(fā)明某些方面，利用組織特異性控制，來控制靶序列的表達水平，如控制siRNA的表達水平，或調(diào)節(jié)其它組分，如能直接或間接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因(siRNA)表達的酶的表達水平。其與條件性阻抑融合蛋白的表達水平相反。然而，在其它實施方案中，條件性阻抑融合蛋白的表達是組織特異性的，而非siRNA或酶的組織特異性表達。還考慮本發(fā)明可采用dectin-1和dectin-2啟動子可在本發(fā)明中聯(lián)用的其它病毒啟動子、細胞啟動子/增強子和誘導(dǎo)型啟動子/增強子列于表1和表2中。此外，啟動子/增強子聯(lián)合(如EukaryoticPromoterDataBaseEPDB)也可用來驅(qū)動編碼多糖加工酶、蛋白質(zhì)折疊輔助蛋白、選擇性標(biāo)記蛋白或感興趣的異源蛋白的結(jié)構(gòu)基因的表達。或者，在本發(fā)明中可采用用于基因治療，如癌基因治療的組織特異性啟動子(表3和表4)。表3基因治療的候選組織特異性啟動子表4用于組織特異性基因的候選啟動子B.起動信號和內(nèi)部核糖體結(jié)合位點有效翻譯編碼序列還需要特異性起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子或毗鄰序列?？赡苄枰峁┩庠葱苑g控制信號，包括ATG起始密碼子。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地確定和提供必須的信號。眾所周知起始密碼子必須位于所城編碼序列的讀框內(nèi)以確保完整翻釋插入物。外源性翻譯控制信號和起始密參天子可以是天然的可合成的。包含適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄增強元件可提高表達效率。在本發(fā)明某些實施方案中，利用內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)元件來產(chǎn)生多基因或多順反子信使。IRES元件能繞過5’-甲基化加帽依賴型翻譯的核糖體掃描模式，并開始在內(nèi)部位點翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。細小病毒家族二成員(脊灰和腦心肌炎病毒)的IRES元件已有描述(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及哺乳動物信使的IRES(Macejak和Sarmow，1991)?？蓪RES元件連接于異源性開放讀框。可一起轉(zhuǎn)錄多個開放讀框，每個由IRES隔開，產(chǎn)生多順反子信使。借助該IRES元件，各個開放讀框均可接近核糖體進行有效翻譯。利用一個啟動子/增強子轉(zhuǎn)錄一個信使，可有效表達多個基因(見美國專利5,925,565和5,935,819，納入本文作參考)。C.多克隆位點載體可含有多個克隆位點(MCS)，它們位于含有多個限制性酶切位點的核酸區(qū)域中，每個酶切位點都可用于標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)來消化此載體(見Carbonelli等，1999和Cocea，1997，二者內(nèi)容納入本文作參考)?！跋拗菩悦赶敝赣弥荒茉谀澈怂岱肿犹囟ㄎ稽c發(fā)揮作用的酶催化性切除該核酸分子?？蓮纳虡I(yè)上獲得許多這樣的酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道這種酶的用途。通常采用能在MCS中切除的限制性酶使載體線性化或片段化，以能將外源序列連接入該載體?！斑B接”指在可以是或不是相互毗連的二個核酸片段之間形成磷酯鍵的過程。涉及限制性酶和連接反應(yīng)的技術(shù)是重組
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員熟知的。D.剪接位點大多數(shù)轉(zhuǎn)錄的真核RNA分子將經(jīng)歷RNA剪接從最初轉(zhuǎn)錄物中除去內(nèi)含子。含基因組真核序列的載體可能需要供體和/或受體剪接位點才能確保轉(zhuǎn)錄物的正確加工用于蛋白質(zhì)表達(見Ch和ler等，1997，其內(nèi)容納入本文作參考)。E.末端信號本發(fā)明的載體或構(gòu)建物一般含有至少一個末端信號?！澳┒诵盘枴被颉敖K止子”組成了RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄DNA序列為RNA時的特定終止位點。因此，在某些實施方案中，考慮設(shè)置中止RNA轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生的終止信號。終止子是體內(nèi)必須的，以達到所需的信使水平。在真核系統(tǒng)中，終止子區(qū)域還包括特異性DNA序列，其可定點切除新生轉(zhuǎn)錄物以暴露出聚腺苷酸化位點。這給予了專門的內(nèi)源性聚合酶信號使其在該轉(zhuǎn)錄物的3’端添加大約200A的殘基(聚A)。經(jīng)昆尾修飾的RNA分子看來更穩(wěn)定，能更有效翻譯。因此，其它涉及真核細胞的實施方案中，優(yōu)選終止子含有RNA切除信號，更優(yōu)選訪終止子信號能開啟信使的聚腺苷酸化。終止子和/或聚腺苷酸化位點元件的作用，可能是提高信使水平和/或最大程度減少從表達盒子到其它序列的讀取?？紤]可用于本發(fā)明的終止子包括本文所述或本領(lǐng)域技術(shù)普通人員已知的轉(zhuǎn)錄終止子，包括但不限于，例如基因的末端序列，如牛生長激素終止子或病毒末端序列如SV40終止子。在某些實施方案中，末端信號可以缺少可轉(zhuǎn)錄或可翻譯序列，如由于序列截短而致。F.聚腺苷酸化信號具體的真核細胞表達通常包括聚腺苷酸化信號對轉(zhuǎn)錄物適當(dāng)聚腺苷酸化的作用。不認(rèn)為聚腺苷酸化信號的性質(zhì)是成功實施本發(fā)明的關(guān)鍵，和/或可采用任何這種序列。優(yōu)選的實施方案包括SV40聚腺苷酸信號和/或牛生長激素聚腺苷酸信號，方便的和/或在各種靶細胞中已知功能良好的。聚腺苷酸化可提高轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性，或可促進胞質(zhì)質(zhì)轉(zhuǎn)運。G.復(fù)制起點為了增殖宿主細胞中的載體，此載體中可含一處或多處復(fù)制起始位點(常稱為“ori”)，它是起動復(fù)制的特異性核酸序列?；蛘撸绻拗骷毎墙湍妇?，可采用自動復(fù)制序列(ARS)。H.可選擇的和可篩選的標(biāo)記在本發(fā)明的某些實施方案中，可在表達載體中加入一標(biāo)記而在體外或體內(nèi)鑒定含本發(fā)明多核苷酸的構(gòu)建物。這類標(biāo)記可賦予細胞一種可被鑒定的變化，使得易于鑒定含該表達載體的細胞。通常，可選擇性標(biāo)記是能賦予某可選擇性能的標(biāo)記。陽性可選擇標(biāo)記是存在該標(biāo)記時可選到其存在的標(biāo)記，而陰性可標(biāo)記是其存在防礙其選擇的標(biāo)記。陽性可選擇標(biāo)記的例子是藥物抗性標(biāo)記。通常在載體中包付諸東流可選擇標(biāo)記有助于克隆和轉(zhuǎn)化子的鑒定，例如能賦予對新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素和組氨醇抗性的基因是有用的可選擇性標(biāo)記。除了能賦予可區(qū)分轉(zhuǎn)化子的表型的標(biāo)記外，也考慮其它類型的標(biāo)記包括可篩選的標(biāo)記，如GFP，依靠比色法進行分析。或者，可利用可篩選的酶，如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道怎樣使用免疫標(biāo)記物，可能要與FACS分析相結(jié)合。認(rèn)為所用的標(biāo)記不重要，只要它能與編碼基因產(chǎn)生的核酸同時表達。可自動控制和可篩選的標(biāo)記的其它例子是該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，Mermad等在美國專利6,340,741中公開了在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研發(fā)，及生物動技術(shù)和體細胞基因治療中廣泛應(yīng)用的靶基因在真核系統(tǒng)中的受控表達。利用異源性或人造(嵌合性)轉(zhuǎn)錄因子對外源加入的藥物誘導(dǎo)物(其作用是bonafide配體)的反應(yīng)，實現(xiàn)了基因表達的調(diào)節(jié)。通常這些轉(zhuǎn)錄因子能識別靶基因啟動子中的同源調(diào)節(jié)元件，該配體能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互反應(yīng)，或DNA-結(jié)合因子與轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的相互反應(yīng)。給予或去除該配體會導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄或活化的開關(guān)處于開或關(guān)狀態(tài)。幾種小分子已顯示能介導(dǎo)組織培養(yǎng)細胞和/或轉(zhuǎn)基因動物模型中基因表達的調(diào)節(jié)。這些小分子包括FK1012和雷帕霉素免疫阻抑藥物(Spencer等，1993；Magari等，1997)、孕酮拮抗劑米非司酮(RU486)(Wang，1994；Wang等，1997)、四環(huán)素抗生素衍生物(Gossen和Bujard，1992；Gossen等，1995；Kistner等，1996)和昆蟲類固醇激素蛻皮激素(No等，1996)。所有這些文獻納入本文作參考)。作為其它例子，Yao在美國專利6,444,871中公布了已開發(fā)的與四環(huán)素抗性(tet)操縱子子的前核元件，其中tet阻抑蛋白與已知能調(diào)節(jié)哺乳動物細胞轉(zhuǎn)錄的多肽融合在一起。通過給tet操縱子序列定位后將該融合蛋白導(dǎo)入特定位點。例如，將tet阻抑子融合于反式激活蛋白(VP16)而靶向位于某選出的基因上游的tet操縱子序列(Gussen等，1992；Kim等，1995；Hennoghausen等，1995)。此融合蛋白的tet阻抑子部分與該操縱子結(jié)合從而將VP16激活蛋白靶向需要誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的特定位點。另一種方法是使tet阻抑子與KRAB阻抑結(jié)構(gòu)域融合，將此蛋白靶向某基因上游數(shù)百個堿基對的操縱子。利用此系統(tǒng)，已發(fā)現(xiàn)該嵌合蛋白，而不是單單tet阻抑子，能產(chǎn)生對CMV-調(diào)節(jié)的基因表達10-15倍的阻抑(Deuschle等，1995)。I.調(diào)節(jié)元件和系統(tǒng)在基因調(diào)節(jié)及其修飾的一些例子中，需要導(dǎo)入進化上相隔很遠物種的調(diào)節(jié)元件，如大腸桿菌到高等真核細胞，預(yù)計調(diào)制這種調(diào)節(jié)環(huán)境的的效應(yīng)器對真核細胞生理將是橢性的，結(jié)果不會在真核細胞中引起不希望的多效性作用。例如大腸桿菌的Lac阻抑子(LacR)/操縱子/誘導(dǎo)物系統(tǒng)在真核細胞中具有功能，已被用來調(diào)節(jié)基因表達，通過三種不同方式(1)將Lac操縱子置于啟動子的恰當(dāng)位點防止轉(zhuǎn)錄啟動(Hu和Davidson，1987；Brown等，1987；Figge等，1988；Fuerst等，1989；Deuschle等，1989)；(2)用LacR/操縱子復(fù)合物阻斷RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄延伸(Deuschle等，1990)；(3)啟動子活化對LacR與單純皰疹病毒(HSV)毒粒蛋白16(VP16)的活化結(jié)構(gòu)域之間的融合起反應(yīng)(Labow等，1990；Baim等，1991)。在一個版本的Lac系統(tǒng)中，lac操縱子-連接序列受LacR-VP16融合蛋白的組成型激活而表達，在存在異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)時表達關(guān)閉(Labow等，1990，同上)。在另一版本此系統(tǒng)中，采用在存在IPTG時能與lac操縱子結(jié)合的lacR-VP16變體，可通過提高細胞溫度而增強(Baim等，1990，同上)。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中采用了Lac系統(tǒng)的組分。例如，可將lac操縱子操作性連接于siRNA-編碼多核苷酸，可從外部用，例如，含lac阻抑子的IPTG可誘導(dǎo)融合蛋白控制其表達。還發(fā)現(xiàn)大腸桿菌四環(huán)素抗性系統(tǒng)的組分在真核細胞中具有功能，已被用來調(diào)節(jié)基因表達。例如在植物細胞中表達能在缺少呈環(huán)素時結(jié)合tet操縱子序列并阻抑基因轉(zhuǎn)錄的Tet阻抑子(TetR)，其表達濃度足夠高能阻抑含tet操縱子序列的啟動子的轉(zhuǎn)錄(Gatz，C等，1992，PlantJ.2397-404)。在本發(fā)明的某些實施方案中，類似地采用了這種阻抑子系統(tǒng)。本發(fā)明中也可利用溫度誘導(dǎo)型基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)，如含有融合蛋白形式的冷誘導(dǎo)反式激活蛋白的示范性TIGR系統(tǒng)，其含有融合于VP16反式激活蛋白的熱激反應(yīng)調(diào)節(jié)子rheA(Weber等，2003a)。能對該融合溫感器反應(yīng)的啟動子含有操作性連接于最小啟動子，如人巨細胞病毒立即早期啟動子最汪版本的rheO元件。在37℃允許溫度時，該冷誘導(dǎo)反式激活蛋白，反式激活了示范性rheO-CMVmin啟動子，得以表達靶基因。41℃時，該冷誘導(dǎo)反式激活蛋白不再反式激活rheO啟動子。本發(fā)明所用的其它實施方案包括大腸桿菌的紅霉素抗性調(diào)節(jié)子，其含有對大環(huán)內(nèi)酯抗生素，如紅霉素、克拉霉索和羅紅霉素起反應(yīng)的阻抑(Eoff)和或誘導(dǎo)(Eon)系統(tǒng)(Weber等，2002)。Eoff系統(tǒng)利用紅霉素依賴型反式激活蛋白，其中提供大環(huán)內(nèi)酯抗生素來阻抑轉(zhuǎn)基因的表達。在Eon系統(tǒng)中，阻抑子與操縱子結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因表達的阻抑。而存在大環(huán)內(nèi)酯蛤誘導(dǎo)了基因表達。Fussenegger等(2000)描述了采用天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)的鏈陽性菌素抗性操縱子編碼的Pip(原始霉素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì))阻抑子的阻抑和可誘導(dǎo)系統(tǒng)，此系統(tǒng)可對鏈陽性菌素類抗生素(如原始霉素、威里霉素和喹奴普丁)反應(yīng)。例如，可將PipDNA-結(jié)合域與VP16的反式激活結(jié)構(gòu)域，或與KRAB沉默結(jié)構(gòu)域相融合。如以上所述，原始霉素存在或不存在都能以各自方式調(diào)節(jié)該PipON和PipOFF。轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng)的另一例子是利用密度感受系統(tǒng)(指顆粒性前核分子通訊系統(tǒng)，其具有可擴散性信號分子可防止阻抑子與操縱子位點結(jié)合，導(dǎo)致靶調(diào)節(jié)子脫阻抑)。例如，Weber等(2003b)采用含有天藍色鏈霉菌的密度感受受體與反式激活結(jié)構(gòu)域結(jié)合的融合蛋白，來調(diào)節(jié)各自具有的該融合蛋可結(jié)合的操縱子的嵌合性啟動子。用無毒性的丁酰內(nèi)酯，如SCB1和MP133來細調(diào)表達。在具體實施方案中，本發(fā)明采用功能上彼此相容的多重多基因治療性基因表達系統(tǒng)(見例如，Kramer等，2003)。例如，在Weber等(2002)中，采用大環(huán)內(nèi)酯反應(yīng)性紅霉素抗性調(diào)節(jié)子系統(tǒng)，結(jié)合鏈陽性菌素(PIP)調(diào)節(jié)的和四環(huán)素調(diào)節(jié)的表達系統(tǒng)。在本發(fā)明一具體實施方案中，用PolII啟動子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因(如示范性的siRMA)的表達(見例如，Shinagawa和Ishii，2003)。如在Shinagawa和Ishii(2003)的示范性系統(tǒng)中，產(chǎn)生的長dsRNA沒有5’-帽結(jié)構(gòu)和3’-聚(A)尾，阻礙了此長dsRNA輸出到胞質(zhì)中，從而阻礙了干擾素反應(yīng)的誘導(dǎo)。雖然在此系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄后加工受到在RNA起始位點(為去除5’-加帽)和MAZ位點(為PolII停頓)下游處加入順式作用錘頭核酶的調(diào)節(jié)，但這樣做的任何方法都屬于本發(fā)明的范圍。III.轉(zhuǎn)染將siRNA表達系統(tǒng)導(dǎo)入細胞或生物體中轉(zhuǎn)染是將核酸導(dǎo)入受體真核細胞中，然后將該核酸序列整合入染色體DNA中。有效的轉(zhuǎn)染需要載體，它能促進外源性核酸導(dǎo)入所需的細胞中，可提供染色體整合機制，和適當(dāng)表達這些核酸編碼的性狀或蛋白質(zhì)。設(shè)計和構(gòu)建細胞轉(zhuǎn)染用的有效、可靠和安全的載體是本領(lǐng)域熟知的。本發(fā)明申請書中，能介導(dǎo)元件(a)、(b)和(c)輸送和基因組整合到靶細胞、組織或生物體內(nèi)的任何載體都認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍。許多類型的病毒構(gòu)成了載體的基礎(chǔ)。所用的病毒常衍生自病原性種類的病毒，它們具有需要的性能和轉(zhuǎn)染細胞的能力。然而，不是所有的病毒者能成功轉(zhuǎn)染處在細胞周期所有階段的所有類型細胞。因此在開發(fā)病毒載體時，常需修飾病毒基因組以提高它們導(dǎo)入外源性基因構(gòu)建物(轉(zhuǎn)基因)或其它核酸的能力和效果。同時，可導(dǎo)入修飾以減少或消除它們引起疾病的能力。因此，本發(fā)明可采用病毒，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺伴隨病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；；Hermonat和Muzycska，1984)和皰疹病毒衍生的病毒載體。它們能賦予各種哺乳動物細胞幾種吸引人的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1998；Horwich等，1990)也可采用衍生自病毒，如痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、仙臺病毒、巨細胞病毒和單純皰疹病毒的其它病毒載體。本領(lǐng)域所知的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可用于輸送siRNA表達構(gòu)建物。見例如，Devroe和Silver(2002)(其內(nèi)容納入本文作參考)證明逆轉(zhuǎn)錄病毒是輸送siRNA表達盒到哺乳動物細胞中的有效載體Barton和Medzhitov(2002)證明用逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入siRNA表達構(gòu)建物導(dǎo)致原代細胞中基因的穩(wěn)定性失活。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個亞組，由于其整合前復(fù)合體的親核性質(zhì)可通過核孔輸入其活性形式，而能感染非分裂細胞。A.慢病毒載體慢病毒屬包括牛慢病毒族、馬慢病毒族、貓慢病毒族、羊慢病毒族和靈長類慢病毒族。用于基因治療的慢病毒載體的開發(fā)綜述見Klimatcheva等(1999)。適合于基因治療的慢病毒載體的設(shè)計和用法見例如美其名曰國專利6,531,123、6,207,455和6,165,782中所述(各專利內(nèi)容納入本文作參考)。慢病毒的例子包括但不限于HIV-1、HIV-2、HIV-1/HIV-2假型、HIV-1/SIV、FIV、貓關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧務(wù)病毒和牛免疫缺陷病毒。優(yōu)選HIV-1。慢病毒載體可賦予基因療法很大優(yōu)點。長期表達需要將它們穩(wěn)定地整合入靶細胞的染色體中。另外，它們不會轉(zhuǎn)移病毒基因從而避免了產(chǎn)生可能被細胞毒T-細胞摧毀的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞問題。此外，它們具有相對較優(yōu)大的克隆容量，因而有臨床適用性。慢病毒與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒相反，能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂懷細胞。這對于組織，如造血系統(tǒng)、腦、肝、肺和肌肉的基因治療非常重要。例如，衍生自HIV-1的載體可在體內(nèi)或先體外后體內(nèi)將轉(zhuǎn)基因輸送、整合到細胞，如神經(jīng)元、肝細胞和肌細胞中并穩(wěn)定表達(Blomer等，1997；Kafri等，1997；Naldini等，1996a；1996b)。慢病毒基因組和原病毒DNA具有3個逆轉(zhuǎn)錄病毒中所見的基因gag、pol和env，它們側(cè)國接有2個長末端重復(fù)(LTR)序列。Gag基因編碼內(nèi)部結(jié)構(gòu)(基質(zhì)、包衣和核衣殼)蛋白pol基因編碼RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)、蛋白酶和整合酶；env基因編碼病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTR的作用是啟動轉(zhuǎn)錄和病毒粒子RNA的聚腺苷酸化。LTR含病毒復(fù)制必須的所有其它順式作用序列。慢病毒含有的其它基因包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx。毗連5’LTR的序列是基因組逆轉(zhuǎn)錄(tRNA引物結(jié)合位點)和病毒RNA有效包裹入顆粒(Psi位點)中所必須的序列。如果從病毒基因組中減去包裹(或逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA包裝入感染性毒粒中)必須的該序列，此順式作用缺陷將阻止基因組RNA的包裹。然而，產(chǎn)生的突變體仍能指導(dǎo)所有毒粒蛋白的合成。慢病毒載體是本領(lǐng)域熟知的，見Naldini等，(1996a和1996b)；Zufferey等(1997)；dULL等，(1998)；美國專利6,013,516和5,994,136，它們的內(nèi)容均納入本文作參考。通常，這些載體是質(zhì)?；虿《?，結(jié)構(gòu)中攜帶有摻入外源性核酸、選擇和將該核酸轉(zhuǎn)移到宿主細胞中所必須的序列。相應(yīng)的，在體外和體內(nèi)，人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)衍生的慢病毒轉(zhuǎn)基因的有效輸送、整合入非有絲分裂細胞中并長時間表達(Naldini等，1996a；Naldini等，1996b；Blomer等，1997)。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中，也含有所有的必須順式作用元件的一個RNA分子，攜帶了所有的編碼序列。通過將編碼基各種組分的序列分配成為盡可能性多的獨立單元，以最大程度提高再創(chuàng)立復(fù)制活性重組體(RCR)所需的交換數(shù)，從而達到了載體產(chǎn)生系統(tǒng)的生物安全性。在宿主生產(chǎn)細胞，如293人胚腎細胞中共表達毒粒包裝元件和載體基因組產(chǎn)生了慢病毒載體顆粒。就HIV-1載體而言其毒粒的核心和酶組分來自HIV-1，而包膜蛋白衍生自異源病毒，最常用VSV病毒，因為其G蛋白穩(wěn)定性高和嗜性廣。HIV的基因組復(fù)雜，全套基因編碼致病所必須的毒力因子，但可分散轉(zhuǎn)移病毒基因，這大大有助于開發(fā)臨床上可接受的載體系統(tǒng)。多功能減毒包裝系統(tǒng)現(xiàn)在通常只包含HIV-1九個基因中的三個gag，編碼毒粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白；pol，負責(zé)編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒的特異性酶，和rev，編碼gag和pol有效表達所需的翻譯后調(diào)節(jié)子(Dull等，1998)。由于這種包裝系統(tǒng)缺失太多，親代病毒不可能重建，因為其基因組的約60％完全被去除。在一種版本的HIV包裝系統(tǒng)中，從4個分離的DNA單元產(chǎn)生了Gag/Pol、Rev、VSVG和載體。另外，載體和輔助序列之間的重疊減少到59個核苷酸使得發(fā)生同源重組的機會減至最低程度?；贖IV1型(HIV-1)的載體顆粒可通過在所謂生產(chǎn)細胞質(zhì)如293T人胚腎細胞中共表達毒粒饈元件和載體基因組而產(chǎn)生?？捎靡恍┵|(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染這些細胞。常用3-4種質(zhì)粒，但數(shù)目可更多，取決于慢病毒組分破開進入不同單元的程度。通常，一種質(zhì)粒編碼HIV-1衍生毒粒的核心和酶組分。此質(zhì)粒稱為包裝質(zhì)粒。另一質(zhì)粒編碼包膜蛋白，最常是水皰口炎病毒的G蛋白(VSVG)，因為它穩(wěn)定性高，嗜性廣。此質(zhì)粒可稱為包膜表達質(zhì)粒。還有一質(zhì)粒編碼待轉(zhuǎn)運給靶細胞的基因組，即載體本身，稱為轉(zhuǎn)運質(zhì)粒。通過此技術(shù)可產(chǎn)生每毫升數(shù)百萬轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU/ml)滴度的重組病毒和及變體。超離心后可獲得大約109TU/ml的濃縮貯存液。載體本身只是一種轉(zhuǎn)移給靶細胞的遺傳物質(zhì)。它通常含轉(zhuǎn)基因盒，側(cè)接有其包裹、逆轉(zhuǎn)錄、核輸入和整合所需的順式作用元件。如先前對致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒所做的工作，制備的慢病毒載體是“自身滅活的”，一旦轉(zhuǎn)移到靶細胞中，它們即會喪失轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列(LTR)的能力(Zufferey等，1998)。此種修飾進一步降低成本了出現(xiàn)復(fù)制活性重組體的危險，和避免了啟動子干擾相關(guān)的問題。這些載體或它們的組分，稱為SIN載體或含SIN的載體。進一步詳述此SIN設(shè)計見Zufferey等，1998和美國專利5,994,136，其內(nèi)容納入本文作參考。B.轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件在某些實施方案，特別是涉及本發(fā)明具有合理活性的啟動子的慢病毒構(gòu)建物實施方案中，可能需要增強轉(zhuǎn)基因的表達。一類翻譯后調(diào)節(jié)元件(PRE)是位于表達盒子中能刺激基因表達的內(nèi)含子。然而，在慢病毒生命周期中可能剪去內(nèi)含子。因此，如果內(nèi)含子用作PRE，可能必須將它們安置在相對于載體基因組轉(zhuǎn)錄的相反朝向。在病毒生命周期中不依賴于剪接活動的翻譯后調(diào)節(jié)元件，優(yōu)點是不會被除去。一些例子是單純皰疹病毒的翻譯后加工元件、乙肝病毒的翻譯后加工元件(HPRE)和美洲旱賴肝炎病毒的翻譯后加工元件(WPRE)。其中最優(yōu)選WPRE，因為它含一個在HPRE中沒有的額外順式作用元件(Donello等，1998)。將此調(diào)節(jié)元件定位于載體包括在該轉(zhuǎn)基因的RNA轉(zhuǎn)錄物中，但在該轉(zhuǎn)基因翻譯單元終止密碼子的下游。如本發(fā)明和Zufferey等，1999所證明的那樣，WPRE元件是刺激和增強慢病毒載體中所需轉(zhuǎn)基因表達的有用工具。WPRE的特征鑒定和描述見美國專利6,136,597，其內(nèi)容納入本文作參考。如上所述，WPRE是一種RNA輸出元件，能介導(dǎo)RNA從細胞核中有效地轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中。它通過插入的順式作用核酸序列能增強轉(zhuǎn)基因的表達，因而可將該元件和轉(zhuǎn)基因包付諸東流在一個轉(zhuǎn)錄物內(nèi)。以有義方向存在的WPRE顯示能提高轉(zhuǎn)基因表達7-10倍。逆轉(zhuǎn)錄病毒輸送cDNA形式的序列，而不是含完整內(nèi)含子的基因，因為在導(dǎo)致形成逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的一系列活動中，內(nèi)含子通常被剪掉。內(nèi)含子介導(dǎo)了原始轉(zhuǎn)錄物與剪接機制的相互反應(yīng)。因為剪接機制對RNA的加工而促進了它的胞質(zhì)輸出，由于剪接和轉(zhuǎn)運機制之間的偶聯(lián)，常駐機構(gòu)不能充分表達cDNA。因此，在載體中加入WPRE可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因表達增加。在細胞核中導(dǎo)入外源核酸需要將該核酸通過核膜輸入到核中。慢病毒所用的活性核輸入系統(tǒng)，形成了它們在非分裂細胞中有效復(fù)制能力的基礎(chǔ)。這訓(xùn)活性輸入系統(tǒng)依靠一系列復(fù)雜的活動，包括特異性調(diào)制逆轉(zhuǎn)錄。具體說，在HIV-1中，位于pol基因中的中央多聚嘌呤片段(cPPT)引起下游plus鏈的合成，同時也引起3’多聚嘌呤片段(PPT)的plus鏈合成。該短的DNA分子的鏈轉(zhuǎn)移后，上游plus鏈的合成將啟動并進行下去直到到達基因組的中心。在中央末端序列(cTS)處，HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶被排斥(從其模板上釋放出來)，以鏈置換方式發(fā)揮功能(Charneau等，1994)。純結(jié)果是在基因組中央形成長99個核苷酸的具有穩(wěn)定下垂物的雙鏈DNA分子。這種中央“下垂物”有助于核輸入(Zennou等，2000)。IV.轉(zhuǎn)基因小鼠和其它轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠所用的方法是該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，可采用題為“ManipulatingtheMouseEmbryo”1986，一書中的手工方法。例子見Leder和Stewart美國專利4,736,866中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的方法。其它例子包括以下納入本文作參考的專利美國專利6,025,539，涉及IL-5轉(zhuǎn)基因小鼠；美國專利6,023,010，缺失成熟淋巴細胞類型的非人轉(zhuǎn)基因動物；美國專利6,018,098，皮膚光衰老的體內(nèi)和體外模型；美國專利6,018,097，表達人胰島素的轉(zhuǎn)基因小鼠；美國專利6,008,434，生長分化因子-11轉(zhuǎn)基因小鼠；美國專利5,994,618，生長分化因子-8轉(zhuǎn)基因小鼠；美國專利5,986,171，檢查脊灰病毒神經(jīng)毒性的方法；美國專利5,981,830，具有被破壞的hepsin基因的敲除小鼠和它們的子代；美國專利5,981,829，DELTA.Nur77轉(zhuǎn)基因小鼠；美國專利5,936,138，編碼能促進HIV感染的突變體L3T4蛋白的基因，和表達此蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠；美國專利5,912,411，四環(huán)素可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠；美國專利5,894,078，表達C-100app的轉(zhuǎn)基因小鼠(各專利內(nèi)容納入本文作參考)。本領(lǐng)域眾所周知，在受精卵的核中，或在最終形成受精卵核部分的任何核遺傳物質(zhì)中，安置或插入外源遺傳物質(zhì)，可進行受精卵的遺傳轉(zhuǎn)化(產(chǎn)生胚胎和成熟的生物)。受精卵和此受精卵所產(chǎn)生的生物的基因型將包括該外源遺傳物質(zhì)的基因型。此外，含有外源遺傳物質(zhì)的受精卵將產(chǎn)生該外遺傳物質(zhì)的表型表達。該外源遺傳物質(zhì)的基因型表達在該受精卵分裂的細胞上。然而，該表型的表達，如產(chǎn)生蛋白產(chǎn)物或外源遺傳物質(zhì)的產(chǎn)物，或受精卵或生物天然表型的變化，將發(fā)生在該受精卵或生物體發(fā)育中該具體外源遺傳物質(zhì)被激活的時間點。表型表達的變化，包括表型表達的增加或減少，或表型啟動和/或控制的改變，包括加入新的啟動子和/或控制子，或補充加強了該表型的現(xiàn)有癖動子和/或控制子。美其名曰國專利4,873,191中公開并詳細描述了各種類型的基因轉(zhuǎn)化，其內(nèi)容納入本文作參考。生物的遺傳轉(zhuǎn)化可用于分化期體內(nèi)基因表達的分析，和采用基因療法或用非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物作為人類疾病的模型系統(tǒng)來消滅或減少遺傳性疾病。此模型系統(tǒng)可用于測試推測的藥物在人體中的潛在治療價值?？蓪⑼庠葱赃z傳物質(zhì)置于成熟卵的核內(nèi)。所述卵宜為受精卵或處在(通過孤雌生殖)活化期。加入外源性遺傳物質(zhì)后，再加入能形成受精卵的一組互補性單倍染色體(如精子細胞或極體)。通過將受精卵植入假孕雌性動物使其發(fā)育成生物。分析所產(chǎn)生的生物外源性遺傳物質(zhì)整合情況。如果確定有正常整合，該生物可用于據(jù)認(rèn)為與某特定遺傳疾病相關(guān)的基因的體內(nèi)表達分析。進行了利用這類轉(zhuǎn)基因動物研究多種不同類型遺傳疾病的嘗試。見例如WO89/06689和WO89/06693關(guān)于阿爾茨海默病的研究，其內(nèi)容納入本文作參考。不同發(fā)育期限的胚胎靶細胞可用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因。根據(jù)胚胎靶細胞的發(fā)育階段采用不同的方法。顯微注射的最好靶子是受精卵。雄性小鼠的前核當(dāng)其大小達到約20微米直徑時，能容納1-2皮升DNA溶液的生殖性注射。利用受精卵作為基因轉(zhuǎn)移的靶主要優(yōu)點是，在大多數(shù)情況下注射的DNA在第一次切除前可摻入宿主基因中(Brinster等，1985)。結(jié)果，所有的非人轉(zhuǎn)基因動物將攜帶該摻入的轉(zhuǎn)基因。這一般也反映在該轉(zhuǎn)基因能有效地優(yōu)越性給該奠基動物的是后代，因為50％胚細胞含有此轉(zhuǎn)基因。受精卵的顯微注射是摻入轉(zhuǎn)基因的優(yōu)選方法。也可利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染將轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙游??？稍隗w外將發(fā)育的非胚胎培養(yǎng)到胚泡期。此期間的卵裂球可作為逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的靶子(Jaenich，1976)。用酶處理去除透明帶可獲得對裂球的有效感染(Hogan等，1986)。用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的病毒載體系統(tǒng)一般是攜帶轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒，Jahner等，(1985)；VanderPutten等，(1985)。在單層能產(chǎn)生病毒的細胞上培養(yǎng)該裂球可容易有效地獲得轉(zhuǎn)染(VanderPutten，同上；Stewart等，1987)?；蛘撸稍谕砥谶M行感染。將病毒或病毒感染細胞注射入該裂球中(Jahner，1982)。大多數(shù)奠基動物是轉(zhuǎn)基因鑲嵌動物，因為轉(zhuǎn)基因工程的摻入只發(fā)生在一亞組細胞中，形成了非人轉(zhuǎn)基因動物。另外，奠基動物在基因組的不同部位可能含有各種逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)基因插入物，通過會分離到后代中。此外，也可通過逆轉(zhuǎn)錄病毒宮內(nèi)感染妊娠中期的胚胎，將轉(zhuǎn)基因?qū)肱呒毎抵校m然效率低(Jahner，1982)。用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的第三種靶細胞是胚胎干細胞(ES)。ES細胞可獲自體外培養(yǎng)的植入前胚胎并與胚胎融合(Evans等，1981；Bradley等，1984；Gossler等，1986；到Robertson等，1986)。通過DNA轉(zhuǎn)染功通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，可有效地將轉(zhuǎn)基因?qū)隕S細胞中。這樣轉(zhuǎn)化的細胞可與非人動物的胚泡組合。ES細胞然后定居在胚胎并歸并入所產(chǎn)生的嵌合動物的胚系中。綜述風(fēng)Jaenisch，(1988)。如本文所用，“轉(zhuǎn)基因”是一種通過人的干預(yù)，如上述方法，引入到非人動物種系中的DNA序列。因此，在本發(fā)明的一具體方面，非人哺乳動物所具有的示范性轉(zhuǎn)基因含有編碼操作性連接于本發(fā)明KRAB阻抑結(jié)構(gòu)域的四環(huán)素可調(diào)控或四環(huán)素類似物可調(diào)控的DNA結(jié)合域的多核苷酸序列，或該示范性轉(zhuǎn)基因編碼的siRNA操作性連接于啟動子和上述融合基因產(chǎn)物可結(jié)合的序列。含有二種轉(zhuǎn)基因(即編碼四環(huán)素可調(diào)控或四環(huán)素類似物可調(diào)控融合蛋白的轉(zhuǎn)基因，和含有連接有對該融合蛋白起反應(yīng)的啟動子的轉(zhuǎn)基因)的雙重轉(zhuǎn)基因動物也包括在本發(fā)明中。一實施方案中，該轉(zhuǎn)基因動物園是小鼠。在其它實施方案中，該轉(zhuǎn)基因動物是奶牛、山羊、綿羊或豬?？赏ㄟ^在受精卵母細胞中導(dǎo)入編碼上述示范性轉(zhuǎn)基因的DNA分子，然后將該受精卵植入假孕養(yǎng)母中，使受精卵母細胞發(fā)育成非人轉(zhuǎn)基因動物，而產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動物。可通過二種轉(zhuǎn)基因動物的適當(dāng)交配產(chǎn)生雙重轉(zhuǎn)基因動物。可通過給予本發(fā)明雙重轉(zhuǎn)基因動物四環(huán)素或四環(huán)素類似物，來阻抑連接含有一啟動子的siRNA(能對調(diào)節(jié)該啟動子的四環(huán)素或四環(huán)素類似物可誘導(dǎo)融合蛋白起反應(yīng))的表達。本發(fā)明另一具體方面涉及含有編碼本發(fā)明四環(huán)素或四環(huán)素類似物融合蛋白轉(zhuǎn)基因的非人轉(zhuǎn)基因動物，其中，所述轉(zhuǎn)基因通過同源重組整合入該動物細胞染色體中的預(yù)定位置(也稱為同源重組動物)。該同源重組動物也可含有第二種編碼操作性連接于對四環(huán)素或四環(huán)素類似物可誘導(dǎo)融合蛋白能起反應(yīng)的siRNA的轉(zhuǎn)基因。此第二種轉(zhuǎn)基因被隨機導(dǎo)入染色體中，或在染色體預(yù)定位置導(dǎo)入(如同源重組)?？赏ㄟ^在胚胎干細胞群中導(dǎo)入本發(fā)明的靶向載體，產(chǎn)生在該動物細胞染色體DNA的預(yù)定位置貪大求含有整合的tTR-KRAB編碼序列的本發(fā)明非人轉(zhuǎn)基因動物，所用條件適合在編碼tTR-KRAB的DNA與細胞染色體DNA之間發(fā)生同源重組，選出其染色體DNA預(yù)定位置整合了編碼tTR-KRAB的DNA的胚胎干細胞，將該胚胎干細胞植入胚泡，再將該胚泡植入假孕養(yǎng)母中使該胚泡發(fā)育成非人轉(zhuǎn)基因動物，從而產(chǎn)生該非人轉(zhuǎn)基因動物。A.條件性轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明還考慮條件性轉(zhuǎn)基因或敲減動物，例如用重組方法產(chǎn)生這些動物。噬菌體P1Cre重組酶和酵母菌質(zhì)粒的flp重組酶是位點特異性DNA重組酶的二個非限制性例子，它們能在特定的靶位點(Cre重組酶在loxP位點，flp重組酶在frt位點)切除DNA并催化該DNA與第二切除位點連接。已報導(dǎo)了許多合適的其它位點特異性重組酶，它們的基因可用于本發(fā)明的方法中。這類重組酶包括噬菌體λ(含或不含Xis)的Int重組酶(Weisberg等，1983，納入本文作參考)、Tpnl和β-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)座子(Mercier等，1990)、Tn3解離酶(Flanagan和Fennewald，1989；Stark等，1989)、酵母菌重組酶(Matsuzaki等，1990)、枯草芽胞桿菌SpoIVC重組酶(Sato等，1990)、Flp重組酶(Schwartz和Sadowski，1989；Parsons等，1990；Golic和Lindquist，1989；Amin等，1990)、Hin重組酶(Glasgow等，1989)、免疫球蛋白重組酶(Malynn等，1988)和Cin重組酶(Haffer和Bickle，1988；Hubner等，1989)，所有均納入本文作參考。這類系統(tǒng)在(Echols，1990；deVillartay，1988；Craig，1988；Poyart-Salmeron等，1989；Hunger-Bertling等，1990；Cregg和Madden，1989)中有所報告，所有這些文獻內(nèi)容納入本文作參考。本發(fā)明中特別令人感興趣的是Cre重組酶。將Cre純化至均一，并已廣泛特征鑒定了它與loxP位點的反應(yīng)(Abremski和Hess，1984，納入本文參考文獻)。Cre蛋白的分子量為35,000，可購自NewEngl和Nuclear/DuPont。已克隆并表達了Cre基因(其編碼Cre蛋白)(Abremski等，1983，納入本文參考文獻)。Cre蛋白可介導(dǎo)存在于相同或不同DNA分子中的二個loxP序列之間的重組(Sternberg等，1981)。因為loxP位點的內(nèi)部間隔序列不對稱，這二個loxP位點可能在方向上顯示彼此相關(guān)(Hoess和Abremski，1984)。因此當(dāng)同一DNA分子上的二位點以直接重復(fù)方向存在時，Cre將切除二位點之間的DNA(Abremski等，1983)。然而，如果二位點彼此相反，重組后它們之間的DNA不會被切斷而是相顛倒。這樣，具有二個順方向loxP位點的環(huán)形DNA分子將會重組產(chǎn)生二個較小的環(huán)，而具有二個反向loxP位點的環(huán)形分子則簡單地顛倒了二個loxP位點側(cè)接的DNA序列。此外，當(dāng)分開的DNA分子上存在靶序列時，重組酶的作用可導(dǎo)致遠離靶位點區(qū)域的相互交換。重組酶在特征鑒定敲除動物模型中的基因功能上有重要應(yīng)用。當(dāng)用本文所述構(gòu)建物來破壞鱟凝血因子蛋白酶樣基因時，在鱟凝血因子蛋白酶樣基因翻譯起始點下游(3’)插入陽性選擇標(biāo)記可產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄物。該融合轉(zhuǎn)錄物可能導(dǎo)致某種水平的蛋白質(zhì)表達后果不知。這提示陽性選擇標(biāo)記基因的插入可影響附近基因的表達。這種影響使測定敲除后基因的功能變得困難，因為不可能分辨某給定表型是否與某基因的滅活或附近基因的轉(zhuǎn)錄相關(guān)連。通過利用重組酶的活性解決了這二個潛在問題。當(dāng)陽性選擇標(biāo)記側(cè)接有同樣取向的重組酶位點時，加入相應(yīng)的重組酶將導(dǎo)致去除該陽性選擇標(biāo)記。以這種方式避免了陽性選擇標(biāo)記或融合轉(zhuǎn)錄物表達所引起的作用。B.轉(zhuǎn)基因敲減小鼠在某些方面，本發(fā)明考慮建立能顯示條件性敲減靶基因的轉(zhuǎn)基因動物的方法，敲減靶基因可以組織特異性方式進行，雖然不需要這樣。某基因的“敲減”可通過干擾突變基因轉(zhuǎn)錄為有害蛋白來實現(xiàn)。將此技術(shù)應(yīng)用來創(chuàng)造其遺傳的RNAi能使靶基因表達降低或沉默的轉(zhuǎn)基因小鼠，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的“基因敲減”。為使RNAi適應(yīng)小鼠基因功能的研究，采用基因工程法創(chuàng)立了小鼠胚胎干細胞，此干細胞中RNAi被靶向到一特定基因(Carmell等，2003)。其根據(jù)是先前通過RNAi使感興趣的基因沉默的研究，該研究采用工程改造的編碼對應(yīng)于該感興趣基因的短發(fā)夾RNA分子有效實現(xiàn)了這種沉默(Carmell等，2003)。將這種干細胞注入胚胎中產(chǎn)生嵌合動物。這些嵌合性小鼠代交配，產(chǎn)生的后代體內(nèi)每一個細胞都含有經(jīng)基因工程程改造的RNAi誘導(dǎo)基因。通過檢查轉(zhuǎn)基因小鼠的組織觀察到，整個生物體內(nèi)(如肝、心、脾)感興趣基因的表達顯著減少?；虮磉_的這種減少稱為“基因敲減(knockdown)”，以和傳統(tǒng)的涉及染色體中某DNA區(qū)段“基因敲除”，或完全缺失的方法相區(qū)別。此RNAi為基礎(chǔ)的基因敲減策略一個優(yōu)點是，可修飾該策略使特定組織中的基因沉默，可設(shè)計使其在動物發(fā)育或成年期間任何時候打開或關(guān)閉。V.治療性應(yīng)用本發(fā)明可廣泛用于各種需要能夠調(diào)節(jié)基因表達水平的情況，如以迅速、有效和可控制方式打開或關(guān)閉基因表達，而不引起多效作用或細胞毒性。本發(fā)明具體可用于人的基因治療目的，治療遺傳或獲得性疾病?；蛑委煹囊话惴椒ò▽⒁环N或多種核酸分子導(dǎo)入細胞，在該細胞中產(chǎn)生導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)所編碼的一種或多種產(chǎn)物，以恢復(fù)或改變功能活性?；蛑委煼椒ǖ木C述見Anderson等，1992；Miller等，1992；Friedmann等，1989；和Cournoyer等，1990。然而，目前的基因治療載體通常使用能對內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子起反應(yīng)的組成型調(diào)節(jié)元件。這些載體系統(tǒng)沒有能力調(diào)節(jié)患者的基因表達水平。相反，本發(fā)明的調(diào)節(jié)系統(tǒng)可提供情報此種能力。為基因治療目的采用本發(fā)明的系統(tǒng)，應(yīng)至少將一種DNA分子導(dǎo)入需要基因治療的患者(如患有遺傳或獲得性疾病的患病)的細胞中以修飾該細胞。被修飾的細胞包括1)編碼本發(fā)明可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)子的核酸，其形式適合在宿主細胞中表達該可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)子；和2)操作性連接有誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)子-反應(yīng)性啟動子(如至少一個tet操縱子序列，任選的和最小啟動子)的siRNA(如為了治療目的)?？刹捎镁幋a本發(fā)明調(diào)節(jié)系統(tǒng)諸組分的一個DNA分子，或者，可采用編碼各個組分的不同DNA分子。可在活體外修飾患者的細胞后再導(dǎo)入該患者，或可采用在細胞中導(dǎo)入核酸的常規(guī)技術(shù)直接修飾體內(nèi)的細胞?；颊咧写嬖赥c或Tc類似物時能刺激文藝患者細胞中感興趣siRNA的表達，而患者中不存在Tc或Tc類似物時阻抑基表達。在某些實施方案中，基因表達水平不同取決于采用那種Tc類似物作為誘導(dǎo)物。此外，可根據(jù)個體的醫(yī)療需要調(diào)節(jié)siRNA的表達，這可能在該個體的一生中有變化。因此，本發(fā)明的調(diào)節(jié)系統(tǒng)賦予了比組成型調(diào)節(jié)系統(tǒng)更好的優(yōu)點，可使基因表達水平的調(diào)節(jié)依據(jù)治療情況的需要而定。為治療遺傳性或獲得性疾病患者細胞中要敲減或敲除的特別感興趣基因，包括編碼不良基因產(chǎn)物，如異常蛋白質(zhì)的那些基因。非限制性特定疾病的例子包括甲狀腺機能亢進(這是一種與甲狀腺素分泌過多缺陷有關(guān)的疾病)和阿爾茨海默綜合征。基因治療的應(yīng)用特別感興趣的在于癌癥治療，包括例如ABL1、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES等癌基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，用本發(fā)明的方法和組合物治療癌癥可與其它其它形式癌癥相結(jié)合，如手術(shù)、化療、放療、基因治療、免疫治療等。治療的癌癥類型包括非限制性例子有膠質(zhì)肉瘤、乳腺癌、肺癌、腦癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、子宮癌、膀胱癌、脾臟癌、頭頸癌和骨癌。本發(fā)明可用于開發(fā)治療目的的自身或同種異體細胞系。例如，在細胞和/或器官移植中利用本發(fā)明作特別感興趣的基因治療。在示范性實施方案中，下調(diào)移植抗原(如通過siRNA下調(diào)β-2-微球蛋白表達)使同種異體移植細胞盡可能免遭患者免疫系統(tǒng)的排斥。就副作用(移植細胞不受控制的復(fù)制)而言，本發(fā)明可關(guān)閉RNAi。可用于本發(fā)明的細胞類型包括造血干細胞、成肌細胞、肝細胞、淋巴細胞、氣道上皮細胞、皮膚上皮細胞、胰島、多巴胺能神經(jīng)元、角質(zhì)形成細胞等。用于基因治療的其它細胞類型、基因和方法的進一步說明見例如Wilson等，(1988)；Armentano等，(1990)；Wolff等，(1990)；Chowdhury等，(1991)；Ferry等，(1991)；Wilson等，(1992)；Quqntin等，(1992)；Dai等，(1992)；vanBeusechem等，(1992)；Rosenfeld等，(1992)；Kay等，(1992)；Cristiano等，(1993)；Hwu等，(1993)；Herz和Gerard，(1993)。在本發(fā)明的具體實施方案中，治療任何疾病的方法易于用siRNA治療。在具體實施方案中，該方法包括制備含有編碼操作性連接有外部可調(diào)控啟動子的siRNA的多核苷酸構(gòu)建物，其中該構(gòu)建物編碼的siRNA可治療疾病，并通過外部可調(diào)控的啟動子從外部調(diào)節(jié)該siRNA的表達。所述疾病可以是，例如過度增殖性疾病，如癌癥，具體的癌癥例子包括膠質(zhì)肉瘤、乳腺癌、肺癌、腦癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、子宮癌、膀胱癌、脾臟癌、頭頸癌和骨癌。在其它實施方案中，所述疾病涉及與至少一種激素過度分泌相關(guān)的過度分泌缺陷病。具體例子包括甲狀腺素分泌過多(如格雷夫斯病)、糖皮質(zhì)激素分泌過多(如庫欣綜合征)、生長激素分泌過多(如巨人癥或肢端肥大癥)、胰島素分泌過多、鹽皮質(zhì)激素分泌過多(如醛固酮過多癥)、雄激素分泌過多(如雌性雄激素綜合征)、雌激素分泌過多(如女子乳腺和/或卵巢癌發(fā)病升高和男子女性乳房)、或腎上腺素和/或去甲腎上腺素分泌過多。上前分泌過多缺陷的治療可包括劇烈的治療措施，如切除腎上腺。本發(fā)明的優(yōu)點是通過本文所述的方法和組合物的特異性調(diào)節(jié)能夠精細治療分泌過多。細胞免疫識別的控制為治療器官疾病和器官衰竭。在醫(yī)學(xué)上采用同種異體或非自身組織移植變得越發(fā)重要。然而，利用同種異體移植物受到受者對移植組織頻繁排斥的限制，因為供者與受者之間存在抗原性差異。同種族各成員之間的抗原差異稱為“同種抗原”。同種異體組織移植排斥時涉及的同種抗原稱為“組織相容性抗原”。術(shù)語“主要組織相容性抗原”和“主要組織相容性復(fù)合物”(MHC)指基因的一種密切相連區(qū)域的產(chǎn)物。這些MHC基因產(chǎn)物位于細胞表面，是成功進行同種異體移植的重要障礙。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，免疫防御機制的關(guān)鍵是T細胞。發(fā)現(xiàn)T細胞在對一種或數(shù)種與它們天然宿主的特異性移植抗原相關(guān)的抗原反應(yīng)中受到限制。在體外，一種單倍型宿主的T細胞能對不同單倍型宿主移植抗原的相關(guān)抗原起反應(yīng)。T細胞的受體庫看來比B細胞免疫球蛋白庫狹窄。此外，T細胞受體看來不能直接結(jié)合抗原，需要與抗原表位和移植抗原一起結(jié)合。本領(lǐng)域知道免疫移植抗原含有主要組織相容性復(fù)合物的成分。移植抗原可分成二類I類和II類，I類抗原比較遍布在宿主細胞上，而II類相對限制于淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。不同的T細胞可被一類或加一類移植抗原所激活。人類中，活化T細胞的性質(zhì)隨與其互補的移植抗原類型而不同。在效果上，看來一個T細胞克隆只識別與特異性等位移植抗原相結(jié)合的一種特異性抗原。然而，當(dāng)將T細胞、抗原和抗原提呈細胞一起培養(yǎng)時，抗原序列的變異會影響反應(yīng)的性質(zhì)。根據(jù)變化的性質(zhì)，可遇到三種可能性，即無變化，刺激增強和刺激減弱?；仡櫼陨纤?，主要感興趣的是能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)外的免疫應(yīng)答，能夠激活或滅活特定的免疫應(yīng)答。以這種方式，可調(diào)節(jié)對某事物的天然應(yīng)答，即通過活化特定淋巴細胞來增強保護性應(yīng)答，或滅活特定淋巴細胞來降低或防止免疫應(yīng)答。在優(yōu)選實施例中，下調(diào)移植抗原可掩蓋該移植物的免疫原性。在具體實施方案中，本發(fā)明提供控制細胞被免疫系統(tǒng)識別能力的方法和組合物。這樣，本發(fā)明可提供至少一種可移植但不會引起免疫應(yīng)答危險的細胞。在本發(fā)明一具體方面，產(chǎn)生的一種或多種細胞其MHC以可控制的方式已被敲減。如果細胞的MHC被敲減，在某些實施方案中，該細胞上的至少主要的MHC抗原基本上都缺少。因此，該細胞缺少組織相容性抗原使其不能補識別為外源性抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，利用本發(fā)明的可調(diào)控性能，臺去除外部施加的藥物即廢棄外部施加的藥物，再從外部施加藥物，加入更多的外加藥物等等，可用來結(jié)束這種需要。因此能夠掩蓋細胞避開使移植不易進行的免疫應(yīng)答是本發(fā)明的優(yōu)點，利用本發(fā)明的可逆方式也是特別有益的。在本發(fā)明的具體實施方案中，在調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物時使全部或基本上全部的MHCI類復(fù)合物缺失，可控制免疫系統(tǒng)識別的能力。例子包括β2-微球蛋白復(fù)合體中的β2-微球蛋白分子，和/或功能類似β2-微球蛋白的分子。在具體實施方案中，擴本發(fā)明方法下調(diào)I類或II類，或二者移植抗原。在加一具體實施方案中，下調(diào)NHCI移植抗原，如β2-微球蛋白。移植抗原的其它例子包括HLA，其中包括HLA-C、HLA-G和HLA-DQ；H-Y；P35B；Kdm4和Kdm5、TL、P198、P91A；H-2Kb等。本文中可用于本發(fā)明的細胞包括，例如干細胞(如胚胎干細胞)、胰島細胞、肝細胞、多巴胺能神經(jīng)元、角質(zhì)形成細胞或它們的混合物。在本發(fā)明的具體實施方案中，用本發(fā)明的方法，如敲減移植抗原如β2-微球蛋白來修飾干細胞，如胚胎干細胞。修飾干細胞然后分化。在另一具體實施方案中，在分化之前或之后修飾干細胞，或移植。VI.人類疾病的動物模型可單獨或聯(lián)用本發(fā)明的方法和組合物來刺激或阻抑動物特定基因的表達，或模擬人類疾病的病理機制，從而創(chuàng)立人類疾病的動物模型。例如在宿主動物中，參與疾病的感興趣基因可能是本文所述siRNA的靶子。在示范性實施方案中，一種動物可與第二種動物交配，該第二種動物攜帶有一種或多種能調(diào)節(jié)siRNA表達的誘導(dǎo)型融合蛋白的轉(zhuǎn)基因，以創(chuàng)立含有四環(huán)素或四環(huán)素類似物調(diào)節(jié)的融合蛋白基因和表達受其影響的siRNA二者的后代動物。可利用四環(huán)素或四環(huán)素類似物調(diào)節(jié)的融合蛋白下調(diào)該siRNA靶的基因的表達，以研究基因表達與疾病之間的關(guān)系。此方法優(yōu)于同源重組基因“敲除”所產(chǎn)生的疾病動物模型，因為本所述示范性實施方案的tet-調(diào)節(jié)系統(tǒng)，能控制感興趣基因的表達水平，又能在基因表達時下調(diào)或上調(diào)其水平。VIII.實施例以下實施例顯示了了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這些實施例中公開的技術(shù)代表了發(fā)明人公開的技術(shù)，按照這些技術(shù)能很好實施本發(fā)明，因此認(rèn)為此技術(shù)構(gòu)成了實施本發(fā)明的優(yōu)選模式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，憑借此公開的內(nèi)容，可在具體實施中做出許多修改而仍能獲得類似結(jié)果，但這些修改不脫離本發(fā)明的思路和范圍。實施例1強力霉素通過tKRAB介導(dǎo)阻抑siRNA產(chǎn)生而誘導(dǎo)GFP表達的調(diào)節(jié)在該系統(tǒng)的這個例子中，將元件(a)、(b)和(c)摻入慢病毒載體中。反式阻抑子(tTR-KRAB)由融合到人Kox-1的KRAB阻抑結(jié)構(gòu)域的四環(huán)素阻抑子tTR的DNA結(jié)合域構(gòu)成。tTR-KRAB的表達受組成型EF-1α啟動子的控制。將tet0(四環(huán)素操縱子)序列、U6或H1啟動子、sihRNA插入慢病毒載體3’長末端重復(fù)序列的U3區(qū)。在靶細胞中，此元件由于逆轉(zhuǎn)錄調(diào)制存在于整合的原病毒二端LTR中，從而復(fù)制了該3’LTR的U3區(qū)(圖1)。沒有強力霉素時，tTR-KRAB結(jié)合tet0并阻斷sihRNA合成，使sihRNA靶基因(例如感興趣的基因))得以表達。存在強力霉素時，tTR-KRAB從tet0中釋放出來，產(chǎn)生sihRNA，靶基因的表達受到阻抑。圖2提供的數(shù)據(jù)(類似于圖5C所示)說明利用上述系統(tǒng)可調(diào)節(jié)GFP標(biāo)記蛋白的表達。用攜帶有tet0和GFP-特異性sihRNA(pNGFP-siGFP/tet0，或pNGFR-siGFP/tet0inv，或pNGFR-siGFPinv/tet0，或pNGFR-siGFPinv/tet0inv)的慢病毒載體，和攜帶有在EF-1α啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的tTR-KRABcDNA(pWPXL-KRAB)的慢病毒，共轉(zhuǎn)導(dǎo)組成型表達的GFP(Hela-GFP)。在存在強力霉素時，GFP的表達受到顯著阻抑，反映了tTR-KRAB從tet0中釋放和GFP-特異性shRNA的合成。相反，在沒有強力霉素時，tTR-KRAB與tet0結(jié)合導(dǎo)致阻抑sihRNA的合成，而使GFP得以表達。此資料證明，本發(fā)明的系統(tǒng)可用于有效和特異性調(diào)節(jié)內(nèi)源或外源基因。這里用的GFP報道基因相當(dāng)于內(nèi)源基因，因為它已整合到細胞染色體中。另外，已知內(nèi)源基因控制病毒載體通過siRNA的表達是有效的(如Devroe和Silver，2002)。實施例2材料和方法以下用于實施3的材料和方法，可用于實施本文所述的本發(fā)明這施方案。載體構(gòu)建物采用標(biāo)準(zhǔn)的克隆方案構(gòu)建載體。pSUPER和pSUPER-p53如前所述構(gòu)建(Brummelkamp等，2002)。將pSUPFR的H1啟動子插入pWPXL的3’LTR中構(gòu)建pLV-H。為構(gòu)建pLVTH，從pUHD13-3切下tet0盒克隆入H1啟動子上游的pLV-H中。最后，用切取自pSUPER-siRNA的H1-siRNA盒替代pLV-H和pLV-TH中的H1啟動子盒，分別產(chǎn)生pLY-H/siRNA和pLV-TH/siRNA。將編碼tTR-KRAB的序列克隆入pWPXL替代的GFP標(biāo)記(pLV-tTR-KRAB)，或利用腦心肌炎病毒的5’內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，作為雙順反子單元也編碼dsRed。細胞培養(yǎng)和用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將293T、Hela和MCF-7細胞系培養(yǎng)在添加了10％胎牛血清的DEME中。按標(biāo)準(zhǔn)方案用瞬時轉(zhuǎn)染的293T細胞產(chǎn)生所有的重組慢病毒(Zufferey等，1997)。簡而言之用20微克質(zhì)粒載體、15微克pCMV-ΔR8.91和5微克pMD2G-VSVG，以磷酸鈣沉淀法反轉(zhuǎn)染亞鋪平的293T細胞。16小時后更換培養(yǎng)液，24小時后收獲重組慢病毒。為了分析GFP的調(diào)節(jié)，采用含有單拷貝WPXLGFP原病毒的Hela細胞克隆(Hela-GFP)。為轉(zhuǎn)導(dǎo)，將Hela-GFP、MCF-7或Hela細胞接種在24孔板中(20×104細胞/孔)，16小時后，加入含重組慢病毒的培養(yǎng)液。培養(yǎng)16小時后，洗滌細胞分成二份，一半轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中加入最終濃度5μg/ml的強力霉素。5天后收獲細胞用FACS分析。Western印跡分析在含有蛋白酶抑制劑(Sigma)的RIPA裂解緩沖液(25mMTrispH7.5，1％TritonX-100，0.5％脫氧膽酸鈉，5mMEDTA，150mMNaCl)中制備細胞提取液。在4-20％梯度PAGE-SDS凝膠上分離蛋白質(zhì)樣品(10μg)，電泳轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，接觸抗p53(SantaCruzBioltechnology)、核纖層蛋白A/C(SantaCruzBioltechnology)、GFP(Clontech)和肌動蛋白(Calbiolchem)抗體。檢測采用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗體(Amersham)和增強的化學(xué)發(fā)光抗體(EFL；Amersham)。FACS分析收獲的Hela-GFP細胞用攜帶ΔNGFPcDNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，與標(biāo)記了藻紅NGFR-PE)的抗人NGFP特異性單克隆抗體(BectonDickinsonPharmingen)一起培育，洗滌二次，用FACSscan(BectonDickinson)分析氯熒光(GFP)和紅色熒光(NGFP-PE)。用LV-THsi/p53或LV-This/核纖層蛋白和Plv-tTR-KRAB-Red共轉(zhuǎn)導(dǎo)MCF-7和Hela細胞，在存在或不存在dox下培養(yǎng)，收獲并用FACSscan分析氯熒光(GFP)和紅色熒光(NGFP-PE)。免疫熒光用LV-This/p53或LV-THsi/核纖層蛋白和Plv-tTR-KRAB-Red共轉(zhuǎn)導(dǎo)MCF-7和Hela細胞，在存在或不存在dox下培養(yǎng)5天，用醛固定(10分鐘/-20℃)，用PBS/1％BSA封閉，抗p53(SantaCruzBioltechnology)或抗核纖層蛋白A/C(SantaCruzBioltechnology)抗體染色，第二抗體為偶聯(lián)有Alexa633(MolecularProbe)的抗體作分析。用三色共焦顯微鏡(LSM510CarlZeiss)拍照，用Zeiss軟件分析。實施例3結(jié)果和討論此研究利用四環(huán)素可調(diào)控雜交蛋白，tTR-KRAB的優(yōu)良特性，此蛋白質(zhì)中大腸桿菌Tn10的四環(huán)素阻抑子(tTR)融合于人Kox1的KRAB結(jié)構(gòu)域(Deuschle等1996；Gossen和Bujard，1992)。KRAB是見于許多鋅指蛋白中的大約長75個氨基酸的轉(zhuǎn)錄阻抑調(diào)制物，可以取向不依賴型方式阻抑距其結(jié)合位點遠達3kb的polII-和polIII-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，推測是觸發(fā)形成了異質(zhì)染色體(Bellefroid等，1991；Deuschle等，1995；Margolin等，1994；Moosmann等，1997；Senatore等，1999)。當(dāng)KRAB連接于tTR的DNA結(jié)合域時，可調(diào)節(jié)整合的與tet操縱子(tet0)序列(6)并列的啟動子的轉(zhuǎn)錄。在沒有強力霉素(dox)時，tTR-KRAB與tet0特異性結(jié)合，阻抑附近啟動子的活性。相反，存在強力霉素時，tTR-KRA脫離與tet0的螯合，使基因工程能夠表達(Deuschle等，1995)。采用HIV-1衍生的慢病毒載體(LV)作為輸送載體，因為它可提供能應(yīng)用于廣泛類型靶細胞的系統(tǒng)，即先體外后體內(nèi)(細胞系、原代細胞如干細胞、受精卵母細胞、胚泡)或體內(nèi)(如腦、肝)(Jacque等，2002；Miyoshi等，1999；Naldini等，1996a；1996b；Pfeifer等，2002；Qin等，2003；Rubinson等，2003；Tiscornia等，2003)；并且，由于tet0連接的轉(zhuǎn)錄單元只在整合入基因組中時才受tTR-KRAB的阻抑。從作為雙順反子轉(zhuǎn)錄物(其也可產(chǎn)生dsRed標(biāo)記)一部分的遍在活性EF-1-α啟動子表達tTR-KRAB式Cdna(圖3A，LV-tTR-KRAB)。將tetO-H1啟動子-siRNA盒插入自身滅活慢病毒載體3’長末端重復(fù)序列(LTR)的U3區(qū)中，構(gòu)建成可調(diào)控的siRNA(圖3A，LV-THsi)。逆轉(zhuǎn)錄中，載體RNA3’U3區(qū)作為合成其5’DNA同源物的模板，因而在整合的原病毒中復(fù)制該tet0-H1-siNA盒(圖3)。選擇這種雙拷貝構(gòu)型可獲得較高速率的siRNA合成。如Brummelkamp等，2002所述設(shè)計了含編碼siRNA發(fā)夾前體的序列。對照載體攜帶有組成型活性的Hi-siRNA盒(LV-Hsi)，或H1或tet0-H1轉(zhuǎn)錄元件，無下游siRNA編碼序列(分別為H1和tet0-H1)。所有的siRNA和對照載體也含內(nèi)部EF1-α啟動子下游的編碼標(biāo)記的基因。預(yù)測用LV-THsi和LVtTR-KRAB共同轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞在保持無dox時，由于tTR-KRAB介導(dǎo)的對siRNA合成的阻抑，通常表達siRNA靶向的基因。相反，加入強力霉素將減輕其阻抑，從而下調(diào)靶基因(圖4B)。該內(nèi)部標(biāo)記基因的表達也受條件性tTR-KRAB的阻抑，因此提供了一種內(nèi)部監(jiān)控裝置。5C說明在慢病院載體中聚合酶III-介導(dǎo)的tTR-KRAB轉(zhuǎn)錄阻抑不依賴于tet0元件或聚合酶III啟動子(HI)彼此的取向及與慢病毒的取向。在第一系列實驗中，研究了該系統(tǒng)調(diào)節(jié)穩(wěn)定表達此熒光分的Hela細胞中的GFP產(chǎn)生(5A)。采用感染復(fù)數(shù)10的載體以確保良好的(共)轉(zhuǎn)導(dǎo)率。用空LV-TH載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hela-GFP細胞在各自培養(yǎng)條件下保持了GFP強陽性。相反，用組成型活化LV-His/GFP載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞表明出該標(biāo)記的強烈下調(diào)。用可調(diào)控的LV-THsi/GFP載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，只存在tTR-KRAB和缺少dox時觀察到GFP表達(圖5A)。相應(yīng)的，缺少強力霉素時，tTR-KRAB阻抑了該載體的ΔNGFP內(nèi)部報告基因的表達(圖5B)。如預(yù)期那樣，tTR-KRAB介導(dǎo)的對siRNA產(chǎn)物的阻抑效果，不論tet0以有義或反義取向插入H1啟動子上游或下游時相等。其次，測試了該系統(tǒng)能否調(diào)節(jié)真正的內(nèi)源性基因。選擇p53和核纖層蛋白作為靶子，因為先前已鑒定和周全特征分析了siRNA能高效靶向這些基因(Brummelkamp等，2002；Elbashr等，2001)。采用MCF-7乳癌細胞作為p53下調(diào)研究的底物(圖6，左)。用LV-tTR-KRAB和LV-THsi/p53共轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，在缺少dox培養(yǎng)時產(chǎn)生了野生型水平的p53，表明siRNA的合成全部阻抑(下圖泳道7)。tTR-KRAB介導(dǎo)了這種阻抑，因為在僅用LV-THsi/p53轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中未測到p53，不論dox是否存在培養(yǎng)液中(上圖，泳道7和8)。相反，加入強力霉素到該雙重轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中，導(dǎo)致p53產(chǎn)生速率下調(diào)，如在含有組成型活化的LV-THsi/p53載體的細胞中觀察到的那樣強(比較下圖泳道8和二圖的泳道5與6)。用相應(yīng)的siRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hela細胞中核纖層蛋白獲得類似結(jié)果(圖6)。值得注意的是，二種設(shè)置中，強力霉素誘導(dǎo)的siRNA產(chǎn)物，不論用Western印跡(圖6)、FACS或共焦顯微鏡觀察，都阻抑了p53或核纖層蛋白靶基因的表達，這與慢病毒載體內(nèi)部GFP標(biāo)記的阻抑相關(guān)。綜合在一起，這些結(jié)果表明，tTR-KRAB調(diào)節(jié)的、慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA輸送能以高效和無遺漏地可調(diào)控性阻抑細胞的基因表達。為完成此系統(tǒng)的特征鑒定，確定了其動力學(xué)和劑量反應(yīng)性(7)。選擇p53作為這種分析研究靶子是因為此蛋白的半衰期限相對較短為12小時左右。在用LV-THsi/p53和LV-tTR-KRAB載體雙重轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7細胞中，p53的穩(wěn)定狀態(tài)水平面早至培養(yǎng)液中加入5μg/mldox后12小時就開始下降，36小時內(nèi)用Western印跡法已測不到(圖7A)。這提示RNA干擾在24小時不到時完全有效，意味著dox介導(dǎo)的tTR-KRAB螯合快速地分離，從而使整合的H1啟動子高速產(chǎn)生siRNA產(chǎn)物。劑量反應(yīng)分析進一步揭示對強力霉素控制極其敏感，同時點出基因阻抑的某些調(diào)節(jié)可能性。的確dox低濃度0.004μg/ml時已顯示p53下調(diào)，而僅在0.25μg/ml劑量即達到了全部阻抑(圖7B)。此實驗中所用的抗p53siRNA抗體很有效，用較低特異性的siRNA時，更大范圍的dox濃度可調(diào)節(jié)基因敲減的程度。實施例4條件性基因敲減動物(Ckd)本發(fā)明涉及應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的和藥物誘導(dǎo)的RNA干擾來開發(fā)基因敲減動物。提供的技術(shù)包括以下系統(tǒng)四環(huán)素反式阻抑子(tTR-KRAB)介導(dǎo)的聚合酶III活性的藥物誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)；和慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因。主要策略包括(1)用tet0-siRNA和tTR-KRAB慢病毒載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)受精卵母細胞(通過卵黃周圍注射)，然后將其轉(zhuǎn)移到代孕母體子宮內(nèi)；(2)用tet0-siRNA和tTR-KRAB慢病毒載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)受精卵母細胞(去除卵黃帶后)，使其在體個成熟為胚泡轉(zhuǎn)移到代孕母體子宮內(nèi)(3)用tet0-siRNA和tTR-KRAB慢病毒載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)桑椹胚或胚泡，使其成熟和/或轉(zhuǎn)移到代孕母體子宮內(nèi)；和(4)用tet0-siRNA和tTR-KRAB慢病毒載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)胚胎干細胞(ES)然后將其注射入胚泡轉(zhuǎn)移到代孕母體子宮內(nèi)。由于高效和沒有嵌合現(xiàn)象，第一代方法是本發(fā)明優(yōu)選的。在發(fā)育或成年的任何時期可通過給予強力霉素誘導(dǎo)基因敲減。實施例5利用轉(zhuǎn)基因tTR-KRAB小鼠產(chǎn)生條件性敲減小鼠實施例4中所述的策略也可應(yīng)用于產(chǎn)生tTR-KRAB轉(zhuǎn)基因動物，然后可利用此動物以tet-可調(diào)控siRNA載體進一步轉(zhuǎn)基因。因此，為了促進cKD小鼠的產(chǎn)生，創(chuàng)立了表達tTR-KRAB的轉(zhuǎn)基因小鼠。用LV-tTR-KRAB-deRed慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)受精卵母細胞(通過卵黃周圍注射)，然后轉(zhuǎn)移到代孕母體子宮壺腹部。此法不需要共轉(zhuǎn)導(dǎo)這樣大量的運作表型，因為分離自tTR-KRAB小鼠的受精卵母細胞或胚泡可用上述(實施例4)方法以tet0-siRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，可從tTR-KRAB小鼠分離ES細胞或任何其它類型細胞并用tet0-siRNA載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，以分析在條件性基因下調(diào)后的表型。實施例6組織特異性可條件性敲減的動物也可擴大本發(fā)明來獲得以組織特異性方式的可條件性基因敲減。此情況為分析具體細胞類型的敲減表型，或基因敲減對生物整體是否有致死作用是特別需要的。將側(cè)接loxP位點的填充片段(floxed)插入可調(diào)控H1聚合酶III啟動子中防止下游shRNA的合成(圖8和9)。轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生，例如可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)從表達在組織特異性啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠挽回的受精卵母細胞(通過卵黃周圍注射)，然后將其植入代孕母體中。由于Cre和填充片段被去除，從而激活了H1啟動子，使條件性shRNA合成限于該特定組織。在某些特定情況時可采用條件性Cre(如與三苯氧氨可誘導(dǎo)核定位信號偶聯(lián))。也可利用標(biāo)記基因作為填充片段來監(jiān)測組織特異性切除的效率。實施例7調(diào)節(jié)組織特異性敲減小鼠中的靶基因本發(fā)明研究了對條件性基因敲減小鼠(其基因敲減是組織特異性的)中的基因調(diào)節(jié)。因此，例如，采用攜帶編碼在組織特異性啟動子轉(zhuǎn)錄控制下感興趣基因的cDNA的tet0慢病毒載體(如LV-TH)，來轉(zhuǎn)導(dǎo)獲自tTR-KRAB小鼠的受精卵母細胞。給予藥物以組織特異性方式調(diào)節(jié)雙重轉(zhuǎn)基因小鼠中的靶基因。實施例8用tTR-KRAB小鼠進行組織特異性條件性基因表達本發(fā)明還可延伸至動物中的條件性基因置換。其中在慢病毒載體中導(dǎo)入靶基因的突變型(圖10)。該突變型因在其DNA序列中插入了沉默突變而能抵抗RNA干擾。此系統(tǒng)的此種特異性調(diào)制導(dǎo)致以下情景缺少強力霉素時，siRNA的的合成及突變基因的表達受到tTR-KRAB的阻抑。相反，存在此藥物時通過RNAi和突變等到位基因的表達導(dǎo)致敲減野生型基因的表達。因此，可通過條件性阻抑野生型等位基因可分析野生型背景中的隱性突變表型。實施例9體外和體內(nèi)通過tTR-KRAB的強力霉素誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)外源基因表達此實施例是關(guān)于本文已有描述的tTR-KRAB的產(chǎn)生，條件性轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生，組織特異條件性轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生，和例如通過調(diào)節(jié)外源基因的表達進行原位條件性表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，本文所述方法和組合物可用于治療目的，如基因治療，來阻抑至少一種細胞的免疫識別，以治療癌癥等)及提供研究基因功能的有用方法。在具體實施方案中，這可通過該系統(tǒng)和本文所述的其各自方法對外源基因表達進行調(diào)節(jié)而實現(xiàn)，。通過開發(fā)能組成型表達tTR-KRAB的轉(zhuǎn)基因小鼠，可大大促進本文所述的策略?？刹捎贸Ｒ?guī)方法(如ES細胞的原核注射或轉(zhuǎn)染)或慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因，產(chǎn)生tTR-KRAB小鼠。例如，該tTR-KRAB小鼠可作為一種“通用平臺”來條件性表達感興趣的基因。本發(fā)明因此采用tet0慢病毒載體(如pLVTH)來輸送編碼感興趣基因的cDNA到tTR-KRAB小鼠中。此轉(zhuǎn)基因的表達將受到位于該載體上游的啟動子特性的控制，并受加入的外部藥物控制(如至少一種藥物)。利用tTR-KRAB小鼠將確保對每一個轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中感興趣基因的調(diào)節(jié)。在另一實驗中，采用攜帶有編碼感興趣基因cDNA的tet0慢病毒載體(如LV-TH)來轉(zhuǎn)導(dǎo)獲自tTR-KRAB小鼠的受精卵母細胞，然后將其植入代孕期母體中。給予藥物進行研究雙重轉(zhuǎn)基因小鼠中靶基因的調(diào)節(jié)。感興趣基因的表達可以是(a)完全性的(如果是組成型啟動子表達該轉(zhuǎn)基因，基本上包括該小鼠的每一個細胞)；(b)組織特異性的(如果由組織特異性啟動子表達該轉(zhuǎn)基因)；(c)局部性的(如局部注射到特定器官或器官某區(qū)域中，給予含藥物可調(diào)控轉(zhuǎn)基因盒的載體)。以于(a)和(b)，可利用tTR-KRAB小鼠作基礎(chǔ)，通過輸送含有位于組成型或組織特異性啟動子下游的感興趣基因表達盒，來產(chǎn)生雙重轉(zhuǎn)基因小鼠(利用常規(guī)或慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因)。本發(fā)明方法優(yōu)于現(xiàn)有方法的一個主要改進是，得以藥物可調(diào)控組織特異性表達轉(zhuǎn)基因。圖11涉及藥物可調(diào)控轉(zhuǎn)基因的代表性實施方式，其中提供了含示范性TR-KRAB的小鼠，和編碼感興趣基因的多核苷酸(示為基因X，雖然該多核苷酸本身可能不是基因)，例如，將受遍在性啟動子控制的(左上圖)，或受組織特異性啟動子控制的(右上圖)多核苷酸導(dǎo)入TR-KRAB小鼠，進行外部藥物可調(diào)控的敲減感興趣的基因(表達)。實施例10體外通過tTR-KRAB介導(dǎo)的對siRNA產(chǎn)生的阻抑強力霉素誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)細胞的基因表達此實施例是關(guān)于采用本發(fā)明的方法和組合物產(chǎn)生本文所述的tTR-KRAB細胞系和產(chǎn)生條件性siRNA文庫。本發(fā)明可用來開發(fā)能夠高通量研究，例如基因功能、藥物試驗(例如分析在缺少細胞基因時藥物的功能)等的siRNA文庫。通過開發(fā)組成型表達tTR-KRAB或類似的轉(zhuǎn)基因的細胞系，可能極有利于下述策略?？捎帽疚乃龅穆《据d體(如pLV-tTR-KRAB)或其它載體產(chǎn)生tTR-KRAB細胞系?？蓪⒃搕TR-KRAB細胞系作為“通用平臺”來條件性表達細胞的基因。因而本發(fā)是采用tet0慢病毒載體(如pLVTH)來輸送siRNA(或siRNA文庫)到tTR-KRAB細胞中。然后給予藥物下調(diào)細胞的基因(表達)。采用至少一種tTR-KRAB細胞系來保證基本上每一個被轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中感興趣基因受到調(diào)節(jié)。利用條件性文庫能定時、短期下調(diào)基因表達，從而避免可能的致死作用。另外，阻抑此可能的致死作用將擴增和增殖所選擇的細胞，用于進一步研究。因此，產(chǎn)生基因敲減的細胞系可用于，例如，治療目的(如基因治療)、藥物篩選和研究基因功能。臨床應(yīng)用siRNA的安全裝置也具有本發(fā)明這種和類似實施方式的優(yōu)點。在本發(fā)明一具體實施方案中，可用此法和組合物來開發(fā)用作治療的自身或同種異體細胞系。如下調(diào)移植抗原(如一實施例中，通過RNAi下調(diào)β2-微球蛋白的表達)將得以移植同種異體細胞(如非限制性的胰島細胞、肝細胞、多巴胺能神經(jīng)元、角質(zhì)形成細胞等)，同時最大程度減少被患者免疫系統(tǒng)排拆的危險。本發(fā)明能在發(fā)生不良反應(yīng)時(如植入細胞不受控制的復(fù)制)關(guān)閉RNAi。實施例11體內(nèi)通過tTR-KRAB介導(dǎo)的對siRNA產(chǎn)生的阻抑強力霉素誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)細胞的基因表達此實施例是關(guān)于體內(nèi)產(chǎn)生示范性tTR-KRAB小鼠，產(chǎn)生條件性敲減轉(zhuǎn)基因小鼠，產(chǎn)生組織特異條件性敲減LFNADLD小鼠，產(chǎn)生條件性siRNA文庫，和產(chǎn)生含有tTR-KRAB的ES細胞系(ES-tTR-KRAB)。圖11涉及藥物可調(diào)控敲減的代表性實施方式，其中提供了含示范性TR-KRAB的小鼠，和編碼siRNA的多核苷酸，例如，將受遍在性PolIII啟動子控制的(左下圖)，或受組織特異性PolIII啟動子控制的(右下圖)多核苷酸導(dǎo)入TR-KRAB小鼠，進行外部藥物可調(diào)控的敲減其表達。在某些實施方案中，本發(fā)明采用tet0慢病毒載體(如pLVTH)輸送siRNA靶向的感興趣細胞基因到tTR-KRAB小鼠中。然后給予藥物使siRNA合成并下調(diào)基本上每一個被轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中該感興趣細胞基因的表達。如實施例10條件性阻抑外源基因所述，條件性下調(diào)細胞基因可以是完全性的、組織特異性的或局部性的。能夠通過給予藥物來激活RNAi可避免基因敲減可能引起的致死作用而得以研究發(fā)育晚期或成年期的基因功能。然而，該條件性RNAi得以分析基因敲減的直接作用，最大程度減少基因功能長期喪失可能發(fā)生的繼發(fā)作用或代嘗。此系統(tǒng)可用于產(chǎn)生模擬人類遺傳缺陷的動物模型。條件性RNAi允許產(chǎn)生體內(nèi)的siRNA文庫?？赏ㄟ^慢病毒載體(如pLVTH)輸送siRNA文庫來轉(zhuǎn)導(dǎo)分離自tTR-KRAB小鼠的受精卵母細胞。或者，可通過慢病毒載體(如pLVTH)輸送siRNA文庫來轉(zhuǎn)導(dǎo)ES-tTR-KRAB細胞。該條件性系統(tǒng)能預(yù)防RNAi可能的早期致死作用，得以從而得以研究細胞基因敲減對發(fā)育或成年的影響。此外，阻抑基因功能喪失的潛在致死作用得以植入、擴增和增殖該小鼠ES細胞文庫存(或選擇有克隆)用于進一步研究。*********憑借本文所公開的內(nèi)容，無須過多實驗即可制備本文所述和權(quán)利要求所述的所有組合物和/或方法。雖然本發(fā)明的組合物和方法已在優(yōu)選實施例中作了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，可對本文所述的組合物和/或方法及其各步順序做出各種變化，這不脫離本發(fā)明的概念、思路和范圍。更具體說，顯然某些相關(guān)的化學(xué)或生理性藥物可替代本文所述的藥物而能匹敵相同或相似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，所有這些相似的替代和修飾都應(yīng)認(rèn)為屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求書中所確定的思路、范圍和概念之內(nèi)。參考文獻以下是特別納入本文中作參考消息的文獻，除未列出的那些以外。美國專利4,683,202美國專利4,736,866美國專利4,873,191美國專利4,873,316美國專利5,654,195美國專利5,665,577美國專利5,894,078美國專利5,912,411美國專利5,925,565美國專利5,928,906美國專利5,935,819美國專利5,936,138美國專利5,981,829美國專利5,981,830美國專利5,986,171美國專利5,994,136美國專利5,994,618美國專利6,002,066美國專利6,013,516美國專利6,018,097美國專利6,018,098美國專利6,023,010美國專利6,025,539美國專利6,136,597美國專利6,165,782美國專利6,207,455美國專利6,340,741美國專利6,444,871美國專利6,531,123PTC申請WO00/44914PTC申請WO01/36646PTC申請WO01/68836PTC申請WO99/32619PTC申請WO89/06689PTC申請WO89/06693歐洲專利申請264,166Abremski和Hess.JMolBiol.，2591509-1514，1984Abremski等，Cell.，321301-1311，1983Akkina等，J.Virol.，702581-2585，1996Altschul，Proteins.32(1)88-96，1998Altschul等，TrendBiochem.23(11)444-7，1998Amin等，JMolBiol.，21455-72，1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37.如權(quán)利要求35所述的系統(tǒng)，其中，所述可被(b)所述融合蛋白結(jié)合域結(jié)合的多核苷酸序列、操作性連接于編碼siRNA的多核苷酸序列的啟動子和編碼siRNA的多核苷酸序列都包含在慢病毒載3’長末端重復(fù)序列的U3區(qū)域中。38.如權(quán)利要求32所述的系統(tǒng)，其中，所述編碼融合蛋白的多核苷酸包含在第二個、與含(a)所述構(gòu)建物分開的載體中。39.如權(quán)利要求38所述的系統(tǒng)，其中，所述含編碼融合蛋白的多核苷酸的第二個載體是慢病毒載體、MLV載體、AAV載體、質(zhì)粒載體或腺病毒(Adv或Ad)載體。40.如權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中，所述多核苷酸編碼的siRNA形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾。41.一種含有權(quán)利要求1所述多核苷酸構(gòu)建物的哺乳動物細胞。42.如權(quán)利要求41所述的哺乳動物細胞，其特征在于，該細胞還含有(a)第一多核苷酸序列，其含有操作性連接于至少一個編碼siRNA的核酸區(qū)段的啟動子；(b)第二多核苷酸序列，其編碼含有DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域的條件性阻抑融合蛋白；和(c)第三多核苷酸序列，其可被(b)所述融合蛋白的結(jié)合域結(jié)合并定位，從而轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域可發(fā)揮作用以阻抑(a)所述核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄。43.如權(quán)利要求41所述的哺乳動物細胞，其中，所述條件性阻抑融合蛋白是藥物誘導(dǎo)型蛋白。44.如權(quán)利要求42所述的哺乳動物細胞，其還包含(d)第四多核苷酸序列，其中所述第四多核苷酸序列是可切除的，并能阻止聚合酶III依賴型啟動子的轉(zhuǎn)錄；和(e)第五多核苷酸序列，其編碼的酶能切除所述第四多核苷酸序列，其中所述第五多核苷酸序列處在一可調(diào)控的啟動子控制之下。45.如權(quán)利要求44所述的哺乳動物細胞，其中，可被融合蛋白結(jié)合域結(jié)合的第三多核苷酸序列是四環(huán)素操縱基因(test0)序列，(b)所述融合蛋白包含融合于人Kox-1的KRAB阻抑結(jié)構(gòu)域(tTR-KRAB)的四環(huán)素阻抑子(tTR)的DNA結(jié)合域，且所述融合蛋白處于強力霉素控制之下。46.如權(quán)利要求41所述的哺乳動物細胞，其中，所述細胞是未分化的細胞。47.如權(quán)利要求41所述的哺乳動物細胞，其中，所述細胞是卵母細胞或受精的卵母細胞。48.一種含有權(quán)利要求41-47中任一項所述的一種或多種細胞的轉(zhuǎn)基因動物。49.一種產(chǎn)生能夠顯示靶基因條件性敲減的轉(zhuǎn)基因動物的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在性細胞或未分化胚細胞中導(dǎo)入含權(quán)利要求1所述的多核苷酸的表達構(gòu)建物；(b)如果上述細胞是性細胞使其受精產(chǎn)生胚胎；和(c)將該胚胎植入雌性動物，在該雌性動物中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述性細胞或未分化的胚細胞是未受精的卵母細胞、受精的卵母細胞、胚胎干細胞、桑椹胚或胚泡中的細胞。51.如權(quán)利要求49所述的方法，該方法還包括在導(dǎo)入所述表達構(gòu)建物和/或移植前培養(yǎng)所述細胞。52.一種調(diào)節(jié)細胞中基因表達的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(a)制備如權(quán)利要求1所述的多核苷酸構(gòu)建物，其中，所述構(gòu)建物編碼的siRNA能下調(diào)所述基因的表達；(b)通過外部可調(diào)控的啟動子從外部調(diào)節(jié)編碼siRNA的表達。53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述外部可調(diào)控啟動子是一種阻抑型啟動子，從而可通過外部施加的制劑下調(diào)編碼的siRNA的表達。54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，可通過外部施加的藥物下調(diào)編碼的siRNA的表達。55.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述阻抑型啟動子含有至少一個tet0序列。56.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述方法還包括提供編碼能阻抑siRNA表達的誘導(dǎo)型阻抑子的多核苷酸的步驟。57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述編碼阻抑子的多核苷酸還被定義為一種藥物可調(diào)控的阻抑融合蛋白，其含有DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域，其中該融合蛋白的結(jié)合域能結(jié)合所述多核苷酸構(gòu)建物，從而使轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用以阻抑siRNA的轉(zhuǎn)錄。58.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述能調(diào)節(jié)siRNA表達的啟動子是組成型啟動子。59.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述能調(diào)節(jié)siRNA表達的啟動子是組織特異性啟動子。60.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述細胞還被定義為細胞系中的細胞。61.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述方法還包括向所述細胞提供某藥物的步驟，以測試在缺少所述基因編碼的基因產(chǎn)物時該藥物的功能。62.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述細胞包含在動物體內(nèi)。63.如權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述編碼siRNA的多核苷酸構(gòu)建物可給予所述動物的某區(qū)域，在該區(qū)域內(nèi)動物含有編碼阻抑子的所述多核苷酸。64.如權(quán)利要求63所述的方法，其中，所述給藥是注射給藥。65.如權(quán)利要求63所述的方法，其中，所述動物的區(qū)域是在某器官內(nèi)。66.如權(quán)利要求62所述的方法，其中，所述動物是人類患者。67.如權(quán)利要求66所述的方法，其中，所述基因是癌基因。68.如權(quán)利要求67所述的方法，其中，所述癌基因是ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3或YES。69.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述從外部調(diào)節(jié)編碼的siRNA的表達包括給予患者影響上調(diào)或下調(diào)所述表達的試劑。70.如權(quán)利要求69所述的方法，其中，所述試劑是抗生素、輻射、類固醇、激素、金屬、二價陽離子、營養(yǎng)物或溫度。71.如權(quán)利要求70所述的方法，其中，所述輻射是離子輻射。72.一種控制細胞被免疫系統(tǒng)識別的能力的方法，其特征在于，該方法包括(a)獲得一種細胞，其含有(i)如權(quán)利要求1所述的多核苷酸構(gòu)建物，其中，所述構(gòu)建物編碼的siRNA能下調(diào)編碼某移植抗原的多核苷酸的表達；和(ii)編碼能阻抑所述siRNA表達的誘導(dǎo)型阻抑子的多核苷酸；和(b)通過外部可調(diào)控的啟動子從外部調(diào)節(jié)編碼的siRNA的表達。73.如權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述細胞在動物體內(nèi)。74.如權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述移植抗原是MHCI類抗原。75.如權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述移植抗原是β2-微球蛋白、HLA、H-Y、P35B、Kdm4、Kdm5、TL、P198、P91A或H-2Kb。76.如權(quán)利要求75所述的方法，其中，所述HLA抗原是HLA-C、HLA-G或HLA-DQ。77.如權(quán)利要求74所述的方法，其中，所述細胞是胰島細胞、干細胞、肝細胞、多巴胺能神經(jīng)元或角質(zhì)形成細胞。78.一種可用siRNA治療的疾病癥狀的治療方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)制備如權(quán)利要求1所述的多核苷酸構(gòu)建物，其中，所述構(gòu)建物編碼的siRNA可治療該疾病癥狀；(b)通過所述外部可調(diào)控的啟動子從外部調(diào)節(jié)所述siRNA的表達。79.如權(quán)利要求78所述的方法，其中，所述疾病是過度增殖性疾病。80.如權(quán)利要求79所述的方法，其中，所述過度增殖性疾病是癌癥。81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中，所述癌癥是膠質(zhì)肉瘤、乳腺癌、肺癌、腦癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、子宮癌、膀胱癌、脾臟癌、頭頸癌或骨癌。82.如權(quán)利要求78所述的方法，其中，所述疾病是甲狀腺功能亢進癥。83.如權(quán)利要求78所述的方法，其中，所述疾病與分泌過多缺陷相關(guān)。84.如權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述分泌過多缺陷包括激素分泌過多缺陷。全文摘要本發(fā)明提供了通過控制或調(diào)節(jié)編碼siRNA的多核苷酸構(gòu)建物或其它所需外源核酸或蛋白質(zhì)的表達來調(diào)制或調(diào)節(jié)真核基因表達的組合物和方法?？蓪⑦@類構(gòu)建物或該系統(tǒng)的其它元件轉(zhuǎn)染到感興趣的細胞中并表達該siRNA，從而可通過給予該細胞一種化合物(如小分子物質(zhì)或藥物)控制該siRNA的靶基因表達。在本發(fā)明的某些實施方案中，可利用慢病毒來產(chǎn)生條件性敲減的動物。文檔編號C12N15/90GK1759182SQ200380109095公開日2006年4月12日申請日期2003年11月24日優(yōu)先權(quán)日2002年11月22日發(fā)明者D·特羅諾,M·維茲那羅維茨申請人:克雷頓研究院