專利名稱：D－氨基酰化酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及D-氨基?；竿蛔凅w，編碼突變體的基因，生產(chǎn)它們的方法，以及利用D-氨基?；竿蛔凅w生產(chǎn)D-氨基酸特別是D-色氨酸的方法。
背景技術(shù)：
酶不僅顯示出高的催化活性，而且顯示出特異性。所述特異性包括立體特異性以及底物特異性和反應(yīng)特異性。盡管有一些例外，酶的立體特異性幾乎是絕對(duì)的。
近來(lái)的研究越來(lái)越依賴于高精度的技術(shù)。在這樣的背景下，藥物，殺蟲(chóng)劑，食品，調(diào)味料等領(lǐng)域中光學(xué)活性體的使用越來(lái)越重要。分離特異性光學(xué)異構(gòu)體的技術(shù)非常重要，因?yàn)楣鈱W(xué)異構(gòu)體的生理活性有時(shí)是截然不同的。因此，如何分離(合成或分解)純的光學(xué)對(duì)映異構(gòu)體成為產(chǎn)業(yè)上重要的目標(biāo)。
D-氨基酸為非蛋白質(zhì)氨基酸，很長(zhǎng)時(shí)間里被認(rèn)為天然存在于小環(huán)肽，細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖和肽類抗生素中。最近，人們發(fā)現(xiàn)D-氨基酸作為結(jié)合物存在于神經(jīng)肽，牙齒釉質(zhì)蛋白，晶狀體和大腦蛋白的成分中，因此人們做了很多研究來(lái)闡釋D-氨基酸的生理重要性以及合成D-氨基酸的酶學(xué)方法。
D-氨基酸在殺蟲(chóng)劑，藥物等的合成中被廣泛的用作重要的中間體。D-色氨酸作為中間體用于合成治療勃起障礙的藥物。
此前制造D-氨基酸的方法包括例如，如下幾種(1)化學(xué)水解5-取代乙內(nèi)酰脲，以便生產(chǎn)相應(yīng)DL-氨基酸并通過(guò)旋光離析分離D-氨基酸的方法。
(2)一種生產(chǎn)D-氨基酸的方法，包括使能從5-取代乙內(nèi)酰脲生產(chǎn)光學(xué)活性D-N-甲氨酰基氨基酸的微生物、其培養(yǎng)基或其加工產(chǎn)物，與5-取代乙內(nèi)酰脲接觸，并使用亞硝酸鈉或D-甲氨酰基轉(zhuǎn)移酶來(lái)生產(chǎn)D-氨基酸(WO94/03613)。另一種方法包括，使能直接從5-取代乙內(nèi)酰脲生產(chǎn)D-氨基酸的微生物、其培養(yǎng)基或其加工產(chǎn)物，與5-取代乙內(nèi)酰脲接觸。下述微生物能用于這種方法
假單胞菌屬(Pseudomonas)(公開(kāi)未審的日本專利申請(qǐng)(JP-A)No.Sho54-2398)莫拉氏菌屬(Moraxella)(JP-A No.Sho 54-89089)漢遜酵母屬(Hansenula)(JP-ANo.Sho 61-177991)(3)一種方法，包括使能分解L-氨基酸的微生物，其培養(yǎng)基或其加工產(chǎn)物與DL-氨基酸反應(yīng)，和回收剩下的D-氨基酸(JP-A No.Hei 09-75097)。
(4)一種方法，包括將L-氨基?；概cN-乙酰-DL-氨基酸接觸，以便水解DL-氨基酸的一種對(duì)映異構(gòu)體N-乙酰-L-氨基酸，回收剩下的N-乙酰-D-氨基酸，并化學(xué)水解N-乙酰-D-氨基酸生產(chǎn)D-氨基酸(Methods in Enzymology.3，554)。
(5)一種生產(chǎn)D-氨基酸的方法，包括使細(xì)胞或使微生物的加工產(chǎn)物與DL-氨基酸酰胺接觸，所述細(xì)胞或所述微生物的加工產(chǎn)物具有能選擇性水解DL-氨基酸酰胺中D-型氨基酸的D-酰胺酶或D-酰胺酶活性(JP-A No.Hei02-234678)，或者一種生產(chǎn)D-氨基酸的方法，包括使細(xì)胞或使微生物的加工產(chǎn)物與DL-氨基酸酰胺接觸并化學(xué)水解剩余的D-氨基酸酰胺，所述細(xì)胞或所述微生物的加工產(chǎn)物具有能選擇性水解DL-氨基酸酰胺中L型氨基酸的L-酰胺酶或有L-酰胺酶活性(JP-A No.Sho 57-013000)。
(6)一種包括從相應(yīng)α-酮酸生產(chǎn)D-氨基酸的方法，該方法是在作為氨基供體的D-氨基酸存在的條件下，將D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶與α-酮酸接觸(JP-ANo.Sho 62-205790)。
(7)一種包括使DL-色氨酸與細(xì)胞或與微生物的加工產(chǎn)物接觸，和回收剩下的D-色氨酸的方法，所述細(xì)胞或微生物的加工產(chǎn)物具有能選擇性分解L-色氨酸的色氨酸酶或色氨酸酶活性(JP-A No.Hei 11-042097)。
然而，上述方法有各種問(wèn)題，包括原料昂貴，過(guò)程復(fù)雜，產(chǎn)量過(guò)低，因此，用這些方法很難生產(chǎn)出低成本高產(chǎn)量的D-色氨酸?？蓪⑾率鲆阎腄-氨基酸生產(chǎn)方法與上述這些方法作一些比較。
(8)一種包括將D-氨基酰化酶與N-乙酰-DL-氨基酸接觸以生產(chǎn)D-氨基酸的方法，其中D-氨基?；竷H僅水解DL-氨基酸中的一種旋光體N-乙酰-D-氨基酸(JP-A No.Sho 53-059092)。
用這種方法，D-色氨酸可以利用N-乙酰-DL-氨基酸為原料通過(guò)一步酶反應(yīng)獲得，N-乙酰-DL-氨基酸可從便宜的L-色氨酸和乙酸酐合成。
生產(chǎn)D-氨基?；傅囊阎⑸锏睦影ㄒ韵逻@些假單胞菌屬假單胞菌AAA6029(pseudomonas sp.AAA6029)(Chem Pharm.Bull，26，2698(1978))；假單胞菌1158(pseudomonas sp.1158)(J.Antibiot，33，550(1980))；假單胞菌5f-1(pseudomonas sp.5f-1)(Appl.Environ.Microbiol 57，2540(1991))；鏈寶菌屬(Stenotrophomonas)橄欖鏈霉菌(streptomyces olivaceus)(Argric.Biol.chem，42，107(1978))；橄欖鏈霉菌62-3(streptomyces thermonitrificans 62-3)(Argric.Biol.chem，44，1089(1980)))；橄欖鏈霉菌S-62(Streptomyces olivaceus S-62)(JP-A No.Sho 53-59092)熱硝化鏈霉菌CS5-9(Streptomyces thermonitrificans CS5-9)(JP-ANo.2002-45179))；產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)反硝化產(chǎn)堿菌反硝化亞種DA181(Alcaligenes denitrificanssubsp.denitrificans DA181)(Appl.Environ.Microbiol，54，984(1998))；糞產(chǎn)堿菌DA1(Alcaligenes faecalis DA1)(Appl.Environ.Microbiol，57，1249(1991))；木糖氧化產(chǎn)堿菌木糖氧化亞種A-6(Alcaligenes xylosoxidans subsp.Xylosoxydans A-6)，具有一種作用于酸性N-?；?D-氨基酸的酶(FEBS，289，44(1991))，Biosci.Biotech.Biochem，57，1145(1993))和一種作用于中性N-?；?D-氨基酸的酶(Biosci.Biotech.Biochem，57，1149(1993))；反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4(Alcaligenes denitrificans subsp.xylosoxydans MI-4)(J.Ferment.Bioeng，71，79(1991))。
產(chǎn)堿菌(Alcaligenes sp.)(WO00/23598)。
其它嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(J.IndustrialMicrobiol.Biotechnol，21，296(1998))Arthrobacter hydrocarboglutamicus(JP-A No.Hei 11-113592)東方擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis orientaris)(JP-A No.Hei 11-98982)
Sebekia benihana(JP-A No.Hei 11-318442)Hypomyces mycophilus(JP-A NO.2000-41684)紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)簡(jiǎn)單脂肪桿菌(Pimelobacter simplex)(JP-A No.Hei 06-22789)嗜中溫甲基桿菌(Methylobacterium mesophilicum)熱丁香類諾卡氏菌(Nocardioides thermolilacinus)(WO 02/061077)Trichoderma harzianum從如上所述寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)，紅球菌(Rhodococcus)和脂肪桿菌(Pimelobacter)所得酶沒(méi)有被純化，因此它們的特性有待闡明，從節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)所得酶已被純化，但它的特性仍有待闡明。
從假單胞菌屬所得N-?；?D-谷氨酸氨基水解酶，從產(chǎn)堿菌A-6菌株所得N-酰-D-谷氨酸脫乙酰酶，N-?；?D-天冬氨酸酰胺水解酶，D-氨基?；笓?jù)報(bào)道對(duì)N-乙酰-D-色氨酸沒(méi)有活性。
根據(jù)參考文獻(xiàn)，從假單胞菌屬，鏈霉菌屬，木霉屬(Trichoderma)，擬無(wú)枝酸菌屬(Amycolatopsis)所得酶，對(duì)N-乙酰-D-色氨酸的活性為10U/mg或更低甚至沒(méi)有該活性。
而且，從產(chǎn)堿菌屬的另一菌株DA1，以及從Hypomyces，從Sebekia所得酶的活性是100U/mg或更低。另一方面，從產(chǎn)堿菌DA1菌株所得酶對(duì)N-乙酰-D-色氨酸的活性據(jù)報(bào)道約為600U/mg，但是它的立體選擇性并不嚴(yán)格，因?yàn)檫@種酶對(duì)N-乙酰-L-色氨酸的活性約11U/mg。
有人報(bào)道了一種從產(chǎn)堿菌(Alcaligenes.sp.)所得新的D-氨基酰化酶(WO00/23598)可作用于N-乙酰-D-色氨酸。但是，該報(bào)道僅僅公開(kāi)了該酶對(duì)25mMN-乙酰-DL-色氨酸和10mM N-乙酰-D-色氨酸的水解活性，這種D-氨基酰化酶據(jù)報(bào)道是一種能催化10g/l N-乙酰-D-色氨酸水解的新酶。
另還發(fā)現(xiàn)，已知的從反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4菌株所得D-氨基?；缚梢詮牡孜?50g/L N-乙酰-DL-色氨酸產(chǎn)生大約2.5g/L D-色氨酸，其相當(dāng)于75g/L N-乙酰-D-色氨酸，如圖1所示。因此，可以確認(rèn)這種酶有足夠高的水解如此高濃度底物的活性。
有人報(bào)道了從嗜中溫甲基桿菌和熱丁香類諾卡氏菌所得D-氨基?；缸饔糜贜-乙酰-D-色氨酸，該催化反應(yīng)幾乎不能被底物抑制，即使是高達(dá)100g/l濃度的底物也不行。然而，這篇報(bào)道沒(méi)有提到N-乙酰-L-色氨酸對(duì)這兩種酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，另外，沒(méi)有任何關(guān)于這兩種酶的細(xì)節(jié)的信息，而且，從熱丁香類諾卡氏菌所得酶既沒(méi)有被純化也沒(méi)有進(jìn)行特征的描述。
有人報(bào)道，采用含有嗜中溫甲基桿菌D-氨基?；富虻腄NA轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.Coli)，將其與100g/L N-乙酰-DL-色氨酸一起保溫時(shí)，可以從底物N-乙酰-D-色氨酸獲得約90％產(chǎn)率的D-色氨酸(WO02/061077)。但是，沒(méi)有關(guān)于從較高濃度的上述底物產(chǎn)生D-色氨酸的報(bào)道，在D-色氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)中，人們期望能水解高濃度底物N-乙酰-DL-色氨酸產(chǎn)生D-色氨酸。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供能利用高濃度底物N-乙酰-DL-色氨酸確保立體選擇性的生產(chǎn)高濃度D-色氨酸的D-氨基?；竿蛔凅w。另一目的是提供編碼所述酶的基因。另一目的是提供利用所述D-氨基?；竿蛔凅w及其編碼基因生產(chǎn)D-氨基酸的方法。
本發(fā)明者注意到，從反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4菌株所得D-氨基?；笇?duì)N-乙酰-D-甲硫氨酸有高度特異性活性(high specific activity，404U/mg)。根據(jù)參考文獻(xiàn)，這種酶對(duì)N-乙酰-D-色氨酸僅僅有20U/mg或更低的活性。本發(fā)明者將編碼這種酶的基因克隆到大腸桿菌中，對(duì)所克隆的酶進(jìn)行純化，測(cè)定它的特異性活性。與已報(bào)道的值相比，這種酶對(duì)N-乙酰-D-色氨酸有非常高的特異性活性(528U/mg)。另外，這種酶對(duì)于N-乙酰-L-色氨酸沒(méi)有活性。因此，這種酶可用于從N-乙酰-DL-色氨酸生產(chǎn)D-色氨酸。
本發(fā)明者利用上述D-氨基?；杆釴-乙酰-DL-色氨酸來(lái)生產(chǎn)D-色氨酸，然后發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)一個(gè)臨界值時(shí)D-色氨酸的產(chǎn)量降低。本發(fā)明者研究了D-色氨酸產(chǎn)量降低的原因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D-氨基?；副怀^(guò)臨界濃度的底物N-乙酰-D-色氨酸或N-乙酰-L-色氨酸抑制。
工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)D-氨基酸需要利用能產(chǎn)生盡可能高濃度的D-氨基酸的酶，這種酶應(yīng)該能在高底物濃度時(shí)保持酶活，因此，為了生產(chǎn)D-色氨酸，需要提供一種D-氨基酰化酶，其催化反應(yīng)很難被N-乙酰-D-色氨酸抑制。
最近在基因工程領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)步，使得能通過(guò)人工修飾氨基酸序列來(lái)修飾蛋白質(zhì)的多種特性(nature)，以使其在產(chǎn)業(yè)上更實(shí)用。本發(fā)明者修飾了一種從反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4所得D-氨基?；富蛞赃_(dá)到上述目的。發(fā)明者成功獲得了能從高濃度N-乙酰-DL-色氨酸生產(chǎn)D-色氨酸的突變型D-氨基?；?。
而且，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，用修飾的突變型D-氨基酰化酶與N-?；?DL-色氨酸在適當(dāng)?shù)臈l件下保溫，可以高效生產(chǎn)D-氨基酸。尤其是，本發(fā)明中突變型D-氨基?；?，與野生型D-氨基?；赶啾龋^少地受到N-乙酰-D-色氨酸抑制。這種特征說(shuō)明這些突變體適用于生產(chǎn)高濃度D-色氨酸，具有工業(yè)實(shí)用性。
具體地，本發(fā)明涉及下述的突變D-氨基?；讣捌鋺?yīng)用[1]具有在存在N-乙酰-D-色氨酸的情況下生產(chǎn)D-色氨酸的活性的多肽，包括(a)SEQ ID NO1所示氨基酸序列，其中至少一個(gè)選自包括位點(diǎn)154的丙氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸，位點(diǎn)374的精氨酸的組的氨基酸殘基被取代；或者(b)(a)所述氨基酸序列，其中位點(diǎn)154，347，374之外的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入；[2][1]所述多肽，包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列，其中包括任何一個(gè)選自下組的氨基酸取代(A)位點(diǎn)154的丙氨酸被選自纈氨酸，半胱氨酸和蘇氨酸中的任何一個(gè)氨基酸取代；(B)位點(diǎn)347的甲硫氨酸被選自甘氨酸，谷氨酰胺，絲氨酸，天冬酰胺，丙氨酸，異亮氨酸和脯氨酸中的任何一個(gè)氨基酸取代；(C)位點(diǎn)374的精氨酸被選自苯丙氨酸，賴氨酸，亮氨酸，酪氨酸，組氨酸，異亮氨酸和色氨酸中的任何一個(gè)氨基酸取代；[3][1]所述多肽，包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列，其中選自位點(diǎn)154的丙氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸和位點(diǎn)374的精氨酸中的兩個(gè)或更多氨基酸殘基被取代；[4][3]所述多肽，包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列，其中包括位點(diǎn)154的丙氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸，位點(diǎn)374的精氨酸的氨基酸取代；[5][1]所述多肽，從底物120g/l N-乙酰-DL-色氨酸特異性水解N-乙酰-D-色氨酸以80％或更高產(chǎn)率生產(chǎn)D-色氨酸；[6][1]所述多肽，具有在有N-乙酰-D-色氨酸和N-乙酰-L-色氨酸的情況下生產(chǎn)D-色氨酸的活性； 一種包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽，其中包括(1)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，而且位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼幔?2)位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?，而且位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸；(3)位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?，而且位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?4)位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚椅稽c(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸；(5)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?，而且位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?6)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，而且位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸；(7)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?，而且位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸；(8)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?，而且位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?9)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，而且位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸；(10)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，而且位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)楸奖彼幔籟8]編碼[1]或[7]所述多肽的多核苷酸；[9][8]所述多核苷酸，包含SEQ ID NO3所示核苷酸序列，其中包括選自下組的核苷酸取代(a)位點(diǎn)460到462的核苷酸序列GCG被選自GTA，TGC和ACA中的一個(gè)核苷酸序列取代；(b)位點(diǎn)1039到1041的核苷酸序列ATG被選自GGT，CAA，TCT，AAC，GCA，ATA，和CCC中的一個(gè)核苷酸序列取代，和；(c)位點(diǎn)1120到1122的核苷酸序列CGC被選自TTT，AAA，CTT，TAT，CAC，ATA和TGG中的一個(gè)核苷酸序列取代；[10][8]所述多核苷酸，包含SEQ ID NO3所示核苷酸序列，其在選自位點(diǎn)460到462的核苷酸序列GCG，位點(diǎn)1039到1041的核苷酸序列ATG，位點(diǎn)1120到1122的核苷酸序列CGC的兩個(gè)或更多個(gè)區(qū)域包含核苷酸取代；[11][10]所述多核苷酸，包含SEQ ID NO3所示核苷酸序列，其中包括位點(diǎn)460到462的核苷酸序列GCG，位點(diǎn)1039到1041的核苷酸序列ATG，位點(diǎn)1120到1122的核苷酸序列CGC的核苷酸取代；[12]包含SEQ ID NO3所示核苷酸序列的多核苷酸；[13]插入了[8]所述多核苷酸的載體；[14]包含[13]所述載體的轉(zhuǎn)化體；[15][14]所述轉(zhuǎn)化體，所述轉(zhuǎn)化體是帶有[9]所述多核苷酸的大腸桿菌；[16]生產(chǎn)[1]或[7]所述多肽的方法，包含培養(yǎng)[14]所述轉(zhuǎn)化體；[17]一種生產(chǎn)D-氨基酸的方法，包含將N-酰基-DL-氨基酸與選自下組的至少一種具有酶活的物質(zhì)接觸(a)[1]或[7]所述多肽；(b)[14]所述轉(zhuǎn)化體，而且；(c)(b)所述轉(zhuǎn)化體的加工產(chǎn)物；并且回收生產(chǎn)的D-氨基酸；[18][17]所述生產(chǎn)方法，所述N-酰基-DL-氨基酸是N-?；?DL-色氨酸；[19][18]所述生產(chǎn)方法，所述N-?；?DL-色氨酸是N-乙酰-DL-色氨酸；[20][19]所述生產(chǎn)方法，所述N-乙酰-DL-色氨酸濃度是120g/l或更高；[21][8]所述多核苷酸，包含SEQ ID NO2所示核苷酸序列，其中包含選自下組的核苷酸取代(a)位點(diǎn)460到462的核苷酸序列GCG被選自GTA，TGC和ACA中的一個(gè)核苷酸序列取代；(b)位點(diǎn)1039到1041的核苷酸序列ATG被選自GGT，CAA，TCT，AAC，GCA，ATA，和CCC中的一個(gè)核苷酸序列取代，并且；(c)位點(diǎn)1120到1122的核苷酸序列CGC被選自TTT，AAA，CTT，TAT，CAC，ATA和TGG中的一個(gè)核苷酸序列取代；[22][8]所述多核苷酸，包含SEQ ID NO2所示核苷酸序列，其在選自位點(diǎn)460到462的核苷酸序列GCG，位點(diǎn)1039到1041的核苷酸序列ATG，位點(diǎn)1120到1122的核苷酸序列CGC的兩個(gè)或更多個(gè)區(qū)域包含核苷酸取代；[23][22]所述多核苷酸，包含SEQ ID NO2所示核苷酸序列，其中含有位點(diǎn)460到462的核苷酸序列GCG，位點(diǎn)1039到1041的核苷酸序列ATG，位點(diǎn)1120到1122的核苷酸序列CGC的核苷酸取代。


圖1顯示，用生產(chǎn)野生型或突變型D-氨基?；傅闹亟M大腸桿菌的培養(yǎng)基，通過(guò)水解15％N-乙酰-DL-色氨酸進(jìn)行的D-色氨酸生產(chǎn)。縱坐標(biāo)表示所生產(chǎn)的D-色氨酸的產(chǎn)量(g/l)或產(chǎn)率(％)；橫坐標(biāo)表示反應(yīng)時(shí)間(h)。
圖2顯示了用生產(chǎn)突變型D-氨基?；傅闹亟M大腸桿菌的培養(yǎng)基通過(guò)水解20％N-乙酰-DL-色氨酸進(jìn)行的D-色氨酸生產(chǎn)?？v坐標(biāo)表示所生產(chǎn)的D-色氨酸的產(chǎn)量(g/l)或產(chǎn)率(％)；橫坐標(biāo)表示反應(yīng)時(shí)間(h)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了從反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4所得D-氨基?；竿蛔凅w。
術(shù)語(yǔ)“D-氨基?；浮敝敢环N從N-?；?D-氨基酸催化生產(chǎn)有機(jī)酸和D-氨基酸的酶，“抑制D-氨基?；浮敝窷-乙酰-D-氨基酸的底物抑制和/或N-乙酰-L-氨基酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。在本發(fā)明中，D-氨基?；富钚阅鼙槐绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員用常規(guī)手段檢測(cè)出。例如，D-氨基酰化酶活性可通過(guò)下述方法測(cè)定。
將含有20mM N-乙酰-D-色氨酸(Sigma)，50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)和酶液的反應(yīng)溶液1ml在30℃保溫10分鐘，來(lái)進(jìn)行酶促反應(yīng)。然后加入0.5ml含有TCA(包含0.11M三氯乙酸，0.22M乙酸鈉，0.33M乙酸)的終止液，D-色氨酸的產(chǎn)量可用TNBS法測(cè)定(Biosci.Biotech.Biochem，58，24(1994))。
例如，將0.25ml的100mM Na2B4O7加入0.25ml終止液，在該混合液中加入10μl的110mM TNBS(三硝基苯磺酸)溶液，馬上攪拌，靜置五分鐘后，加入含有1.5mM Na2SO3的1ml 100mM NaHPO4以停止顏色反應(yīng)，然后在420nm測(cè)定溶液的吸光率，一單位酶活定義為在30℃一分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol D-色氨酸的酶量。
在本發(fā)明中，通過(guò)酶促反應(yīng)或利用微生物細(xì)胞進(jìn)行的反應(yīng)生產(chǎn)的D-色氨酸可以通過(guò)高效液相色譜用ODS柱定量(柱wakosil II 5C18(4.6×250nm)；Wako Pure Chemical Industries；洗脫緩沖液CH3CN/50mMKH2PO4H3PO4(pH2.5)＝2∶8；檢測(cè)波長(zhǎng)，A280nm；流速，1.0mL/min；柱溫，40℃)。D-色氨酸的滯留時(shí)間是3.8分鐘，N-乙酰-D-色氨酸的是10.7分鐘。蛋白量可以通過(guò)BIO-RAD蛋白分析試劑盒(Bio-Rad Protein Assay kit，Bio-Rad)測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白使用牛血漿白蛋白。
本文中，氨基酸序列中氨基酸殘基的修飾按照如下規(guī)則表述。氨基酸位置以SEQ ID NO1的N末端殘基為1開(kāi)始編號(hào)。按照野生型氨基酸殘基的單字母代碼、位置編號(hào)、取代氨基酸殘基的單字母代碼這種順序從左排起。例如，位置154的Ala被氨基酸X取代表述為A154X，同樣，位置347的Met被氨基酸Y取代表述為M347Y，位置374的Arg被氨基酸Z取代表述為R374Z。A154X/M347Y/R374Z表示這三個(gè)修飾同時(shí)發(fā)生。
從反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4所得D-氨基?；傅陌被嵝蛄腥鏢EQ ID NO1所示，本發(fā)明中D-氨基酰化酶突變體具有SEQ ID NO1所示序列，其中有選自位置154的丙氨酸，位置347的甲硫氨酸，位置374的精氨酸中的至少一個(gè)氨基酸殘基被其它氨基酸所取代。本發(fā)明的突變酶能通過(guò)這三個(gè)氨基酸中至少一個(gè)的氨基酸取代而獲得，例如，這三個(gè)氨基酸殘基中的任何一個(gè)或兩個(gè)，或所有三個(gè)殘基。
位置154的取代氨基酸殘基優(yōu)選是纈氨酸，半胱氨酸或蘇氨酸，更優(yōu)選是纈氨酸。位置347的取代殘基優(yōu)選是甘氨酸，谷氨酰胺，絲氨酸，天冬酰胺，丙氨酸，異亮氨酸或脯氨酸，更優(yōu)選是丙氨酸。位置374的取代殘基優(yōu)選是苯丙氨酸，賴氨酸，亮氨酸，酪氨酸，組氨酸，異亮氨酸或色氨酸，更優(yōu)選是苯丙氨酸。
本發(fā)明提供了含有氨基酸序列SEQ ID NO1的多肽，所述序列中有選自位置154的丙氨酸，位置347的甲硫氨酸，位置374的精氨酸中的至少一個(gè)氨基酸殘基被其它氨基酸取代。本發(fā)明多肽有D-氨基酰化酶活性，與從反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4所得野生型D-氨基?；赶啾容^少的被底物N-乙酰-D-色氨酸所抑制。下文中從反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4中所得D-氨基?；赣袝r(shí)稱“野生型D-氨基?；浮薄１景l(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案是，比野生型D-氨基酰化酶對(duì)上述N-乙酰-L-色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)抑制和底物抑制有更高抗性的多肽。
本發(fā)明多肽的優(yōu)選氨基酸序列是從SEQ ID NO1所得修飾的氨基酸序列，其中位置154的丙氨酸，位置347的甲硫氨酸，和位置374的精氨酸進(jìn)行了表1所示的取代。這些突變的多肽是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈儗?duì)上文描述的底物抑制和競(jìng)爭(zhēng)性抑制有抗性。
表1氨基酸154氨基酸347氨基酸374丙氨酸 甲硫氨酸 精氨酸(1)纈氨酸丙氨酸 -(2)- 丙氨酸 組氨酸(3)- 丙氨酸 苯丙氨酸(4)- 谷氨酰胺 組氨酸(5)纈氨酸丙氨酸 苯丙氨酸(6)纈氨酸谷氨酰胺 組氨酸(7)蘇氨酸丙氨酸 組氨酸(8)蘇氨酸丙氨酸 苯丙氨酸(9)蘇氨酸谷氨酰胺 組氨酸(10)蘇氨酸 谷氨酰胺 苯丙氨酸-無(wú)取代本發(fā)明突變體除了包含上述突變，還可以包含其它突變，包括一個(gè)或更多氨基酸取代，缺失，添加和/或插入，只要它的氨基酸序列中包含上述突變，并且它比野生型酶對(duì)N-乙酰-D-色氨酸和/或N-乙酰-L-色氨酸的抑制有更高抗性。這些突變可以是人工引入的，也可以是自發(fā)生成的。本發(fā)明突變體包括人工突變體或自發(fā)突變體。本發(fā)明突變體的突變氨基酸數(shù)目通常是50個(gè)或更少，優(yōu)選是30個(gè)或更少，更優(yōu)選是10個(gè)或更少(例如，5個(gè)氨基酸或更少，3個(gè)氨基酸或更少)。
當(dāng)本發(fā)明突變體在除了位置154，347，374之外的位置具有諸如氨基酸缺失，添加或插入等突變時(shí)，這些從N末端算起的氨基酸位置可能改變。這種情況下，通過(guò)將處在相應(yīng)于位置154，347，374的氨基酸殘基用不同氨基酸取代，可以將SEQ ID NO1的更改后的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成本發(fā)明突變體。換句話說(shuō)，本發(fā)明多肽包括以下多肽(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO1，其中有選自相應(yīng)于位置154的丙氨酸，位置347的甲硫氨酸，位置374的精氨酸的至少一個(gè)氨基酸被其它氨基酸取代，和(2)在被N-乙酰-D-色氨酸和/或N-乙酰-L-色氨酸抑制方面具有降低的趨勢(shì)。
所述相應(yīng)位置可通過(guò)將改變的氨基酸序列中突變位置附近的氨基酸序列與SEQ ID NO1中突變位置附近的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)來(lái)發(fā)現(xiàn)。這樣的操作叫做氨基酸序列比對(duì)。例如，BLAST就是進(jìn)行這種比對(duì)的一種算法。本領(lǐng)域熟練者可以通過(guò)對(duì)比而在不同長(zhǎng)度的氨基酸序列中找到相應(yīng)位置。因此，含有下述氨基酸序列的多肽是本發(fā)明的優(yōu)選突變體，所述多肽例如，在上述相應(yīng)位置具有表1所列的取代的氨基酸殘基。
本發(fā)明中，那些除了在位置154的丙氨酸、位置347的甲硫氨酸、位置374的精氨酸之外還含有其它突變的氨基酸序列，優(yōu)選保持與SEQ IDNO1的高同源性?！案咄葱浴笔侵?，例如80％或更高，優(yōu)選85％或更高，更優(yōu)選90％或更高，更優(yōu)選95％或更高的同源性。
本發(fā)明所述其它突變優(yōu)選是指保守取代，一般來(lái)說(shuō)，取代的氨基酸優(yōu)選與被取代的氨基酸具有相似性質(zhì)以保持蛋白質(zhì)功能，這樣的氨基酸取代叫做保守取代。
例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸和色氨酸被分入非極性氨基酸，互相有相似的性質(zhì)。不帶電荷的氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺。酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。堿性氨基酸包括賴氨酸，精氨酸，和組氨酸。
本發(fā)明多肽的特征是，與從反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4所得野生型D-氨基?；赶啾?，對(duì)N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制和/或N-乙酰-L-色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制有更高的抗性。那些希望弱化其底物抑制或競(jìng)爭(zhēng)抑制的化合物并不僅限于上述這些。特別的，只要本發(fā)明多肽能保持對(duì)N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制和/或N-乙酰-L-色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)抑制的抗性，還可以削弱除了這些化合物之外的其它化合物的底物抑制或競(jìng)爭(zhēng)性抑制。除了對(duì)底物抑制和競(jìng)爭(zhēng)抑制的抗性之外，本發(fā)明突變體可以通過(guò)另外的基因修飾獲得其它表型。
本發(fā)明多肽能從12％或更高濃度的N-乙酰-DL-色氨酸生產(chǎn)80％或更高產(chǎn)率的D-色氨酸。本發(fā)明優(yōu)選的多肽能從15％或更高或17％濃度的N-乙酰-DL-色氨酸生產(chǎn)80％或更高產(chǎn)率的D-色氨酸。
另外，本發(fā)明一種優(yōu)選多肽可以從20％或更高濃度的N-乙酰-DL-色氨酸生產(chǎn)50％或更高產(chǎn)率的D-色氨酸。更優(yōu)選的多肽能從22％或更高濃度的N-乙酰-DL-色氨酸生產(chǎn)50％或更高產(chǎn)率的D-色氨酸。
上述80％或更高產(chǎn)率或50％或更高產(chǎn)率是指，在包含10U/ml酶的反應(yīng)液中、在pH8.0和30℃進(jìn)行反應(yīng)而從底物N-乙酰-D-色氨酸獲得D-色氨酸的產(chǎn)率。
野生型或突變型D-氨基?；柑崛∥锟梢岳纾ㄟ^(guò)過(guò)濾和離心回收微生物細(xì)胞，并將它們懸浮在緩沖液中，使用Bead-Beater(BIOSPECPRODUCT)使它們破裂而獲得。包含10U/ml所得酶，300mM Tris-HCl(pH8.0)緩沖液的反應(yīng)液，與12％，15％，17％，20％，或22％N-乙酰-DL-色氨酸，在30℃振蕩保溫24小時(shí)。如此一來(lái)，D-色氨酸可從12％，15％，或17％的濃度的底物獲得80％或更高的產(chǎn)率，或從20％或22％的濃度的底物中獲得50％或更高產(chǎn)率。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明多核苷酸包括一種DNA，它包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO1的核苷酸序列，所述核苷酸序列中相應(yīng)于154位的丙氨酸，347位的甲硫氨酸，和374位的精氨酸的密碼子被取代氨基酸殘基的密碼子所取代。編碼氨基酸序列的核苷酸序列通過(guò)選擇遺傳密碼系統(tǒng)中氨基酸各自相對(duì)應(yīng)的密碼而設(shè)計(jì)。眾所周知，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，一個(gè)氨基酸不是被一個(gè)而是多個(gè)密碼子編碼。因此，編碼氨基酸序列SEQ ID NO1的核苷酸序列不僅含有SEQ ID NO2所述核苷酸序列，而且含有用同義密碼子設(shè)計(jì)的所有核苷酸序列。
本發(fā)明提供了，通過(guò)將如上述獲得的編碼本發(fā)明D-氨基酰化酶的多核苷酸，插入已知表達(dá)載體而制備的D-氨基酰化酶表達(dá)載體。本發(fā)明D-氨基酰化酶可以是通過(guò)培養(yǎng)已被上述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體而獲得的重組多肽。
本發(fā)明多肽可通過(guò)如下方法制備。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因可通過(guò)在野生型D-氨基酰化酶基因的所需氨基酸位置引入突變而獲得。從野生型反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4獲得的D-氨基酰化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
本發(fā)明多核苷酸可用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽。包含目的氨基酸序列的多肽可以通過(guò)在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)本發(fā)明多核苷酸而以重組多肽的形式獲得。本發(fā)明多肽可以采用多種方法修飾以提高其在宿主中表達(dá)時(shí)的生產(chǎn)力(productivity)。比如，可以從多核苷酸上移除那些與宿主中罕見(jiàn)密碼子相應(yīng)的密碼子，或依據(jù)與宿主中密碼子使用習(xí)慣的兼容性和GC含量來(lái)修飾多核苷酸。可以基于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，將原始密碼子改變成編碼同一種氨基酸的另一密碼子，從而在不改變多核苷酸編碼的氨基酸序列的前提下修飾核苷酸序列。
例如，可以修改多核苷酸的核苷酸序列來(lái)增加D-氨基?；冈诖竽c桿菌中的生產(chǎn)力，或提高D-氨基?；富蛟诖竽c桿菌中的穩(wěn)定性。具體地，可以從多核苷酸上移除那些在大腸桿菌中罕見(jiàn)的密碼子，也可以依據(jù)大腸桿菌中密碼子使用的兼容性和GC的含量來(lái)修飾多核苷酸。含有編碼本發(fā)明突變體的核苷酸序列、并且經(jīng)過(guò)修飾適合在大腸桿菌中表達(dá)的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。SEQ ID NO3所示的核苷酸序列編碼SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
因而，適合于在大腸桿菌中表達(dá)本發(fā)明突變體的DNA，可以由修飾核苷酸序列SEQ ID NO3而設(shè)計(jì)出的編碼本發(fā)明突變體的DNA來(lái)制備。下列核苷酸序列是在154位、347位和374位編碼本發(fā)明優(yōu)選的取代氨基酸殘基的核苷酸序列示例。本發(fā)明優(yōu)選的多核苷酸包括含核苷酸序列SEQ IDNO3的DNA，其中如下列所示的核苷酸序列已經(jīng)取代為至少一個(gè)選自核苷酸460-462，1039-1041或1120-1122的區(qū)域。
154位 纈氨酸/gta(丙氨酸/460-gcg) 半胱氨酸/tgc蘇氨酸/aca347位 甘氨酸/ggt(甲硫氨酸/1039-atg) 谷氨酰胺/caa絲氨酸/tct天冬酰胺/aac丙氨酸/gca異亮氨酸/ata脯氨酸/ccc374位 苯丙氨酸/ttt(精氨酸/1120-cgc) 賴氨酸/aaa亮氨酸/ctt酪氨酸/tat組氨酸/cac異亮氨酸/ata色氨酸/tgg
包含核苷酸序列SEQ ID NO3的DNA的質(zhì)粒pSL-ADD6，已經(jīng)被保藏在以下單位。插入該質(zhì)粒中的DNA優(yōu)選地用來(lái)在大腸桿菌中生產(chǎn)本發(fā)明突變體。
保藏單位的名稱和地址名稱International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology(AIST)，IndependentAdminisrative Institution.
(前稱The National Institute of Bioscience and Human-Technology，TheAgency of Industrial Science and Technology，The Ministry of InternaltinalTrade and Industry)地址AIST Tsukuba Central 6，1-1-3 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，305-8566，Japan(郵政編碼302-8566)保藏日期2003年10月17日(最初保藏于2002年12月12日)保藏號(hào)FERM BP-08508通過(guò)使用本領(lǐng)域常規(guī)的誘變技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變和隨機(jī)誘變技術(shù)，將突變導(dǎo)入野生型基因，可以獲得突變型D-氨基酰化酶。這些誘變技術(shù)包括，例如，容錯(cuò)PCR(error-prone PCR)，定點(diǎn)飽和誘變(site-directed saturationmutagenesis)，盒式誘變(cassette mutagenesis)，DNA改組(DNA shufling)和StEP(Appl.Microbiol.Biotechnol.，55，519，2001)。比如，將需要導(dǎo)入突變的目的DNA作為模板，通過(guò)使用低精確度PCR方法(容錯(cuò)PCR)對(duì)DNA進(jìn)行復(fù)制，可以隨機(jī)導(dǎo)入突變，所述低精確度PCR方法中，Taq DNA聚合酶摻入核苷酸的精確度被削弱了。
特別地，削弱了Taq DNA聚合酶摻入核苷酸的精確度的那些容錯(cuò)PCR可以通過(guò)下列方式來(lái)實(shí)現(xiàn)(1)增加PCR反應(yīng)溶液中的MgCl2濃度；(2)在反應(yīng)溶液中添加MnCl2；(3)在反應(yīng)溶液中以不同濃度使用四種核苷酸；(4)在反應(yīng)溶液中添加核苷酸類似物。備選地，使用容易發(fā)生核苷酸取代的模板DNA，例如具有高GC含量的DNA時(shí)，通過(guò)使用摻入核苷酸的精確度較低的Taq DNA聚合酶，不需要上述程序就可以導(dǎo)入隨機(jī)突變。
通過(guò)將復(fù)制的DNA片段插入到已知的表達(dá)載體、并制備用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體，可以獲得突變體文庫(kù)。例如，可以用增加了N-乙酰-L-色氨酸的比例的N-乙酰-DL-色氨酸混合物作為底物，通過(guò)使突變體和底物接觸，并比較野生型和突變體的D-色氨酸的產(chǎn)量，分離出所需突變體，其N-乙酰-L-色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)抑制和/或N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制被降低。
例如，將轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基與5％N-乙酰-DL-色氨酸和1％N-乙酰-L-色氨酸的混合物(作為底物)一起保溫，當(dāng)一種突變體在反應(yīng)溶液中產(chǎn)生D-色氨酸的量比野生型的大時(shí)，選出該突變體，其N-乙酰-L-色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)抑制和/或N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制被降低。
通過(guò)這樣的隨機(jī)誘變實(shí)驗(yàn)，一旦鑒定出產(chǎn)生期望效果的突變位置(氨基酸取代的位置)，下一個(gè)步驟就是，用以下方法進(jìn)行位點(diǎn)特異性氨基酸取代和隨機(jī)氨基酸取代，從中選出最合適的氨基酸取代。例如，如果NNN(N代表A，T，C和G的混合物)表示相應(yīng)于將要引入氨基酸取代的位置上的密碼子，可以設(shè)計(jì)和合成出覆蓋了NNN位置的64種引物的混合物。合成另一個(gè)引物，使該引物含有野生型相應(yīng)位置的核苷酸序列，與前述的一種引物組成一對(duì)。優(yōu)選的，在每一個(gè)引物的5’末端都設(shè)計(jì)了一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，如限制性酶位置。使用這樣的引物對(duì)，用野生型DNA作為模板進(jìn)行PCR，可以制備出一個(gè)文庫(kù)，其中包含編碼特定位置的天然氨基酸的所有類型密碼子的DNA片段。
擴(kuò)增的DNA片段的兩端都使用適當(dāng)?shù)南拗泼富蝾愃频拿高M(jìn)行降解。將片段和表達(dá)載體連接，表達(dá)載體包含了用相同步驟處理的野生型DNA。通過(guò)用上述表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，制備出轉(zhuǎn)化體，從而制備出轉(zhuǎn)化體文庫(kù)，每一轉(zhuǎn)化體表達(dá)所述酶，該酶中特定位置的氨基酸被另一天然氨基酸所取代。通過(guò)使用增加了N-乙酰-L-色氨酸的比例的N-乙酰-DL-色氨酸混合物作為底物，選出能高水平產(chǎn)生D-色氨酸的突變體，可以選出能最有效降低N-乙酰-L-色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)抑制和/或N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制的氨基酸取代。
例如，轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基與5％N-乙酰-DL-色氨酸和2％N-乙酰-L-色氨酸的混合物(作為底物)一起保溫，當(dāng)一個(gè)突變體在反應(yīng)溶液中D-色氨酸的產(chǎn)量比野生型的大時(shí)，可將該突變體選出，其包含最適于降低N-乙酰-L-色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)抑制和/或N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制的氨基酸殘基。一旦鑒定出一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選的氨基酸取代位置和優(yōu)選的取代的氨基酸殘基，就可以通過(guò)有目的的或隨機(jī)的組合這些氨基酸取代來(lái)獲得目的特性得到改進(jìn)的突變體。例如，想將三個(gè)氨基酸位置的氨基酸取代隨機(jī)組合時(shí)，包含所述三個(gè)突變酶之一的基因的每一個(gè)質(zhì)粒在三個(gè)適當(dāng)?shù)奈恢糜孟拗泼傅认?，然后純化和回收覆蓋所述氨基酸取代位置的DNA片段。
將所有處理過(guò)的DNA組合，以覆蓋所述突變酶基因的全長(zhǎng)。通過(guò)使用T4連接酶隨機(jī)連接該混合物，可以制備出突變體的質(zhì)粒文庫(kù)，該質(zhì)粒文庫(kù)包括了在這三個(gè)位置的氨基酸取代的所有可能組合。通過(guò)使用上述三個(gè)氨基酸取代位置之一的野生型DNA片段，可以同時(shí)制備出包含兩個(gè)氨基酸取代突變體的質(zhì)粒文庫(kù)和只包含一個(gè)氨基酸取代的突變體的質(zhì)粒文庫(kù)。這樣一來(lái)，通過(guò)用上述質(zhì)粒文庫(kù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可以獲得一個(gè)轉(zhuǎn)化體文庫(kù)，其中的轉(zhuǎn)化體表達(dá)包含一至三個(gè)氨基酸取代的突變酶。
能有效降低N-乙酰-L-色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)抑制和/或N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制程度的最佳組合氨基酸取代可以通過(guò)如下的方法選出使用含有增加了N-乙酰-L-色氨酸比例的N-乙酰-DL-色氨酸混合物作為底物，選出高水平生產(chǎn)D-色氨酸的突變體。
例如，可以將轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基與由2％N-乙酰-DL-色氨酸和3.5％N-乙酰-L-色氨酸組成的作為底物的混合物一起保溫，當(dāng)一種突變體在反應(yīng)溶液中產(chǎn)生D-色氨酸的量比野生型大時(shí)，將該突變體選出，作為包含了最適于降低N-乙酰-L-色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)抑制和/或N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制程度的氨基酸取代組合的突變體。
對(duì)用于表達(dá)本發(fā)明D-氨基酰化酶的轉(zhuǎn)化微生物的類型沒(méi)有特別限制，只要該微生物能被含有編碼本發(fā)明D-氨基?；傅亩嗪塑账岬闹亟M載體轉(zhuǎn)化，并能表達(dá)該酶。本發(fā)明包括這樣的轉(zhuǎn)化體和生產(chǎn)本發(fā)明D-氨基?；傅姆椒?，所述方法包括培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體?？梢宰鳛樗拗饔糜谥苽渌鲛D(zhuǎn)化體的微生物包括，例如，下列微生物開(kāi)發(fā)了宿主載體系統(tǒng)的細(xì)菌埃希氏菌屬(Escherichia)，芽胞桿菌屬(Bacillus)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，沙雷氏菌屬(Serratia)，短桿菌屬(Brevibacterium)，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，
鏈球菌屬(Streptococcus)，或乳桿菌屬(Lactobacillus)。
開(kāi)發(fā)了宿主載體系統(tǒng)的放線菌紅球菌屬(Rhodococcus)，或鏈霉菌屬(Streptomyces)。
開(kāi)發(fā)了宿主載體系統(tǒng)的酵母糖酵母屬(Saccharomyces)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，單孢菌屬(Zygosaccharomyces)，Yarrowia屬(Yarrowia)，Trichosporon屬(Trichosporon)，Rhodosporidium屬(Rhodosporidium)，畢赤氏酵母屬(Pichia)，或假絲酵母屬(Candiada)。
開(kāi)發(fā)了宿主載體系統(tǒng)的真菌鏈孢霉屬(Neurospora)，曲霉屬(Aspergillus)，頭孢霉屬(Cephalosporium)，或木霉屬(Trichoderma)。
產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體和構(gòu)建適合于宿主的重組載體的步驟，可以依照分子生物學(xué)、生物工程學(xué)和基因工程學(xué)領(lǐng)域的已知標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)進(jìn)行(例如，Sambrook etal，Molucular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratories)。
為了在微生物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明D-氨基?；竿蛔兓蚧駾-氨基酰化酶修飾基因，將本發(fā)明多核苷酸插入穩(wěn)定存在于微生物中的質(zhì)粒載體或噬菌體載體中，并對(duì)遺傳信息進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。可以將調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯的啟動(dòng)子插入本發(fā)明多核苷酸的5’上游，優(yōu)選還在所述多核苷酸的3’下游插入終止子。啟動(dòng)子和終止子應(yīng)當(dāng)在用作宿主細(xì)胞的微生物中具有功能。在不同微生物中具有功能的載體、啟動(dòng)子和終止子可參見(jiàn)“BiseibutsugakuKisokouza(Basic Course of Microbiology)Vol.8 Idenshikougaku(GeneticEngineering)，Kyritsu Shuppan Co，Ltd.”，對(duì)于酵母菌的，記載于“Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)，Yeast 8，423-488(1992)”等。
例如，象pBR和pUC系列這樣的質(zhì)粒載體，和諸如β-半乳糖苷酶(lac)，色氨酸操縱子(trp)，tac，trc(lac和trp的融合)等的啟動(dòng)子，以及來(lái)源于λ-噬菌體的那些PL，PR等，可以用于埃希氏菌屬，特別是大腸桿菌。來(lái)自trpA，噬菌體和rrnB核糖體RNA的終止子也可以使用。
諸如pUB110和pC194系列等載體可以用于芽胞桿菌屬，并可整合到染色體上?？梢允褂玫膯?dòng)子和終止子如堿性蛋白酶(apr)、中性蛋白酶(npr)和amy(α-淀粉酶)的啟動(dòng)子和終止子。
假單孢菌屬，特別是惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和蔥頭假單胞菌(Pseudomonas cepacia)的宿主-載體系統(tǒng)已開(kāi)發(fā)出來(lái)?？梢允褂脤捤拗鞣秶妮d體pKT240(包含自我復(fù)制所必需的來(lái)源于RSF1010的基因)，它基于質(zhì)粒TOL，其參與甲苯化合物的降解?？梢允褂弥久?JP-A Hei 5-284973)基因的啟動(dòng)子和終止子及其類似物。
質(zhì)粒載體如pAJ43(Gene 39，281(1985))可以應(yīng)用于短桿菌屬，特別是乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)。用于埃希氏菌屬的啟動(dòng)子和終止子可以用于這種微生物中。
質(zhì)粒載體如pCS11(JP-A Sho 57-183799)和pCB101(Mol.Gen.Genet.196，175，(1984))可以用于棒桿菌屬，特別是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)。
質(zhì)粒載體如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett，26，239，(1985))和pGK1(Appl.Environ.Microbiol.50，94(1985))可以用于鏈球菌屬。
對(duì)于乳桿菌屬，可以使用為鏈球菌屬開(kāi)發(fā)的pAM β1(J.Bacteriol.137，614(1979))，以及為埃希氏菌屬開(kāi)發(fā)的一些啟動(dòng)子。
對(duì)于紅球菌屬，可以使用分離自玫瑰色紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)或類似菌株的質(zhì)粒載體(I.Gen.Microbiol.138，1003(1992))。
在鏈霉菌屬中有功能的質(zhì)?？梢杂妹枋鲇凇癎enetic Manipulation ofStreptomycesA Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories byHopwood et al.(1985)”的方法來(lái)構(gòu)建。例如，可以使用pIJ486(Mol.Gen.Genet.203，468-478(1986))，pKC1064(Gene 103，97-99(1991))，和pUWL-KS(Gene165，149-150(1995))，特別是用于變青鏈霉菌(Streptomyces lividans)。這些質(zhì)粒也可以用于弗吉尼亞鏈霉菌(Streptomyces virginiae)(Actinomycetol.11，46-53(1997))。
質(zhì)粒如YRp，YEp，YCp和YIp系列可以用于糖酵母屬，特別是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。與基因組DNA中核糖體DNA的多個(gè)拷貝進(jìn)行同源重組的整合載體(如EP537456)，由于它們能將多個(gè)基因拷貝導(dǎo)入宿主基因組并能穩(wěn)定維持這些基因，因此非常有用。還可以使用乙醇脫氫酶(ADH)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、酸性磷酸酶(pHO)、半乳糖苷酶(GAL)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、烯醇酶(ENO)等的啟動(dòng)子和終止子。
來(lái)源于啤酒糖酵母的2μm質(zhì)粒系列、pKD1質(zhì)粒系列(J.Bacteriol.145，382-390(1981))、來(lái)源于pGK11的與殺傷活性有關(guān)的質(zhì)粒、包含來(lái)源于克魯維酵母屬的自我復(fù)制基因的KARS質(zhì)粒系列、能通過(guò)與核糖體DNA進(jìn)行同源重組而整合到染色體中的載體質(zhì)粒(如EP537456)，他們都能用于克魯維酵母屬，特別是乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)。還可以使用來(lái)源于ADH和PGK的啟動(dòng)子和終止子。
裂殖酵母屬可以使用下述質(zhì)粒載體，它包含來(lái)源于粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)ARS(一個(gè)與自我復(fù)制有關(guān)的基因)，并包含能彌補(bǔ)啤酒糖酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選擇標(biāo)記(Mol.Cell.Biol.6，80(1986))。此外，來(lái)源于粟酒裂殖糖酵母的ADH啟動(dòng)子是可應(yīng)用的(EMBO J.6，729(1987))。特別地，pAUR224可以從Takara Shuzo購(gòu)得。
單孢菌屬可以使用諸如源自Zygosaccharomyces rouxii的pSB3(NucleicAcids Res.13，4267(1985))等質(zhì)粒載體。也可以使用源自啤酒糖酵母的pHO5啟動(dòng)子和源自Zygosaccharomyces rouxii的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP-Zr)的啟動(dòng)子(Agri.Biol.Chem.54，2521(1990))等。
在畢赤氏酵母屬中，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了針對(duì)Pichia angusta(曾用名多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha))的宿主-載體系統(tǒng)。可使用的載體包括了源自Pichia angusta的與自我復(fù)制有關(guān)的基因(HARS1和HARS2)，但它們是相對(duì)不穩(wěn)定的。因此，將該基因的多個(gè)拷貝插入到染色體中是有效的(Yeast 7，431-443(1991))。由甲醇等誘導(dǎo)的AOX(醇氧化酶)和FDH(甲酸脫氫酶)的啟動(dòng)子也可以利用。已經(jīng)使用源自畢赤氏酵母的與自我復(fù)制有關(guān)的PARS1和PARS2等基因，開(kāi)發(fā)了巴斯德畢赤氏酵母(Pachia pastoris)的宿主-載體系統(tǒng)(Mol.Cell.Biol.5，2276(1985))。啟動(dòng)子如由高密度培養(yǎng)物和甲醇誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)活性AOX啟動(dòng)子是可應(yīng)用的(Nucleic Acids Res.15，3859(1987))。
對(duì)假絲酵母屬而言，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了針對(duì)麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)，白色假絲酵母(Candida albicans)，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)，產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)等的宿主-載體系統(tǒng)。可以用從麥芽糖假絲酵母克隆的ARS開(kāi)發(fā)該菌的載體(Agri.Biol.Chem.51，51，1587(1987))。針對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母的、能整合到染色體中的載體的強(qiáng)啟動(dòng)子已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)(JP-A Hei 08-173170)。
在曲霉菌屬中，黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究。目前已有能整合到染色體中的質(zhì)粒，還有源自胞外蛋白酶和淀粉酶的啟動(dòng)子(Trends in Biotechnology 7，283-287(1989))。
對(duì)于木霉菌屬，已開(kāi)發(fā)出基于Trichoderma reesie的宿主-載體系統(tǒng)，并能獲得源自胞外纖維素酶基因的啟動(dòng)子(Biotechnology 7，596-603(1989))。
除了微生物之外，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了針對(duì)植物和動(dòng)物的各種各樣的宿主-載體系統(tǒng)。特別地，在昆蟲(chóng)特別是家蠶中(Nature 315，592-594(1985))以及在植物如油菜籽(rape seed)、玉米(corn)和馬鈴薯中，生產(chǎn)大量外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，并且是可獲得的。
本發(fā)明D-氨基?；缚梢杂冒幋a該酶的多核苷酸的重組載體轉(zhuǎn)化微生物細(xì)胞并按常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物細(xì)胞而獲得。合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基都可以使用，只要它們包含適當(dāng)量的碳源、氮源、無(wú)機(jī)物和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基可以是固態(tài)的或是液態(tài)的。
特別地，可以使用一種、兩種或者多種碳源，這些碳源可以從常規(guī)使用的碳源中適當(dāng)?shù)倪x擇，包括糖，如葡萄糖、果糖、麥芽糖、半乳糖、淀粉、淀粉水解物、糖蜜和黑糖蜜；天然的碳水化合物，如小麥和玉米；醇類，如甘油、甲醇和乙醇；脂肪酸，如乙酸、葡萄糖酸、丙酮酸和檸檬酸；烴類，如正鏈烷烴(normal paraffin)；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺?？梢允褂靡环N、兩種或者多種氮源，這些氮源可以從有機(jī)含氮化合物中適當(dāng)?shù)倪x擇，例如肉浸汁、蛋白胨、酵母提取物、大豆水解物、奶酪(milk casein)、酪蛋白氨基酸、各種氨基酸、玉米浸汁，動(dòng)物、植物和微生物的其它水解物等；以及無(wú)機(jī)含氮化合物，例如銨鹽，如氨、硝酸銨、硫酸銨和氯化銨；硝酸鹽，如硝酸鈉；和尿素。
此外，使用少量的一種、兩種或多種無(wú)機(jī)鹽，可以適當(dāng)?shù)倪x自鎂、錳、鉀、鈣、鈉、銅、鋅等的磷酸鹽、氫氯酸鹽、硝酸鹽、醋酸鹽和其它鹽類。如果有需要，可以使用消泡劑，包括植物油、表面活性劑(detergent)和硅。
細(xì)胞可以用常規(guī)培養(yǎng)方法在包含上述成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如振蕩培養(yǎng)、通氣攪拌培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和流加培養(yǎng)。
對(duì)培養(yǎng)條件沒(méi)有限制，只要微生物菌株能夠生長(zhǎng)并產(chǎn)生D-氨基酰化酶。培養(yǎng)條件可以依據(jù)培養(yǎng)類型、培養(yǎng)方法和其它的因素來(lái)適當(dāng)選擇。通常，將起始培養(yǎng)的pH值調(diào)到4-10(優(yōu)選6-8)，然后于15-50℃(更優(yōu)選25-35℃)進(jìn)行培養(yǎng)。
待微生物細(xì)胞充分生長(zhǎng)之后或在細(xì)胞生長(zhǎng)期間，將轉(zhuǎn)化體置于允許誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的條件下。例如，外源基因位于lac啟動(dòng)子的下游時(shí)，通過(guò)添加IPTG來(lái)誘導(dǎo)其表達(dá)。備選地，當(dāng)使用溫度敏感的啟動(dòng)子時(shí)，將細(xì)胞置于能表達(dá)外源基因的溫度下培養(yǎng)。
對(duì)培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間沒(méi)有限制，只要培養(yǎng)能夠產(chǎn)生具有足夠高的D-氨基?；富钚缘奈⑸锛?xì)胞。通常，培養(yǎng)時(shí)間為1-14天，優(yōu)選為1-3天。由基因表達(dá)所產(chǎn)生和積聚的本發(fā)明D-氨基?；?，可以通過(guò)下述方法收集和回收。
當(dāng)D-氨基?；冈谖⑸锛?xì)胞內(nèi)聚集時(shí)，在培養(yǎng)后，通過(guò)過(guò)濾和離心等方法收集細(xì)胞。用生理鹽水等緩沖液洗滌細(xì)胞，然后單獨(dú)或組合使用物理方法、生物化學(xué)方法和化學(xué)方法進(jìn)行細(xì)胞溶解，物理方法如凍融、超聲破碎、壓力處理、滲透壓差處理和碾磨；生物化學(xué)方法如用溶菌酶等細(xì)胞壁溶解酶進(jìn)行處理；化學(xué)處理如使用表面活性劑進(jìn)行處理。從而提取出D-氨基?；?。如此所得粗制D-氨基酰化酶可以通過(guò)單獨(dú)或組合使用以下手段來(lái)純化鹽析、使用溶劑等進(jìn)行分級(jí)沉淀；各種層析分離方法，包括鹽析層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、疏水層析、染料層析(dyechromatography)、羥基磷灰石層析、親和層析等，使用開(kāi)放柱、中壓層析或高效液相色譜(HPLC)；電泳分離方法，如等電聚焦、非變性凝膠電泳，等。
具體地，例如，將過(guò)濾或離心所收集的微生物細(xì)胞冷凍或者裂解，然后懸浮在緩沖液中。將細(xì)胞用Bead-Beater(BIOSPEC PRODUCT)進(jìn)行裂解，制備野生型或突變型D-氨基?；傅奶崛∥铩Ｈ缓?，用硫化銨對(duì)該提取物進(jìn)行鹽析處理。通過(guò)進(jìn)行Phenyl-Sepharose FF疏水層析和Mono Q離子交換層析，可以純化出均一的酶(在聚丙烯酰胺凝膠電泳中是單一泳帶)。
由如此純化的反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4野生型D-氨基?；负捅景l(fā)明D-氨基酰化酶突變體催化的與N-乙酰-D-色氨酸和N-乙酰-L-色氨酸反應(yīng)的速率常數(shù)，可以通過(guò)描述于“Lectures for Biochemical Experiments21Introduction to Experimental Approach to Enzyme Kinetics”和“BasicExperimental Methods for Proteins and Enzymes，2ndEd.”的方法進(jìn)行測(cè)定。Km為米氏常數(shù)(Michaelis constant)，最大速率是Vmax，抑制常數(shù)是Ki，過(guò)量底物的反應(yīng)抑制常數(shù)是Ks’。
本發(fā)明還包括一種使用本發(fā)明D-氨基?；干a(chǎn)D-氨基酸的方法，一種表達(dá)所述D-氨基?；富蚱浼庸ず螽a(chǎn)物的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明D-氨基?；缚梢岳酶鞣NN-?；?D-氨基酸來(lái)生產(chǎn)D-氨基酸。在D-氨基酸的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中，本發(fā)明D-氨基酰化酶是有用的。例如，本發(fā)明D-氨基酰化酶可以允許作用于N-?；?DL-氨基酸(D型和L型的混合物)而特異地生產(chǎn)D-氨基酸。更具體地，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)D-氨基酸的方法，包括使N-?；?DL-氨基酸與選自如下(a)至(c)的至少一種酶活性物質(zhì)相接觸和回收所得的D-氨基酸的步驟(a)本發(fā)明D-氨基?；傅鞍?；(b)表達(dá)本發(fā)明D-氨基?；傅霓D(zhuǎn)化體；和(c)表達(dá)本發(fā)明D-氨基酰化酶的轉(zhuǎn)化體的加工產(chǎn)物。
本發(fā)明中使用的N-酰基-DL-氨基酸的類型沒(méi)有限制，這樣的氨基酸可以選自較寬范圍的化合物。代表性的N-?；?DL-氨基酸列于式(I)中。
式(I) 其中，R1和R2是相同或不同的，選自烷基、鏈烯基、鏈炔基(alkynyl)、環(huán)烷基、烯丙基和芳烷基。這些基團(tuán)可以用鹵素原子、單鏈烷氧基、硝基、羥基或這類基團(tuán)取代。更具體地，R2的優(yōu)選取代基包括甲基、氯甲基和苯基。優(yōu)選的R1包括如下所列的取代基。包含每種取代基的N-?；?DL-氨基酸的名稱在括號(hào)中說(shuō)明。
吲哚基(N-?；?DL-色氨酸)苯甲基(N-酰基-DL-苯丙氨酸)硫代甲基乙基(N-?；?DL-甲硫氨酸)異丙基(N-?；?DL-纈氨酸)2-甲基-丙基(N-?；?DL-亮氨酸)本發(fā)明中，優(yōu)選的N-?；?DL-氨基酸包括N-乙酰-DL-氨基酸。N-乙酰-DL-氨基酸的具體例子如下所述。在這些N-乙酰-DL-氨基酸中，N-乙酰-DL-色氨酸是生產(chǎn)D-色氨酸的特別有用的底物，而D-色氨酸是一種重要的工業(yè)用化合物。
N-乙酰-DL-甲硫氨酸N-乙酰-DL-纈氨酸N-乙酰-DL-色氨酸N-乙酰-DL-天冬酰胺N-乙酰-DL-苯丙氨酸N-乙酰-DL-丙氨酸N-乙酰-DL-亮氨酸上述(a)至(c)的任何一種有酶活性的物質(zhì)，都能被用于本發(fā)明的生產(chǎn)方法?？梢允褂玫木哂忻富钚缘奈镔|(zhì)包括部分純化的酶、能產(chǎn)生D-氨基酰化酶的轉(zhuǎn)化體及其除純化的酶之外的加工產(chǎn)物。特別地，可以通過(guò)使N-乙酰-DL-氨基酸與能產(chǎn)生D-氨基酰化酶的轉(zhuǎn)化體或其加工產(chǎn)物直接接觸來(lái)生產(chǎn)D-氨基酸。
這里所使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體的加工產(chǎn)物”是指，對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行如下處理所獲得的產(chǎn)物物理處理，如凍融、超聲破碎、壓力處理、滲透壓差處理或碾磨；或生物化學(xué)處理，如用溶菌酶等細(xì)胞壁溶解酶處理；或化學(xué)處理，如用表面活性劑，或甲苯、二甲苯、丙酮等有機(jī)溶劑進(jìn)行處理。通過(guò)這些處理而改變了細(xì)胞膜通透性的微生物；通過(guò)用玻璃珠或酶裂解微生物細(xì)胞而獲得的無(wú)細(xì)胞提取物；以及它們經(jīng)過(guò)部分純化獲得的物質(zhì)；都被包括在所述加工產(chǎn)物中。
一般地，酶和微生物通過(guò)固定化來(lái)穩(wěn)定。固定化可以通過(guò)已知的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如聚丙烯酰胺凝膠法、硫酸化多糖凝膠法(角叉藻聚糖凝膠法)、藻酸鹽凝膠法和瓊脂凝膠法，包括與離子交換樹(shù)脂結(jié)合。與固定化酶或微生物進(jìn)行反應(yīng)所需的時(shí)間，取決于D-氨基酰化酶和底物這兩者的量。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)這些參數(shù)，憑經(jīng)驗(yàn)選擇最適條件。一般通過(guò)10-100小時(shí)的溫育，可以高效的獲得目的反應(yīng)產(chǎn)物。
可以選擇本發(fā)明D-氨基?；浮⒛鼙磉_(dá)D-氨基?；傅霓D(zhuǎn)化體或其加工產(chǎn)物，與N-?；?D-氨基酸進(jìn)行溫育的條件，使得有利于D-氨基?；傅幕钚院头€(wěn)定性以及能產(chǎn)生D-氨基酰化酶的轉(zhuǎn)化體菌株的反應(yīng)性。本發(fā)明D-氨基?；傅幕钚杂袝r(shí)被二價(jià)金屬離子(如Zn2+、Ni2+、和Co2+)增強(qiáng)或者抑制。如果酶被二價(jià)金屬離子抑制，可以向反應(yīng)溶液中添加螯合劑，如EDTA。
對(duì)作為反應(yīng)底物的N-?；?DL-氨基酸的濃度沒(méi)有限制。通常使用的底物濃度大約0.1％-50％，優(yōu)選1％-40％，更優(yōu)選5％-30％。在使用本發(fā)明的酶或細(xì)胞進(jìn)行的反應(yīng)中，作為底物的N-?；?DL-氨基酸是N-酰基-D-氨基酸和N-?；?L-氨基酸的混合物。對(duì)混合物中L型和D型的比例(D型∶L型)沒(méi)有限制。通常的比例范圍從10∶90到90∶10，優(yōu)選25∶75到75∶25，更優(yōu)選50∶50。當(dāng)比例為50∶50時(shí)，這一混合物被稱為外消旋的N-?；?氨基酸。
這里所使用的術(shù)語(yǔ)“N-乙酰-DL-色氨酸的高濃度”是指120g/l或更高的N-乙酰-DL-色氨酸濃度，優(yōu)選的150g/l或更高，更優(yōu)選的200g/l或更高。
這里使用的單位“％”是指“重量/體積(w/v)”。當(dāng)反應(yīng)溶液中的所有N-乙酰-D-色氨酸分子都被轉(zhuǎn)變?yōu)镈-色氨酸時(shí)，“反應(yīng)產(chǎn)率”達(dá)到100％。
底物添加到反應(yīng)溶液中，可以在反應(yīng)一開(kāi)始的時(shí)候即刻添加，或持續(xù)的、或分步的添加。使用的D-氨基?；傅臐舛?，通常約為0.01-100000U/ml，優(yōu)選約為0.1-10000U/ml，更優(yōu)選為1-1000U/ml。對(duì)反應(yīng)溫度沒(méi)有限制，只要在這一溫度本發(fā)明的酶具有活性并因此使反應(yīng)能繼續(xù)下去。反應(yīng)溫度的范圍通常為5-70℃，優(yōu)選為10-50℃，更優(yōu)選為20-40℃。對(duì)反應(yīng)的pH值也沒(méi)有限制，只要在這一pH值下本發(fā)明的酶是有活性的并因此使反應(yīng)能繼續(xù)下去。通常，反應(yīng)中的pH值的范圍為3-11，優(yōu)選5-10，更優(yōu)選6-9。反應(yīng)能在溶液被攪拌或靜止的情況下進(jìn)行。
例如，通過(guò)將40％N-乙酰-DL-色氨酸和轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基等量的混合，使混合物在30℃攪拌溫育24小時(shí)，可以生產(chǎn)出產(chǎn)率達(dá)80％或更高的D-色氨酸；其中所述轉(zhuǎn)化體能表達(dá)突變型D-氨基?；福揇-氨基?；负蠥154V/M347A/R374F突變。
在反應(yīng)溶液中產(chǎn)生的D-氨基酸可以用已知的方法提取，例如，濃縮、通過(guò)等電點(diǎn)沉淀等方法直接結(jié)晶、用離子交換樹(shù)脂處理、過(guò)濾等。例如，當(dāng)以N-乙酰-DL-色氨酸作為底物生產(chǎn)出D-色氨酸時(shí)，使反應(yīng)溶液流經(jīng)用于吸附D-色氨酸的強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，用水洗滌樹(shù)脂，然后用0.5N的氨水洗脫，可以從反應(yīng)溶液中分離出D-色氨酸。將通過(guò)濃縮洗脫液獲得的粗制D-色氨酸結(jié)晶粉末，溶解在少量的熱的1∶1乙醇-水中，然后使用活性炭脫色。冷卻這一混合物，獲得D-色氨酸的結(jié)晶。
使用本發(fā)明的D-氨基酸生產(chǎn)方法，N-?；?L-氨基酸在反應(yīng)中不被消耗。殘留的N-酰基-L-氨基酸可以通過(guò)外消旋作用轉(zhuǎn)換成N-?；?DL-氨基酸來(lái)重復(fù)利用。使用酶反應(yīng)(JP-A No.Hei 1-137973)或化學(xué)反應(yīng)(Biochem.Z.，203，280(1929))對(duì)N-乙酰-L-氨基酸進(jìn)行外消旋的方法已經(jīng)被公開(kāi)。
本發(fā)明能夠高效的生產(chǎn)突變型D-氨基?；福銷-乙酰-D-色氨酸的底物抑制和/或N-乙酰-L-色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)抑制是降低的。
本發(fā)明的突變型D-氨基?；缚梢杂糜诹Ⅲw選擇性的水解較高濃度的N-乙酰-DL-色氨酸，生產(chǎn)具有改進(jìn)活性的D-色氨酸。本發(fā)明D-氨基?；傅牡孜镆种坪透?jìng)爭(zhēng)抑制被削弱了，致使所述酶能夠水解高濃度(如200g/l)N-乙酰-DL-色氨酸中的底物N-乙酰-D-色氨酸，以80％或更高的產(chǎn)率生產(chǎn)D-色氨酸。在此之前，還沒(méi)有得到過(guò)這樣的D-氨基酰化酶。用本發(fā)明D-氨基?；敢愿弋a(chǎn)率合成的D-色氨酸，可以作為起始材料用于生產(chǎn)藥劑或其它化合物。
實(shí)施例以下引用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4菌株的染色體DNA的制備按照Nuclei acids Res.8，4321(1980)所描述的方法，從反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4菌株(FERM P-9413)制備染色體DNA。
實(shí)施例2通過(guò)PCR從反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4菌株克隆D-氨基酰化酶基因依據(jù)參考文獻(xiàn)(Biosci.Biotech.Biochem，59，2115(1995))中的描述，合成出正義引物ADD-ATG1(SEQ ID NO1)和反義引物ADD-TGA1(SEQ NOID5)，它們對(duì)應(yīng)于木糖氧化產(chǎn)堿菌木糖氧化亞種A-6(Alcaligenesxylosoxydans subsp.xylosoxydans A-6)的D-氨基酰化酶基因的5’-和3’-非翻譯區(qū)。進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用50-μl反應(yīng)溶液，其中含有70ng反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4菌株的染色體DNA、1.0U ExTaq DNA聚合酶、Taq聚合酶緩沖液、0.2mM dNTP、5％DMSO、以及引物ADD-ATG1和ADD-TGA1(各10pmol)，在94℃變性30秒、72℃延伸2分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR獲得了高度特異的約1.5kbp的PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例3PCR產(chǎn)物的測(cè)序。
實(shí)施例2所得DNA片段用GFX試劑盒(Pharmacia)純化。分析純化的DNA片段的核苷酸序列。DNA的核苷酸序列分析通過(guò)PCR，使用BigDyeTerminator Cycle Sequening ready Reaction Kit(Applied Bio Systems)在PRISM 310基因分析儀(Applied Bio Systems)中進(jìn)行。使用的引物是ADD-189R(SEQ ID NO6)，ADD-524R(SEQ ID NO7)，ADD-466F(SEQ ID NO8)，ADD-1032R(SEQ ID NO9)，ADD-987F(SEQ ID NO10)，和ADD-TGA1。
所得序列如SEQ ID NO1所示。將這個(gè)D-氨基?；傅暮塑账嵝蛄?，與已知的木糖氧化產(chǎn)堿菌木糖氧化亞種A-6菌株D-氨基?；缚寺∵M(jìn)行比較。以起始密碼子ATG的第一個(gè)字母A為1，在這兩個(gè)克隆之間，只發(fā)現(xiàn)了兩處核苷酸取代，360-T-＞C和435-C-＞T。氨基酸序列彼此完全相同。此外，將此D-氨基?；概c產(chǎn)堿菌CMC3352和CMC3353菌株的D-氨基酰化酶進(jìn)行了比較。顯示出11個(gè)核苷酸變化，4-T-＞G(Ser2-＞Ala)，7-C-＞G(Gln3-＞Glu)，41-C-＞T(Ala14-＞Val)，234-T-＞C(Arg78-＞Arg)，306-G-＞A(Ala102-＞Ala)，363-T-＞G(Ser121-＞Ser)，369-T-＞C(Arg123-＞Arg)，450-A-＞G(Ser150-＞Ser)，676-G-＞C(Gly2-＞Arg)，718-G-＞C(Gly240-＞Arg)，和724-G-＞A(Glu242-＞Lys)，在這11個(gè)取代中，6個(gè)使氨基酸發(fā)生改變。
實(shí)施例4通過(guò)PCR從反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MI-4菌株中克隆D-氨基?；富?2-根據(jù)實(shí)施例3中確定的DNA片段的核苷酸序列，合成出正義引物ADD-ATG2(SEQ ID NO11)和反義引物ADD-TAA2(SEQ ID NO12)。進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用50-μl反應(yīng)溶液，其中含有10ng的實(shí)施例2中所得PCR產(chǎn)物作為模板、2.5U PfuTurbo DNA聚合酶、PfuTurbo緩沖液、0.2mM dNTP、5％DMSO、以及引物ADD-ATG2和ADD-TGA2(各10pmol)，在95℃變性30秒、72℃延伸160秒，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR獲得高度特異的約1.5kbp的PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例5構(gòu)建包含所述D-氨基酰化酶基因的表達(dá)載體。
實(shí)施例4所得DNA片段用GFX試劑盒(Pharmacia)純化，然后用限制酶EcoRI和HindIII進(jìn)行雙水解。使DNA在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。從凝膠上切割下目的條帶，用Sephaglas(Pharmacia)進(jìn)行純化。
使用T4 DNA連接酶，所得DNA片段被連接到用同樣的限制酶進(jìn)行了雙水解的pSE420D(JP-A No.2000-189170)上。用連接好的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株的細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)在含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB平板中，從一些菌落中純化出質(zhì)粒，測(cè)定插入片段的核苷酸序列。每一個(gè)含有D-氨基?；富虻馁|(zhì)粒被分別命名為pSL-ADD2，pSL-ADD3，pSL-ADD4和pSL-ADD5。質(zhì)粒中的D-氨基?；富虻暮塑账嵝蛄信c由實(shí)施例2中得到的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列(反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MT-4的D-氨基?；富虻暮塑账嵝蛄?進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把開(kāi)放閱讀框架(ORF)的起始密碼子ATG的第一個(gè)堿基A作為1時(shí)，在質(zhì)粒pSL-ADD2中，D-氨基酰化酶基因核苷酸序列的第679位密碼子GAG取代為GGG(Glu227-＞Gly)，第991位的密碼子AAG被取代為AGG(Lys331-＞Arg)；在質(zhì)粒pSL-ADD4中，第1012位的密碼子CTG被取代為CCG(Leu338-＞Pro)。并且在這兩種質(zhì)粒中，D-氨基?；傅幕钚詭缀鯗y(cè)不到。這些氨基酸取代導(dǎo)致D-氨基酰化酶的催化活性喪失。
然而在質(zhì)粒pSL-ADD3中，第103位的密碼子GGC被取代為GAC(Gly35-＞Asp)，634位的密碼子AGC被取代為AGT(Ser212-＞Ser)，973位的密碼子GCC被取代為GCT(Ala325-＞Ala)；在質(zhì)粒pSL-ADD5中，第43位的密碼子GGC被取代為GGA(Gly15-＞Gly)，1009位的密碼子GAG被取代為GGG(Glu337-＞Gly)，然而由這兩種質(zhì)粒編碼的酶具有D-氨基酰化酶活性，可見(jiàn)這些氨基酸取代對(duì)D-氨基酰化酶的催化活性沒(méi)有影響。
實(shí)施例6制備與大腸桿菌的密碼子使用習(xí)慣相容的修飾型D-氨基酰化酶基因(1)構(gòu)建包含修飾的D-氨基?；富虻谋磉_(dá)質(zhì)粒反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MT-4菌株的D-氨基酰化酶基因，在其編碼區(qū)內(nèi)存在著對(duì)于大腸桿菌來(lái)說(shuō)非常稀有的密碼子，而且該基因的GC含量非常高。為了提高在大腸桿菌內(nèi)D-氨基酰化酶基因表達(dá)的穩(wěn)定性以及效力，對(duì)實(shí)施例4所述PCR過(guò)程中產(chǎn)生的核苷酸取代進(jìn)行校正，并且那些在大腸桿菌中非常稀有的密碼子也需要從D-氨基酰化酶基因中缺失。另外，改變密碼子使之與宿主大腸桿菌的密碼子使用習(xí)慣相容，編碼區(qū)的GC含量也進(jìn)行調(diào)節(jié)使其適用于大腸桿菌。對(duì)核苷酸序列進(jìn)行再構(gòu)建，但確保不因核苷酸序列取代而改變其所編碼的氨基酸序列。所得的DNA序列見(jiàn)SEQ ID NO3。
雙鏈DNA的合成基于修飾的D-氨基?；富虻暮塑账嵝蛄械男畔?，該基因經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)在其兩端分別含有PciI和XbaI識(shí)別位點(diǎn)。雙鏈DNA通過(guò)oligo-DNA裝配法整合到pUC載體中。在確認(rèn)該克隆的核苷酸序列后，該DNA被PciI和XbaI雙酶切，再用T4 DNA連接酶將該DNA片段連接到已經(jīng)NcoI和XbaI雙酶切的質(zhì)粒pSE420D中，得到能表達(dá)修飾型D-氨基?；富虻馁|(zhì)粒pSL-ADD6。該質(zhì)粒含有修飾型D-氨基酰化酶基因，于2002年11月12日保藏在International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology(AIST)，IndependentAdministrative Institution，保藏號(hào)為FERM BP-08508。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株。
(2)檢測(cè)修飾型D-氨基?；富蛩磉_(dá)的D-氨基?；富钚詫?shí)施例5(1)所得轉(zhuǎn)化體在含有氨芐青霉素(50ug/ml)的液體LB培養(yǎng)基中26℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，加入0.1mM IPTG，然后在30℃振蕩溫育4小時(shí)。細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)離心收集后，懸浮在含0.02％2-巰基乙醇的100mM Tris-HCl緩沖液(pH9.0)中。細(xì)胞在密閉的超聲波儀UCD-200TM(cosmo Bio)中進(jìn)行3分鐘超聲裂解。細(xì)胞裂解物離心，回收上清液，將其作為細(xì)胞提取液用來(lái)進(jìn)行D-氨基?；富钚苑治觥Ｒ吧虳-氨基?；富钚詾?4U/mg，而修飾型D-氨基?；富钚詾?6U/mg，可見(jiàn)核苷酸序列修飾對(duì)提高該酶的特異性活性有貢獻(xiàn)。
實(shí)施例7反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MT-4的D-氨基酰化酶的PCR誘變用低保真DNA聚合酶和實(shí)施例6中構(gòu)建的D-氨基?；副磉_(dá)載體pSL-ADD6，通過(guò)PCR法復(fù)制D-氨基?；富颍瑥亩贒-氨基?；富蛑幸腚S機(jī)核苷酸取代。轉(zhuǎn)化體通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109細(xì)胞而獲得。
用引物ADD-ATG2和ADD-TAA2擴(kuò)增目的DNA片段。PCR反應(yīng)在50μl的反應(yīng)液中進(jìn)行，該反應(yīng)液中含有Taq聚合酶緩沖液，0.2mM dNTP和引物ADD-ATG2和ADD-TAA2(各10pmol)，2.0U Taq DNA聚合酶以及125ng的質(zhì)粒pSL-ADD6，在94℃變性30秒，72℃延伸105秒，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。所得PCR片段用EcoRI和HindIII雙酶切，再用T4 DNA連接酶與經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切的質(zhì)粒pSE420D連接，得到含有不同的隨機(jī)核苷酸取代的D-氨基?；富虻馁|(zhì)粒文庫(kù)。用該質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，得到含有突變型D-氨基?；富虻霓D(zhuǎn)化體的文庫(kù)。
實(shí)施例8篩選突變體。
大腸桿菌轉(zhuǎn)化體細(xì)胞在LB瓊脂平板上進(jìn)行溫育，在平板上長(zhǎng)出菌落，將每一菌落用牙簽接種到微滴板(microtiter plate)上含有150μl LB培養(yǎng)基的孔中溫育，所述培養(yǎng)基含有50μg/ml氨芐青霉素和0.02mM IPTG。微滴板用可透氣的密閉膜(Nalgene)覆蓋，37℃振蕩溫育18個(gè)小時(shí)。將10μl培養(yǎng)基溶液加入微滴板含有下述反應(yīng)液的孔中，所述反應(yīng)液含有300mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)，0.1％鯨蠟基溴化吡啶鎓，5％N-乙酰-DL-色氨酸，1％N-乙酰-L-色氨酸以及蒸餾水。然后平板在25℃振蕩溫育1小時(shí)。由N-乙酰-D-色氨酸產(chǎn)生的D-色氨酸按TNBS法進(jìn)行比色定量。
野生型菌株同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后選出D-色氨酸生產(chǎn)活性高于野生型菌株者。約3000個(gè)菌落中選出了4個(gè)突變菌株，這4個(gè)突變菌株在含有50μg/ml氨芐青霉素和0.02mM IPTG的LB培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)。該液體培養(yǎng)基在5％N-乙酰-DL-色氨酸和1％N-乙酰-L-色氨酸存在下溫育。與野生型菌株釋放的D-色氨酸量相比較，N-乙酰-L-色氨酸對(duì)D-色氨酸生產(chǎn)的抑制程度減弱。因此，通過(guò)上述方法得到4種突變型D-氨基?；窤D-0103，AD-1064，AD-1089，和AD-1927。
實(shí)施例9分析突變型D-氨基?；傅耐蛔兾稽c(diǎn)用常規(guī)的方法從大腸桿菌轉(zhuǎn)化體純化含有突變基因的重組DNA，分析這些突變酶基因(其抑制作用已減弱)的核苷酸序列。結(jié)果顯示，在突變型D-氨基?；窤D-0103和AD-1089中，第347位的纈氨酸殘基(GTG)被取代為甲硫氨酸殘基(ATG)。在突變型D-氨基?；窤D-1064中，第154位的纈氨酸殘基(GTC)被取代為丙氨酸殘基(GCC)。在突變型D-氨基酰化酶AD-1927中，第154位的蘇氨酸殘基(ACC)被取代為丙氨酸殘基(GCC)，374位的組氨酸殘基(CAC)被取代為精氨酸殘基(CGC)。在這之前，產(chǎn)堿菌屬的D-氨基酰化酶的任一種氨基酸序列中還未發(fā)現(xiàn)過(guò)這些氨基酸取代。
實(shí)施例10突變體對(duì)較高濃度N-乙酰-DL-色氨酸的轉(zhuǎn)變的影響用實(shí)施例8所得的抑制作用已減弱的突變型D-氨基酰化酶AD-0103，AD-1064和AD-1927的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101菌株。大腸桿菌細(xì)胞在30℃的液體LB培養(yǎng)基中溫育過(guò)夜。然后將轉(zhuǎn)化體接種到2x YT培養(yǎng)基(含2％細(xì)菌用胰蛋白胨，1％細(xì)菌用酵母提取物，1％氯化鈉，pH7.2)中30℃溫育18小時(shí)。收獲大腸桿菌細(xì)胞，用于水解N-乙酰-D-色氨酸。
從5ml液體培養(yǎng)基制備每種大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞，將其置于10ml含300mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)和5％或10％N-乙酰-DL-色氨酸的反應(yīng)液中，25℃攪拌溫育。用含有攜帶野生型D-氨基?；傅馁|(zhì)粒pSL-ADD6的大腸桿菌HB101菌株作為對(duì)照。以5％N-乙酰-DL-色氨酸為底物時(shí)，野生型的產(chǎn)率約為50％，而4個(gè)突變型都約為100％；以10％N-乙酰-DL-色氨酸為底物時(shí)，野生型的產(chǎn)率約為15％，突變型AD-0103和AD-1089的約為25％，AD-1064的約為40％，AD-1927的約為60％?？梢?jiàn)，實(shí)施例8所得抑制作用減弱的突變體，在較高濃度N-乙酰-DL-色氨酸的轉(zhuǎn)變中，有更高的處理能力(processibility)。
實(shí)施例11制備第二代突變體在154位的丙氨酸，347位的甲硫氨酸和374位的精氨酸處引入隨機(jī)突變，實(shí)施例9已發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)的突變消弱了底物的抑制作用和/或競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。然后從中篩選出更為有效的氨基酸殘基。
合成下述引物引物ADDm-55(SEQ ID NO13)和ADDm-460mix(SEQID NO14)用于將反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MT-4菌株D-氨基?；傅?54位的丙氨酸隨機(jī)取代為另一個(gè)氨基酸；引物ADDm-627F(SEQ ID NO15)和ADDm-1039mix(SEQ ID NO16)用于將第347位的甲硫氨酸隨機(jī)取代為另一個(gè)氨基酸；引物ADDm-627F和ADDm-1120mix(SEQ ID NO17)用于將第374位的精氨酸隨機(jī)取代為另一個(gè)氨基酸。利用實(shí)施例6中含有修飾型D-氨基酰化酶基因的表達(dá)載體pSL-ADD6和上述引物，通過(guò)PCR法將隨機(jī)氨基酸取代引入目的位點(diǎn)。
以質(zhì)粒pSL-ADD6為膜板，用每一對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，95℃變性30秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。引物對(duì)ADDm-55和ADDm-460mix所得PCR擴(kuò)增片段用AvaI和BglII雙酶切；引物對(duì)ADDm-627F和ADDm-1039mix所得PCR擴(kuò)增片段用BlpI和BsrGI雙酶切；引物對(duì)ADDm-627F和ADDm-1120mix所得PCR擴(kuò)增片段用BlpI和KpnI雙酶切。然后用T4 DNA連接酶將經(jīng)過(guò)消化的上述每一PCR擴(kuò)增片段與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶雙酶切的質(zhì)粒pSL-ADD6連接，獲得3種不同質(zhì)?；旌衔?，其中第154位的丙氨酸，第347位的甲硫氨酸和第374位的精氨酸分別被隨機(jī)取代為另一個(gè)氨基酸。然后將這3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，以構(gòu)建3種類型的文庫(kù)。
實(shí)施例12篩選第二代突變體將實(shí)施例11所得3種大腸桿菌轉(zhuǎn)化體文庫(kù)接種到LB瓊脂平板中，在平板上長(zhǎng)出菌落。將每一菌落用牙簽接種到微滴板上含有150μl LB培養(yǎng)基的孔中溫育，所述培養(yǎng)基含有50μg/ml氨芐青霉素和0.02mM IPTG。微滴板用可透氣的密閉膜(Nalgene)覆蓋。37℃振蕩溫育18個(gè)小時(shí)。將10μl培養(yǎng)基溶液加入微滴板上含有下述反應(yīng)液的孔中，所述反應(yīng)液含有300mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)，0.1％鯨蠟基溴化吡啶鎓，5％N-乙酰-DL-色氨酸，1％N-乙酰-L-色氨酸以及蒸餾水。然后平板在25℃振蕩溫育1小時(shí)。從N-乙酰-D-色氨酸產(chǎn)生的D-色氨酸按TNBS法進(jìn)行比色定量。同時(shí)用野生型大腸桿菌菌株進(jìn)行同樣的反應(yīng)。分離出與野生型菌株相比，產(chǎn)生D-色氨酸的能力提高的突變株作為抑制作用減弱的突變株。結(jié)果在約200個(gè)菌落里分離出若干個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性抑制減弱的突變株。
實(shí)施例13分析第二代D-氨基?；竿蛔凅w的突變位點(diǎn)。
檢測(cè)實(shí)施例12所得3種第二代突變酶(其抑制作用已減弱)基因的核苷酸序列。分析每一組大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中抑制作用已減弱的菌株。選出最佳的(top)7株A154X，18株M347X和18株R374X，分析每一個(gè)位點(diǎn)上何種氨基酸被取代。含有各自突變基因的重組DNA通過(guò)常規(guī)的方法純化，測(cè)定重組DNA中的突變型D-氨基酰化酶基因的核苷酸序列。
突變體中的氨基酸取代以及該氨基酸取代的效果，通過(guò)在5％N-乙酰-DL-色氨酸和2％N-乙酰-L-色氨酸存在時(shí)D-色氨酸的生產(chǎn)活性來(lái)評(píng)估，見(jiàn)表2。這里用到的“活性”是指，反應(yīng)結(jié)束時(shí)通過(guò)TNBS法(Abs.420)測(cè)出的反應(yīng)液比色值/細(xì)菌生長(zhǎng)程度(OD600)。
表2

實(shí)施例14制備第三代突變體。
從實(shí)施例13的每一組第二代突變株中選出2種含有氨基酸取代并且抑制作用進(jìn)一步減弱的突變D-氨基?；?，即A154-0043(含氨基酸取代A154V)和A154-0183(含氨基酸取代A154T)；M347-0073(含氨基酸取代M347Q)和M347-0133(含氨基酸取代M347A)；R374-0017(含氨基酸取代R374F)和R374-0062(含氨基酸取代R374H)。將這些位點(diǎn)的突變組合，鑒定出抑制作用進(jìn)一步減弱的第三代突變酶。后文中，將含有編碼酶A154-0043的DNA的質(zhì)粒稱為“pA154-0043”，含有編碼酶A154-0183的DNA的質(zhì)粒稱為“pA154-0183”，含有編碼酶M347-0073的DNA的質(zhì)粒稱為“pM347-0073”，含有編碼酶M347-0133的DNA的質(zhì)粒稱為“pM347-0133”，含有編碼酶R374-0017的DNA的質(zhì)粒稱為“pR374-0017”，含有編碼酶R374-0062的DNA的質(zhì)粒稱為“pR374-0062”。
質(zhì)粒pA154-0043和pA154-0183被限制性內(nèi)切酶AvaI和BlpI雙酶切，乙醇沉淀后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，約0.6kbp的泳帶從凝膠中切出，DNA用Sephagls BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)純化并回收。來(lái)自質(zhì)粒pA154-0043和pA154-0183的約0.6kbp的DNA片段分別含有突變A154V和A154T，于是被分別稱為pA154-0043/AvaI/BlpI和pA154-0183/AvaI/BlpI。質(zhì)粒pM347-0073和pM347-0133被限制性內(nèi)切酶BlpI和BsrGI雙酶切，乙醇沉淀后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，約0.4kbp的泳帶被從凝膠中切出，DNA片段用Sephagls BandPrep(Amersham Pharmacia Biotech)純化并回收。
來(lái)自質(zhì)粒pM347-0073和pM347-0133的約0.4kbp的DNA片段分別含有突變M347Q和M347A，因此被分別稱為pM347-0073/BlpI/BsrGI和pM347-0133/BlpI/BsrGI。質(zhì)粒pR374-0017和pR374-0062被3種限制性內(nèi)切酶AvaI，BlpI和BsrGI消化。乙醇沉淀后回收DNA。來(lái)自質(zhì)粒pM374-0017和pM374-0062的DNA片段分別約為0.6kbp，0.4kbp和5kbp，這3種片段的混合物分別被稱為pR374-0017/AvaI/BlpI/BsrGI和pR374-0062/AvaI/BlpI/BsrGI。這2種混合物中約5kbp的片段分別具有突變R374F和R374H。質(zhì)粒pSL-ADD6用3種限制性內(nèi)切酶AvaI，BlpI和BsrGI消化。乙醇沉淀后回收DNA。來(lái)自質(zhì)粒pSL-ADD6的DNA片段包含約0.6kbp，0.4kbp和5kbp的片段，它們都不合有氨基酸取代。這3種片段的混合物被稱為pSL-ADD6/AvaI/BlpI/BsrGI。
，[pA154-0043/AvaI/BlpI，pA154-0183/AvaI/BlpI]，和[pM347-0073/BlpI/BsrGI，pM347-0133/BlpI/BsrGI]以1∶3∶3摩爾比混合在一起，混合物用T4 DNA連接酶隨機(jī)連接。通過(guò)上述步驟得到了一種質(zhì)?；旌衔?，該混合物包含以下突變體，它們分別含有在3個(gè)位點(diǎn)之一隨機(jī)組合三種突變而產(chǎn)生的2個(gè)和3個(gè)氨基酸取代。用所述質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，得到了轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例15篩選第三代突變體。
將實(shí)施例9所得大腸桿菌轉(zhuǎn)化體細(xì)胞接種到LB瓊脂平板中，在平板上長(zhǎng)出菌落。將每一菌落用牙簽接種到微滴板上含有150μl LB培養(yǎng)基的孔中溫育，所述培養(yǎng)基含有50μg/ml氨芐青霉素和0.02mM IPTG。微滴板用可透氣的密閉膜(Nalgene)覆蓋。37℃振蕩溫育18個(gè)小時(shí)。將10μl培養(yǎng)基溶液加入微滴板上含有下述反應(yīng)液的孔中，所述反應(yīng)液含有300mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，0.1％鯨蠟基溴化吡啶鎓，2％N-乙酰-DL-色氨酸，3.5％N-乙酰-L-色氨酸以及蒸餾水。然后平板在25℃振蕩溫育30分鐘。從N-乙酰-D-色氨酸產(chǎn)生的D-色氨酸按TNBS法進(jìn)行比色定量，用D-色氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)用野生型大腸桿菌菌株進(jìn)行同樣的反應(yīng)。分離出與野生型菌株相比，產(chǎn)生D-色氨酸的能力提高的突變株作為抑制作用減弱的突變株。結(jié)果在約200個(gè)菌落里分離出若干個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性抑制減弱的突變株。
實(shí)施例16分析第三代D-氨基?；竿蛔凅w的突變位點(diǎn)檢測(cè)實(shí)施例15所得第三代突變酶(其抑制作用已經(jīng)減弱)基因的核苷酸序列。按照常規(guī)的方法，從選自每一組大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的20個(gè)最佳菌株(其抑制作用已減弱)中純化出含有所述突變基因的重組DNA。測(cè)定這些重組DNA中突變型D-氨基酰化酶基因的核苷酸序列。
每一突變體的氨基酸取代見(jiàn)表3。
表3

實(shí)施例17評(píng)價(jià)第三代D-氨基?；竿蛔凅w的反應(yīng)活性。
通過(guò)常規(guī)的方法，從實(shí)施例16所得總共10株大腸桿菌JM109轉(zhuǎn)化體純化出重組質(zhì)粒DNA。用這些重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞，以制備轉(zhuǎn)化體。將平板上長(zhǎng)出的每一菌落用牙簽接種到微滴板上含有150μlLB培養(yǎng)基的孔中溫育，所述培養(yǎng)基含有50μg/ml氨芐青霉素和0.02mMIPTG。微滴板用可透氣的密閉膜(Nalgene)覆蓋。37℃振蕩溫育18個(gè)小時(shí)。該反應(yīng)用微滴板每孔中總共200μl的反應(yīng)液進(jìn)行，該反應(yīng)液含有100μl培養(yǎng)基溶液，300mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，7％N-乙酰-DL-色氨酸和蒸餾水。然后平板在25℃振蕩溫育8小時(shí)。當(dāng)?shù)孜镏兴械腘-乙酰-D-色氨酸被轉(zhuǎn)變?yōu)镈-色氨酸時(shí)，將該產(chǎn)率當(dāng)作100％。野生型的產(chǎn)率為約70％，實(shí)施例11所得第三代突變體的產(chǎn)率約為100％?？梢?jiàn)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用在第三代突變體中減弱。
實(shí)施例18選擇最優(yōu)選的突變體3AD-0013(M347Q/R374H)和3AD-0089(A154V/M347A/R374P)分別是實(shí)施例17中第3代突變體的具有2個(gè)和3個(gè)氨基酸取代的突變體。用表達(dá)這2種突變體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞，將細(xì)胞接種在液體LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過(guò)夜。然后將大腸桿菌細(xì)胞接種在培養(yǎng)基(2x YT)中30℃溫育18小時(shí)，收獲細(xì)胞，用于水解N-乙酰-D-色氨酸。
從5ml培養(yǎng)基溶液制備大腸桿菌細(xì)胞，將其置于10ml含300mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)和15％N-乙酰-DL-色氨酸的反應(yīng)液中，25℃攪拌溫育24小時(shí)。用含有野生型pSL-ADD6的大腸桿菌HB101菌株作為對(duì)照。野生型的產(chǎn)率約為15％，含有2個(gè)氨基酸取代的突變體3AD-0013和含有3個(gè)氨基酸取代的突變體3AD-0089的產(chǎn)率分別為大約30％和大約80％?？梢?jiàn)，實(shí)施例15所得第三代突變體，在水解較高濃度N-乙酰-DL-色氨酸時(shí)有更高的處理能力(processibility)。
實(shí)施例19純化野生型D-氨基?；笇⒑袛y帶野生型D-氨基?；妇幋aDNA的質(zhì)粒pSL-ADD6的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體接種在液體LB培養(yǎng)基中，30℃溫育過(guò)夜。然后將大腸桿菌細(xì)胞接種在培養(yǎng)基(2x YT)中，30℃溫育過(guò)夜。離心收集細(xì)胞，所得細(xì)胞在含有100mM磷酸緩沖液(pH8.0)，0.02％2-巰基乙醇和2mM苯甲烷磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的混合液中懸浮。然后將細(xì)胞用beadbeater(Biospec)破碎，經(jīng)離心去除細(xì)胞殘?jiān)玫綗o(wú)細(xì)胞提取物，向其中加入硫酸魚(yú)精蛋白。提取物經(jīng)離心去除核酸。加入硫酸銨至30％飽和。將混合物加載到已經(jīng)用含30％硫酸銨的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(含10mM的磷酸緩沖液(pH8.0)，0.01％2-巰基乙醇和10％甘油)平衡的phenyl-Sepharose HP柱(2.6cm×10cm)中，用30％至0％的硫酸銨梯度進(jìn)行洗脫，在一個(gè)級(jí)分中檢測(cè)到樣品。D-氨基?；富钚杂迷撎荻认疵摚厥障疵摰姆寮?jí)分并進(jìn)行超濾濃縮。
濃縮的酶溶液在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中透析后，見(jiàn)所得溶液加載到用相同緩沖液平衡的Mono-Q柱(1.6cm×10cm)中，用0至0.5mM的氯化鈉梯度洗脫，回收活性級(jí)分，并進(jìn)行超濾濃縮，得到濃縮的酶溶液。
純化的酶的特異性活性為528U/mg。
實(shí)施例20純化突變型D-氨基?；窤154-0043(含有氨基酸取代A154V)用實(shí)施例19所述方法，將從含有質(zhì)粒pSL-AD07的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中純化突變型D-氨基?；窤154-0043，該質(zhì)粒含有編碼突變型D-氨基?；窤154-0043的DNA。
純化的酶的特異性活性為758U/mg。
實(shí)施例21純化突變型D-氨基?；窶347-0133(含有氨基酸取代M347A)用實(shí)施例19所述方法，從含有質(zhì)粒pSL-AD08的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中純化突變型D-氨基?；窶347-0133，該質(zhì)粒含有編碼突變型D-氨基?；窶347-0133的DNA。
純化的酶的特異性活性為1099U/mg。
實(shí)施例22純化突變型D-氨基?；窻374-0017(含有氨基酸取代R374F)用實(shí)施例19所述方法，從含有質(zhì)粒pSL-AD09的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中純化突變型D-氨基?；窻374-0017，該質(zhì)粒含有編碼突變型D-氨基酰化酶R374-0017的DNA。
純化的酶的特異性活性為855U/mg。
實(shí)施例23純化突變型D-氨基?；?AD-0089(含有氨基酸取代A154V/M347A/R374F)用實(shí)施例19中所述方法，從含有質(zhì)粒pSL-AD10的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中純化突變型D-氨基?；?AD-0089，該質(zhì)粒含有編碼突變型D-氨基?；?AD-0089的DNA。
純化的酶在純度約70％時(shí)的特異性活性為324U/mg。
實(shí)施例24檢測(cè)突變型D-氨基?；傅腘-乙酰-D-色氨酸和N-乙酰-L-色氨酸抑制作用檢測(cè)實(shí)施例20-23所得突變型D-氨基?；傅腘-乙酰-D-色氨酸和N-乙酰-L-色氨酸抑制作用。N-乙酰-D-色氨酸和N-乙酰-L-色氨酸的反應(yīng)速率常數(shù)按照“Lectures for Biochemical Experiments 21Introduction toExperimental Approach to Enzyme Kinetics”和“Basic Experimental Methods forProteins and Enzymes，第2版”所述進(jìn)行。米氏常數(shù)用Km來(lái)代表，最大反應(yīng)速率用Vmax代表，抑制常數(shù)用Ki代表，過(guò)量的底物對(duì)反應(yīng)的抑制常數(shù)用Ks’表示，Km和Vmax通過(guò)Lineweaver-Burk倒推作圖(reciprocal plot)獲得，Ki通過(guò)二階作圖(second-order plot)(Royer)得出，Ks’通過(guò)[S]-1/V作圖確定，結(jié)果見(jiàn)表4。
結(jié)果證實(shí)，使用任一種突變型D-氨基酰化酶進(jìn)行反應(yīng)，N-乙酰-D-色氨酸的底物抑制作用和N-乙酰-L-色氨酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用都減弱了。
特別的，當(dāng)應(yīng)用3AD-0089(含有氨基酸取代A154V/M347A/R374F)時(shí)，在99mM的N-乙酰-D-色氨酸存在的情況下，底物抑制作用甚至檢測(cè)不到，在89mM的N-乙酰-L-色氨酸存在的情況下，競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用也檢測(cè)不到，可見(jiàn)這些突變對(duì)抑制作用的減弱起到了很大的作用。
表4

a)30℃，pH7.5的測(cè)量值b)N-乙酰-D-色氨酸的反應(yīng)常數(shù)c)N-乙酰-L-色氨酸的反應(yīng)常數(shù)d)N.D.未檢測(cè)實(shí)施例25使用野生型和突變型D-氨基?；笍腘-乙酰-LD-色氨酸應(yīng)得到D-色氨酸含有5個(gè)單位的無(wú)細(xì)胞提取物(在實(shí)施例19或23所述酶純化步驟中獲得)的0.5ml反應(yīng)液與12％，15％，17％，20％或22％N-乙酰-DL-色氨酸，以及300mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)在30℃攪拌溫育24小時(shí)。結(jié)果見(jiàn)表5。使用野生型時(shí)，在任意的底物濃度下，D-色氨酸的產(chǎn)率都低于10％，而當(dāng)使用突變型3AD-0089時(shí)，在底物濃度高達(dá)17％情況下，D-色氨酸的產(chǎn)率為80％或更多。而且，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0％時(shí)，這些突變體能以66％的產(chǎn)率產(chǎn)生D-色氨酸，底物濃度為22％時(shí)，D-色氨酸的產(chǎn)率為58％。
表5


a)N-Ac-DL-TrpN-乙酰-DL-色氨酸，D-TrpD-色氨酸b)Wild-type野生型D-氨基?；福?AD-0089突變型D-氨基?；笇?shí)施例26使用含有質(zhì)粒pSL-AD10的重組大腸桿菌從高濃度N-乙酰-DL-色氨酸獲得D-色氨酸，該質(zhì)粒含有編碼突變型D-氨基酰化酶3AD-0089(含有氨基酸取代A154V/M347A/R374F)的DNA用實(shí)施例18所得的表達(dá)突變型D-氨基?；?AD-0089(含有氨基酸取代A154V/M347A/R374F)的質(zhì)粒pSL-AD10轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化體接種在液體LB培養(yǎng)基中，30℃溫育過(guò)夜。然后將大腸桿菌接種在培養(yǎng)基(2x YT)中，30℃溫育18小時(shí)，之后用大腸桿菌培養(yǎng)基溶液水解N-乙酰-D-色氨酸。
含有大腸桿菌培養(yǎng)基溶液和15％N-乙酰-DL-色氨酸的400ml反應(yīng)液在30℃攪拌溫育24小時(shí)。用含有野生型質(zhì)粒pSL-ADD1的大腸桿菌HB101菌株作為對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)圖1，野生型的產(chǎn)率為約4％，而含有質(zhì)粒pSL-AD10的重組大腸桿菌的產(chǎn)率為90％或更高(見(jiàn)圖1)。
實(shí)施例27使用含有質(zhì)粒pSL-AD10的重組大腸桿菌從高濃度N-乙酰-DL-色氨酸得到D-色氨酸，該質(zhì)粒含有編碼突變型D-氨基?；?AD-0089(含有氨基酸取代A154V/M347A/R374F)的DNA-2-使用與實(shí)施例26中相同的方法在20％N-乙酰-DL-色氨酸存在的條件下進(jìn)行水解，結(jié)果見(jiàn)圖2。含有質(zhì)粒pSL-AD10的重組大腸桿菌的產(chǎn)率為90％或更高，該質(zhì)粒含有編碼突變型D-氨基?；?AD-0089(含有氨基酸取代A154V/M347A/R374F)的DNA。所產(chǎn)生的色氨酸的光學(xué)純度用下述的步驟分析將樣品加載到CROWNPAK CR(+)(Daicel化工有限公司)中。然后用HClO4溶液(pH2.0)作為洗脫緩沖液在40℃以1.0ml/min的流速洗脫。檢測(cè)洗脫液在280nm的光密度。D型和L型的滯留時(shí)間分別為16和19分鐘。所產(chǎn)生的色氨酸經(jīng)證實(shí)為D型，因?yàn)槠涔鈱W(xué)純度接近100％e.e?？梢?jiàn)，引入的突變對(duì)立體選擇性沒(méi)有影響(見(jiàn)圖2)。
序列表<110>大賽璐化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社(DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD)<120>D-氨基?；竿蛔凅w<130>D1-A0207<150>JP 2002-372624<151>2002-12-24<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>484<212>PRT<213>反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種(Alcaligenes denitrificans subsp.Xylosoxydans)MI-4<400>1Met Ser Gln Ser Asp Ser Gln Pro Phe Asp Leu Leu Leu Ala Gly Gly1 5 10 15Thr Leu Ile Asp Gly Ser Asn Thr Pro Gly Arg Arg Ala Asp Leu Gly20 25 30Val Arg Gly Asp Arg Ile Ala Ala Ile Gly Asp Leu Ser Asp Ala Ala35 40 45Ala His Thr Arg Val Asp Val Ser Gly Leu Val Val Ala Pro Gly Phe50 55 60Ile Asp Ser His Thr His Asp Asp Asn Tyr Leu Leu Arg Arg Arg Asp65 70 75 80Met Thr Pro Lys Ile Ser Gln Gly Val Thr Thr Val Val Thr Gly Asn85 90 95Cys Gly Ile Ser Leu Ala Pro Leu Ala His Ala Asn Pro Pro Ala Pro100 105 110Leu Asp Leu Leu Asp Glu Gly Gly Ser Tyr Arg Phe Glu Arg Phe Ala115 120 125Asp Tyr Leu Asp Ala Leu Arg Ala Thr Pro Ala Ala Val Asn Ala Ala130 135 140Cys Met Val Gly His Ser Thr Leu Arg Ala Ala Val Met Pro Asp Leu145 150 155 160Gln Arg Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ile Ala Ala Met Arg Asp Leu Ala165 170 175Glu Glu Ala Met Ala Ser Gly Ala Ile Gly Ile Ser Thr Gly Ala Phe
180 185 190Tyr Pro Pro Ala Ala Arg Ala Thr Thr Glu Glu Ile Ile Glu Val Cys195 200 205Arg Pro Leu Ser Ala His Gly Gly Ile Tyr Ala Thr His Met Arg Asp210 215 220Glu Gly Glu His Ile Val Ala Ala Leu Glu Glu Thr Phe Arg Ile Gly225 230 235 240Arg Glu Leu Asp Val Pro Val Val Ile Ser His His Lys Val Met Gly245 250 255Gln Pro Asn Phe Gly Arg Ser Arg Glu Thr Leu Pro Leu Ile Glu Ala260 265 270Ala Met Ala Arg Gln Asp Val Ser Leu Asp Ala Tyr Pro Tyr Val Ala275 280 285Gly Ser Thr Met Leu Lys Gln Asp Arg Val Leu Leu Ala Gly Arg Thr290 295 300Ile Ile Thr Trp Cys Lys Pro Phe Pro Glu Leu Ser Gly Arg Asp Leu305 310 315 320Asp Glu Val Ala Ala Glu Arg Gly Lys Ser Lys Tyr Asp Val Val Pro325 330 335Glu Leu Gln Pro Ala Gly Ala Ile Tyr Phe Met Met Asp Glu Pro Asp340 345 350Val Gln Arg Ile Leu Ala Phe Gly Pro Thr Met Ile Gly Ser Asp Gly355 360 365Leu Pro His Asp Glu Arg Pro His Pro Arg Leu Trp Gly Thr Phe Pro370 375 380Arg Val Leu Gly His Tyr Ala Arg Asp Leu Gly Leu Phe Pro Leu Glu385 390 395 400Thr Ala Val Trp Lys Met Thr Gly Leu Thr Ala Ala Arg Phe Gly Leu405 410 415Ala Gly Arg Gly Gln Leu Gln Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Val Val420 425 430Phe Asp Pro Ala Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Phe Glu His Pro Thr435 440 445Glu Arg Ala Ala Gly Ile His Ser Val Tyr Val Asn Gly Ala Pro Val450 455 460Trp Gln Glu Gln Ala Phe Thr Gly Gln His Ala Gly Arg Val Leu Ala465 470 475 480Arg Thr Ala Ala<210>2<211>1455<212>DNA
<213>反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種(Alcaligenes denitrificans subsp.Xylosoxydans)MI-4<400>2atgtcccaat ccgattccca gcccttcgac ctgctgctcg cgggcggcac cctcatcgac 60ggcagcaaca ccccggggcg gcgcgccgac ctgggcgtgc gcggcgaccg catcgccgcc 120atcggcgatc tgtcggacgc cgccgcgcac acccgggtcg acgtgtcggg cctggtggtc 180gcgcccggct tcatcgactc gcacacccac gacgacaact acctgctcag gcgtcgcgac 240atgacgccca agatctcgca gggcgtcacc acggtggtca cgggcaattg cggcatcagc 300ctggcgccgc tggcgcacgc caacccgccc gcccccctgg acctgctgga cgaaggcggt 360tcttaccgtt tcgagcgctt cgccgactac ctggacgcgt tgcgggccac gccggcggcc 420gtcaacgccg cctgcatggt gggccattca acgctgcgcg ccgcggtcat gccggacttg 480cagcgcgccg ccaccgacga ggaaatcgcg gccatgcggg acctggccga ggaagccatg 540gccagcggcg ccatcggcat ttcgaccggc gccttctacc cgcccgccgc ccgcgccacc 600accgaagaga tcatcgaggt gtgccggccg ctgagcgcgc atggcggcat ctacgccacc 660cacatgcgcg acgaaggcga gcacatcgtg gccgcgctgg aggaaacctt ccgcatcggc 720cgcgagctgg acgtgccggt ggtgatctcg caccacaagg tcatgggcca gcccaatttc 780ggccgctcgc gcgagacgct gccgctgatc gaggccgcca tggcgcgcca ggacgtctcg 840ctggacgcgt atccctacgt ggccggctcc accatgctca agcaggaccg cgtgctgctg 900gccggacgca ccatcatcac ctggtgcaag cccttccccg aactgagcgg gcgcgacctg 960gatgaagtcg cggccgagcg cggcaaatcc aagtacgacg tggtgcccga gctgcagccg1020gccggcgcca tctacttcat gatggacgaa cccgacgtgc agcgcatcct ggcgttcggc1080ccgaccatga tcggctccga cggcctgccg cacgacgagc gcccgcatcc gcgcctgtgg1140ggcaccttcc cgcgggtgct ggggcactat gcgcgcgacc tgggcctgtt cccgctggag1200acggcggtat ggaagatgac cggcctgacc gccgcgcgct tcggcctggc cgggcgcggg1260cagctgcagg ccgggtactt cgccgacctg gtggtgttcg acccggccac ggtggccgat1320accgccacct tcgaacaccc taccgagcgc gccgccggca tccattccgt gtacgtcaac1380ggcgcgccgg tctggcaaga gcaggcgttc accggccagc atgccggccg cgtgctcgca1440cgcacggccg cctga 1455<210>3<211>1455<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的序列<400>3atgtctcaat ctgattcaca accttttgat ttactgttag ctggtggcac actgatcgat 60ggtagtaaca ccccgggccg tcgcgcggac ctgggtgttc gtggcgatcg catcgcagcg 120attggtgact tgagtgatgc tgcggcacat actcgtgtgg acgttagcgg cctggtggta 180gctccaggtt tcatcgattc tcacacccat gacgataact acctgcttcg acgtcgcgac 240atgaccccga aaatctccca gggcgttact accgtggtta ccggtaattg cggcatttca 300
ctggctccgc tggcgcacgc aaacccgccg gcgcctctcg atctgctgga cgaaggtggc 360tcgtaccgtt tcgaacgctt tgctgattat ttagacgcgc tgcgtgcaac tccagccgct 420gtgaacgcgg catgtatggt aggtcatagt accctgcgcg cggctgttat gccagatctg 480cagcgtgcgg caaccgacga agagatcgca gctatgcgcg atctggcgga agaagcaatg 540gcgtccggcg caattggtat ttctactggc gccttctacc cgccagcagc gcgtgctacc 600acggaagaga tcatcgaagt gtgtcgaccg ctgagcgcgc acggtggcat ttacgcaact 660catatgcgtg atgaaggtga acacatcgtt gcagctcttg aggaaacctt tcgcatcggc 720cgtgaactgg atgtgccggt agttatttca catcacaaag tgatgggtca gccaaatttc 780ggccgctcgc gtgaaaccct gccgctcatc gaggccgcaa tggcgcgcca ggacgttagt 840ctggatgctt atccgtacgt ggcgggtagc actatgctga aacaggatcg tgtattactg 900gccggccgca caatcattac ctggtgcaag ccattcccgg aactgtctgg tcgtgatttg 960gacgaagttg cggctgaacg cggcaaatcc aaatacgatg tggttccgga gctgcaacct1020gctggtgcaa tctattttat gatggacgaa ccggatgtac agcgtatcct ggcgttcggc1080ccgactatga ttggttcaga cggccttcca catgatgaac gcccgcaccc gcgtctgtgg1140ggtaccttcc cacgggtact gggccattac gctcgtgacc tcggtctgtt tccgctggaa1200accgcggttt ggaaaatgac tggcttaacc gcagcgcgct tcggtctggc tggccgtggt1260cagctgcagg ccggctactt cgcagatttg gtggtttttg acccggcgac cgtggctgat1320actgctacct tcgagcaccc aactgaacgc gcagcgggta tccattcggt atatgttaac1380ggagctccgg tgtggcaaga acaggcattt actggtcagc atgcaggtcg tgttcttgct1440cgtacagctg cataa 1455<210>4<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>4cttgatcgcc ccgccggaga tttccatg 28<210>5<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>5gattgtaagg gctggcgccg ggctca 26
<210>6<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>6cgtcgtgggt gtgcgagtcg atgaag 26<210>7<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>7catggcttcc tcggcca 17<210>8<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>8gtcatgccgg acttgcag18<210>9<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>9ggttcgtcca tcatgaagta g21<210>10<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>10atccaagtac gacgtggtg 19<210>11<211>49<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>11gtcgaattca tacatgtctc aatcagattc tcaaccattc gacctgctg 49<210>12<211>48<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>12ctgaagcttc tagattatgc agcagtacgt gcaagaacgc ggccggca 48<210>13<211>29
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>13atcgatggta gtaacacccc gggccgtcg29<210>14<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(23)<223>n是指g，a，c或t任意之一<400>14tgcagatctg gcataacagc nnngcgcagg gtac 34<210>15<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<400>15accgctgagc gcgcacggtg gcatttacgc aa32<210>16<211>38<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列<220>
<221>misc_feature<222>(24)..(26)<223>n是指g，a，c或t任意之一<400>16cgctgtacat ccggttcgtc catnnnaaaa tagattgc 38<210>17<211>41<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的引物序列<220>
<221>misc_feature<222>(28)..(30)<223>n是指g，a，c或t任意之一<400>17gaaggtaccc cacagacgcg ggtgcggnnn ttcatcatgt g 4權(quán)利要求
1.具有在N-乙酰-D-色氨酸存在的情況下生產(chǎn)D-色氨酸的活性的多肽，其含有(a)SEQ ID NO1所示氨基酸序列，其中至少一個(gè)選自位點(diǎn)154的丙氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸，位點(diǎn)374的精氨酸中的氨基酸殘基被取代；或者(b)(a)所述氨基酸序列，其中位點(diǎn)154，347，374之外的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入。
2.權(quán)利要求1所述多肽，包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列，其中含有任何一個(gè)選自下組的氨基酸取代(A)位點(diǎn)154的丙氨酸被選自纈氨酸，半胱氨酸和蘇氨酸中的任何一個(gè)氨基酸取代；(B)位點(diǎn)347的甲硫氨酸被選自甘氨酸，谷氨酰胺，絲氨酸，天冬酰胺，丙氨酸，異亮氨酸和脯氨酸中的任何一個(gè)氨基酸取代；和(C)位點(diǎn)374的精氨酸被選自苯丙氨酸，賴氨酸，亮氨酸，酪氨酸，組氨酸，異亮氨酸和色氨酸中的任何一個(gè)氨基酸取代。
3.權(quán)利要求1所述多肽，包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列，其中選自位點(diǎn)154的丙氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸和位點(diǎn)374的精氨酸的兩個(gè)或更多氨基酸殘基被取代。
4.權(quán)利要求3所述多肽，包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列，其中含有位點(diǎn)154的丙氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸，位點(diǎn)374的精氨酸的氨基酸取代。
5.權(quán)利要求1所述多肽，其以120g/l N-乙酰-DL-色氨酸為底物，特異性水解N-乙酰-D-色氨酸，因此以80％或更高產(chǎn)率產(chǎn)生D-色氨酸。
6.如權(quán)利要求1所述多肽，具有在N-乙酰-D-色氨酸和N-乙酰-L-色氨酸存在的情況下產(chǎn)生D-色氨酸的活性。
7.一種包含含有下述任意突變的SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽(1)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，和位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼幔?2)位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?，和位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸；(3)位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?，和位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?4)位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚臀稽c(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸；(5)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?，和位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?6)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚臀稽c(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸；(7)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?，和位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸；(8)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?，和位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?9)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，和位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸；(10)位點(diǎn)154的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，位點(diǎn)347的甲硫氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，和位點(diǎn)374的精氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?br> 8.編碼權(quán)利要求1或7所述多肽的多核苷酸。
9.如權(quán)利要求8所述多核苷酸，包含SEQ ID NO3所示核苷酸序列，其含有選自下組的核苷酸取代(a)位點(diǎn)460到462的核苷酸序列GCG被選自GTA，TGC和ACA的一個(gè)核苷酸序列取代；(b)位點(diǎn)1039到1041的核苷酸序列ATG被選自GGT，CAA，TCT，AAC，GCA，ATA，和CCC的一個(gè)核苷酸序列取代，和；(c)位點(diǎn)1120到1122的核苷酸序列CGC被選自TTT，AAA，CTT，TAT，CAC，ATA和TGG的一個(gè)核苷酸序列取代。
10.權(quán)利要求8所述多核苷酸，包含SEQ ID NO3所示核苷酸序列，其在選自位點(diǎn)460到462的核苷酸序列GCG，位點(diǎn)1039到1041的核苷酸序列ATG，位點(diǎn)1120到1122的核苷酸序列CGC的兩個(gè)或更多個(gè)區(qū)域包含核苷酸取代。
11.權(quán)利要求10所述多核苷酸，包含SEQ ID NO3所示核苷酸序列，其中含有位點(diǎn)460到462的核苷酸序列GCG，位點(diǎn)1039到1041的核苷酸序列ATG，位點(diǎn)1120到1122的核苷酸序列CGC的核苷酸取代。
12.包含SEQ ID NO3所示核苷酸序列的多核苷酸。
13.含有權(quán)利要求8所述多核苷酸作為插入子的載體。
14.包含權(quán)利要求13所述載體的轉(zhuǎn)化體。
15.權(quán)利要求14所述轉(zhuǎn)化體，所述轉(zhuǎn)化體是帶有權(quán)利要求9所述多核苷酸的大腸桿菌。
16.生產(chǎn)權(quán)利要求1或7所述多肽的方法，其含有培養(yǎng)權(quán)利要求14所述轉(zhuǎn)化體。
17.一種生產(chǎn)D-氨基酸的方法，含有將N-?；?DL-氨基酸與選自下組的至少一種具有酶活性的物質(zhì)接觸(a)權(quán)利要求1或7所述多肽；(b)權(quán)利要求14所述轉(zhuǎn)化體，和(c)(b)所述轉(zhuǎn)化體的加工產(chǎn)物；并且回收所產(chǎn)生的D-氨基酸。
18.如權(quán)利要求17所述生產(chǎn)方法，所述N-?；?DL-氨基酸是N-?；?DL-色氨酸。
19.權(quán)利要求18所述生產(chǎn)方法，所述N-酰基-DL-色氨酸是N-乙酰-DL-色氨酸；
20.權(quán)利要求19所述生產(chǎn)方法，所述N-乙酰-DL-色氨酸濃度為120g/l或更高。
21.權(quán)利要求8所述多核苷酸，包含SEQ ID NO2所示核苷酸序列，其中包含選自下組的核苷酸取代(a)位點(diǎn)460到462的核苷酸序列GCG被選自GTA，TGC和ACA的核苷酸序列取代；(b)位點(diǎn)1039到1041的核苷酸序列ATG被選自GGT，CAA，TCT，AAC，GCA，ATA，和CCC的核苷酸序列取代，并且；(c)位點(diǎn)1120到1122的核苷酸序列CGC被選自TTT，AAA，CTT，TAT，CAC，ATA和TGG的核苷酸序列取代。
22.權(quán)利要求8所述多核苷酸，包含SEQ ID NO2所示核苷酸序列，其在選自包含位點(diǎn)460到462的核苷酸序列GCG，位點(diǎn)1039到1041的核苷酸序列ATG，位點(diǎn)1120到1122的核苷酸序列CGC的兩個(gè)或更多個(gè)區(qū)域包含核苷酸取代。
23.權(quán)利要求22所述多核苷酸，包含SEQ ID NO2所示核苷酸序列，其中含有位點(diǎn)460到462的核苷酸序列GCG，位點(diǎn)1039到1041的核苷酸序列ATG，位點(diǎn)1120到1122的核苷酸序列CGC的核苷酸取代。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種突變型D－氨基酰化酶及其應(yīng)用。該突變型D－氨基?；覆蝗菀妆坏孜锼种撇⒑衼?lái)自反硝化產(chǎn)堿菌木糖亞種MT－4菌株的D－氨基酰化酶的氨基酸序列，其特定位點(diǎn)的氨基酸殘基被修飾。本發(fā)明突變體能抵抗底物的抑制作用并具有較高的反應(yīng)特異性。本發(fā)明能夠利用高濃度N－乙酰－DL－氨基酸作為底物以高產(chǎn)率生產(chǎn)D－氨基酸。本發(fā)明突變體尤其可用于生產(chǎn)D－色氨酸。
文檔編號(hào)C12N9/80GK1618801SQ20031012496
公開(kāi)日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2003年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月24日
發(fā)明者中島賢則, 山本浩明 申請(qǐng)人:大賽璐化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社