專利名稱：具有形態(tài)形成活性和促進(jìn)生長活性的新化學(xué)物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由微生物、其衍生物制得的新的類似維生素的活性物質(zhì)，并涉及其制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
迄今為止已知，使用傳統(tǒng)合成培養(yǎng)基在室內(nèi)培養(yǎng)大型綠藻，如石莼科(Ulvaceae)和礁膜科(Monostromataceae)綠藻的過程中，隨著純化程度的提高，藻類可降解為纖維性或單細(xì)胞狀態(tài)(L.Provasoli，Ulva.Biol.Bull.，1958，114，375；M.Tatewaki，L.Provasoli和I.J.Pintner，J.Phycol.，1983，19，409)。還已知，向已失去形態(tài)的藻類中加入新鮮海水、土壤提取物、紅藻提取物、褐藻提取物或一些種類的海洋微生物培養(yǎng)液可使其恢復(fù)葉狀體或促進(jìn)生長(M.Tatewaki，L.Provasoli和I.J.Pintner，J.Phycol.，1983，19，409)。但是，還未發(fā)現(xiàn)這些提取物的活性成分及其類似維生素的活性物質(zhì)。因此，使用室內(nèi)無菌培養(yǎng)的大型綠藻，例如石莼科和礁膜科綠藻一直很難進(jìn)行長期的生理和生態(tài)學(xué)研究、培養(yǎng)或保存。

發(fā)明內(nèi)容
如果僅使用由已知成分組成的培養(yǎng)基就可長期無菌培養(yǎng)海洋大型綠藻，則此項(xiàng)技術(shù)可作為實(shí)際的培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于，例如，制備、維持和處理被培養(yǎng)物種(如食用礁膜科)的種子和幼苗，或用于保存綠藻的種子，此外還可對目標(biāo)藻類進(jìn)行生理和生態(tài)學(xué)研究。基于這種觀點(diǎn)，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了誘導(dǎo)海洋大型綠藻重建形態(tài)和促進(jìn)生長的微生物(JP-A-2003-189845)。但是，由這種微生物制得的活性成分和類似維生素的活性物質(zhì)還屬未知。
本發(fā)明的目的是提供上述的類似維生素的新活性物質(zhì)及其衍生物。
如上所述，本發(fā)明者找到了新的活性成分。結(jié)果，本發(fā)明者從YM-2-23株的培養(yǎng)液中分離出了活性極強(qiáng)的活性物質(zhì)(最初收錄在高級工業(yè)科學(xué)和技術(shù)國家研究所(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本))的International Patent Organism Depositary上，日期為2001年8月20日，登記號FERM BP-8417(于2003年6月25日接受按照布達(dá)佩斯條約將其由最初收錄處轉(zhuǎn)移收錄的請求))，Tenacibaculum屬YM-1-69株(最初收錄在National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)的International Patent OrganismDepositary上，日期為2001年8月20日，登記號FERM BP-8418(于2003年6月25日接受按照布達(dá)佩斯條約將其由最初收錄處轉(zhuǎn)移收錄的請求))，和與上述菌株類似的菌株，并發(fā)現(xiàn)這些化合物為新物質(zhì)。這樣就完成了本發(fā)明。至今為止，已報道類胡蘿卜素類似物，如番茄紅素和玉米黃質(zhì)是由YM-2-23株和/或黃桿菌屬、Zobellia屬或與YM-1-69株類似的Tenacibaculum屬制得的物質(zhì)。但是，此前并沒有成功的實(shí)施例，可分離此種可促進(jìn)大型藻類生長或控制其形態(tài)的化合物。因此，這是世界上對其進(jìn)行的第一次報導(dǎo)。
也就是，本發(fā)明包括下列發(fā)明。
1.一種新化學(xué)物質(zhì)1，其具有下列物理化學(xué)性質(zhì)(i)物質(zhì)顏色無色(ii)分子量457(iii)分子式C24H31N3O4S質(zhì)譜分析FABMSm/z 456[M-H]-(

圖1)高分辨質(zhì)譜實(shí)測值456.1960[M-H]-計(jì)算值456.193(C24H30N3O4S)(iv)核磁共振信號1)1H-NMR(D2O-20mM Na2HPO4(pH 9)，750MHz)(圖2)δppm 0.818(3H，s)，0.837(3H，s)，0.882(3H，s)，0.960(1H，m)，1.058(1H，m)，1.167(1H，m)，1.326(3H，s)，1.37(1H，m)，1.38(1H，m)，1.40(1H，m)，1.58(1H，m)，1.61(2H，m)，1.52(1H，br d，J＝13Hz)，1.76(1H，br d，J＝14Hz)，2.024(1H，m)，2.181(1H，dd，J＝4，14Hz)，2.291(1H，dd，J＝14，16.5Hz)，7.698(1H，d，J＝7.5Hz)，7.845(1H，d，J＝7.5Hz)2)13C-NMR(D2O-20mM Na2HPO4(pH 9)，125MHz)(圖3)δppm 15.236(q)，19.037(t)，20.287(t)，20.955(q)，21.835(q)，25.987(t)，33.381(s)，33.636(q)，37.308(s)，39.590(t)，41.199(t)，42.346(t)，52.769(d)，56.381(d)，79.096(s)，114.965(s)，124.399(d)，139.004(s)，141.232(d)，150.282(s)，152.656(s)，172.081(s)，173.538(s)，174.661(s)。
2.一種新化學(xué)物質(zhì)2，其具有下列物理化學(xué)性質(zhì)(i)物質(zhì)顏色無色(ii)核磁共振信號1H-NMR(D2O-20mM Na2HPO4(pH 9)，500MHz)(圖4)δppm 0.815(3H，s)，0.834(3H，s)，0.877(3H，s)，0.949(1H，m)，1.048(1H，m)，1.163(1H，m)，1.297(3H，s)，1.35-1.40(3H，m)，1.52-1.63(4H，m)，1.753(1H，br d，J＝14Hz)，2.012(1H，m)，2.1 58(1H，m)，2.299(1H，m)，7.646(1H，d，J＝8.0Hz)，7.769(1H，d，J＝8.0Hz)3.一種制備新化學(xué)物質(zhì)1或2的方法，其中在培養(yǎng)基中培養(yǎng)可制備根據(jù)第1項(xiàng)的新化學(xué)物質(zhì)1的微生物，或在培養(yǎng)基中培養(yǎng)可制備根據(jù)第2項(xiàng)的新化學(xué)物質(zhì)2的微生物，新化學(xué)物質(zhì)1或2在培養(yǎng)中產(chǎn)生并累積，并回收產(chǎn)生和累積的新化學(xué)物質(zhì)1或2。
4.根據(jù)第3項(xiàng)的制備方法，其中微生物為YM-2-23株(FERMBP-8417)，Tenacibaculum屬YM-1-69株(FERM BP-8418)，或其類似的菌株。
5.海藻培養(yǎng)基，其包括作為活性成分的根據(jù)第1項(xiàng)的新化學(xué)物質(zhì)1，或作為活性成分的根據(jù)第2項(xiàng)的新化學(xué)物質(zhì)2。
6.一種新化學(xué)物質(zhì)1的單甲基化、二甲基化或三甲基化衍生物，其通過用三甲基甲硅烷基重氮甲烷處理根據(jù)第1項(xiàng)的新化學(xué)物質(zhì)1而獲得。
7.一種化合物或其衍生物，其通過用硼氫化鈉處理根據(jù)第6項(xiàng)的三甲基化衍生物而獲得。
下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
可使用微生物制備根據(jù)本發(fā)明的新化學(xué)物質(zhì)1或2。用于制備根據(jù)本發(fā)明的新化學(xué)物質(zhì)的微生物并不受特別限制，只要其能夠制備這種化學(xué)物質(zhì)即可。其例子包括，屬于噬纖維菌屬-黃桿菌屬-類桿菌(cytophaga-Flavoba-Cterium-Bacteriodes)復(fù)合體的菌株，例如黃桿菌屬、Zobellia，或Tenacubaculum及其變體。其具體例子為YM-2-23株(FERM BP-8417)，Tenacibaculum屬YM-1-69株(FERM BP-8418)，及其變體。除了YM-1-69或YM-2-23株，還可使用其類似的菌株?！癥M-1-69的類似菌株”的例子包括這樣的菌株具有形成葉狀體或促進(jìn)海洋大型綠藻生長的活性，且在16S rRNA基因中具有V3區(qū)，而代表該16S rRNA基因的核苷酸序列中85％或更大部分，且優(yōu)選95％或更大部分同源于SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列，或在gyrB基因中具有V3區(qū)，而代表該gyrB基因的核苷酸序列中72％或更大部分，且優(yōu)選95％或更大部分同源于SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列。“YM-2-23的類似菌株”的例子包括這樣的菌株其顯示有形成葉狀體或促進(jìn)海洋大型綠藻生長的活性，且在16S rRNA基因中具有V3區(qū)，而代表該16S rRNA基因的核苷酸序列中85％或更大部分，且優(yōu)選95％或更大部分同源于SEQ ID NO2中所示的核苷酸序列，或在gyrB基因中具有V3區(qū)，而代表該gyrB基因的核苷酸序列中72％或更大部分，優(yōu)選80％或更大部分，更優(yōu)選95％或更大部分同源于SEQ ID NO4中所示的核苷酸序列。
“YM-1-69的類似菌株”和“YM-2-23的類似菌株”的例子包括YM2-10(MBIC 04671)、YM2-11(MBIC 04672)、YM2-12(MBIC04673)、YM2-13(MBIC 04674)、YM1-66(MBIC 04663)、YM2-24(MBIC 04684)、YM1-51(MBIC 04662)、Zobellia uliginosa(ATCC14397)、YM1-11(MBIC 04693)、T-588(MBIC 05930)、YM2-22(MBIC04682)、YM2-27(MBIC 04687)、YM2-6(MBIC 04669)、YM1-68(MBIC 04664)、YM1-38(MBIC 04661)、YM2-4(MBIC 04667)、YM2-5(MBIC 04668)、YM2-7(MBIC 04670)、YM2-21(MBIC04681)、YM2-1(MBIC 04666)、T-565(MBIC 05877)、T-424(MBIC05876)、噬細(xì)胞菌屬UP7(MBIC 01484)、T-551(MBIC 05929)、Pedobacter heparinus(IFO 12017)、T-561(MBIC 05879)、海水環(huán)狀桿菌(Cyclobacterium marinum)(LMG 13164)、噬細(xì)胞菌屬(MBIC01539)、噬細(xì)胞菌屬(MBIC 01599)，和Chitinophaga pinensis(DSM2588)。
對于上述菌株，標(biāo)記為“ MBIC”的菌株可獲得自MarineBiotechnology Institute Culture Collection(MBIC)(3-75-1 Heita，釜石，Iwate，日本)(http//seasquirt.mbio.co.jp/mbic/index.php？page＝top)。標(biāo)記為“IFO”的菌株可獲得自Institute for Fermentation，大阪(IFO)(17-85，Juso-Honmachi 2-chome Ydogawa-ku，大阪，日本)。標(biāo)記為“ATCC”的菌株可獲得自American Type Culture Collection(ATCC)(12301Parklawn Drive，Rockville，馬里蘭，20852，美國)。標(biāo)記為“DSM”的菌株可獲得自Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)(Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，德國)。標(biāo)記為“LMG”的菌株可獲得自BCCMTM/LMGBateria Collection(Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms，Laboratorium voor Microbiologie，Universiteit Gent(RUG)，K.L.Ledegancksfaat 35，B-9000 Gent，布魯塞爾，比利時)。
上述的類似菌株中，特別優(yōu)選的是其16S rRNA基因和/或gyrB基因中，V3區(qū)的核苷酸序列與YM-1-69或YM-2-23株的相應(yīng)核苷酸序列相同的菌株。
通常將培養(yǎng)海洋細(xì)菌的一般培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于培養(yǎng)上述微生物。可以使用合成或天然的培養(yǎng)基，只要其包括足夠量的微生物可吸收的碳源、氮源、無機(jī)物質(zhì)等物質(zhì)即可。
碳源的例子包括葡萄糖、淀粉、糊精、甘露糖、果糖、蔗糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖醇和糖漿。其可單獨(dú)或結(jié)合使用。此外，取決于菌株的吸收能力，還可使用糖類、醇類、有機(jī)酸等。
氮源的例子包括氯化銨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鈉、尿素、胨、肉汁、酵母抽提物、干酵母、玉米漿、大豆粉和酪蛋白氨基酸。其可單獨(dú)或結(jié)合使用。
此外，還可根據(jù)需要加入無機(jī)鹽，例如氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、碳酸鈣、磷酸二氫鉀、八水合磷酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣、硫酸錳、硫酸鋅或硫酸銅。
可加入足量的促進(jìn)所用菌株生長或促進(jìn)本發(fā)明化學(xué)物質(zhì)的制備的微量元素(如，糖類、氨基酸或無機(jī)鹽)。
液體培養(yǎng)是最有效的技術(shù)，適宜的培養(yǎng)溫度約30℃，培養(yǎng)基的pH水平通常為7-9，且優(yōu)選7.5-8。使用氫氧化鈉、鹽酸水溶液等調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH水平。
當(dāng)液體培養(yǎng)進(jìn)行1-4天時，新化學(xué)物質(zhì)1或2在培養(yǎng)液和菌株中產(chǎn)生并累積。當(dāng)培養(yǎng)產(chǎn)物中產(chǎn)生的新化學(xué)物質(zhì)的量達(dá)到最大水平時優(yōu)選終止培養(yǎng)。最優(yōu)選在培養(yǎng)開始3天后終止培養(yǎng)。
根據(jù)從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離和純化微生物代謝產(chǎn)物的一般技術(shù)，從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離和純化新化學(xué)物質(zhì)1或2。其一個實(shí)施例中，對培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行過濾或離心以從菌株中分離出培養(yǎng)物濾液，并借助于，例如甲醇水溶液或乙腈水溶液提取菌株。之后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或其它方式從提取物中減壓除去有機(jī)溶劑，將此提取物和培養(yǎng)物濾液結(jié)合起來，使所得物質(zhì)在聚苯乙烯等吸收劑(如，苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)上進(jìn)行吸附。漂洗被吸附的活性物質(zhì)使其脫鹽，并借助于，例如甲醇水溶液或乙腈水溶液對該活性物質(zhì)進(jìn)行洗脫。采用凍干法等方法減壓濃縮洗脫液，使用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法或高效液相色譜法，通過色譜法獲得新化學(xué)物質(zhì)1或2。新化學(xué)物質(zhì)2為非常不穩(wěn)定的化合物。將新化學(xué)物質(zhì)2放置在強(qiáng)堿性水溶液，例如氫氧化鈉水溶液和氨水溶液中時，其逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾禄瘜W(xué)物質(zhì)1。新化學(xué)物質(zhì)1為非常穩(wěn)定的化合物。
用足夠的甲基化試劑(如，三甲基甲硅烷基重氮甲烷)處理新化學(xué)物質(zhì)1可獲得新化學(xué)物質(zhì)1的單甲基化、二甲基化或三甲基化衍生物。可調(diào)節(jié)三甲基甲硅烷基重氮甲烷與新化學(xué)物質(zhì)1的摩爾比，或者可選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件(如，反應(yīng)溫度或pH水平的設(shè)定，或在二甲基氨基硫三氟化物(DAST)存在下反應(yīng))，從而選擇性地獲得單甲基化、二甲基化或三甲基化衍生物。
此外，具有下述物理化學(xué)性質(zhì)的Me1H3可通過用硼氫化鈉處理上述三甲基化衍生物而獲得。而且，改變反應(yīng)溶劑的極性和反應(yīng)溫度可獲得化合物Me1H1，其為Me1H3進(jìn)一步還原所得的衍生物。甲基化衍生物Me1H1Me或類似的烷基化衍生物可在強(qiáng)堿條件下，由RI(其中R代表C1-6烷基)所代表的烷基碘(如，碘代甲烷)與Me1H1進(jìn)行作用獲得。有關(guān)此反應(yīng)及其產(chǎn)物的信息在，例如，鑒定新化學(xué)物質(zhì)1或2時特別有用。
根據(jù)本發(fā)明的新化學(xué)物質(zhì)1和2可用作海藻培養(yǎng)基的活性成分。其可單獨(dú)或結(jié)合使用。
上述培養(yǎng)海藻的培養(yǎng)基優(yōu)選用于培養(yǎng)海洋大型綠藻。海洋大型綠藻的一種形式為屬于石莼亞目的海洋藻類，其例子包括綠藻，例如，礁膜科和石莼科。屬于礁膜科的海藻的具體例子包括礁膜(monostromanitidum)、尖種礁膜(Monostroma oxyspermum)和袋礁膜(Monostromaangicavo)。屬于石莼科的海藻的具體例子包括扁滸苔、腸滸苔、緣管滸苔、蠣萊和孔石莼。
培養(yǎng)海洋大型綠藻的培養(yǎng)基可與常用培養(yǎng)技術(shù)中所用的、使海洋大型綠藻不利地成為單細(xì)胞的培養(yǎng)基相同，只是該培養(yǎng)基中要包括新化學(xué)物質(zhì)1和/或2作為活性成分。例如，可使用ASP7培養(yǎng)基、PES培養(yǎng)基、PESI培養(yǎng)基，或使用只進(jìn)行了殺菌的海水。新化學(xué)物質(zhì)1和/或2在培養(yǎng)基中的有效濃度并不受特別限制，只要可誘導(dǎo)葉狀體形成即可。優(yōu)選10-12-10-13μg/ml。
培養(yǎng)溫度不受特別限制，只要海洋大型綠藻能在其中存活即可。溫度適當(dāng)為約15℃-25℃。
附圖簡述圖1為新化學(xué)物質(zhì)1的質(zhì)譜圖。
圖2為新化學(xué)物質(zhì)1的1H-NMR譜圖。
圖3為新化學(xué)物質(zhì)1的13C-NMR譜圖。
圖4為新化學(xué)物質(zhì)2的1H-NMR譜圖。
圖5為實(shí)施例1的試驗(yàn)中未加入試樣時，培養(yǎng)開始5天后，培養(yǎng)的尖種礁膜細(xì)胞的照片。
圖6為實(shí)施例1的試驗(yàn)中已加入試樣時，培養(yǎng)開始5天后，培養(yǎng)的尖種礁膜細(xì)胞的照片。
圖7為Me1的1H-NMR譜圖。
圖8為Me1的13C-NMR譜圖。
圖9為Me1B的1H-NMR譜圖。
圖10為Me1H3的1H-NMR譜圖。
圖11為Me1H1的1H-NMR譜圖。
圖12為Me1H1Me的1H-NMR譜圖。
圖13為實(shí)施例5中，培養(yǎng)開始10天后，7-步稀釋的照片。
圖14為實(shí)施例5中，培養(yǎng)開始10天后，6-步稀釋的照片。
圖15顯示了實(shí)施例7中，使用孔石莼進(jìn)行試驗(yàn)所得的結(jié)果。
圖16顯示了實(shí)施例7中，使用腸滸苔進(jìn)行試驗(yàn)所得的結(jié)果。
圖17為YM-1-69株、YM-2-23株及其類似菌株的gyrB DNA系統(tǒng)樹。
圖18為YM-1-69株、YM-2-23株及其類似菌株的16S rDNA系統(tǒng)樹，以及這些菌株誘導(dǎo)大型綠藻形成形態(tài)的具體活性。
圖19為新化學(xué)物質(zhì)1的部分結(jié)構(gòu)。
圖20為新化學(xué)物質(zhì)1的HMBC光譜分析結(jié)果。
圖21為Me1的部分結(jié)構(gòu)和相對構(gòu)型。
圖22為Me1的HMBC光譜分析結(jié)果。
圖23為Me1H3的光譜分析結(jié)果。
圖24為Me1H3的HMBC光譜分析結(jié)果。
圖25為Me1H1的光譜分析結(jié)果。
圖26為Me1H1的HMBC光譜分析結(jié)果。
圖27為Me1H1Me的光譜分析結(jié)果。
圖28為Me1H1Me的HMBC光譜分析結(jié)果。
本說明書包括日本專利申請?zhí)?002-203608的說明書和/或附圖中公開的部分或全部內(nèi)容，該專利申請為本申請的優(yōu)先權(quán)文件。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式下面將參考下列實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限定于這些實(shí)施例中。
參考實(shí)施例1微生物的分離按照下述方式分離本發(fā)明中使用的菌株。將無菌海水(10ml)加入到約1g收集的新鮮海藻中，并將所得物質(zhì)劇烈旋轉(zhuǎn)約1分鐘。使用無菌海水將上層清液進(jìn)一步稀釋10倍和100倍，將100μL該物質(zhì)分注到1/10的海瓊脂板上，并使用無菌Conradi棒將其分布于整個板上。該板在室溫下放置2-3天，將生長的、顯示出黃-紅色的菌落單獨(dú)接種在單獨(dú)的海瓊脂板上，并不斷進(jìn)行接種直至獲得單一的菌落。將ASP7培養(yǎng)基(1或2ml)分注在24-孔或48-孔微板上，并向每個孔中加入約20個單細(xì)胞尖種礁膜細(xì)胞。使用無菌接種環(huán)或類似物，每次直接將各個分離菌株的菌落接種在2個孔中。該板在19-22℃下培養(yǎng)5天，每天由14小時的光照和10小時的黑暗組成，在倒置顯微鏡下觀察到尖種礁膜葉狀體的形成。并按照上述方法對形成葉狀體的菌株進(jìn)行另外的測試，以確定葉狀體的形成。經(jīng)上述篩選步驟，

工業(yè)適用性本發(fā)明的呋喃并異喹啉衍生物具有優(yōu)異的磷酸二酯酶IV-抑制作用，并且作為炎性疾病、特應(yīng)性皮炎、過敏性鼻炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性疾病、抑郁癥、阿爾茨海默癡呆、骨質(zhì)疏松、記憶紊亂、糖尿病、動脈粥樣硬化等的預(yù)防和/或治療藥是有用的。
表2

+陽性，-陰性根據(jù)表1和2所示的結(jié)果，YM-1-69株鑒定為Tenacibaculum屬，YM-2-23株鑒定為噬纖維菌屬-黃桿菌屬-擬桿菌復(fù)合體。
實(shí)施例1培養(yǎng)尖種礁膜的試驗(yàn)經(jīng)抗菌素等物質(zhì)殺菌處理的尖種礁膜失去了葉狀體形狀，就如在合成培養(yǎng)基，如ASP7培養(yǎng)基中自然觀察到的形狀，而且其基本上變?yōu)閱渭?xì)胞狀。
將改性ASP7培養(yǎng)基(1ml)加至第一排中，再將其0.9ml加至第二排及隨后的48-孔微板中，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)(Iwaki，下文縮寫為“48-MTP”)，將11μl的各個目標(biāo)活性物質(zhì)部分加至第一排中，并取100μl所得物質(zhì)加至下一排中，同時用移液管進(jìn)行充分?jǐn)嚢?。每一部分重?fù)進(jìn)行此步驟8-18次。這樣就可制得8-18系列的10-倍稀釋液。棄去最后一排的剩余物(100μl)。尖種礁膜的培養(yǎng)液稀釋至最終濃度時，作時間60分鐘的條件下，于2L反應(yīng)器中進(jìn)行工作臺規(guī)模的淤漿聚合。

很清楚，當(dāng)使用無常規(guī)固體載體時，形態(tài)仍可接受。
表4*1維生素混合物S3

表5*2 PII金屬

表6*3 S2金屬

實(shí)施例2新化學(xué)物質(zhì)1的分離和純化使用YM-2-23株(FERM BP-8417)作為種菌。使用海水肉汁(37.4g/l，Difco或按照預(yù)定成分將試劑混合起來制得)作為總培養(yǎng)的培養(yǎng)基。30℃下，使用50ml海水肉汁，在100ml錐形燒瓶中振蕩-培養(yǎng)(100rpm)該種菌24小時，全部培養(yǎng)產(chǎn)物再接種至含有450ml培養(yǎng)基的1升帶擋板錐形燒瓶中，并在相同條件下培養(yǎng)24小時。對于該總培養(yǎng)，于130rpm下在分別含有800ml培養(yǎng)基的16個1升帶擋板錐形燒瓶中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，于100rpm下在分別含有450ml培養(yǎng)基的10個1升錐形燒瓶中進(jìn)行另一組振蕩培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過程在30℃下進(jìn)行3天。如此得到的約18升培養(yǎng)液進(jìn)行離心作用。菌株在提取前保存于-20℃下，而培養(yǎng)物濾出液保存于4℃下。由上述4個分別的總培養(yǎng)過程獲得的菌株(約72升)經(jīng)1,200ml 50％乙腈水溶液提取兩次再進(jìn)行濃縮。濃縮物與約72升的培養(yǎng)物濾出液結(jié)合，并使所得物質(zhì)吸附在2,500ml苯乙烯-二乙烯基苯共聚物甲醛系樹脂HP-20(Mitsubishi Chemical Corporation)上，該樹脂用6,000ml 10％乙腈水溶液洗滌脫鹽，并用6,000ml 50％乙腈水溶液洗脫，以獲得可誘導(dǎo)葉狀體形成的部分。使活性部分吸附在Toyopearl DEAE-650(M)(Tosoh)上，用180mM NaCl-20％乙腈洗滌，并用450mM NaCl-20％乙腈水溶液洗脫。洗脫下來的部分經(jīng)減壓濃縮除去乙腈，再使其吸附在500ml甲醛系樹脂HP-20(Mitsubishi Chemical Corporation)上，并用1,000ml 10％乙腈水溶液洗滌脫鹽。這樣，借助于1,000ml 50％乙腈水溶液得到了活性部分。減壓濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，以獲得誘導(dǎo)葉狀體形成的部分。上述培養(yǎng)和分級分離過程重復(fù)兩次(約140升細(xì)菌培養(yǎng)物)并結(jié)合起來。所得物質(zhì)用凝膠過濾色譜(Sephacryl S-100HR，25mm(內(nèi)徑)×1,200mm(長度)，Amersham Bioscience)純化，該色譜使用100mM NaCl-20mM Na2HPO4-20％乙腈(pH 9)水溶液作為流動相，得到了對促進(jìn)葉狀體形成顯示出活性的部分。對所得活性部分進(jìn)行濃縮、脫鹽、凍干、用高效液相色譜(3-ml RESOURCEPRC柱，2根6.4mm(內(nèi)徑)×100mm(長度)的柱子彼此串聯(lián)，Amersham Bioscience)分離，該色譜柱使用14％-22％乙腈-5g(NH4)2CO3/升的水溶液作為流動相、凍干，然后再用高效液相色譜(3-mlRESOURCE PRC柱，2根6.4mm(內(nèi)徑)×100mm(長度)的柱子彼此串聯(lián)，Amersham Bioscience)分離，該色譜柱使用5％-25％乙腈/1％NH3水溶液作為流動相純化。這樣，得到了約140μg根據(jù)本發(fā)明的、具有上述物理化學(xué)性質(zhì)的新化學(xué)物質(zhì)1。
實(shí)施例3新化學(xué)物質(zhì)2的分離和純化已發(fā)現(xiàn)，根據(jù)實(shí)施例2中描述的步驟分離出的新化學(xué)物質(zhì)1是新化學(xué)物質(zhì)2在強(qiáng)堿條件下(由于在最后純化時使用了5％-25％乙腈-1％NH3水溶液)的修飾衍生物。新化學(xué)物質(zhì)1在純化前與新化學(xué)物質(zhì)2一起存在于培養(yǎng)物上層清液中。雖然新化學(xué)物質(zhì)2在中性至弱堿性條件下非常不穩(wěn)定，但堿性條件下形成的新化學(xué)物質(zhì)1相對穩(wěn)定。如果在實(shí)施例2的最后純化步驟中使用高效液相色譜(3-mlRESOURCE PRC柱，2根6.4mm(內(nèi)徑)×100mm(長度)的柱子彼此串聯(lián)，Amersham Bioscience)進(jìn)行分離，且其流動相為17％乙腈-5g(NH4)2CO3+5ml NH3/升的水溶液，則可以得到具有圖4所示的1H-NMR譜圖的化學(xué)物質(zhì)2。
實(shí)施例4新化學(xué)物質(zhì)1的甲基化衍生物及其進(jìn)一步衍生物的制備，以及它們的物理化學(xué)性質(zhì)將新化學(xué)物質(zhì)1(約140μg)溶解在40μl甲醇中，向其中加入160μl苯和100μl三甲基甲硅烷基重氮甲烷(10％，正己烷溶液，由東京KaseiKogyo有限公司制造)，充分?jǐn)嚢柙摶旌衔?，并使所得物質(zhì)在室溫下反應(yīng)2小時。逐漸加入小部分乙酸直至重氮甲烷的黃色消失，使用蒸發(fā)器蒸餾除去溶劑，之后經(jīng)高效液相色譜(TSK凝膠ODS-80Ts，4.6mm(內(nèi)徑)×150mm(長度)，Tosoh)分離，該高效液相色譜使用50％-100％乙腈-水作為流動相。結(jié)果，基本上定量(產(chǎn)率約152μg，99％)得到新化學(xué)物質(zhì)1的三甲基化衍生物(下文中縮寫為“Me1”)。該三甲基衍生物在NMR光譜的溶劑氘代甲醇中，由于氘代甲氧基(-OCD3)逐漸取代一個甲氧基(-OCH3)而成為Me1B。將Me1(約152μg)溶解在200μl甲醇中，冰浴條件下加入1mg硼氫化鈉，并使所得物質(zhì)還原1小時。反應(yīng)溶液經(jīng)高效液相色譜(TSK凝膠ODS-80Ts，4.6mm(內(nèi)徑)×150mm(長度)，Tosoh)分離，該高效液相色譜使用50％-100％乙腈-水作為流動相。結(jié)果，以高產(chǎn)率(產(chǎn)率約140μg，98％)得到Me1的還原衍生物(下文縮寫為“Me1H3”)。將上面獲得的全部Me1H3溶解在400μl干燥的乙醚中，室溫下向其中加入100μl溶于乙醇的硼氫化鈉溶液(20mg/ml)，并使所得物質(zhì)在室溫下反應(yīng)150分鐘。向其中加入飽和氯化鈉水溶液(100μl)，所得物質(zhì)攪拌10分鐘，再使用蒸發(fā)器蒸餾除去溶劑。用流動相為50％-100％乙腈-水的高效液相色譜(TSK凝膠ODS-80Ts，4.6mm(內(nèi)徑)×150mm(長度)，Tosoh)分離反應(yīng)溶液。結(jié)果，基本上定量(產(chǎn)率約123μg，99％)得到高度還原的Me1衍生物(下文縮寫為“Me1H1”)。另外，再將上面獲得的全部Me1H1溶解在400μl干燥的二甲基亞砜中，向其中加入1mg精細(xì)粉碎的氫氧化鈉、40μl碘代甲烷，然后使所得物質(zhì)在室溫下反應(yīng)30分鐘。冰浴條件下加入蒸餾水(500μl)以終止反應(yīng)。此后，再用流動相為50％-100％乙腈-水的高效液相色譜(TSK凝膠ODS-80Ts，4.6mm(內(nèi)徑)×150mm(長度)，Tosoh)分離該反應(yīng)溶液。結(jié)果，基本上定量(產(chǎn)率約135μg，99％)得到高度還原的Me1H1的甲基化衍生物(下文縮寫為“Me1H1Me”)。
如此制得的化合物具有下列物理化學(xué)性質(zhì)。
Me1的物理化學(xué)性質(zhì)1.物質(zhì)顏色無色2.分子量4993.分子式C27H37N3O4S質(zhì)譜分析FABMSm/z 500M+H+高分辨質(zhì)譜實(shí)測值500.2569M+H+計(jì)算值500.2583(C27H38N3O4S)4.核磁共振信號1)1H-NMR(氘代甲醇，500MHz)(圖7)δppm 0.916(3H，s)，0.941(3H，s)，0.973(3H，s)，1.086(1H，ddd，J＝3.5，12.5，13.0Hz)，1.136(1H，dd，J＝2.0，12.0Hz)，1.271(1H，ddd，J＝4.0，13.0，14.0Hz)，1.380(3H，s)，1.47(2H，m)，1.50(1H，m)，1.65(1H，m)，1.69(2H，m)，1.73(1H，m)，1.84(1H，m)，2.130(1H，ddd，J＝3.5，7.0，12.5Hz)，2.34(2H，m)，3.488(3H，s)，3.914(3H，s)，4.034(3H，s)，7.911(1H，d，J＝8.0Hz)，8.258(1H，d，J＝8.0Hz)2)13C-NMR(氘代甲醇，125MHz)(圖8)δppm 15.413(q)，19.559(t)，20.797(t)，20.961(q)，21.981(q)，28.416(t)，33.855(q)，34.164(s)，37.928(s)，40.356(t)，41.722(t)，42.996(t)，52.266(q)，53.255(q)，52.255(q)，53.328(d)，57.432(d)，79.291(s)，120.0(s)，127.392(d)，140.407(d)，141.6(s)，1146.659(s)，149.8(s)，164.761(s)，166.027(s)，167.402(s)
5.溶解度幾乎不溶于水和DMSO，溶解于含水溶劑，如50％-100％甲醇水溶液或50％-100％乙腈水溶液中，幾乎不溶于弱極性有機(jī)溶劑，如己烷或氯仿中。
Me1B的物理化學(xué)性質(zhì)1.物質(zhì)顏色無色2.分子量5023.分子式C27H34D3N3O4S質(zhì)譜FABMSm/z 50M+H+高分辨質(zhì)譜實(shí)測值503.277M+H+計(jì)算值503.2772(C27H35D3N3O4S)4.核磁共振信號1)1H-NMR(氘代甲醇，500MHz)(圖9)δppm 0.916(3H，s)，0.941(3H，s)，0.973(3H，s)，1.086(1H，ddd，J＝3.5，12.5，13.0Hz)，1.136(1H，dd，J＝2.0，12.0Hz)，1.271(1H，ddd，J＝4.0，13.0，14.0Hz)，1.380(3H，s)，1.47(2H，m)，1.50(1H，m)，1.65(1H，m)，1.69(2H，m)，1.73(1H，m)，1.84(1H，m)，2.130(1H，ddd，J＝3.5，7.0，12.5Hz)，2.34(2H，m)，3.488(3H，s)，3.914(3H，s)，7.911(1H，d，J＝8.0Hz)，8.258(1H，d，J＝8.0Hz)5.溶解度幾乎不溶于水和DMSO，溶解于含水溶劑，如50％-100％甲醇水溶液或50％-100％乙腈水溶液中，幾乎不溶于弱極性有機(jī)溶劑，如己烷或氯仿中。
Me1H3的無力化學(xué)性質(zhì)1.物質(zhì)顏色無色2.分子量4713.分子式C26H37N3O3S質(zhì)譜FABMSm/z 4M+H+高分辨質(zhì)譜實(shí)測值472.2630M+H+計(jì)算值472.2634(C26H38N3O3S)4.核磁共振信號1)1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)(圖10)δppm 0.802(3H，s)，0.810(3H，s)，0.885(3H，s)，0.951(1H，m)，1.01 8(1H，m)，1.150(1H，m)，1.254(3H，s)，1.35(1H，m)，1.36(1H，m)，1.37(1H，m)，1.50(1H，m)，1.54(1H，m)，1.57(1H，m)，1.58(1H，m)，1.688(1H，m)，1.984(1H，m)，2.174(2H，br d，J＝8.5Hz)，3.399(3H，s)，3.741(3H，s)，4.570(2H，br d，J＝5.5Hz)，5.495(1H，br t，J＝5.5Hz)，7.587(1H，d，J＝8.0Hz)，7.722(1H，d，J＝8.0Hz)2)13C-NMR(氘代甲醇，基于HMBC(異核多重鍵相關(guān)譜)和HSQC(異核單量子相關(guān)譜)光譜確定化學(xué)位移)δppm 14.2(q)，17.7(t)，19.0(t)，20.0(q)，21.1(q)，26.7(t)，33.0(q)，33.3(s)，36.1(s)，38.3(t)，40.1(t)，41.1(t)，51.2(q)，51.2(d)，52.0(q)，55.2(d)，63.7(t)，76.8(s)，119.2(s)，121.8(d)，134.1(s)，138.3(d)，146.2(s)，159.8(s)，162.8(s)，166.2(s)5.溶解度幾乎不溶于水和100％甲醇，溶解于含水溶劑，如50％的甲醇水溶液或50％的乙腈水溶液中，溶于DMSO，幾乎不溶于弱極性有機(jī)溶劑，如己烷或氯仿中。
Me1H1的物理化學(xué)性質(zhì)1.物質(zhì)顏色無色2.分子量4153.分子式C24H37N3OS質(zhì)譜FABMSm/z 41M+H+高分辨質(zhì)譜實(shí)測值416.274M+H+計(jì)算值416.2735(C24H38N3OS)4.核磁共振信號1)1H-NMR(氘代氯仿，500MHz)(圖11)δppm 0.842(6H，s)，0.918(3H，s)，0.97(1H，m)，1.04(1H，m)，1.18(1H，m)，1.327(3H，s)，1.36(1H，m)，1.42(1H，m)，1.45(1H，m)，1.55(1H，m)，1.58(1H，m)，1.64(1H，m)，1.667(1H，dd，J＝5.5，12Hz)，1.78(1H，m)，2.02(2H，m)，2.05(1H，m)，3.650(2H，d，J＝12Hz)，4.647(2H，d，J＝14Hz)，4.801(2H，br s)，7.226(1H，d，J＝8.0Hz)，7.474(1H，d，J＝8.0Hz)
2)13C-NMR(氘代氯仿，基于HMBC(異核多重鍵相關(guān)譜)和HSQC(異核單量子相關(guān)譜)光譜確定化學(xué)位移)δppm 15.1(q)，18.4(t)，19.8(t)，20.9(q)，21.5(q)，25.1(t)，33.2(s)，33.3(q)，36.8(s)，39.2(t)，40.7(t)，41.7(t)，52.5(d)，56.0(d)，60.61(t)，62.33(t)，64.73(t)，77.0(s)，106.0(s)，119.8(d)，133.2(s)，139.7(d)，148.0(s)，156.2(s)5.溶解度幾乎不溶于水，溶解于含水溶劑，如10％-100％的甲醇水溶液或10％-100％的乙腈水溶液中，溶于弱極性有機(jī)溶劑，如己烷或氯仿中。
Me1H1Me的物理化學(xué)性質(zhì)1.物質(zhì)顏色無色2.分子量4573.分子式C27H43N3OS質(zhì)譜FABMSm/z 458M+H+高分辨質(zhì)譜實(shí)測值458.320M+H+計(jì)算值458.3205(C27H44N3OS)4.核磁共振信號1)1H-NMR(氘代氯仿，500MHz)(圖12)δppm 0.847(6H，s)，0.921(3H，s)，0.96(1H，m)，1.05(1H，m)，1.18(1H，m)，1.331(3H，s)，1.36(1H，m)，1.41(1H，m)，1.43(1H，m)，1.57(1H，m)，1.59(1H，m)，1.67(1H，m)，1.68(1H，m)，1.77(1H，br d，J＝13Hz)，2.00(1H，m)，2.09(1H，m)，2.16(1H，m)，3.19(3H，br s)，3.45(3H，br s)，3.509(3H，s)，3.564(2H，d，J＝12Hz)，4.41 9(2H，dd，J＝8.5，10.5Hz)，4.644(2H，br s)，7.356(1H，d，J＝7.0Hz)，7.488(1H，d，J＝7.0Hz)2)13C-NMR(氘代氯仿，確定基于HMBC(異核多重鍵相關(guān))和HSQC(異核單量子相關(guān))光譜確定化學(xué)位移)δppm 15.0(q)，18.7(t)，20.0(t)，20.6(q)，21.7(q)，26.2(t)，33.2(s)，33.5(q)，36.9(s)，39.4(t)，41.0(t)，42.0(t)，52.8(d)，56.2(d)，58.4(q)，59.0(q)，59.1(q)，70.2(s)，74.0(s)，75.6(s)，76.9(s)，109.9(s)，120.5(d)，135.1(s)，139.2(d)，145.7(s)，155.1(s)5.溶解度幾乎不溶于水，溶解于含水溶劑，如30％-100％的甲醇水溶液或30％-100％的乙腈水溶液中，溶于弱極性有機(jī)溶劑，如己烷或氯仿中。
實(shí)施例5新化學(xué)物質(zhì)1最小有效濃度(MEC)的檢測按照與實(shí)施例1相同的方式，對在48-MTP上分離和純化的新化學(xué)物質(zhì)1進(jìn)行16-步稀釋，稀釋開始于最終濃度1μg/ml。這種情況下，1ml培養(yǎng)基中約包括20個尖種礁膜細(xì)胞。稀釋時，隨著稀釋步驟的進(jìn)行，移液管末端進(jìn)行交換。提供了其3個系列的試樣，并按照實(shí)施例1的情況培養(yǎng)3天。其顯示達(dá)到12-步稀釋的排同時，尖種礁膜形成了葉狀體。這說明新化學(xué)物質(zhì)1的MEC為1μg/ml×10-12＝1ag/ml。當(dāng)該培養(yǎng)持續(xù)進(jìn)行很長一段時期時，新化學(xué)物質(zhì)1被生長的尖種礁膜消耗，則葉狀體開始降解。圖13顯示了培養(yǎng)開始(新化學(xué)物質(zhì)1的最終濃度1×10-7μg/ml)10天后，7-步稀釋的照片。雖然在某些程度上保持了葉狀體的最初形式，但仍觀察到了葉狀體的降解。圖14顯示了培養(yǎng)開始(新化學(xué)物質(zhì)1的最終濃度1×10-6μg/ml)10天后，6-步稀釋的照片。葉狀體還保持未降解，培養(yǎng)開始10天后的MEC為1×10-6μg/ml＝1pg/ml。在實(shí)施例1所述的條件下，尖種礁膜每天約進(jìn)行兩次有絲分裂。如果初始細(xì)胞數(shù)量為20，則根據(jù)計(jì)算，3天后的細(xì)胞數(shù)量為20×(2×2)3＝1,280個細(xì)胞，而10天后的細(xì)胞數(shù)量為20×(2×2)10＝20,971,520個細(xì)胞。也就是說，培養(yǎng)開始10天后的細(xì)胞數(shù)量與培養(yǎng)開始3天后相比，增加至10,000倍或更多，而MEC根據(jù)細(xì)胞數(shù)量和培養(yǎng)天數(shù)會發(fā)生顯著變化。更具體地說，取決于培養(yǎng)天數(shù)和細(xì)胞生長數(shù)量，需要加入充足的新化學(xué)物質(zhì)1。
實(shí)施例6新化學(xué)物質(zhì)1及其衍生物的活性按照與實(shí)施例5相同的方式，測定新化學(xué)物質(zhì)1及其衍生物的最小有效濃度。得到下面所示的結(jié)果。
表7最小有效濃度

當(dāng)新化學(xué)物質(zhì)1進(jìn)行了甲基化時，其活性降低至1/108。這說明，如實(shí)施例4中所述的，被甲基化試劑，如三甲基甲硅烷基重氮甲烷甲基化的官能團(tuán)對于活性來說是非常重要的。
實(shí)施例7培養(yǎng)孔石莼和腸滸苔的試驗(yàn)利用趨光性，在包括抗菌素混合溶液的ASP7培養(yǎng)基中洗滌源自孔石莼和腸滸苔(收集于Miho、Shimizu、Shizuoka，日本)的游動細(xì)胞。將洗滌后的細(xì)胞加入到覆蓋有無菌蓋片的正方形器皿中，然后將細(xì)胞殺菌5天。當(dāng)游動細(xì)胞沉積在蓋片上并開始生長時，將各個蓋片放置在6-MTP的各個孔中，并加入10ml不含抗菌素的ASP7培養(yǎng)基。將新化學(xué)物質(zhì)1以1ng/mg的量加入到試驗(yàn)試樣中，而不向?qū)φ赵嚇又屑尤肴魏挝镔|(zhì)，按照與實(shí)施例1相同的條件培養(yǎng)7天。10天之后，在已加入相同培養(yǎng)基的培養(yǎng)試管中對試驗(yàn)試樣和對照試樣的蓋片進(jìn)行再次培養(yǎng)，再次培養(yǎng)另外進(jìn)行7天。圖15顯示了對孔石莼進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果，圖16顯示了對腸滸苔進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果。由試驗(yàn)試樣和對照試樣的比較顯而易見可知，對照試樣中只有假根異常生長，并沒有形成正常的葉狀體。與之相比較，加入新化學(xué)物質(zhì)1時，沉積后可觀察到葉狀體的正常生長和形成。
上述包括抗菌素混合溶液的ASP7培養(yǎng)基這樣制備向ASP7培養(yǎng)基中加入2％的抗菌素混合溶液，該抗菌素混合溶液具有下列組成表8抗菌素混合溶液

實(shí)施例8促進(jìn)大型綠藻形態(tài)形成的特定活性按照與實(shí)施例5中相同的方式，測定如圖17中所示的YM-1-69株、YM-2-23株和類似菌株的最小有效濃度。得到如圖18所示的結(jié)果。水平軸代表由1μl類似菌株培養(yǎng)物上清液活化的尖種礁膜培養(yǎng)液的量。例如，1μl YM-2-23株的培養(yǎng)物上清液可活化約8,000ml圖18中的尖種礁膜培養(yǎng)溶液。
實(shí)施例9新化學(xué)物質(zhì)1及其衍生物的部分結(jié)構(gòu)的確定圖19所示的局部結(jié)構(gòu)是通過新化學(xué)物質(zhì)1的各種NMR譜圖和質(zhì)譜推斷出來的。由這些局部結(jié)構(gòu)的HMBC譜圖分析結(jié)果推斷出圖20所示的driman-型萜類化合物結(jié)構(gòu)和四取代苯環(huán)結(jié)構(gòu)。如圖21所示，基于新化學(xué)物質(zhì)1的三甲基化衍生物，即，Me1的NMR譜圖，通過對四取代苯環(huán)上一個取代基的局部結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以及通過對NOESY光譜的分析，確定了相對構(gòu)型。如圖22所示，基于HMBC譜圖確認(rèn)了上述預(yù)測的結(jié)構(gòu)。如圖23和24所示，對于Me1H3，在driman部分和苯環(huán)之間觀察到了NOESY光譜和HMBC光譜的交叉峰。這兩個結(jié)構(gòu)通過碳數(shù)為11-16和碳數(shù)為8-O-21(用以預(yù)測局部結(jié)構(gòu))的原子彼此相連。對于新化學(xué)物質(zhì)1的還原衍生物，即，Me1H1，在苯環(huán)24位置的亞甲基和21位置的碳之間觀察到了交叉峰。如圖25和26所示，確定了四取代苯環(huán)的最后一個取代基。如圖27和28所示，基于Me1H1的甲基化衍生物，即，Me1H1Me的各個NMR譜圖，觀察到了苯環(huán)、N-甲基和24位置亞甲基之間的相互關(guān)系，且確認(rèn)了上述預(yù)測的局部結(jié)構(gòu)。
如實(shí)施例4所述，Me1H1Me為新化學(xué)物質(zhì)1通過甲基化、還原和隨后的再次甲基化而制得的化合物。因此，新化學(xué)物質(zhì)1具有式1所代表的結(jié)構(gòu)
如實(shí)施例3所述，新化學(xué)物質(zhì)1為新化學(xué)物質(zhì)2經(jīng)過堿性處理而獲得的衍生物。因此，新化學(xué)物質(zhì)2為式2、3或4中任一項(xiàng)所代表的化合物或其混合物，其中式2、3或4為式1所代表化合物的酮形式。
式2 式3
式4 此外，式5代表Me1的結(jié)構(gòu)；式6代表實(shí)施例4中所述的、Me1經(jīng)氘代甲氧基-取代的衍生物，即，Me1B的結(jié)構(gòu)；式7代表Me1的部分還原形式，即，Me1H3的結(jié)構(gòu)；式8代表Me1的還原衍生物，即，Me1H1的結(jié)構(gòu)；式9代表Me1H1再次甲基化的衍生物，即，Me1H1Me的結(jié)構(gòu)。
式5
式6 式7 式8
式9 所有本文中引用的出版物、專利和專利申請的全部內(nèi)容均結(jié)合至本文中作為參考。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供一種利用新化學(xué)物質(zhì)培養(yǎng)海洋大型綠藻，如石莼科和礁膜科綠藻的新技術(shù)。該技術(shù)使實(shí)驗(yàn)室無菌培養(yǎng)或安全維持和處理種子及幼苗成為可能，并使海洋大型綠藻在海中牧場或其它地方穩(wěn)定生產(chǎn)和生長成為可能。
序列表<110>MARINE BIOTECHNOLOGY INSTITUTE CO.，LTD.
<120>具有形態(tài)形成活性和促進(jìn)生長活性的新化學(xué)物質(zhì)<130>PH-1841-PCT<150>JP2002/203608<151>2002-07-12<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>190<212>DNA<213>Tenacibaculum屬<400>1CCTACGGGAG GCAGCAGTGA GGAATATTGG TCAATGGAGG CAACTCTGAA CCAGCCATGC 60CGCGTGTAGG AAGACTGCCC TATGGGTTGT AAACTACTTT TATATGGGAA GAAACCCCTC 120TTACGTGTAG AGGCTTGACG GTACCATAAG AATAAGCACC GGCTAACTCC GTGCCAGCAG 180CCGCGGTAAT190<210>2<211>189<212>DNA<213>未知<400>2CCTACGGGAG GCAGCAGTGA GGAATATTGG ACAATGGGCG GGAGCCTGAT CCAGCCATGC 60CGCGTGCGGG AAGAAGGCCC TATGGGTCGT AAACCGCTTT TATACGGGAA GAAACCACCC 120TACGTGTAGG GTACTGACGG TACCGTAAGA ATAAGGACCG GCTAACTCCG TGCCAGCAGC 180CGCGGTAAT 189<210>3<211>1173<212>DNA<213>Tenacibaculum屬<400>3GTATCTGGAG GTTTACACGG AGTTGGTGTA TCTTGTGTGA ATGCACTTTC AGATCATTTA 60
AAAGCTACAG TTCACAGAGA AGGTAAAATA TGGGAACAAG AGTATGAACG TGGTAAAACA 120CTTTATCCTG TAAAAACTGT AGGTGAAACT GATATAACTG GTACAGAAGT AACTTTCTTA 180CCAGACAAAA GTATTTTCCA ACAAACCACA GAATATAATT ACGAAACGTT AGCTACACGT 240ATGCGTGAGT TAGCGTATCT TAATAAAGGA ATCACGATTA CGTTAACAGA TAAGCGTAAT 300AAAGATGATG AAGGAAATTT TATTGCTGAA ACTTTCCACA GTAACGAAGG ATTATCTGAA 360TTTGTTAAAT ATTTAGATAG TACTCGTACT CCTGTTATTC AGCATGTAAT TTCAATGGAA 420GGTGAGAAAA ACGGAATTCC TGTTGAGGTT GCAATGATTT ATAATGATTC ATATGCTGAA 480AATTTACATT CTTATGTAAA TAACATTAAT ACTCACGAAG GAGGAACACA TTTATCAGGA 540TTTAGAAGAG GTTTAACAAG TACTTTAAAG AAATATGCAG ATACTTCTGG ATTACTAAAG 600AACGTTAAGT TTGAGATTTC TGGAGATGAT TTCCGTGAAG GTTTAACGGC AATTGTATCT 660GTAAAAGTAG CTGAACCTCA GTTTGAAGGA CAAACAAAAA CAAAATTAGG AAACAGAGAA 720GTTACTTCTG CAGTATCGCA AGCTGTAGCA GAAATGTTAA CTGATTATTT AGAGGAAAAT 780CCTAATGATG CTAAAACGAT TGTACAAAAA GTAATTCTTG CAGCTCAAGC GCGTCACGCA 840GCTCGTAAAG CAAGAGAAAT GGTGCAACGT AAAACAGTAA TGAGTATTGG AGGTTTACCT 900GGTAAACTAT CTGATTGTTC TGAAACTGAT CCAGCAGTTT GTGAAATTTT CTTAGTCGAG 960GGAGATTCGG CAGGTGGAAC TGCAAAACAA GGTCGTGATC GTAATTTCCA AGCAATTTTA 1020CCCTTACGTG GTAAGATTCT TAACGTAGAA AAAGCGATGC AGCATAAAGT TTTTGAGAAT 1080GAAGAAATCA AAAACATGTT TACGGCTTTA GGAATCACTA TCGGAACAGA AGAAGATCCA 1140AGAGCATTAA ACTTATCAAA ATTAAGATAT CAT 1173<210>4<211>1173<212>DNA<213>未知<400>4GTATCCGGTG GTTTGCACGG GGTAGGTGTT TCTTGTGTGA ACGCCCTTTC CAATCATCTT 60AAAGCTACCG TACATAGAGA TGGGAAAGTT TGGGAACAGG AATATGAACG GGGTAAATCC 120CTTTATCCCG TAAAAAGTGT TGGGGAGACC GATGAAACTG GAACCATTGT TACCTTCATA 180CCAGATGATT CAATCTTTAC CCAAACAACA GAGTATAGTT ATGAGACCCT TGCCAACAGA 240ATGCGTGAGC TTTCGTTCTT GAACAAAGGG GTTACCATTA GCATTACGGA CAAAAGAGTA 300AAGGATAAAG AAGGGGAGTA CCTTTCTGAA ACTTTTTATT CCGATGCTGG ACTAAGTGAA 360TTTGTTAAGT TCTTGGATGG TACCCGTGAA CCTTTGATTC AAGGGGTTAT CGCGATGGAA 420GGGGAGAAAA ATGGTATCCC TGTGGAAGTG GCAATGGTTT ACAACACCAG TTACACGGAG 480AATTTACATT CCTATGTGAA TAACATTAAC ACGCACGAAG GGGGTACGCA TCTTTCCGGT 540TTTAGAAGGG GATTGACCTC TACTTTAAAG AAATACGCAG ATTCTTCTGG AATGCTCGAG 600AAATTGAAGT TTGAGGTTCA GGGAGATGAT TTCCGTGAAG GACTTACAGC AATTGTTTCC 660GTTAAGGTCG CAGAACCTCA ATTTGAAGGT CAGACGAAAA CCAAGCTTGG AAACCGCGAG 720GTTTCTTCTG CGGTGAGCCA AGCTGTTTCT GAAATGCTCA CGGATTATTT GGAGGAGCAT 780CCAGATGATG CCAAGGTTAT TGTTCAAAAA GTTATCCTTG CCGCTCAGGC CAGACATGCC 840GCTACAAAGG CCCGTGAAAT GGTACAGCGT AAGACGGTAA TGAGTATTGG TGGGCTACCT 900GGAAAATTGT CCGATTGTTC TGAGCAAGAT CCTGCGCAAT GTGAAGTATT TCTTGTAGAG 960GGAGATTCTG CAGGTGGTAC GGCAAAAATG GGCCGGGACC GAAAATTTCA GGCCATTCTT 1020CCACTAAGGG GTAAAATCTT GAACGTGGAA AAAGCCATGC AGCACAAGGT TTTTGAAAAT 1080
GAGGAAATAA AGAATATTTA TACGGCCCTA GGGGTTACTA TTGGAACGGA AGAAGATAGT 1140AAGGCCTTGA ACCTGGAAAA ATTAAGATAT CAT 117權(quán)利要求
1.一種新化學(xué)物質(zhì)1，其具有下列物理化學(xué)性質(zhì)(i)物質(zhì)顏色無色(ii)分子量457(iii)分子式C24H31N3O4S質(zhì)譜分析FABMSm/z 456[M-H]-(圖1)高分辨質(zhì)譜實(shí)測值456.1960[M-H]-計(jì)算值456.193(C24H30N3O4S)(iv)核磁共振信號1)1H-NMR(D2O-20mM Na2HPO4(pH9)，750MHz)(圖2)δppm 0.818(3H，s)，0.837(3H，s)，0.882(3H，s)，0.960(1H，m)，1.058(1H，m)，1.167(1H，m)，1.326(3H，s)，1.37(1H，m)，1.38(1H，m)，1.40(1H，m)，1.58(1H，m)，1.61(2H，m)，1.52(1H，br d，J＝13Hz)，1.76(1H，br d，J＝14Hz)，2.024(1H，m)，2.181(1H，dd，J＝4，14Hz)，2.291(1H，dd，J＝14，16.5Hz)，7.698(1H，d，J＝7.5Hz)，7.845(1H，d，J＝7.5Hz)2)13C-NMR(D2O-20mM Na2HPO4(pH9)，125MHz)(圖3)δppm 15.236(q)，19.037(t)，20.287(t)，20.955(q)，21.835(q)，25.987(t)，33.381(s)，33.636(q)，37.308(s)，39.590(t)，41.199(t)，42.346(t)，52.769(d)，56.381(d)，79.096(s)，114.965(s)，124.399(d)，139.004(s)，141.232(d)，150.282(s)，152.656(s)，172.081(s)，173.538(s)，174.661(s)。
2.一種新化學(xué)物質(zhì)2，其具有下列物理化學(xué)性質(zhì)(i)物質(zhì)顏色無色(ii)核磁共振信號1H-NMR(D2O-20mM Na2HPO4(pH9)，750MHz)(圖4)δppm 0.815(3H，s)，0.834(3H，s)，0.877(3H，s)，0.949(1H，m)，1.048(1H，m)，1.163(1H，m)，1.297(3H，s)，1.35-1.40(3H，m)，1.52-1.63(4H，m)，1.753(1H，br d，J＝14Hz)，2.012(1H，m)，2.158(1H，m)，2.299(1H，m)，7.646(1H，d，J＝8.0Hz)，7.769(1H，d，J＝8.0Hz)
3.一種制備新化學(xué)物質(zhì)1的方法，其中在培養(yǎng)基中培養(yǎng)可制備根據(jù)權(quán)利要求1的新化學(xué)物質(zhì)1的微生物，新化學(xué)物質(zhì)1在培養(yǎng)中產(chǎn)生并累積，并回收產(chǎn)生和累積的新化學(xué)物質(zhì)1。
4.一種制備新化學(xué)物質(zhì)2的方法，其中在培養(yǎng)基中培養(yǎng)可制備根據(jù)權(quán)利要求2的新化學(xué)物質(zhì)2的微生物，新化學(xué)物質(zhì)2在培養(yǎng)中產(chǎn)生并累積，并回收產(chǎn)生和累積的新化學(xué)物質(zhì)2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的制備方法，其中微生物為YM-2-23株(FERMBP-8417)，Tenacibaculum屬YM-1-69株(FERM BP-8418)，或其類似的菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的制備方法，其中微生物為YM-2-23株(FERMBP-8417)，Tenacibaculum屬YM-1-69株(FERM BP-8418)，或其類似的菌株。
7.海藻培養(yǎng)基，其包括作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求1的新化學(xué)物質(zhì)1。
8.海藻培養(yǎng)基，其包括作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求2的新化學(xué)物質(zhì)2。
9.新化學(xué)物質(zhì)1的單甲基化、二甲基化或三甲基化衍生物，其通過用三甲基甲硅烷基重氮甲烷處理根據(jù)權(quán)利要求1的新化學(xué)物質(zhì)1而獲得。
10.一種化合物或其衍生物，其通過用硼氫化鈉處理根據(jù)權(quán)利要求9的三甲基化衍生物而獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)海洋大型綠藻形態(tài)形成和促進(jìn)海洋大型綠藻生長的新化學(xué)物質(zhì)，涉及一種使用微生物制備該新化學(xué)物質(zhì)的方法，以及包括該新化學(xué)物質(zhì)的、用于培養(yǎng)綠藻的培養(yǎng)基。
文檔編號C12P17/18GK1681830SQ03821498
公開日2005年10月12日 申請日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者松尾嘉英 申請人:株式會社海洋生物技術(shù)研究所