專利名稱：產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌生物質(zhì)、特別是本文中稱作″細(xì)菌提取物″的生物質(zhì)作為微生物生長(zhǎng)基質(zhì)的應(yīng)用，所述的細(xì)菌生物質(zhì)至少部分由包括甲烷營(yíng)養(yǎng)菌(methanotrophic bacterium)的細(xì)菌培養(yǎng)物衍生。
背景技術(shù)：
微生物通常以商品和實(shí)驗(yàn)室等級(jí)生長(zhǎng)，例如由天然產(chǎn)生所需物質(zhì)的細(xì)菌菌株產(chǎn)生這類物質(zhì)或已經(jīng)遺傳修飾以產(chǎn)生這類物質(zhì)或測(cè)定細(xì)菌污染物的性質(zhì)等。為了這些目的，微生物需要營(yíng)養(yǎng)物且在這方面通常使用為廣泛商購(gòu)的酵母、肉膏或植物提取物，例如MRS(De Mann，Rogosa和Sharpe)、PCA(平板計(jì)數(shù)瓊脂)、VRBD(紫紅膽汁葡萄糖瓊脂)、YM瓊脂(酵母霉瓊脂)、Baird-Parker瓊脂基質(zhì)、VRB瓊脂(Violet Red Bile瓊脂)、XLD瓊脂(木糖-賴氨酸-脫氧膽酸瓊脂)、CASO(酪蛋白胨大豆蛋白胨)、TSB(胰胨豆胨瓊脂培養(yǎng)液)和NB(營(yíng)養(yǎng)肉湯)。酵母提取物生長(zhǎng)基質(zhì)(例如包含在MRS、VRBD、VRB瓊脂、PCA、Baird-Parker瓊脂基質(zhì)和XLD瓊脂中)商購(gòu)自Merck和Difco等。通常使用來(lái)自酵母培養(yǎng)物的生物質(zhì)產(chǎn)生這類酵母提取物，已經(jīng)使所述的酵母培養(yǎng)物自溶，即酵母細(xì)胞內(nèi)天然出現(xiàn)的酶在細(xì)胞死亡后起分解細(xì)胞的作用。酵母自溶一般是緩慢的且需要幾天，此后獲得適宜程度的消化。因此，起自溶起始劑或刺激劑作用的添加劑、例如硫醇試劑一般用于加速自溶過(guò)程。當(dāng)然，這類添加劑的應(yīng)用為酵母自溶物的商業(yè)化生產(chǎn)增加了成本。為了得到自溶物，可以加入額外的營(yíng)養(yǎng)物以使特定微生物的細(xì)胞生長(zhǎng)最優(yōu)化且實(shí)際上微生物的文庫(kù)寄存物(library deposit)一般指定應(yīng)最適合于寄存的微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
由于不同的微生物具有不同的營(yíng)養(yǎng)需求，所以對(duì)可選和改進(jìn)的微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基當(dāng)然存在不間斷的需求，特別是對(duì)使那些攻擊以便在體外生長(zhǎng)的微生物(例如乳桿菌)有效生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和對(duì)可以適用于未知微生物的″廣譜″生長(zhǎng)培養(yǎng)基存在不間斷的需求。
目前我們已經(jīng)令人意外地發(fā)現(xiàn)可以使用從包括甲烷營(yíng)養(yǎng)菌的培養(yǎng)基中獲得的生物質(zhì)、例如如WO 01/60974中所述產(chǎn)生的生物質(zhì)生產(chǎn)特別有效的微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容
因此，從一個(gè)方面來(lái)看，本發(fā)明提供了來(lái)源于包括甲烷營(yíng)養(yǎng)菌的細(xì)菌培養(yǎng)物生物質(zhì)且任選含有其它營(yíng)養(yǎng)物的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物組合物作為微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基的應(yīng)用。
用于生產(chǎn)生物質(zhì)的細(xì)菌培養(yǎng)物優(yōu)選為至少50％、更優(yōu)選至少60％、尤其是至少70％、特別是至少75％、例如75-95％、更特別的為75-80％重量的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌(占總細(xì)菌重量)。
從另一個(gè)方面來(lái)看，本發(fā)明提供了培養(yǎng)微生物的方法，包括使微生物與其生長(zhǎng)培養(yǎng)基彼此接觸的步驟，其特征在于所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基為無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物組合物或由其制備，該無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物組合物來(lái)源于包括甲烷營(yíng)養(yǎng)菌的細(xì)菌培養(yǎng)物的生物質(zhì)且任選添加了其它營(yíng)養(yǎng)物。
從另一個(gè)方面來(lái)看，本發(fā)明提供了微生物生長(zhǎng)基質(zhì)，包括無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物組合物，該組合物來(lái)源于包括甲烷營(yíng)養(yǎng)菌的細(xì)菌培養(yǎng)物的生物質(zhì)、進(jìn)一步含有至少一種無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物且任選含有稀釋劑。
制備生長(zhǎng)培養(yǎng)基或基質(zhì)的生物質(zhì)優(yōu)選為從至少一個(gè)種類的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌和至少一個(gè)種類的異養(yǎng)菌中產(chǎn)生的生物質(zhì)，例如，優(yōu)選使用可提供甲烷、氧、氨和無(wú)機(jī)原料的環(huán)式反應(yīng)器使所述菌生長(zhǎng)在相同的培養(yǎng)基中。用于生產(chǎn)生物質(zhì)的適宜細(xì)菌組合例如描述在WO 01/60974中，將該文獻(xiàn)的內(nèi)容引入作為參考。一種特別合適的組合為莢膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB11132)、Ralstonia sp.DB3(菌株NCIMB 13287)、Aneurinibacillus sp.DB4(菌株NCIMB 13288)和Brevibacillus agri DB5(菌株NCIMB 13289)(這些微生物中每一種在本專利期限內(nèi)均可得自Norferm DA，Norway)。
可以直接使用來(lái)自細(xì)菌培養(yǎng)物的生物質(zhì)(不過(guò)，一般在脫水和滅菌之后)或例如可以首先將其通過(guò)勻化、水解或自溶進(jìn)行處理以分解細(xì)菌細(xì)胞。這類處理描述在WO01/60974和2003年2月12日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/GB03/000610和PCT/GB03/000640中，也將這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。(將這兩篇國(guó)際專利申請(qǐng)的復(fù)印件也一起提交。)盡管細(xì)菌生物質(zhì)的勻化物、水解產(chǎn)物和自溶物、尤其是干燥的勻化物且更特別的是干燥的自溶物是用于制備本發(fā)明微生物培養(yǎng)基的優(yōu)選物質(zhì)，但是也可以使用通過(guò)過(guò)濾(例如超濾)勻化、自溶或水解生物質(zhì)得到的前體物質(zhì)，即液體濾液自身和存留物。不過(guò)，最優(yōu)選干燥的自溶物。
微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以為細(xì)菌生物質(zhì)產(chǎn)物自身或含有生物質(zhì)產(chǎn)物和其它成分的組合物，所述的其它成分例如有液體或非液體載體或稀釋劑(諸如水、凝膠(例如瓊脂凝膠)或可膠凝液體)和諸如礦物、碳源(諸如糖類(例如單糖類、二糖類、寡糖類和多糖類，尤其是單糖類和二糖類))、氮源(例如硝酸鹽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段、銨化合物、寡肽類、氨基酸(尤其是必需氨基酸，例如色氨酸))、核酸和核酸片段、脂類等這類物質(zhì)。特別優(yōu)選培養(yǎng)基含有葡萄糖和添加的硝酸鹽和無(wú)機(jī)鹽(例如鉀、鈣、鎂、鈉、鉬、鐵、鋅、硼、鈷、錳和鎳化合物)，尤其是葡萄糖。所提供的組合物可以為備用或濃縮物形式的無(wú)菌固體(例如顆粒)、半固體或液體。尤其優(yōu)選所提供的組合物為可以通過(guò)添加水或水膠凝劑組合物轉(zhuǎn)化成生長(zhǎng)培養(yǎng)基的無(wú)菌干顆粒濃縮物。
其中，該組合物含有添加的葡萄糖，以干物質(zhì)為基準(zhǔn)，其優(yōu)選與生物質(zhì)衍生成分的重量比為5∶1-1∶5(尤其是2∶1-1∶2)。如果該組合物含有添加的硝酸鹽和無(wú)機(jī)鹽，那么優(yōu)選它與生物質(zhì)衍生成分的重量比為0.01∶1-0.2∶1(尤其是0.05∶1-0.1∶1)。如果所提供的組合物不含添加的葡萄糖和/或無(wú)機(jī)硝酸鹽，那么優(yōu)選生長(zhǎng)培養(yǎng)基制備包括添加上述特定重量比的這類成分中的一種或它們兩種。
本發(fā)明的組合物特別適合于用作異養(yǎng)微生物的生長(zhǎng)基質(zhì)，尤其是異養(yǎng)藻類、酵母或細(xì)菌，特別是厭氧菌、諸如乳桿菌(例如植物乳芽孢桿菌、嗜酸乳芽孢桿菌)；需氧菌，諸如大腸桿菌；和藻類，諸如Crypthecodiniumcohnii。
附圖簡(jiǎn)述現(xiàn)在參照下列非限制性實(shí)施例和附圖進(jìn)一步解釋本發(fā)明，其中附

圖1解釋了在發(fā)酵罐中A)嗜酸乳芽孢桿菌和B)植物乳芽孢桿菌在MRS(-)和BP自溶物(...)上的發(fā)酵研究結(jié)果。添加25％NaOH(g)和OD620nm(就在MRS上發(fā)酵而言)-時(shí)間(小時(shí))。
附圖2解釋了來(lái)自酵母提取物、BP提取物和BP自溶物上的大腸桿菌發(fā)酵研究的數(shù)據(jù)。
附圖3解釋了使用不同發(fā)酵的賴氨酸產(chǎn)量為時(shí)間的函數(shù)和添加的復(fù)合N-源的類型和用量。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1生物質(zhì)提取物如WO01/60974所述培養(yǎng)各自購(gòu)自Norferm DA，Norway)的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌(莢膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)、Ralstonia sp.DB3(菌株NCIMB 13287)、Aneurinibacillus sp.DB4(菌株NCIMB 13288)和Brevibacillusagri DB5(菌株NCIMB 13289)并如WO01/60974中所述獲得和處理所得生物質(zhì)而產(chǎn)生噴霧干燥的勻化物(下文的″BPH勻化物″)、如國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/GB03/000610中所述產(chǎn)生噴霧干燥的水解產(chǎn)物(下文的″BP水解產(chǎn)物″)且如國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/GB03/000640(例如，參見(jiàn)實(shí)施例1)所述產(chǎn)生自溶物(下文的″BP提取物″)。如果不采用生產(chǎn)″BP提取物″中的自溶后超濾和蒸發(fā)步驟，那么產(chǎn)物在本文中稱作″BP自溶物″。例如，在國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/GB03/000640的實(shí)施例3和4中描述了這類產(chǎn)物的制備。稱作″BP存留物″的產(chǎn)物為超高溫處理的勻化的生物質(zhì)。稱作″BP滲透物″的產(chǎn)物基本上相當(dāng)于生產(chǎn)″BP提取物″中超濾步驟的產(chǎn)物。
上述所有物質(zhì)均購(gòu)自Norferm DA，Norway。
通過(guò)以1g/L的濃度向軟化水中添加BP勻化物、BP自溶物、BP提取物、BP殘留物和BP滲透物生產(chǎn)微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基。然后直接使用這些培養(yǎng)基或通過(guò)添加0.1g/L葡萄糖和/或32.4mL/L無(wú)機(jī)硝酸鹽介質(zhì)(NMS)使用。
NMS包括1.0g KNO30.2g CaCl2.2H2O1.0g MgSO4.7H2O0.1mL微量元素溶液*0.1mL鉬酸鈉溶液(5g/L在軟化水中的NaMoO4.2H2O)0.1mL EDTA溶液(45g/L在水中的FeNaDTA.2H2O)
水-加至1L加入10mL/L無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(35.6g Na2HPO4.2H2O，26.0g KH2PO4且水加至1L)。
*6.4g ZnSO4.7H2O150mg H3BO3600mg CoSO4.7H2O130mg MnCl2100mg NiCl2.6H2O軟化水加至1L所有培養(yǎng)基均在高壓滅菌后使用。
還制備了基于瓊脂的微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其含有32.2g/L BP提取物20.0g/L葡萄糖34mL/LNMS培養(yǎng)基14.0g/L脂軟水加至1L將該養(yǎng)基在高壓滅菌后使用。
實(shí)施例2微生物生長(zhǎng)試驗(yàn)使需氧和厭氧革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)在使用實(shí)施例1的液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基的振搖燒瓶中并將為細(xì)菌菌株推薦的生長(zhǎng)培養(yǎng)基用作對(duì)照。將培養(yǎng)物的光密度監(jiān)測(cè)為獲得細(xì)菌生長(zhǎng)的指示劑(即具有最高細(xì)胞數(shù)量的″平穩(wěn)期″或穩(wěn)定期)。將結(jié)果列在下表1中。
表1


---沒(méi)有BP衍生物的組合優(yōu)于對(duì)照基質(zhì)。
+BP衍生物的某些組合與對(duì)照基質(zhì)同樣好。
+++BP衍生物的某些組合明顯優(yōu)于對(duì)照基質(zhì)。
就大腸桿菌而言，添加了葡萄糖的BP提取物顯然提供了最佳生長(zhǎng)。就植物乳芽孢桿菌而言，所有的BP提取物的組合均顯著使生長(zhǎng)最佳。就銅綠假單胞菌而言，BP提取物的所有組合均得到了最佳生長(zhǎng)，特別是添加了葡萄糖的BP提取物。就枯草芽孢桿菌而言，添加了葡萄糖的BP提取物和既添加了葡萄糖又添加了NMS的BP提取物均顯然得到了生長(zhǎng)最佳。
實(shí)施例3未知細(xì)菌的生存力使瓊脂凝膠(PCA、MRS-瓊脂和含有瓊脂的BP提取物(實(shí)施例1)pH6.0和7.1)與取自大量切碎的肉的未知微生物一起擴(kuò)散。將培養(yǎng)物在25℃下保溫72小時(shí)并記錄總平板計(jì)數(shù)。就BP提取物而言，log(CFU/g)為5-約6.6，而就MRS而言，該值小于1。就PCA而言，log(CFU/g)約為6.7，即幾乎不更高。
實(shí)施例4乳芽孢桿菌屬的生存力使乳芽孢桿菌屬的菌株鼠李糖乳桿菌(菌株ATCC 7469)、德氏乳桿菌亞種(菌株ATCC 7830)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)(菌株CCUG 30138)、加氏乳桿菌(菌株ATCC 19992)和植物乳芽孢桿菌(菌株ATCC 8014)生長(zhǎng)在需氧條件下的MRS瓊脂和BP提取物瓊脂(實(shí)施例1)上。在所有情況中，測(cè)定為log(CFU/mL)的存活力與對(duì)BP提取物所述的相同或大于它。這一結(jié)果對(duì)德氏乳桿菌而言最為顯著。還使相同的菌株生長(zhǎng)在厭氧條件下的這些培養(yǎng)基上且在所有情況中，存活力也與對(duì)BP提取物所述的相同或優(yōu)于它。
實(shí)施例5多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)使Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky(菌株ATCC 30772)生長(zhǎng)在包括在軟化水中的9g/L葡萄糖、25g/L海鹽和2g/L酵母提取物(YE)或BP提取物的培養(yǎng)基上。2天保溫后，收集細(xì)胞并測(cè)定了總脂肪酸、細(xì)胞干重(CDW)和22∶6(二十二碳六烯酸)含量。將結(jié)果列在下表2中。
表2

表2表明CDW和多不飽和脂肪酸22∶6的百分比在使用BP提取物時(shí)較高。
實(shí)施例6乳芽孢桿菌屬在含有BP自溶物的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)在燒瓶和發(fā)酵中將乳芽孢桿菌屬菌株植物乳芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌在含有被BP自溶物取代的復(fù)合成分的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)(實(shí)施例1)與使用標(biāo)準(zhǔn)MRS-培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)進(jìn)行比較。
燒瓶中的實(shí)驗(yàn)使乳芽孢桿菌屬生長(zhǎng)在厭氧燒瓶中以比較BP自溶物與市售的現(xiàn)有產(chǎn)品的特性。用表4中的BP自溶物取代MRS-培養(yǎng)基中的復(fù)合成分(參見(jiàn)表3)，使得總氮含量保持恒定。
表3復(fù)合培養(yǎng)基成分中的總氮(％)

表4復(fù)合培養(yǎng)基成分

發(fā)酵罐中的實(shí)驗(yàn)對(duì)每種菌株進(jìn)行兩種發(fā)酵；一種使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基MRS，而在另一種中，用BP自溶物取代MRS中的復(fù)合成分(在燒瓶實(shí)驗(yàn)中使用培養(yǎng)基CA-4)。
在厭氧燒瓶中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)方法接種物將1ml接種批量的植物乳芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌用于接種80ml MRS-肉湯(Oxoid)并在37℃下保溫20小時(shí)。就菌株嗜酸乳桿菌而言，將MRS-肉湯調(diào)節(jié)至pH5.5。
培養(yǎng)條件按照表4使用復(fù)合培養(yǎng)基基質(zhì)，而使其它培養(yǎng)基成分保持恒定(表5)。將除葡萄糖外的所有成分混合并分別將pH調(diào)節(jié)至6.0和pH5.5且在121℃下高壓滅菌20分鐘。對(duì)葡萄糖單獨(dú)進(jìn)行高壓滅菌。用氮?dú)鉀_洗燒瓶，此后進(jìn)行接種。
給兩燒瓶接種并將一個(gè)用作對(duì)照。每個(gè)燒瓶使用0.5ml接種物。在37℃下分別在20小時(shí)和24小時(shí)內(nèi)以100rpm給燒瓶側(cè)向接種。分析樣品的pH和CFU/ml。
表5用于在厭氧燒瓶中的實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基組合物

發(fā)酵方法接種物將相同條件用作燒瓶實(shí)驗(yàn)將1ml接種批量的植物乳芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌用于接種80mlMRS-肉湯(Oxoid)并在37℃下保溫20小時(shí)。就菌株嗜酸乳桿菌而言，將MRS-肉湯調(diào)節(jié)至pH5.5。
培養(yǎng)條件所有發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均在7.5-LChemap發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行。給7L批量的試驗(yàn)體系接種70ml接種物。按照MRS和CA-4使用復(fù)合培養(yǎng)基基質(zhì)并保持作為燒瓶實(shí)驗(yàn)中的剩余成分，但將(Na)3-檸檬酸(2.40g/l)改變成(NH4)3-檸檬酸(2.00g/l)(表6)。將除葡萄糖外的所有成分混合并分別將pH調(diào)節(jié)至6.0和pH5.5且在121℃下高壓滅菌20分鐘。對(duì)葡萄糖單獨(dú)進(jìn)行高壓滅菌。
發(fā)酵在37℃下進(jìn)行且通過(guò)添加25％NaOH使pH保持恒定，就植物乳芽孢桿菌而言為pH5.8，而就嗜酸乳桿菌而言，為pH5.5。當(dāng)終止添加NaOH時(shí)，停止發(fā)酵。注意應(yīng)使混入培養(yǎng)基中的空氣最少。分析終產(chǎn)物在MRS瓊脂(Oxoid)上的CFU和在血液-瓊脂和TSA(Difco)上的污染。
表6發(fā)酵用培養(yǎng)基組合物

燒瓶中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表7生產(chǎn)植物乳芽孢桿菌的燒瓶實(shí)驗(yàn)。
相應(yīng)于37℃下20小時(shí)后的生長(zhǎng)基質(zhì)(g/l)、植物乳芽孢桿菌的生存力(CFU/ml)和pH的培養(yǎng)基組成。MRS-培養(yǎng)基的其它成分沒(méi)有改變。將pH調(diào)節(jié)至6.0。對(duì)每次實(shí)驗(yàn)而言平行進(jìn)行兩次。


表8生產(chǎn)嗜酸乳桿菌的燒瓶實(shí)驗(yàn)。
相應(yīng)于37℃下24小時(shí)后的生長(zhǎng)基質(zhì)(g/l)、嗜酸乳桿菌的生存力(CFU/ml)和pH的培養(yǎng)基組成。MRS-培養(yǎng)基的其它成分沒(méi)有改變。將pH調(diào)節(jié)至5.5。對(duì)每次實(shí)驗(yàn)而言平行進(jìn)行兩次。

發(fā)酵罐中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果就兩種菌株而言，CFU和氫氧化鈉的利用表明在含有BP自溶物的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)等于或優(yōu)于在MRS中的標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合成分上的生長(zhǎng)。兩種菌株的發(fā)酵時(shí)間在BP自溶物上均短于在MRS上的發(fā)酵時(shí)間。將結(jié)果概括在表9和附圖1中。在任何時(shí)間時(shí)均沒(méi)有觀察到污染。
表9在MRS上發(fā)酵的概括(使用復(fù)合培養(yǎng)基成分細(xì)菌用胨10(g/l)、牛肉膏10(g/l)。酵母提取物5(g/l))并用BP自溶物32(g/l)交換復(fù)合培養(yǎng)基成分。

結(jié)論燒瓶和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證實(shí)在包括BP自溶物的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)至少等于標(biāo)準(zhǔn)MRS上的生長(zhǎng)或比它改善。
實(shí)施例7用于β-半乳糖苷酶產(chǎn)生的大腸桿菌發(fā)酵本研究的目的在于測(cè)試可選BP自溶物作為大腸桿菌發(fā)酵中的氮源。測(cè)試BP提取物和BP自溶物(實(shí)施例1)并與標(biāo)準(zhǔn)酵母提取物進(jìn)行比較。
方法將氧飽和保持在20％以上。溫度為37℃且pH為6.8。開(kāi)始以批量方式進(jìn)行發(fā)酵并添加礦物作為50％C-源和50％N-源。在OD620為10時(shí)，在1小時(shí)期限內(nèi)加入剩余的N-源。在葡萄糖濃度低于0.7gL-1時(shí)，添加葡萄糖。另外通過(guò)pH監(jiān)測(cè)葡萄糖1)pH＞6.8時(shí)，葡萄糖進(jìn)料增加；和2)pH＜6.75時(shí)，葡萄糖進(jìn)料減少并加入NaOH。
原料1.作為葡萄糖的C-源；和2.N-源a.酵母提取物b.BP提取物c.BP自溶物(濃度為酵母提取物和BP提取物的1.5倍)。
4.5小時(shí)后，加入ITPG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)作為半乳糖苷酶的誘導(dǎo)物。
結(jié)果如附圖2中所示且證實(shí)對(duì)三種N-源類似而言酶的產(chǎn)量相似。
實(shí)施例8對(duì)作為復(fù)合N-源用于超量產(chǎn)生L-賴氨酸的谷氨酸棒桿菌RRL B-11470菌株的BP自溶物的分析本研究的目的在于比較BP自溶物(實(shí)施例1)與大豆水解產(chǎn)物(Bactosoytone)作為復(fù)合N-源在通過(guò)用超量產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌突變體發(fā)酵的賴氨酸產(chǎn)量。
將在3升玻璃發(fā)酵罐與使用谷氨酸棒桿菌NRRL B-11470的1升培養(yǎng)基進(jìn)行的發(fā)酵中的賴氨酸產(chǎn)量進(jìn)行比較。在所有發(fā)酵中培養(yǎng)基組成是相同的，但復(fù)合N-源為BP自溶物或soytone(14、21或28g/升)。
結(jié)果將發(fā)酵的主要結(jié)果概括在表10中。賴氨酸產(chǎn)量為還在附圖3中所示的發(fā)酵時(shí)間的函數(shù)。
一般來(lái)說(shuō)，賴氨酸產(chǎn)率隨復(fù)合N-源的濃度增加而增加，這可能是因?yàn)榧?xì)胞濃度隨添加的復(fù)合N-源增加而增加所導(dǎo)致的。然而，加入BP自溶物的培養(yǎng)物中的產(chǎn)率明顯高于添加相同量的soytone的培養(yǎng)物中的產(chǎn)率。由于BP自溶物中的顆粒濃度較高，所以不能測(cè)定使用BP自溶物發(fā)酵中的光密度。因此，我們沒(méi)有估計(jì)這些發(fā)酵中的細(xì)胞質(zhì)量。然而，較高的產(chǎn)率可能是由于使用BP自溶物發(fā)酵中的細(xì)胞濃度高于相應(yīng)使用soytone發(fā)酵中的細(xì)胞濃度所導(dǎo)致的。
表10使用谷氨酸棒桿菌NRRL B-11470的賴氨酸產(chǎn)量。發(fā)酵結(jié)果的概括。
表10

A消耗的葡萄糖?？傆?jì)加入132g，但在終止發(fā)酵時(shí)，仍有7g/升。
B在本計(jì)算中考慮到了在發(fā)酵過(guò)程中的體積增加(5-15％)。
C盡管在終止發(fā)酵時(shí)對(duì)培養(yǎng)物的顯微鏡檢查沒(méi)有顯示出培養(yǎng)物中存在任何污染的微生物，但是分析結(jié)果清楚地表明存在污染的微生物。不過(guò)，這些微生物看起來(lái)沒(méi)有對(duì)賴氨酸產(chǎn)量有較大程度的影響。
E在這種發(fā)酵中，在最后的樣品中測(cè)定的賴氨酸濃度低于倒數(shù)第二份樣品中的濃度。這是因?yàn)镃hinard法具有相當(dāng)大的標(biāo)準(zhǔn)偏差。主要基于倒數(shù)第二份樣品估計(jì)最終的體積產(chǎn)率。
最終的賴氨酸產(chǎn)率/單位葡萄糖在大部分發(fā)酵中基本上相同，為0.17-0.19g賴氨酸HCl/g葡萄糖，與添加的復(fù)合N-源的類型和量無(wú)關(guān)。可能的情況是，在使用21g/升添加的BP自溶物中的發(fā)酵，產(chǎn)率稍高，0.21-0.22g賴氨酸HCl/g葡萄糖。
結(jié)論發(fā)酵研究顯然證實(shí)BP自溶物是soytone的另一種良好的選擇且看起來(lái)在發(fā)酵罐中的產(chǎn)率方面優(yōu)于soytone。產(chǎn)率增加可能是使用BP自溶物的發(fā)酵中的細(xì)胞濃度高于使用相同量的soytone的發(fā)酵中的細(xì)胞濃度導(dǎo)致的。對(duì)其原因尚不了解，但可能的情況是BP自溶物因其細(xì)菌來(lái)源而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)要求在諸如核糖核酸、細(xì)胞壁構(gòu)成成分、脂類等這類成分方面的適應(yīng)性上優(yōu)于soytone。
權(quán)利要求
1.來(lái)源于包括甲烷營(yíng)養(yǎng)菌的細(xì)菌培養(yǎng)物的生物質(zhì)且任選含有其它營(yíng)養(yǎng)物的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物組合物作為微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基的應(yīng)用。
2.培養(yǎng)微生物的方法，包括使微生物與其生長(zhǎng)培養(yǎng)基彼此接觸的步驟，其特征在于所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基為無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物組合物或由其制備，該無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物組合物來(lái)源于包括甲烷營(yíng)養(yǎng)菌的細(xì)菌培養(yǎng)物的生物質(zhì)且任選添加了其它營(yíng)養(yǎng)物。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的應(yīng)用或方法，其中所述的營(yíng)養(yǎng)物組合物包括所述生物質(zhì)的水解產(chǎn)物、勻化物或自溶物，優(yōu)選自溶物。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用或方法，其中所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)一步包括葡萄糖和/或硝酸鹽和無(wú)機(jī)鹽(例如鉀、鈣、鎂、鈉、鉬、鐵、鋅、硼、鈷、錳和鎳化合物)。
5.如權(quán)利要求4中所述的應(yīng)用或方法，其中在所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中存在的葡萄糖與生物質(zhì)衍生成分的以干物質(zhì)計(jì)的重量比為5∶1-1∶5(尤其是2∶1-1∶2)。
6.如權(quán)利要求4或權(quán)利要求5中所述的應(yīng)用或方法，其中所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中存在的硝酸鹽和無(wú)機(jī)酸與衍生生物質(zhì)的成分的以干物質(zhì)計(jì)的重量比為0.01∶1-0.2∶1(尤其是0.05∶1-0.1∶1)。
7.如上述任意權(quán)利要求中所述的應(yīng)用或方法，其中用于產(chǎn)生生物質(zhì)的細(xì)菌培養(yǎng)物至少為50％、優(yōu)選至少為60％、尤其是至少為70％、特別是至少為75％、例如75-95％、更特別的是75-80％重量的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌(占總細(xì)菌重量)。
8.如上述任意權(quán)利要求中所述的應(yīng)用或方法，其中所述的細(xì)菌培養(yǎng)物包括甲烷營(yíng)養(yǎng)菌中的至少一個(gè)種類和異養(yǎng)菌中的至少一個(gè)種類。
9.如權(quán)利要求8中所述的應(yīng)用或方法，其中所述的培養(yǎng)物包括莢膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB11132)、Ra1stonia sp.DB3(菌株NCIMB13287)和Brevibacillus agri DB5(菌株NCIMB 13289)任選與Aneurinibacillus sp.DB4(菌株NCIMB 13288)的組合。
10.如上述任意權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用或方法，其中所述的細(xì)菌培養(yǎng)物通過(guò)對(duì)烴級(jí)分或?qū)μ烊粴獍l(fā)酵而產(chǎn)生、優(yōu)選通過(guò)對(duì)天然氣發(fā)酵而產(chǎn)生。
11.包括如權(quán)利要求1-3和7-10中任意一項(xiàng)所定義的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物組合物的微生物生長(zhǎng)基質(zhì)，進(jìn)一步含有至少一種無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物且任選含有稀釋劑。
12.如權(quán)利要求11中所述的基質(zhì)，其中所述的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物選自葡萄糖、硝酸鹽和無(wú)機(jī)鹽(例如鉀、鈣、鎂、鈉、鉬、鐵、鋅、硼、鈷、錳和鎳化合物)及其組合。
13.如權(quán)利要求12中所述的基質(zhì)，其中所含的葡萄糖與生物質(zhì)衍生成分的以干物質(zhì)計(jì)的重量比為5∶1-1∶5(尤其是2∶1-1∶2)。
14.如權(quán)利要求12或權(quán)利要求13中所述的基質(zhì)，其中所含的硝酸鹽和無(wú)機(jī)酸與生物質(zhì)衍生成分的以干物質(zhì)計(jì)的重量比為0.01∶1-0.2∶1(尤其是0.05∶1-0.1∶1)。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物組合物的微生物生長(zhǎng)基質(zhì)，所述的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物組合物來(lái)源于包括甲烷營(yíng)養(yǎng)菌的細(xì)菌培養(yǎng)物的生物質(zhì)且進(jìn)一步含有至少一種無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)物。優(yōu)選的生物質(zhì)來(lái)源于微生物培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物包括莢膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)、Ralstonia sp.DB3(菌株NCIMB 13287)和Brevibacillus agri DB5(菌株NCIMB 13289)任選與Aneurinibacillus sp.DB4(菌株NCIMB 13288)的組合。
文檔編號(hào)C12N1/00GK1659272SQ03813386
公開(kāi)日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月19日
發(fā)明者艾納·莫恩, 珍妮特·M·喬根森, 卡倫·M·詹森, 阿里爾德·約翰尼森 申請(qǐng)人:諾弗姆公司