專利名稱：：新型的重組抗凝血蛋白的制作方法本專利申請(qǐng)優(yōu)先于2002年六月六日申請(qǐng)的專利號(hào)為60/386932的臨時(shí)美國專利申請(qǐng)。2002年六月六日申請(qǐng)的專利號(hào)為60/386932的臨時(shí)美國專利申請(qǐng)中全部內(nèi)容在此以參考資料被綜合。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明整體上涉及抗凝血蛋白，重點(diǎn)涉及新型的重組血液凝固抑制劑。組織因子(Tissuefactor，TF)被公認(rèn)為是在正常止血和各種凝血異常及血栓性疾病中的血液凝固生理啟動(dòng)因子。組織因子在正常情況下在某些血管外細(xì)胞表面作為一種膜整合蛋白存在，但也可在受到刺激的血管內(nèi)皮和單核細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)[見綜述(1)]。根據(jù)在全血和人工膜系統(tǒng)中的研究(2-5)，組織因子啟動(dòng)的凝血關(guān)鍵過程可用圖1來說明。當(dāng)組織因子暴露于血液時(shí)，與血液循環(huán)中的凝血因子VII/VIIa形成復(fù)合物。所形成的外源性的因子X活化酶復(fù)合物(tenasecomplex，TF/VIIa)在表面具有組織因子的細(xì)胞/微粒上通過活化少量的因子IX和X啟動(dòng)凝血連鎖反應(yīng)。由TF/VIIa激活的活化的因子IX和X在隨后的凝血反應(yīng)中起著重要的作用。因子X在具有組織因子的膜表面上與因子Va/V形成復(fù)合物，產(chǎn)生少量的凝血酶，這少量的凝血酶再部分激活血小板，裂解纖維蛋白原形成早期凝塊，并激活因子V，VIII和XI。在這早期凝血反應(yīng)之后，是凝血酶產(chǎn)生的傳播。在這傳播期，活化的血小板為內(nèi)源性因子X活化酶(VIIIa/IXa)和凝血酶原酶(Va/Xa)的形成提供了陰離子表面膜，二者十分有效地分別激活因子X和凝血酶原，導(dǎo)致爆發(fā)性地凝血酶生成和纖維蛋白-血小板凝塊的加固。有三種血漿抗凝系統(tǒng)分別在不同的反應(yīng)部位調(diào)節(jié)凝血系列反應(yīng)。組織因子途徑抑制物(Tissuefactorpathwayinhibitor，TFPI)與因子Xa形成抑制性復(fù)合物反饋性地抑制TF/VIIa，從而影響凝血的初始期。抗凝血酶III(AntithrombinIII，AT-III)主要通過在凝血傳播期抑制凝血酶和Xa來發(fā)揮其作用。而活化的蛋白質(zhì)C(ActivatedproteinC，APC)則通過蛋白水解滅活Va和VIIIa。膜表面上的陰離子磷脂，主要是磷脂酰絲氨酸(phosphatidyl-L-serine，PS)對(duì)于促使凝血連鎖反應(yīng)的發(fā)生和傳播的血液凝固酶復(fù)合物(外源性和內(nèi)源性因子X激活酶，凝血酶原酶和XIa)在膜上的的形成及催化活性的表達(dá)都十分重要。正常情況下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞漿膜上的磷脂是非對(duì)稱分布的，PS都局限于膜內(nèi)側(cè)面(6)。正因?yàn)镻S局限于膜內(nèi)側(cè)面，完整的靜止細(xì)胞是無促凝活性的。在細(xì)胞活化，細(xì)胞受到損傷或凋亡性刺激等情況下，磷脂在漿膜上的非對(duì)稱分布不能維持，導(dǎo)致PS暴露于細(xì)胞膜外表面及膜“微顆粒”的脫落。PS暴露于細(xì)胞膜外表面有利與血液凝固酶與其輔因子在膜上形成復(fù)合物，并與其底物發(fā)生作用，從而增強(qiáng)凝血反應(yīng)(7-9)。在完整細(xì)胞膜上形成的TF/VIIa復(fù)合物通常對(duì)其底物是隱蔽，無活性的。但在細(xì)胞被破損，受到某些因子激惹或凋亡發(fā)生時(shí)，PS可暴露于膜外表面，這時(shí)可觀察到TF/VIIa復(fù)合物活性數(shù)倍地升高(去隱蔽，de-cryption)(10-14)。TF摻入在僅由PC組成的微粒時(shí)激活因子X的速率只是摻入在由PS組成的微粒時(shí)的5％。這些觀察提示同時(shí)相的TF表達(dá)和PS暴露對(duì)于凝血的啟動(dòng)十分重要。在止血和血栓形成的過程中，已知血小板可提供形成內(nèi)源性因子X活化酶(VIIIa/IXa)和凝血酶原酶(Va/Xa)的陰離子膜表面(7，16)。血小板一旦活化，PS迅速出現(xiàn)在血小板膜表面上。因子VIIIa與膜表面磷脂相互作用產(chǎn)生鈣依賴性，具有高親和力的因子IXa結(jié)合點(diǎn)，導(dǎo)致內(nèi)源性因子X活化酶形成。同樣，因子Va與陰離子磷脂結(jié)合帶動(dòng)鈣依賴性因子Xa的結(jié)合，形成凝血酶原酶復(fù)合物。因子XIa有效地催化因子IX轉(zhuǎn)變?yōu)橐蜃覫Xa也依賴于PS暴露的膜表面。TFPI是一種調(diào)節(jié)人類血管內(nèi)經(jīng)組織因子途徑啟動(dòng)的凝血的多價(jià)Kunitz型抑制物(17)。TFPI除直接抑制因子Xa外，也以一種依賴因子Xa的方式，反饋性地抑制TF/VIIa復(fù)合物，從而阻遏組織因子途徑蛋白酶系列反應(yīng)。雖然TFPI在生理上對(duì)組織因子途徑的調(diào)節(jié)非常重要，但由于其有效阻斷血管內(nèi)血栓形成所需的劑量很大，目前在臨床抗血栓治療的應(yīng)用開發(fā)中仍受到限制(18-20)。幾種其它天然存在的可結(jié)合組織因子途徑中因子VIIa，IXa，Xa和XIa的Kunitz型抑制物已被報(bào)告。這包括來自水蛭的Antistasin(ATS)(21)，壁蚤抗凝肽(TickAnticoagulantPeptide，TAP)(22)，兩種特異性地抑制因子Xa的鉤蟲抗凝肽(AncylostomacaninumAnticoagulantPeptides，AcAP5和AcAP6)(23)和另一種抑制因子VIIa的鉤蟲抗凝肽(AcAPc2)(23)以及抑制因子VIIa，IXa，Xa和XIa的淀粉樣β蛋白前體Kunitz抑制基團(tuán)(Kunitz-inhibitorydomainofamyloidβ-proteinprecursor，KAPP)。通過點(diǎn)突變和噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)，產(chǎn)生出了對(duì)兩類對(duì)不同的凝血蛋白酶(TF/VIIa，Xa，XIa和激肽釋放酶等)具有高親和力(Ki低于納摩爾級(jí))的KAPP和抑肽酶的同源物(28-31)。然而這些突變體在體外抗凝測(cè)定(組織因子啟動(dòng)的凝血測(cè)定和活化部分凝血酶原時(shí)間)中活性很低。抑肽酶同源物在體內(nèi)血管損傷模型中達(dá)到抗血栓效果所需要的溶度也很高(31)。本發(fā)明簡介本發(fā)明提供幾種新型的重組抗凝蛋白，生產(chǎn)這些重組抗凝蛋白的方法和所需的物質(zhì)材料，以及其在臨床治療中的使用方法。本專利發(fā)明首選的一類新型的重組抗凝蛋白可用將一種能和PS相結(jié)合的蛋白annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)與作用于酶復(fù)合物中絲氨酸蛋白酶的Kunitz型蛋白酶抑制物(KPI)相連接而成。所形成的融合蛋白的抗凝活性遠(yuǎn)高于其組成蛋白。其中幾種重組蛋白的活性大大高于血液中存在的組織因子途徑凝血天然抑制物TFPI。這些ANV-Kunitz型抑制物(ANV:KPI)融合體代表了一類新型的抗凝物。這類新型的抗凝物特異性地作用于PS被暴露，具有前凝血活性的膜表面上的血液凝固酶復(fù)合物，因而可成為一類能掩蓋引發(fā)血栓形成的血管壁及其相連血栓的抗血栓治療劑。因此，本專利的特征是提供了由annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)組成的融合蛋白為代表的一類重組抗凝蛋白。本專利的另一特征是提供的另一類重組抗凝蛋白包括諸如ANV和壁蚤抗凝肽(TickAnticoagulantPeptide，TAP)(序列編號(hào)1)，或抑肽酶變體(6L15)(序列編號(hào)2)，或淀粉樣β蛋白前體的Kunitz抑制基團(tuán)(KAPP)(序列編號(hào)3)，及KKTFPI22-160(序列編號(hào)4)形成的重組抗凝蛋白。本專利的又一特征是提供另一類抗血栓成分。該抗血栓成分由annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)形成的融合蛋白形成的另一類重組抗凝蛋白組成。本專利另一特征是提供的其它抗血栓成分包括諸如TAP-ANV(序列編號(hào)1)，ANV-6L15(序列編號(hào)2)，ANV-KAPP(序列編號(hào)3)，andANV-KKTFPI22-160(序列編號(hào)4)融合蛋白。本專利的又一特征是提供了一種對(duì)哺乳類生物個(gè)體通過給予有效劑量的重組抗凝蛋白來抑制該個(gè)體血液凝固的方法。該組抗凝蛋白由annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)和一種Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合而成。本專利的又一特征是提供了一種將annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)和一種Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)連接起來產(chǎn)生重組抗凝蛋白的方法。本專利的又一特征是提供了在需要時(shí)給具有過度血栓形成表現(xiàn)的個(gè)體進(jìn)行治療或預(yù)防的方法，如給于該個(gè)體有效劑量的由annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)和一種Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合物組成的抗血栓成分。本專利的又一特征是提供了一種重組DNA分子，這種DNA分子由編碼annexinV(ANV)的DNA序列(序列編號(hào)9)和編碼Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)的第二段DNA序列組成。本專利另一特征是提供了包括來自由TAP-ANV(序列編號(hào)5)，ANV-6L15(序列編號(hào)6)，ANV-KAPP(序列編號(hào)7)和ANV-KKTFPI(序列編號(hào)8)，或保留替代變異等其它的重組DNA分子。本專利的又一特征是提供了制備表達(dá)由annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合體形成的重組抗凝蛋白的細(xì)胞株的過程。此過程包括將含有編碼ANV或保留替代變異體和編碼KPI的cDNA序列的重組表達(dá)載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞。本專利的又一特征是提供了一種由兩條核苷酸序列組成的重組表達(dá)質(zhì)粒。第一段核苷序列編碼annexinV(ANV)(序列編號(hào)9)，胱氨酸315-丙氨酸突變ANV(序列編號(hào)14)或保留替代變異體等的核苷酸序列。第二段核苷序列是帶有一附加序列的Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)核苷酸序列。所帶的附加序列能指導(dǎo)由ANV和KPI融合體組成的重組抗凝蛋白在穩(wěn)定傳染的細(xì)胞株培養(yǎng)體系中合成。本專利的另一特征是還提供含有諸如TAP-ANV(序列編號(hào)5)，ANV-6L15(序列編號(hào)6)，ANV-KAPP(序列編號(hào)7)和ANV-KKTFPI(序列編號(hào)8)或保留替代變異體等核苷酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒。圖示簡要說明圖一組織因子啟動(dòng)的血液凝固概圖因子VII結(jié)合于TF暴露的細(xì)胞/微粒上的TF，活化為VIIa。TF/VIIa復(fù)合物激活因子IX和X。因子Xa在局部激活產(chǎn)生少量的凝血酶(IIa)。這少量的凝血酶再活化血小板，激活因子V，從vonWillebrand因子釋放出因子VIII，并激活因子VIII和XI。TF/VIIa激活的因子IXa可結(jié)合于活化的血小板上的因子VIIIa，形成內(nèi)源性因子X活化酶。所形成內(nèi)源性因子X活化酶可高效地激活因子X。血小板上激活的因子Xa結(jié)合因子Va形成凝血酶原酶(Va/Xa)，所形成的凝血酶原酶再促使大量的凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?。有三類血漿抗凝系統(tǒng)調(diào)節(jié)凝血反應(yīng)TFPI直接抑制Xa，并以Xa依賴方式反饋性地抑制TF/VIIa；抗凝血酶III主要抑制Xa和凝血酶；APC水解滅活Va和VIIIa。按Roberts等(5)和MannK(3)等改編。圖二AnnexinV及其與各種Kunitz型抑制物的融合產(chǎn)物概圖。ANV，(annexinV，序列編號(hào)10)；丙氨酸-壁蚤抗凝肽(Ala-TickAnticoagulantPeptide)，一種經(jīng)甘氨酸-絲氨酸二肽連接于annexinV的TAP-ANV(序列編號(hào)1)；ANV-6L15(序列編號(hào)2)，一種連接于6L15(一種與TF/VIIa有高親和力的Kunitz型抑制物)的annexinV；ANV-KAPP(序列編號(hào)3)，一種連接于KAPP(淀粉樣β蛋白前體的Kunitz型抑制基團(tuán))的annexinV；ANV-KKTFPI(序列編號(hào)4)，一種連接于KKTFPI(含Kunitz-1和Kunitz-2基團(tuán)的TFPI22-161)的annexinV。圖三純化的ANV及其與各種Kunitz型蛋白酶抑制物形成的融合體的SDS-PAGE分析。樣品在非還原(A)與還原(B)條件下經(jīng)12％SDS-PAGE凝膠電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色。所有樣品在無(A)或有(B)50mM二巰基丙醇存在的情況下煮沸3分鐘。每電泳孔加樣5μg蛋白質(zhì)。泳道1分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道2ANV-KKTFPI(序列編號(hào)4)；泳道3ANV-6L15(序列編號(hào)2)；泳道4TAP-ANV(序列編號(hào)1)；泳道5ANV-KAPP(序列編號(hào)3)；泳道6ANV(序列編號(hào)10)。圖四各種純化的抑制物對(duì)豬胰蛋白酶和牛因子Xa的抑制。對(duì)胰蛋白酶和牛因子Xa的抑制按在以下“方法”一項(xiàng)中所述的酯水解測(cè)定(amidolyticassay)進(jìn)行?；罨囊鹊鞍酌负团Ｒ蜃覺a溶度用4-nitrophenylp’-guanidinobenzoate對(duì)其活化點(diǎn)的滴定來測(cè)定(41，42)。純化的抑制物溶度用在280nm波長處的吸光度測(cè)定。測(cè)定ANV-6L15，6L15，TAP-ANV，TAP，ANV-KAPP和ANV-KKTFPI所用的克分子吸光系數(shù)分別為28170，7120，39550，18500，31300和30170。(A)ANV-6L15對(duì)胰蛋白酶的抑制；(B)6L15對(duì)胰蛋白酶的抑制；(C)TAP-ANV對(duì)因子Xa的抑制；(D)TAP對(duì)因子Xa的抑制；(E)ANV-KAPP對(duì)胰蛋白酶的抑制；(F)ANV-KKTFPI對(duì)因子Xa的抑制。圖五各種抑制物對(duì)活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的影響。APTT用APTT-SP試劑(InstrumentLaboratories)在ACL200凝血計(jì)上測(cè)定。人混合血漿(180μl)與分別與20μl各種抑制物混合，使各抑制物在混合血漿達(dá)中到測(cè)定所需的終溶度。含對(duì)照緩沖液的血漿凝固時(shí)間為40.7秒。TFPI(m)為來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞株C127的FL-TFPI。專利發(fā)明的詳細(xì)說明為了進(jìn)一步對(duì)本專利發(fā)明和優(yōu)先例證細(xì)節(jié)進(jìn)行說明，特將專利發(fā)明與所附圖示一并詳細(xì)描述如下。血液凝固連鎖反應(yīng)主要以形成酶復(fù)合物來進(jìn)行。每種復(fù)合物包括在陰離子膜表面上與和膜結(jié)合的輔因子/受體相連的絲氨酸蛋白酶類。這些復(fù)合物通常稱之為外源性因子X活化酶(因子VIIa-組織因子)，內(nèi)源性因子X活化酶(因子IXa-因子VIIIa)，凝血酶原酶(因子Xa-因子Va)和因子XIa復(fù)合物。如上所述，已產(chǎn)生一系列新的重組抗凝融合蛋白，如通過將磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合蛋白annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)連接作用于酶復(fù)合物中絲氨酸蛋白酶的Kunitz型蛋白酶抑制物(KPI)。所產(chǎn)生的融合蛋白表現(xiàn)出比其組份單獨(dú)活性甚至活性相加強(qiáng)得多的抗凝活性。為方便起見，這些重組融合抗凝蛋白簡稱為ANV:KPI。這些融合蛋白利用了ANV對(duì)磷脂酰L-絲氨酸(PS)的高親和力(32)和各種KPI對(duì)凝血反應(yīng)中膜上凝血復(fù)合物中絲氨酸蛋白酶的抑制活性。在這些新的組合蛋白中，有些具有比TF啟動(dòng)的凝血的天然抑制物TFPI高得多的活性。AnnexinVKunitz型蛋白酶抑制物，即ANV:KPI融合蛋白代表了一類新的抗凝劑。這類抗凝劑特異性地作用于具有前凝血活性，PS暴露的膜表面上的血液凝固酶復(fù)合物，因而可作為一種具有掩蓋可致血栓形成的血管壁及相連血栓能力的抗血栓治療劑。這類新型的融合蛋白可用于治療與具有嚴(yán)重血栓形成有關(guān)的疾病和狀態(tài)。這包括動(dòng)脈血栓性病變，如不穩(wěn)定性心絞痛，心肌梗塞，心型猝死，缺血性中風(fēng)，動(dòng)脈瘤破裂，間隙性跛行和嚴(yán)重肢體缺血；靜脈血栓形成如深部靜脈血栓形成，肺血栓栓塞，血栓型靜脈炎及慢性靜脈功能不全；其它的臨床情況如手術(shù)引起的血栓形成，人工心臟瓣膜，動(dòng)脈樣硬化，血管再狹窄，缺血再灌流損傷，敗血癥，廣泛性血管內(nèi)凝血，急性肺損傷，惡性腫瘤，慢性腎衰竭，腎病綜合癥，半月狀腎小球腎炎(crescenticglomerulonephritis)，糖尿病，鐮狀紅細(xì)胞性貧血，地中海貧血，抗磷脂綜合癥，體外循環(huán)，血液透析，腹膜透析和annexinopathies。為了進(jìn)一步闡明本專利發(fā)明，現(xiàn)舉證以下實(shí)驗(yàn)室特例。但需注意本發(fā)明不限于此處描述的特例或細(xì)節(jié)。舉例材料和方法試劑尿素(測(cè)序級(jí))和Brij35來自Pierce?；旌闲蛯游鲋矘渲珹G501-X8，SDS-PAGE試劑，及分子量標(biāo)準(zhǔn)物購自BioRad。DadeInnovin來自BaxterDiagnosticsInc.(Deerfield，IL)。APTT-SP來自InstrumentationLaboratory(Lexington，MA)。牛因子Xa由AmericanDiagnostica，Inc.(Greenwich，CT)供應(yīng)。胰蛋白酶，p-nitrophenylp’-guanidinobenzoateHCl，牛腦提取物，膽固醇和二乙酰磷酸鹽購自Sigma(St.Louis，MO)。合成底物S2444和S2765來自diaPharma(WestChester，OH)。新鮮冷凍人血漿購自臺(tái)北血液中心。C127哺乳動(dòng)物細(xì)胞株和E.coli重組TFPIs按以前所述制備(33，34)。重組X-K1(人因子X的C端多肽與TFPI第一個(gè)Kunitz基團(tuán)融合物)(35)和TFPI1-160由GeorgeBroze，Jr.博士(WashingtonUniversity)贈(zèng)送。酵母重組TAP由DanaAbendschein博士(WashingtonUniversity)贈(zèng)送。AannexinVcDNA克隆終止密碼缺如的ANVcDNA用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)從人胎盤組織mRNA產(chǎn)生。所用的ANV反向引物(reverseprimer)為5’-ATCAAGCTTATGCATGTCATCTTCTCCACAGAG-3’(序列編號(hào)11)，正向引物(forwardprimer)為5’-GATCGGATCCAGTCTGGTCCTGCTTCACCTT-3’(序列編號(hào)12)。ATGCAT是限制性內(nèi)切酶NsiI的內(nèi)切點(diǎn)。該點(diǎn)用來連接6L15，KAPP，或KKTFPI22-161基因片段。Cys315-Ala突變ANVcDNA用PCR技術(shù)產(chǎn)生。所用寡聚核苷酸X為5’-CGTGACATGCATGTCATCTTCTCCAGCGAGCA-3’(序列編號(hào)13)。所用寡聚核苷酸X序列中的GC(用黑體表示)由CA變來，這是為了把原來的胱氨酸密碼變?yōu)楸彼崦艽a。重組ANV的表達(dá)沒有Cys315突變。所有其它ANV:KPI融合體均含有Cys315-Ala突變ANVcDNA(序列編號(hào)14)。Cys/Ala在PCR擴(kuò)增的缺少起始蛋氨酸密碼的ANVcDNA中的位置編號(hào)為315。6L15，TAP和KAPP基因構(gòu)建編碼6L15的合成基因由三對(duì)重疊的寡聚核苷酸構(gòu)建。三條正向寡聚核苷酸是BP-1(5’-TCCGGACTTCTGCCTGGAACCGCCGTACGACGGTCCGTGCCGTGCTCTGCACCTGCGTTACTTC-3’)(序列編號(hào)15)；BP-2(5’-TACAATGCAAAGGCAGGCCTGTGTCAGACCTTCTACTACGGCGGTTGCCTGGCTAAGCGT-3’)(序列編號(hào)16)；和BP-3(5’-AACAACTTCGAATCCGCGGAACACTGCATGCGTACTTGCGGTGGTGCTTA-3’)(序列編號(hào)17)。三條反向寡聚核苷酸是BP-1-3’(5’-ACGCAGGTGCAGAGCACGGCACGGACCGTCGTACGGCGGTTCCAGGCAGAAGTCCGGATGCAT-3’)(序列編號(hào)18)；BP-2-3’(5’-AGCCAGGCAACCGCCGTAGTAGAAGGTCTGACACAGGCCTGCCTTTGCATTGTAGAAGTA-3’)(序列編號(hào)19)和BP-3-3’(5’-AGCTTAAGCACCACCGCAAGTACGCATGCAGTCTTCCGCGGATTCGAAGTTGTTACGCTT-3’)(序列編號(hào)20)。中間的寡聚核苷酸用T4多核苷酸磷酸激酶磷酸化。三對(duì)互補(bǔ)寡聚核苷酸用加熱到95°再慢慢冷卻到室溫分別配對(duì)雜交(anneale)。配對(duì)雜交后的寡聚核苷酸用T4DNA連接酶連接組成6L15基因。寡聚核苷酸序列BP-1-3’中的內(nèi)切酶NsiI內(nèi)切點(diǎn)ATGCAT由原來的精氨酸密碼設(shè)計(jì)改變?yōu)榻M氨酸密碼以便連接到ANV基因片段。為了6L15的表達(dá)，原來的精氨酸密碼由丙氨酸密碼替代。6L15的合成基因由下列序列組成GCTCCGGACTTCTGCCTGGAACCGCCGTACGACGGTCCGTGCCGTGCTCTGCACCTGCGTTACTTCTACAATGCAAAGGCAGGCCTGTGTCAGACCTTCTACTACGGCGGTTGCCTGGCTAAGCGTAACAACTTCGAATCCGCGGAAGACTGCATGCGTACTTGCGGTGGTGCTTAA(序列編號(hào)21)。合成丙氨酸-TAP基因按Neeper等(36)所述用合成寡聚核苷酸合成。所合成的丙氨酸-TAP基因由如下序列組成GCTTACAACCGTCTGTGCATCAAACCGCGTGACTGGATCGATGAATGCGACTCCAACGAAGGTGGTGAACGTGCTTACTTCCGTAACGGTAAAGGTGGTTGCGACTCCTTCTGGATCTGCCCGGAAGACCACACCGGTGCTGACTACTACTCCTCCTACAACGACTGCTTCAACGCTTGCATCTAA(序列編號(hào)22)；兩端具有序列的KAPP合成基因由兩對(duì)重疊的合成寡聚核苷酸構(gòu)建。兩條正向寡聚核苷酸是KAPP-1(5’-GGCCCTACCCCACAGATACGGAGTTGCCACCACTGAAACTTGAGGTTGTTAGAGAGGTTTGTTCTGAGCAAGCTGAGACTGGTCCATGTAGAGCTATGATTTCTAGATGGTACTTCGACGTT-3’)(序列編號(hào)23)和KAPP-2(5’-ACTGAGGGTAAGTGTGCTCCATTCTTCTACGGTGGTTGTGGTGGTAACAGAAACAACTTCGACACTGAGGAGTACTGTATGGCTGTTTGTGGTTCTGCTATTTAAATGCATTGATGA-3’)(序列編號(hào)24)。兩條反向寡聚核苷酸是KAPP-1-3’(5’-CTCAGTAACGTCGAAGTACCATCTAGAAATCATAGCTCTACATGGACCAGTCTCAGCTTGCTCAGAACAAACCTCTCTAACAACCTCAAGTTTCAGTGGTGGCAACTCCGTATCTGTGGGGTAG-3’)(序列編號(hào)25)和KAPP-2-3’(5’-AGCTTCATCAATGCATTTAAATAGCAGAACCACAAACAGCCATACAGTACTCCTCAGTGTCGAAGTTGTTTCTGTTACCACCACAACCACCGTAGAAGAATGGAGCACACTTACC-3’)(序列編號(hào)26)。劃線部分是編碼KAPP基團(tuán)的互補(bǔ)序列。兩對(duì)核苷酸用T4多核苷酸磷酸激酶磷酸化，加熱到95°再慢慢冷卻到室溫配對(duì)雜交。配對(duì)雜交后的寡聚核苷酸用T4-DNA連接酶連接。KAPP基團(tuán)的合成基因由下列序列組成GAGGTTTGTTCTGAGCAAGCTGAGACTGGTCCATGTAGAGCTATGATTTCTAGATGGTACTTCGACGTTACTGAGGGTAAGTGTGCTCCATTCTTCTACGGTGGTTGTGGTGGTAACAGAAACAACTTCGACACTGAGGAGTACTGTATGGCTGTTTGTGGTTCTGCTATTTAA(序列編號(hào)27)E.coli表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建為了構(gòu)建表達(dá)ANV-6L15和NV-KKTFPI的質(zhì)粒，下列引物被用于PCR擴(kuò)增和亞克隆于pET20b表達(dá)載體ANV-nde(5’-GGAATTCCATATGGCACAGGTTCTCAGAGG-3’)(序列編號(hào)28)，ANV-nsi(5’-CCAATGCATGTCATCTTCTCCAGC-3’))(序列編號(hào)29)，6L15-nsi(5’-CCAATGCATCCGGACTTCTGCCTG-3’))(序列編號(hào)30)，KKTFPI-nsi(5’-CCAATGCATTCATTTTGTGCATTC-3’))(序列編號(hào)31)，6L15-sal(5’-ACGCTTAAGCACCACCGCAAG-3’)(序列編號(hào)32)，andKKTFPI-sal(5’-ACGCTTAGGTTCCATAATTATCC-3’)(序列編號(hào)33)。序列中劃線部分是內(nèi)切酶NdeI內(nèi)切點(diǎn)，方框部分是內(nèi)切酶SalI內(nèi)切點(diǎn)。劃線部分ATGCAT是用來做基因融合的內(nèi)切酶Nsi內(nèi)切點(diǎn)。大體字ATG是蛋氨酸啟動(dòng)密碼，大體字TTA是終止密碼TAA的互補(bǔ)序列。KKTFPI22-161基因片段是用引物KKTFPI-nsi(序列編號(hào)31)和KKTFPI-sal(序列編號(hào)33)從全長TFPIcDNA克隆(34)經(jīng)PCR放大得來。PCR放大ANV基因片段經(jīng)內(nèi)切酶NdeI和內(nèi)切酶NsiI消化再連接到經(jīng)內(nèi)切酶NdeI和內(nèi)切酶NsiI消化的6L15(orKKTFPI)PCR片段。所得融合基因連接入經(jīng)內(nèi)切酶NdeIand內(nèi)切酶SalI切開的pET20b(+)表達(dá)載體。為了構(gòu)建表達(dá)TAP-ANV的質(zhì)粒，下列引物被用于PCR將融合基因亞克隆于pET20b表達(dá)載體TAP-nde(5’-GGAATTCCATATGGCTTACAACCGTCTGTG-3’)(序列編號(hào)34)；TAP-bam(5’-CGGGATCCGATGCAAGCGTTGAAGCAG-3’)(序列編號(hào)35)；ANV-bam(5’-CGGGATCCGCACAGGTTCTCAGAGGC-3’)(序列編號(hào)36)；ANV-sal(5’-ACGCTTAGTCATCTTCTCCAGCG-3’)(序列編號(hào)37)。PCR擴(kuò)增的TAP基因片段經(jīng)內(nèi)切酶NdeI和內(nèi)切酶BamHI消化后再連接到經(jīng)內(nèi)切酶NdeI和BamHI消化的ANV基因片段。所得融合基因連接入經(jīng)內(nèi)切酶NdeI和SalI切開的pET20b(+)表達(dá)載體。所需的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和DNA測(cè)序篩選。表達(dá)質(zhì)粒命名為pET20b-AB8，pET20b-AKK11和pET20b-TAP-A。它們?cè)贓.coli細(xì)胞內(nèi)由啟動(dòng)子T7控制分別表達(dá)重組蛋白ANV-6L15，ANV-KKTFPI和TAP-ANV。為了表達(dá)用于比較的ANV和6L15，PCR產(chǎn)生的ANV和6L15基因片段用同一過程分別嵌入到質(zhì)粒經(jīng)E.coli表達(dá)。E.coli表達(dá)重組蛋白的表達(dá)生物體采用E.coliBL21(DE3)pLysS[(F-ompThsdSB(rB-，mB-)galdcm(DE3)pLysS(Cam)R)](Novagene，Madison，WI)。E.coliDH5α[(F-(φ80dlacZΔM15)Δ(lacZYA-argF)U169endA1recA1hsdR17(rK-mK+)deoRthi-1supE44gyrA96relA1λ-)]用于表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。表達(dá)質(zhì)粒在E.coliDH5α增殖并從其分離，再轉(zhuǎn)染入冰凍保存的感受態(tài)(competent)E.coliBL21。單個(gè)克隆置入25-mlLB液體培養(yǎng)基(broth)(含100mg/Lampicillin和34mg/Lchloroamphenicol)培養(yǎng)，在37°和劇烈搖動(dòng)的條件下過夜繁殖。10ml過夜繁殖培養(yǎng)液再接種到裝在容量為2.8L燒瓶(Nalgene)中的1升同樣的培養(yǎng)基，在37°生長直到OD600值達(dá)到0.5。該培養(yǎng)液加入終溶度為1mMIPTG(Promega)，在37°和劇烈搖動(dòng)的條件下誘導(dǎo)生長4小時(shí)。coli細(xì)胞通過7000rpm離心12分鐘收集。離心沉淀的細(xì)胞置入-80°冰箱備用。酵母表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建Pichia表達(dá)載體pPIC9使用可誘導(dǎo)高效PAOX1啟動(dòng)子和α因子信號(hào)肽促使目的蛋白的表達(dá)和分泌。含目的基因的DNA片段克隆到兩端連有XhoI和NotI內(nèi)切點(diǎn)的分泌信號(hào)肽框架。從XhoI內(nèi)切點(diǎn)到編碼KEX2酶內(nèi)切點(diǎn)的目的基因啟動(dòng)密碼之間的序列對(duì)融合蛋白的有效裂解是必須的。用于產(chǎn)生克隆入載體pPIC9的PCR目的片段的設(shè)計(jì)引物是ANV-xho(5’-CCGCTCGAGAAAAGAGCACAGGTTCTCAGAG-3’)(序列編號(hào)38)，KAPP-not(5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAAATAGCAGAACCAC-3’)(序列編號(hào)39)，ANV-ecov(5’-CGCGATATCATCTTCTCCAGCGAG-3’)(序列編號(hào)40)和5’-KAPP(5’-GAGGTTTGTTCTGAGCAAGC-3’)(序列編號(hào)41)。序列CTCGAG和GCGGCCGC分別是XhoIandNotI限制性內(nèi)切點(diǎn)，分別用于編輯基因片段及連接入pPIC9載體。序列CTCGAGAAAAGA編碼典型的KEX2蛋白酶裂解點(diǎn)Leu-Glu-Lys-Arg，因此引物后的密碼被設(shè)計(jì)為分泌的目的蛋白的第一個(gè)密碼(用大體字表示)。為了制造ANV-KAPP融合基因，我們?cè)O(shè)計(jì)了ANV-ecov引物。該引物可產(chǎn)生位于ANV基因片段3’端的EcoRV內(nèi)切點(diǎn)而不需改變最后被編碼的氨基酸(Asp)。5’-KAPP引物是KAPP基因中從起始Glu密碼(GAG)開始的正向序列。由引物5’-KAPP和KAPP-not擴(kuò)增的KAPP基因片段用其鈍型末端與ANV基因連接而產(chǎn)生ANV-KAPP融合基因。ANV基因用引物ANV-xho和ANV-ecov經(jīng)PCR擴(kuò)增并經(jīng)內(nèi)切酶EcoRV裂解。所形成的融合基因經(jīng)內(nèi)切酶XhoI和NotI裂解，再連接到用同樣的內(nèi)切酶切開的pPIC9。連接反應(yīng)混合物被轉(zhuǎn)染入E.coliDH5α。所需的克隆經(jīng)PCR篩選并經(jīng)DNA序列分析證實(shí)，以鑒定框架內(nèi)的氨基酸序列及α因子信號(hào)肽。所制備的質(zhì)粒為pPIC9ANV-KAPP。Pichia表達(dá)酵母表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)E.coliDH5α增殖并從其分離。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前經(jīng)內(nèi)切酶SacI切開。含His4選擇標(biāo)記的α因子融合基因框架在AOX1位點(diǎn)經(jīng)電導(dǎo)轉(zhuǎn)染嵌入P.pastorisGS115(his4)的基因組DNA(37)。該重組菌株通過His4補(bǔ)償在MD(minimaldextrosemedium，不含氨基酸的1.34％yeastnitrogenbase，4×10-5％biotin，2％dextrose，1.5％bacto-agar)培養(yǎng)皿進(jìn)行生長選擇。將在MD培養(yǎng)皿生長的單一P.pastorisGS115重組菌株克隆接種到在容量為10ml長Pyrex管中的2mlBMGY培養(yǎng)基(bufferedglycerolcomplexmedium，1％yeastextract，2％peptone，100mMpotassiumphosphate，pH6.0，不含氨基酸的1.34％yeastnitrogenbase，4×10-5％biotin，1％glycerol)，在37°和200rpm劇烈搖動(dòng)的條件下過夜增殖生長，直到培養(yǎng)基OD600值達(dá)到2-6。取1ml培養(yǎng)基離心后將沉淀懸浮在容量為15ml長Pyrex管中的3mlBMMY培養(yǎng)基(bufferedmethanolcomplexmedium，1％yeastextract，2％peptone，100mMpotassiumphosphate，pH6.0，不含氨基酸的1.34％yeastnitrogen，4×10-5％biotin，0.5％methanol)。該培養(yǎng)基保持在30°和200rpm劇烈搖動(dòng)的條件下24小時(shí)表達(dá)分泌蛋白。細(xì)胞經(jīng)12,000rpm離心10分鐘，其上清液用來測(cè)定胰蛋白酶抑制活性。10μl上清液用來做12％SDS-PAGE電泳及表達(dá)的ANV-KappWesternblot檢測(cè)。在經(jīng)Pichia大規(guī)模ANV-KAPP表達(dá)中，將新鮮MD培養(yǎng)皿生長的單一P.pastorisGS115重組菌株克隆接種到在容量為300ml燒瓶中的25mlBMGY培養(yǎng)基，在37°和200rpm搖動(dòng)的條件下繁殖生長2天。再將這種處于對(duì)數(shù)生長期的培養(yǎng)細(xì)胞接種到在容量為1L燒瓶中的400ml新鮮BMGY培養(yǎng)基中，使其OD600值為0.1。該培養(yǎng)液保持在30°，直到OD600值達(dá)到2。細(xì)胞用無菌離心管通過12,000rpm離心10分鐘收集，懸浮在1LBMMY培養(yǎng)基中，再轉(zhuǎn)移到2.8L燒瓶中。該培養(yǎng)液保持在30°并搖動(dòng)，開始表達(dá)蛋白。經(jīng)24小時(shí)誘導(dǎo)后，細(xì)胞經(jīng)離心移去，上清液置于-80°冷凍。E.coli包聚體(inclusionbodies)分離懸浮冷凍的E.coli細(xì)胞團(tuán)(cellpaste)于冷Milli-Q水中，使其蛋白質(zhì)溶度為75mg/ml。細(xì)胞用勻漿器在冰中打散30分鐘。再用超聲波將細(xì)胞機(jī)械粉碎。細(xì)胞溶碎體(Lysate)在16,000g離心20分鐘，去掉上清液。收集沉淀包聚體。再將包聚體懸浮于等體積的冷Milli-Q水中，按上述再次勻漿化，超聲波粉碎和離心沉淀。收集包聚體置于-80°冷凍。包聚體磺化(Sulfonation)和陰離子交換層析用于磺化，陰離子交換層析和蛋白質(zhì)折疊的緩沖液含有高溶度尿素。所用尿素在與緩沖液混合前用BioRad混合型床樹脂AG501-X8在室溫下處理至少20分鐘并經(jīng)0.2μm濾膜過濾。一克包聚體(濕重)經(jīng)勻漿和振動(dòng)分散于40ml含50mMTris/HCl，pH8.0和7.5M尿素溶液中。在包聚體大部分溶解后，加入800mg硫酸鈉，再在室溫下?lián)u動(dòng)30分鐘。其后再加入400mg四氰酸鈉(sodiumtetracyanate)，混合液在4°下過夜振搖。此溶液再用400ml含20mMTris/HCl，pH8，和4M尿素的溶液透析。透析后的溶液用48,000g離心1小時(shí)，經(jīng)0.2mm濾膜過濾后在-80°儲(chǔ)藏。在陰離子交換層析時(shí)，40ml磺化和透析過的樣品在室溫下加樣到HiLoadQ-Sepaharose16/10層析柱。層析柱用含0.15M氯化鈉的Q緩沖液(20mMTris/HCl，pH8，6Murea，0.01％Brij35)平衡。層析柱用240ml平衡緩沖液沖洗，再用396mlQ緩沖液以每分鐘3ml流速進(jìn)行氯化鈉梯度洗脫(0.15-0.4M氯化鈉)。收集管每管收集洗脫液9ml。含所需蛋白質(zhì)的高峰部分經(jīng)SDS-PAGE分析后合并，用于蛋白質(zhì)折疊。含二硫鍵蛋白質(zhì)折疊以前描述的E.coliTFPI折疊的標(biāo)準(zhǔn)條件(34)也用于Kunitz抑制物和ANV:KPI融合蛋白質(zhì)的折疊。簡要地說，經(jīng)過磺化和陰離子交換層析的蛋白質(zhì)合并后用含0.3M氯化鈉的Q緩沖液稀釋到在280nm處光密度處為0.07。加入固體L-胱氨酸到終溶度為2mM。該溶液在室溫下放置24小時(shí)后用水以1∶1稀釋并加入1mML-胱氨酸。溶液在室溫下再放置24到48小時(shí)。對(duì)單一基團(tuán)的Kunitz蛋白質(zhì)，折疊時(shí)蛋白質(zhì)溶度可高一些而效果基本相同。6L15和ANV-KKTFPI的純化將6L15折疊反應(yīng)混合物(18ml)用1M的檸檬酸酸化到pH3.0，再用水以1∶1稀釋，通過經(jīng)pH為3.0的20mM檸檬酸酸鈉緩沖液平衡的1×8cmQ-Sepharose(快流速)柱。層析柱再用同樣的緩沖液進(jìn)行0.1到1M氯化鈉的梯度洗脫。6L15在0.5M氯化鈉時(shí)以一對(duì)稱峰洗脫出。ANV-KKTFPI折疊反應(yīng)混合物(600ml)用水以1∶1稀釋，通過經(jīng)pH為8.0，含5mMTris和75mM氯化鈉緩沖液平衡的1×8cmQ-Sepharose(快流速)柱。層析柱再用50ml平衡緩沖液沖洗。ANV-KKTFPI用pH為8.0，含5mMTris和0.25mM氯化鈉緩沖液洗脫。TAP-ANV，ANV-6L15，ANV和ANV-KAPP的純化TAP-ANV折疊反應(yīng)混合物(160ml)通過經(jīng)pH為7.4，含20mMTris緩沖液平衡的1×8cmQ-Sepharose(快流速)柱。層析柱再用50ml含0.15M氯化鈉的平衡緩沖液沖洗，再用同樣的緩沖液進(jìn)行0.15到0.35M氯化鈉的梯度洗脫。TAP-ANV在0.33M氯化鈉時(shí)以一對(duì)稱峰洗脫出。ANV-6L15折疊反應(yīng)混合物上柱到經(jīng)pH為9.5，含6.7mMTris，2M尿素，0.003％Brij35和0.1M氯化鈉的緩沖液平衡的1×8cmQ-Sepharose(快流速)柱。層析柱先后用40ml平衡緩沖液和30mlpH為7.4，含20mMTris的緩沖液沖洗，再用180mlpH為7.4，含20mMTris的緩沖液進(jìn)行0.1到1M氯化鈉的梯度洗脫。ANV-6L15約在0.28M氯化鈉時(shí)洗脫出。經(jīng)Q-Sepharose純化的TAP-ANV和ANV-6L15再按ThiagarajanandBenedict(38)所述的方法經(jīng)含PS的脂質(zhì)體吸附進(jìn)一步純化。多層脂質(zhì)體按Kinsky(39)所述的方法制備。含50％PS，150mg膽固醇和10mg二乙酰磷酸鹽的牛腦提取物溶于氯仿中，再在容量為40ml的玻璃管中用氮?dú)獯蹈?。加入TBS(10ml)于管中并用振搖器劇烈振搖5分鐘。脂質(zhì)體經(jīng)10,000g離心10分鐘收集。經(jīng)Q-Sepharose純化的TAP-ANV或ANV-6L15加入到脂質(zhì)體中，再加入終溶度為5mM的氯化鈣?；旌弦涸谑覝叵路胖?0分鐘，在10,000g離心10分鐘。所得沉淀按上述懸浮，離心程序用TBS-5mMC氯化鈣反復(fù)洗滌4次。TAP-ANV或ANV-6L15用pH為9.5，含10mMTris和5mMEDTA的溶液從脂質(zhì)體上洗脫。重組ANV用改進(jìn)的已描述方法(38)通過ANV結(jié)合于脂質(zhì)體直接從E.coli溶漿(lysate)分離。簡要地說，將表達(dá)ANV的E.coli沉淀物懸浮在pH為7.4，含50mMTris和10mMEDTA的溶液中，在冰上經(jīng)超聲振蕩取得細(xì)胞溶漿(lysate)。細(xì)胞溶漿儲(chǔ)存在-80°。將分裝的細(xì)胞溶漿溶化，用TBS透析，經(jīng)15,000g離心30分鐘澄清。澄清的細(xì)胞溶漿與含5mM氯化鈣的脂質(zhì)體溫育40分鐘，其后按上述進(jìn)行洗滌，離心和EDTA洗脫。重組ANV-KAPP表達(dá)后分泌到pichia培養(yǎng)液中。將該培養(yǎng)液濃縮10倍后用pH為7.4，含10mMTris和0.15M氯化鈉的緩沖液交換，再經(jīng)40,000g離心1小時(shí)澄清。澄清的培養(yǎng)液濃縮物與含5mM氯化鈣的脂質(zhì)體溫育，再按上述進(jìn)行洗滌，離心和EDTA洗脫。所有用EDTA溶液從脂質(zhì)體洗脫的蛋白質(zhì)均在20,000g離心1小時(shí)以將蛋白質(zhì)與大部分脂質(zhì)體分離。蛋白質(zhì)溶液再經(jīng)CentriPlusYM-100(Amicon)過濾以清除殘留微粒。蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)溶度用其在280nm處的吸光度測(cè)定。蛋白質(zhì)克分子吸光系數(shù)的理論值按GillandvonHippel(40)所述從氨基酸序列求得。所用的蛋白質(zhì)克分子消光系數(shù)如下ANV(21,050)；TAP-ANV(39,550)；ANV-6L15(28,170)；ANV-KAPP(31,300)；ANV-KKTFPI(30,170)；TAP(18,500)；6L15(7,120)；C127和E.coliFL-TFPI(20,650)；C127truncatedTFPI(19,370)；TFPI1-160(7,840)；X-K1(14,490)。胰蛋白酶和因子X抑制物活性的脂水解測(cè)定抑制物-蛋白酶相互作用的立體測(cè)量(stoichiometries)牛因子Xa(AmericanDiagnostica)和豬胰蛋白酶(Sigma)分別按Smith(41)和Chase及Shaw(42)所述用p-nitrophenylp’-guandininobenzoate滴定，以測(cè)定二者的溶度。TAP，TAP-ANV和ANV-KKTFPI對(duì)因子Xa的抑制活性用S2765做酯水解測(cè)定。10μl50nM牛因子Xa溶于DB緩沖液(10mMTris，pH7.5，0.15M氯化鈉，1mg/mlBSA，0.002％Tween，20-0.02％NaN3)中，與10μl稀釋在同樣緩沖液中的抑制物混合。在室溫下溫育30分鐘后，取10μl反應(yīng)液于96孔板中，加入85μl含5mMCaCl2的TBS緩沖液(50mMTris，pH7.5-0.15M氯化鈉，0.02％NaN3)混合。室溫下用SPECTRAmaxPLUS384(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)微板光度計(jì)在405nm處測(cè)定吸光度在60秒內(nèi)的變化。將豬胰蛋白酶溶于含1mMHCl和20mMCaCl2的50％甘油溶液中制備儲(chǔ)藏液置于-20°。6L15，ANV-6-L15和ANV-KAPP對(duì)胰蛋白酶的抑制活性以S2444為底物用酯水解法測(cè)定。稀釋于含0.1mg/mlBSA和20mMCaCl2的TBS緩沖液的胰蛋白酶溶液(23nM)由儲(chǔ)藏液新鮮配置。10μl胰蛋白酶溶液與10μl稀釋在同樣緩沖液中的抑制物在微板孔中混合。在室溫下溫育10分鐘后，加入75μl含20mMCaCl2的TBS緩沖液和5μl的10mMS2444，室溫下用微板光度計(jì)在405nm處測(cè)定吸光度在2分鐘內(nèi)的變化。在這兩種測(cè)定中，抑制物存在時(shí)的部分活性用在沒有抑制物存在時(shí)活性的百分率計(jì)算。血漿凝固時(shí)間測(cè)定人血漿凝血測(cè)定采用ACL200凝血儀(InstrumentationLaboratory，LexingtonMA)。所用血漿為4個(gè)正常供血者的混合血漿。在組織因子啟動(dòng)的血漿凝血測(cè)定中，每一測(cè)定樣本為100μl混合血漿與同容積溶于DB緩沖液(10mMTris，pH7.4，0.15M氯化鈉，1mg/mlBSA，0.02％NaN3)的不同溶度抑制物的混合。抑制物溶度按在單獨(dú)血漿中，而不是血漿和抑制物的最終混合物的納摩爾溶度計(jì)算。用于測(cè)定的Innovin(與合成磷脂組建的重組人組織因子)以1∶100稀釋于PT緩沖液(75mM氯化鈉，12.5mMCaCl2，0.5mg/mlBSA，0.02％NaN3)中。在活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測(cè)定中，每一測(cè)定樣本為180μl混合血漿與20μl溶于DB緩沖液中不同溶度抑制物的混合物。抑制物溶度按在血漿與抑制物的混合物中的終溶度計(jì)算。測(cè)定時(shí)使用未加稀釋的APTT-SP試劑(InstrumentationLaboratory)。結(jié)果重組ANV和ANV:KPI融合體構(gòu)建和表達(dá)所構(gòu)建的質(zhì)粒載體用于表達(dá)重組ANV和ANV與各種Kunitz型蛋白酶抑制物的融合體。這些Kunitz型蛋白酶抑制物對(duì)因子VIIa，IX，X和XI等四種在凝血連鎖反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的血液凝固酶類具有特異的抑制活性。圖二概括地說明了這些蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。E.coli.所表達(dá)的ANV是一種全長，未突變的分子。在其它ANV-KPI融合體中，ANV的Cys315突變?yōu)锳la以避免在蛋白質(zhì)折疊時(shí)與Kunitz基團(tuán)內(nèi)的胱胺酸形成二硫鍵。TAP-ANV融合蛋白共有382個(gè)氨基酸殘基。第一個(gè)是丙氨酸殘基，接著是TAP中的從Tyr1到Ile60的60個(gè)氨基酸殘基，一個(gè)Gly-Ser二肽和319個(gè)氨基酸殘基的ANV(Cys315到Ala)。ANV-6L15融合蛋白共有378個(gè)氨基酸殘基。開始是ANV(Cys315到Ala)中的從Ala到Asp的319個(gè)氨基酸殘基，接著是6L15中從Met1到Ala60的60個(gè)氨基酸殘基。為了產(chǎn)生NsiI內(nèi)切點(diǎn)以便基因編輯和連接，融合蛋白中6L15的第二個(gè)氨基酸由Ala變?yōu)镠is。ANV-KAPP融合蛋白是總長為376氨基酸殘基的多肽。其N端是全長ANV(Cys315到Ala)，C端是KAPP多肽中從Asp1到Ile57的57個(gè)氨基酸。ANV-KKTFPI融合蛋白是長度為459氨基酸殘基的多肽。該融合蛋白的N端是全長ANV(Cys315到Ala)。ANV(Cys315到Ala)與TFPI蛋白中從Met22到Thr161的長度為140氨基酸，包括TFPI蛋白中Kunitz基團(tuán)1和2的多肽融合。ANV和ANV:KPI融合蛋白質(zhì)的純化重組ANV，TAP-ANV，ANV-6L15和ANV-KKTFPI經(jīng)E.coli.胞內(nèi)表達(dá)。SDS-PAGE分析證明，E.coil.細(xì)胞溶漿內(nèi)的ANV分子在Ca++存在的情況下基本上都能與含PS的脂質(zhì)體結(jié)合。這提示所表達(dá)的蛋白可自發(fā)地折疊形成活性形式。其它經(jīng)E.coli.表達(dá)的ANV:KPI融合蛋白大部分存在于包聚體，需要折疊形成活性分子。采用以前用于TFPI的磺化折疊方法(34)，我們成功地對(duì)ANV:KPI融合蛋白進(jìn)行了折疊。這可由在折疊過程中其對(duì)胰蛋白酶或因子Xa抑制活性的增加證明。反應(yīng)混合物中的折疊蛋白經(jīng)Q-Sepharose層析一步便被高度純化，這可由在SDS-PAGE電泳中僅見一條與預(yù)期表觀分子量相符的色帶證明。融合蛋白在Ca++存在的情況下與含PS的脂質(zhì)體結(jié)合，再用EDTA洗脫進(jìn)一步純化。經(jīng)P.pastoris表達(dá)，分泌到培養(yǎng)液的重組ANV-KAPP以活性形式存在。有活性的ANV-KAPP可由在Ca++存在的情況下與含PS的脂質(zhì)體結(jié)合，再用EDTA洗脫來從濃縮的培養(yǎng)液純化。圖三顯示了最后純化蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析。在非還原條件下(圖三A)，每種制備樣品都可見一主帶。ANV-KKTFPI(泳道2)和ANV(泳道6)都可見微量二聚體。在還原條件下(圖三B)，二聚體消失，融合蛋白帶泳動(dòng)稍慢。這可能是因?yàn)槎蜴I破裂和Kunitz基團(tuán)展開。純化抑制物與胰蛋白酶或因子Xa相互作用的化學(xué)計(jì)算圖四顯示了用純化抑制物對(duì)胰蛋白酶或因子Xa的活性滴定。除ANV-KKTFPI外，其它純化融合蛋白(ANV-6L15，TAP-ANV和ANV-KAPP)及Kunitz型抑制物(6L15和TAP)都表現(xiàn)出對(duì)胰蛋白酶或因子Xa化學(xué)表觀上1∶1抑制。這些結(jié)果表明所有這些含有單一Kunitz基團(tuán)的經(jīng)純化的融合蛋白純度很高，并具有充分的活性。在接近抑制物與酶為等克分子溶度時(shí)，觀察到某些對(duì)1∶1化學(xué)計(jì)算的偏離。這反映了分子間親和力的不同。ANV-6L15，6L15和ANV-KAPP對(duì)胰蛋白酶的親和力(圖四A，B和E)似乎強(qiáng)一點(diǎn)，而TAP-ANV和TAP與因子Xa的結(jié)合(Fig.4C，andD)似乎弱一點(diǎn)。TAP-ANV和TAP與因子Xa較弱的親和力也可從活性測(cè)定中加入底物和緩沖液后其脂解活性的時(shí)間依賴型緩慢增加看出。用ANV-KKTFPI對(duì)Xa的滴定表現(xiàn)出對(duì)1∶1化學(xué)計(jì)算的偏離(圖四F)。這可能是由于TFPI-K2對(duì)Xa較弱的結(jié)合親和力(Ki＝90nM)(43)。因此，在這種實(shí)驗(yàn)條件下不能決定相互作用的化學(xué)計(jì)算關(guān)系。另一種可能是純化的ANV-KKTFPI含有無活性的錯(cuò)誤折疊的分子。組織因子啟動(dòng)的凝血時(shí)間延長現(xiàn)已清楚TF是血液凝固的生理性啟動(dòng)因子。因此，各種抑制物的抗凝作用都用TF啟動(dòng)的血漿凝固測(cè)定。純化的抑制物被加入混合血漿，達(dá)到不同的溶度。再加入稀釋的凝血活酶試劑(1∶100稀釋的DadeInnovin)啟動(dòng)血漿凝固。Innovin是一種用最佳組合的磷脂構(gòu)建的重組人TFa商業(yè)試劑。該測(cè)定試劑含有TF和陰離子磷脂以啟動(dòng)和促進(jìn)血液凝固連鎖反應(yīng)，是一種模擬在具有TF的活化細(xì)胞/微粒和血小板存在的情況下血漿凝固的簡化系統(tǒng)。加有對(duì)照緩沖液的混合血漿的凝固時(shí)間是40.7秒。當(dāng)加入的抑制物溶度逐漸增高時(shí)，凝血時(shí)間也逐漸延長。延長凝血時(shí)間1.5倍(即從40.7到61.1秒)時(shí)抑制物的溶度可從溶度-凝血時(shí)間曲線求出。表一列出了各種抑制物延長凝血時(shí)間1.5倍所需要的溶度及相對(duì)的活性等級(jí)。由于TFPI是血液中組織因子啟動(dòng)的血液凝固最重要的生理性調(diào)節(jié)因子，而來源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的TFPI與前者極相似，我們選擇了重組C127FL-TFPI作為用于比較的參考標(biāo)準(zhǔn)。TAP-ANV被推測(cè)應(yīng)作用于凝血酶原酶，其活性較C127FL-TFPI高86倍。設(shè)計(jì)來抑制TF/VIIa的ANV-6L15的活性較C127FL-TFPI高12倍。ANV-KAPP(應(yīng)作用于TF/VIIa，XIa，VIIIa/IXa和Va/Xa)，ANV-KKTFPI(應(yīng)作用于TF/VIIa和Va/Xa)，來源于E.coli的非糖化TFPI(應(yīng)作用于TF/VIIa/Xa)和X-K1TFPIhybrid(應(yīng)作用于TF/VIIa)等的活性較C127FL-TFPI高6-7倍。單一ANV的活性是C127FL-TFPI的2.4倍。TAP活性與C127FL-TFPI相同。用以代表單一Kunitz抑制物的TFPI1-160和6L15的活性分別比C127FL-TFPI低40和59倍。各種抑制物對(duì)APTT的影響各種抑制物的抗凝作用也用活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)檢查。APTT用于測(cè)量內(nèi)源性凝血途徑活性。圖五顯示各種抑制物延長APTT的作用。為便于比較，用ANV作為參考標(biāo)準(zhǔn)。TAP-ANV是作用最強(qiáng)的分子，活性高于ANV一個(gè)數(shù)量級(jí)。其作用可能是通過抑制凝血酶原酶發(fā)揮。ANV-KAPP(應(yīng)作用于XIa，VIIIa/IXa，andVa/Xa)，ANV-KKTFPI(應(yīng)作用于Va/Xa)和X-K1TFPI融合體(應(yīng)作用于TF/VIIa)活性較C127FL-TFPI高6-7倍。來源于E.coli的非糖化TFPI和ANV活性較C127FL-TFPI高2-3倍。TAP活性與C127FL-TFPI相同。代表單一Kunitz抑制物的C127CT-TFPI，TFPI1-160和6L15的活性較C127FL-TFPI分別低19，40和59倍。表一各種抑制物對(duì)組織因子啟動(dòng)的人血漿凝固時(shí)間的影響抑制物a[抑制物]1.5×CT，(nM)b相對(duì)活性TAP-ANV0.8086ANV-6L156.012ANV-KAPP9.47.3X-K1TFPI106.9ANV-KKTFPI-160116.3E.coliala-TFPI193.6ANV292.4TAP681C127FL-TFPIc691C127CT-TFPIc13000.053E.coliTFPI1-16027500.0256L1559000.012a[抑制物]1.5CT是凝血時(shí)間延長到對(duì)照的1.5倍(從40.7到61.1秒)時(shí)抑制物的溶度。該溶度可從溶度-凝血時(shí)間曲線求出。b相對(duì)活性以哺乳動(dòng)物C127FL-TFPI作為參考標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)抑制物]1.5CT求出(以C127FL-TFPI活性為1)。cC127FL-TFPI為全長分子；CT-TFPI為前述的在C端截?cái)嗟姆肿?33)。雖然本專利發(fā)明者并不束縛于理論，但以上結(jié)果認(rèn)為可以按以下解釋分析外源性因子X活化酶(TF/VIIa)，內(nèi)源性因子X活化酶(VIIIa/IXa)，凝血酶原酶(Va/Xa)和XIa酶復(fù)合物在陰離子膜表面的形成是組織因子途徑血液凝固的啟動(dòng)和發(fā)展的關(guān)鍵步驟。TFPI是血液凝固啟動(dòng)的主要生理調(diào)節(jié)物。TFPI本身并不直接抑制TF/VIIa復(fù)合物，而是在形成無活性的TFPI/Xa/TF/VIIa四聚體前必須首先有因子Xa的生成(17)。因子Xa的生成導(dǎo)致凝血酶原酶(Va/Xa)的形成，而凝血酶原酶一旦形成，就受保護(hù)免于被生理溶度的TFPI失活(44，45)。在此過程中，不被TFPI抑制的一定量內(nèi)源性因子X活化酶(VIIIa/IXa)也被產(chǎn)生。因此TFPI是以一種“有遺漏(leaky)”的方式來調(diào)節(jié)組織因子途徑血液凝固。在用1∶100稀釋的商業(yè)組織凝血活酶試劑的體外凝血測(cè)定中，延長凝血時(shí)間1.5倍所需要的來源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的全長TFPI溶度是69nM(表一)。而在體內(nèi)血栓模型中，僅當(dāng)循環(huán)血液中或局部的TFPI溶度很高時(shí)(100-200nM)才能看到作用(18，19，46)。TFPI這種治療劑量約是正常血漿中TFPI溶度的100-200倍。TFPI這樣明顯的低效能和達(dá)到所需血液水平必須的大劑量輸入使TFPI在臨床應(yīng)用中并不理想。因此，目前急需一種能更有效調(diào)節(jié)組織因子途徑血液凝固的生物分子。本專利提供的ANV:KPI融合蛋白質(zhì)作為一種治療抗凝劑具有比TFPI強(qiáng)得多的抑制組織因子啟動(dòng)的血液凝固活性及其它優(yōu)點(diǎn)。血液凝固鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)生于PS暴露的膜表面上。PS暴露的膜表面有利于血液凝固復(fù)合物的組成，提高催化效能。在本研究中，一種假設(shè)是被賦予作用于PS暴露膜表面能力的酶抑制物具有抗血栓部位特異性，且抗血液凝固復(fù)合物的具有更強(qiáng)的活性。為了檢驗(yàn)此假設(shè)，用重組DNA技術(shù)制備了四種融合蛋白。這四種融合蛋白都具有ANV基團(tuán)，而ANV基團(tuán)連接于不同的KPI基團(tuán)(TAP，6L15，KAPP和KKTFPI)。融合蛋白中的ANV部分對(duì)PS暴露的膜表面具有高度親和力(Kd＜0.1nM)(32)。而所選擇的四種KPI基團(tuán)對(duì)不同的凝血絲氨酸蛋白酶有如下抑制常數(shù)TAP(對(duì)Xa0.18nM)(22)；6L15(對(duì)TF/VIIa0.2nM，對(duì)血漿激肽釋放酶0.02nM，對(duì)XIa13nM)(30，31)；KAPP(對(duì)TF219/VIIa68nM，對(duì)Xa13nM，對(duì)IXa190nM，對(duì)XIa0.01nM)(24-27)；K1K2TFPI(對(duì)Xa90nM，對(duì)TF/VIIa240nM)(43)?；谒肒PI基團(tuán)的特異性，推測(cè)這些融合蛋白按下述優(yōu)先抑制不同的膜表面血液凝固酶復(fù)合物TAP-ANV抑制Va/Xa；6L15-ANV抑制TF/VIIa，kallikrein和XIa；KAPP抑制XIa，Va/Xa，TF/VIIa和VIIIa/IXa；ANV-KKTFPI抑制Va/Xa和TF/VIIa。在體外凝血測(cè)定中，所有KPI在血漿中均需相當(dāng)高的溶度才能延長凝血時(shí)間(30，47，表一和Figure五)。相反，所有四種ANV:KPI融合蛋白都能在較ANV和KPI低得多的溶度下延長血漿凝血時(shí)間(表一和圖五)。在TF啟動(dòng)的血漿凝固和APTT測(cè)定中，活性最強(qiáng)的融合蛋白都是TAP-ANV。由于該分子對(duì)因子Xa有高度的特異性，故可以抑制凝血酶原酶。這樣所得的結(jié)果與因子Xa和凝血酶原酶是凝血連鎖反應(yīng)中的限速步驟的發(fā)現(xiàn)是一致的(3)。值得注意的是盡管6L15具有對(duì)TF/VIIa的高親和力(Ki0.2nM)(30)，6L15對(duì)TF啟動(dòng)的血漿凝固抑制活性很低(表一)?？梢妴为?dú)對(duì)TF/VIIa的高親和力并不能導(dǎo)致對(duì)TF啟動(dòng)的血液凝固連鎖反應(yīng)的高抑制活性。相反，ANV-6L15融合抑制蛋白在抑制TF啟動(dòng)的血液凝固上活性較6L15高三個(gè)數(shù)量級(jí)。這表明對(duì)PS的結(jié)合大大加強(qiáng)了6L15對(duì)TF/VIIa的抑制。本專利提供的四種ANV:KPI融合分子在TF啟動(dòng)的血漿凝固和APTT測(cè)定中都表現(xiàn)出較ANV，KPIs，和TFPI高得多的抗凝活性。因此，這些分子較那些自然抗凝蛋白有更優(yōu)越的抗凝功能。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，ANV能特異性地集聚在含血小板的血栓(48)。此外，ANV優(yōu)先積聚在血管損傷部位，并以劑量依賴方式抑制動(dòng)，靜脈血栓模型中的血栓形成(38，49，50)。本專利提供的ANV:KPI融合蛋白的一個(gè)重要特征是含ANV部分。該ANV部分賦于ANV:KPI融合蛋白特異性地，高親和力地結(jié)合PS的性質(zhì)。由于給血液凝固酶復(fù)合物的形成提供環(huán)境的PS在血栓形成部位暴露，因此這些分子具有特異性地集中于血栓形成部位的固有特點(diǎn)。由于ANV:KPI融合蛋白作用于血栓產(chǎn)生部位的能力，這些蛋白質(zhì)在系統(tǒng)循環(huán)中水平不高的情況下也可產(chǎn)生抗血栓作用，從而降低了產(chǎn)生系統(tǒng)性出血的付作用的危險(xiǎn)。在本專利中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受”(pharmaceuticallyacceptable)指常用于為治療疾病和病態(tài)組成藥物組方的載體，賦型劑或其它添加劑的一種特性。在本專利中，術(shù)語“個(gè)體”(subject)是指具有或懷疑有血栓形成傾向的人或動(dòng)物。在本專利中，術(shù)語“有效”(effective)和“治療上有效”(therapeuticallyeffective)是指一定量的治療化合物或組分，當(dāng)給予一個(gè)體時(shí)，能達(dá)到預(yù)防，抑制，減輕或排除存在于該個(gè)體的疾病和病態(tài)的一個(gè)或數(shù)個(gè)目的的特性。在本專利申請(qǐng)中，根據(jù)所提供的方法和材料所能治療的疾病和病態(tài)包括與過度血栓形成有關(guān)的任何疾病和病態(tài)。這些疾病和病態(tài)包括，作為例子如不穩(wěn)定性心絞痛，心肌梗塞，心臟猝死，缺血性腦中風(fēng)，動(dòng)脈瘤破裂，間隙性跛行和嚴(yán)重肢體缺血；深部靜脈血栓形成，肺血栓栓塞，血栓型靜脈炎，慢性靜脈功能不全；與手術(shù)有關(guān)的靜脈血栓形成，人工心臟瓣膜，動(dòng)脈樣硬化，血管再狹窄，缺血再灌流損傷，敗血癥，廣泛性血管內(nèi)凝血，急性肺損傷，惡性腫瘤，慢性腎衰竭，腎病綜合癥，半月狀腎小球腎炎(crescenticglomerulonephritis)，糖尿病，鐮狀紅細(xì)胞性貧血，地中海貧血，抗磷脂綜合癥，體外循環(huán)，血液透析，腹膜透析和annexinopathies。在本專利中，術(shù)語“劑量”(dosing)和“治療”(treatment)是指對(duì)一為了改善其狀況而需要醫(yī)療幫助的個(gè)體，特別是人類個(gè)體，所進(jìn)行的直接或間接的任何過程，活動(dòng)，應(yīng)用，治療或其它相似的事務(wù)。在本專利中，術(shù)語“治療性化合物”(therapeuticcompound)是指在預(yù)防或治療與血栓形成有關(guān)的疾病或狀態(tài)中有用的化合物。如已在本專利中闡述的那樣，一系列重組蛋白質(zhì)可在E.col和酵母菌中產(chǎn)生。在E.coli系統(tǒng)，這些蛋白質(zhì)能高水平地表達(dá)于包聚體，而且活性分子能通過簡單的折疊和純化過程來獲得。在酵母菌系統(tǒng)，這些蛋白質(zhì)以活性形式能被分泌到培養(yǎng)液里，并可通過同樣簡單的過程來純化。從實(shí)際生產(chǎn)的觀點(diǎn)來看，簡便和低成本具有巨大的優(yōu)越性。但是，根據(jù)那些熟知的一般分子生物學(xué)過程，如Sambrook等在分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版，ColdSpringHarborLaboratory，1989)中所描述的，使用其它原核和真核細(xì)胞株來表達(dá)重組蛋白質(zhì)也受到關(guān)注。根據(jù)本工作所得到的結(jié)果，相信應(yīng)可以產(chǎn)生其它用類似的概念設(shè)計(jì)的融合分子。比如由多個(gè)ANV和KPI基團(tuán)組成的融合蛋白；由ANV和Antistasin，ecotin(51)，Acylostomacaninum抗凝肽等其他凝血因子天然抑制物組成的融合蛋白；由ANV和KPI的同源體和變異體組成的融合蛋白及由ANV和因子VIIa，IXa，Xa和XIa的小分子抑制物組成的融合體。在另一類融合蛋白變異體中，其它的PS結(jié)合蛋白，如annexin家族中的其它成員，lacadherin(52)及因子V，因子VIII和磷酯酶A2分子的磷脂酶結(jié)合部分均可用來代替ANV產(chǎn)生融合分子。更多的例子包括用disintegrin基團(tuán)與ANV或ANV-KPIs連接來創(chuàng)造在血栓形成部位既能抑制凝血反應(yīng)，又能抑制血小板集聚的融合分子。對(duì)于那些有這方面技巧的人來說，在閱讀了本專利公開的內(nèi)容之后，所有以上列舉的例子都是顯而易見的，因此所有以上列舉的例子也都包括在本發(fā)明專利范圍之內(nèi)。綜合來說，本專利開新開發(fā)的融合蛋白代表了一類具有血栓部位特異性的新型抗凝劑。這類抗凝劑具有以下特點(diǎn)(a)這類抗凝劑被設(shè)計(jì)來特異性地作用于與PS暴露的致血栓膜相連的TF/VIIa，內(nèi)源性因子X活化酶(VIIIa/IXa)，凝血酶原酶(Va/Xa)和XIa；(b)在TF啟動(dòng)的血液凝固中，這類抗凝劑比天然血液凝固起始反應(yīng)抑制物TFPI的抗凝活性高6-86倍；(c)由于具有充分活性的分子能通過微生物系統(tǒng)生產(chǎn)，通過簡單的鈣依賴性結(jié)合于含PS的脂質(zhì)體再用鈣螯合溶液(Ca++-chelatingsolution)洗脫來純化，這類抗凝劑生產(chǎn)簡便，成倍低廉；(d)由于PS暴露的生物膜和與之相連的血液凝固復(fù)合物是導(dǎo)致血栓形成和血管損傷的關(guān)鍵因素，ANV:KPIs可以作為一類能掩蓋致血栓血管壁和相連的血栓的有效的抗血栓藥物。參考文獻(xiàn)1.MorrisseyJH.TissuefactorAnenzymecofactorandatruereceptor.ThrombHaemost2001；8666-74.2.RandMD，LockJB，van’tVeerC，GaffneyDP，MannKG.Bloodclottinginminimallyalteredwholeblood.Blood1996；883432-45.3.MannKG.Biochemistryandphysiologyofbloodcoagulation.ThrombHaemost1999；82165-74.4.HoffmanM，MonroeDM，OliverJA，RobertsHR.FactorsIXaandXaplaydistinctrolesintissuefactor-dependen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20ttcttcaatattttcactcgacagtgcgaagaatttatatatgggggatgtgaaggaaat1080cagaatcgatttgaaagtctggaagagtgcaaaaaaatgtgtacaagagataatgcaaac1140aggattataaagacaacattgcaacaagaaaagccagatttctgctttttggaagaagat1200cctggaatatgtcgaggttatattaccaggtatttttataacaatcagacaaaacagtgt1260gaacgtttcaagtatggtggatcgctgggcaatatgaacaattttgagacactggaagaa1320tgcaagaacatttgtgaagatggtccgaatggtttccaggtggataattatggaacctaa1380<210>6<211>1137<212>DNA<213>人工的<220><223>帶人工6L15的人源ANV的融合基因，其為天然牛胰腺胰蛋白酶抑制劑的變體<400>6gcacaggttctcagaggcactgtgactgacttccctggatttgatgagcgggctgatgca60gaaactcttcggaaggctatgaaaggcttgggcacagatgaggagagcatcctgactctg120ttgacatcccgaagtaatgctcagcgccaggaaatctctgcagcttttaagactctgttt180ggcagggatcttctggatgacctgaaatcagaactaactggaaaatttgaaaaattaatt240gtggctctgatgaaaccctctcggctttatgatgcttatgaactgaaacatgccttgaag300ggagctggaacaaatgaaaaagtactgacagaaattattgcttcaaggacacctgaagaa360ctgagagccatcaaacaagtttatgaagaagaatatggctcaagcctggaagatgacgtg420gtgggggacacttcagggtactaccagcggatgttggtggttctccttcaggctaacaga480gaccctgatgctggaattgatgaagctcaagttgaacaagatgctcaggctttatttcag540gctggagaacttaaatgggggacagatgaagaaaagtttatcaccatctttggaacacga600agtgtgtctcatttgagaaaggtgtttgacaagtacatgactatatcaggatttcaaatt660gaggaaaccattgaccgcgagacttctggcaatttagagcaactactccttgctgttgtg720aaatctattcgaagtatacctgcctaccttgcagagaccctctattatgctatgaaggga780gctgggacagatgatcataccctcatcagagtcatggtttccaggagtgagattgatctg840tttaacatcaggaaggagtttaggaagaattttgccacctctctttattccatgattaag900ggagatacatctggggactataagaaagctcttctgctgctcgctggagaagatgacatg960catccggacttctgcctggaaccgccgtacgacggtccgtgccgtgctctgcacctgcgt1020tacttctacaatgcaaaggcaggcctgtgtcagaccttctactacggcggttgcctggct1080aagcgtaacaacttcgaatccgcggaagactgcatgcgtacttgcggtggtgcttaa1137<210>7<211>1131<212>DNA<213>人工的<220><223>帶有合成人K-APP基因的人源ANV的融合基因<400>7gcacaggttctcagaggcactgtgactgacttccctggatttgatgagcgggctgatgca60gaaactcttcggaaggctatgaaaggcttgggcacagatgaggagagcatcctgactctg120ttgacatcccgaagtaatgctcagcgccaggaaatctctgcagcttttaagactctgttt180ggcagggatcttctggatgacctgaaatcagaactaactggaaaatttgaaaaattaatt240gtggctctgatgaaaccctctcggctttatgatgcttatgaactgaaacatgccttgaag300ggagctggaacaaatgaaaaagtactgacagaaattattgcttcaaggacacctgaagaa360ctgagagccatcaaacaagtttatgaagaagaatatggctcaagcctggaagatgacgtg420gtgggggacacttcagggtactaccagcggatgttggtggttctccttcaggctaacaga480gaccctgatgctggaattgatgaagctcaagttgaacaagatgctcaggctttatttcag540gctggagaacttaaatgggggacagatgaagaaaagtttatcaccatctttggaacacga600agtgtgtctcatttgagaaaggtgtttgacaagtacatgactatatcaggatttcaaatt660gaggaaaccattgaccgcgagacttctggcaatttagagcaactactccttgctgttgtg720aaatctattcgaagtatacctgcctaccttgcagagaccctctattatgctatgaaggga780gctgggacagatgatcataccctcatcagagtcatggtttccaggagtgagattgatctg840tttaacatcaggaaggagtttaggaagaattttgccacctctctttattccatgattaag900ggagatacatctggggactataagaaagctcttctgctgctcgctggagaagatgacgag960gtttgttctgagcaagctgagactggtccatgtagagctatgatttctagatggtacttc1020gacgttactgagggtaagtgtgctccattcttctacggtggttgtggtggtaacagaaac1080aacttcgacactgaggagtactgtatggctgtttgtggttctgctatttaa1131<210>8<211>1380<212>DNA<213>人工的<220><223>帶有KK-TFPI的人源ANV的融合基因，其為人類序列<400>8gcacaggttctcagaggcactgtgactgacttccctggatttgatgagcgggctgatgca60gaaactcttcggaaggctatgaaaggcttgggcacagatgaggagagcatcctgactctg120ttgacatcccgaagtaatgctcagcgccaggaaatctctgcagcttttaagactctgttt180ggcagggatcttctggatgacctgaaatcagaactaactggaaaatttgaaaaattaatt240gtggctctgatgaaaccctctcggctttatgatgcttatgaactgaaacatgccttgaag300ggagctggaacaaatgaaaaagtactgacagaaattattgcttcaaggacacctgaagaa360ctgagagccatcaaacaagtttatgaagaagaatatggctcaagcctggaagatgacgtg420gtgggggacacttcagggtactaccagcggatgttggtggttctccttcaggctaacaga480gaccctgatgctggaattgatgaagctcaagttgaacaagatgctcaggctttatttcag540gctggagaacttaaatgggggacagatgaagaaaagtttatcaccatctttggaacacga600agtgtgtctcatttgagaaaggtgtttgacaagtacatgactatatcaggatttcaaatt660gaggaaaccattgaccgcgagacttctggcaatttagagcaactactccttgctgttgtg720aaatctattcgaagtatacctgcctaccttgcagagaccctctattatgctatgaaggga780gctgggacagatgatcataccctcatcagagtcatggtttccaggagtgagattgatctg840tttaacatcaggaaggagtttaggaagaattttgccacctctctttattccatgattaag900ggagatacatctggggactataagaaagctcttctgctgctcgctggagaagatgacatg960cattcattttgtgcattcaaggcggatgatggcccatgtaaagcaatcatgaaaagattt1020ttcttcaatattttcactcgacagtgcgaagaatttatatatgggggatgtgaaggaaat1080cagaatcgatttgaaagtctggaagagtgcaaaaaaatgtgtacaagagataatgcaaac1140aggattataaagacaacattgcaacaagaaaagccagatttctgctttttggaagaagat1200cctggaatatgtcgaggttatattaccaggtatttttataacaatcagacaaaacagtgt1260gaacgtttcaagtatggtggatcgctgggcaatatgaacaattttgagacactggaagaa1320tgcaagaacatttgtgaagatggtccgaatggtttccaggtggataattatggaacctaa1380<210>9<211>960<212>DNA<213>智人<400>9gcacaggttctcagaggcactgtgactgacttccctggatttgatgagcgggctgatgca60gaaactcttcggaaggctatgaaaggcttgggcacagatgaggagagcatcctgactctg120ttgacatcccgaagtaatgctcagcgccaggaaatctctgcagcttttaagactctgttt180ggcagggatcttctggatgacctgaaatcagaactaactggaaaatttgaaaaattaatt240gtggctctgatgaaaccctctcggctttatgatgcttatgaactgaaacatgccttgaag300ggagctggaacaaatgaaaaagtactgacagaaattattgcttcaaggacacctgaagaa360ctgagagccatcaaacaagtttatgaagaagaatatggctcaagcctggaagatgacgtg420gtgggggacacttcagggtactaccagcggatgttggtggttctccttcaggctaacaga480gaccctga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0ctcagaacaaacctctctaacaacctcaagtttcagtggtggcaactccgtatctgtggg120gtag124<210>26<211>115<212>DNA<213>人工的<220><223>用于生成帶側(cè)翼序列的合成K-APP基因的反向合成寡核苷酸<400>26agcttcatcaatgcatttaaatagcagaaccacaaacagccatacagtactcctcagtgt60cgaagttgtttctgttaccaccacaaccaccgtagaagaatggagcacacttacc115<210>27<211>174<212>DNA<213>人工的<220><223>源自人類序列的合成K-APP基因<400>27gaggtttgttctgagcaagctgagactggtccatgtagagctatgatttctagatggtac60ttcgacgttactgagggtaagtgtgctccattcttctacggtggttgtggtggtaacaga120aacaacttcgacactgaggagtactgtatggctgtttgtggttctgctatttaa174<210>28<211>30<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>28ggaattccatatggcacaggttctcagagg30<210>29<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>29ccaatgcatgtcatcttctccagc24<210>30<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>30ccaatgcatccggacttctgcctg24<210>31<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>31ccaatgcattcattttgtgcattc24<210>32<211>27<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>32acgcgtcgacttaagcaccaccgcaag27<210>33<211>29<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>33acgcgtcgacttaggttccataattatcc29<210>34<211>30<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>34ggaattccatatggcttacaaccgtctgtg30<210>35<211>27<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>35cgggatccgatgcaagcgttgaagcag27<210>36<211>26<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>36cgggatccgcacaggttctcagaggc26<210>37<211>29<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>37acgcgtcgacttagtcatcttctccagcg29<210>38<211>31<212>DNA<213>人工的<220><223>為了生成目的PCR片段以克隆進(jìn)載體pPIC9而設(shè)計(jì)的引物<400>38ccgctcgagaaaagagcacaggttctcagag31<210>39<211>33<212>DNA<213>人工的<220><223>為了生成目的PCR片段以克隆進(jìn)酵母表達(dá)載體pPIC9而設(shè)計(jì)的引物<400>39ataagaatgcggccgcttaaatagcagaaccac33<210>40<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>為了生成目的PCR片段以克隆進(jìn)酵母表達(dá)載體pPIC9而設(shè)計(jì)的引物<400>40cgcgatatcatcttctccagcgag24<210>41<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>為了生成目的PCR片段以克隆進(jìn)酵母表達(dá)載體pPIC9而設(shè)計(jì)的引物<400>41gaggtttgttctgagcaagc20權(quán)利要求1.由annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)和Kunitz蛋白酶抑制物(Kunitzproteaseinhibitor，KPI)融合體組成的重組抗凝蛋白質(zhì)。2.專利要求1中的重組抗凝蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列包括TAP-ANV(序列編號(hào)1)，ANV-6L15(序列編號(hào)2)，ANV-KAPP(序列編號(hào)3)，和ANV-KKTFPI(序列編號(hào)4)或有關(guān)的保守替代變異等。3.一種由annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合體形成的重組抗凝蛋白質(zhì)組成抗血栓成分。4.專利要求3中的抗血栓成分與藥學(xué)上可接受的賦型劑組成的抗血栓成分。5.專利要求3中的抗血栓成分包括來自TAP-ANV(序列編號(hào)1)，ANV-6L15(序列編號(hào)2)，ANV-KAPP(序列編號(hào)3)和ANV-KKTFPI(序列編號(hào)4)或有關(guān)的保守替代變異等蛋白質(zhì)序列。6.一種抑制哺乳動(dòng)物個(gè)體血液凝固的方法。該方法包括對(duì)有關(guān)個(gè)體給予有效劑量的由annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合體形成的重組抗凝蛋白質(zhì)。7.一種生產(chǎn)由annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合體形成的重組抗凝蛋白質(zhì)的方法。8.一種產(chǎn)生專利要求7中所需要的重組DNA分子的方法。該重組DNA分子的第一段序列(序列編號(hào)9)編碼annexinV(ANV)，第二段序列編碼Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)。9.專利要求8中的重組DNA分子的序列選自TAP-ANV(序列編號(hào)5)，ANV-6L15(序列編號(hào)6)，ANV-KAPP(序列編號(hào)7)和ANV-KKTFPI(序列編號(hào)8)或有關(guān)的保守替代變異。10.一種對(duì)過度血栓表現(xiàn)需進(jìn)行治療或預(yù)防的個(gè)體進(jìn)行此類治療或預(yù)防的方法。該方法包括對(duì)有關(guān)個(gè)體給予有效劑量的由annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合體形成的抗血栓成分。11.一種重組DNA分子。該重組DNA分子的第一段序列(序列編號(hào)9)編碼annexinV(ANV)，第二段序列編碼Kunitz型蛋白酶抑制物(KPI)。12.專利要求11中所述的重組DNA分子的第一段DNA序列包括序列編號(hào)9(編碼ANV)，序列編號(hào)14(編碼ANV的Cys315-Ala突變體)或有關(guān)的保守替代變異。13.專利要求11中所述的重組DNA分子包括TAP-ANV(序列編號(hào)5)，ANV-6L15(序列編號(hào)6)，ANV-KAPP(序列編號(hào)7)和ANV-KKTFPI(序列編號(hào)8)或有關(guān)的保守替代變異等DNA序列。14.用于專利要求11中的含有重組DNA分子的宿主細(xì)胞。15.用于專利要求1中的被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的，表達(dá)重組抗凝蛋白的細(xì)胞株。16.用于專利要求15中的原核細(xì)胞株。17.用于專利要求15中的真核細(xì)胞株。18.制備表達(dá)重組抗凝蛋白細(xì)胞株的過程。該細(xì)胞株表達(dá)的重組抗凝蛋白為annexinV(ANV)(序列編號(hào)10)和一種Kunitz型蛋白酶抑制物(KPI)的融合體。制備細(xì)胞株的過程包括用含編碼ANV或有關(guān)保守替代變異和KPI的DNA序列的重組表達(dá)載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。19.一種重組表達(dá)質(zhì)粒。該表達(dá)質(zhì)粒的第一段核苷酸序列編碼annexinV(ANV)(序列編號(hào)9)，Cys315-Ala突變ANV(序列編號(hào)14)，或有關(guān)的保守替代變異。第二段序列編碼Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)。20.專利要求19中的存在于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染原核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的重組表達(dá)質(zhì)粒。21.專利要求19中的存在于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的重組表達(dá)質(zhì)粒。22.專利要求19中重組表達(dá)質(zhì)粒由序列編號(hào)9(編碼ANV)，序列編號(hào)14(編碼Cys315-Ala突變ANV)或有關(guān)的保守替代變異組成的第一段核苷酸序列。23.專利要求19中重組表達(dá)質(zhì)粒核苷酸序列包括TAP-ANV(序列編號(hào)5)，ANV-6L15(序列編號(hào)6)，ANV-KAPP(序列編號(hào)7)和ANV-KKTFPI(序列編號(hào)8)或有關(guān)的保守替代變異序列。全文摘要本發(fā)明闡述了一類新型的重組抗凝蛋白質(zhì)，以及它們的應(yīng)用和生產(chǎn)。對(duì)由annexinV(ANV)和蛋白酶抑制物(KPI)形成的具有高度抗凝活性的重組融合蛋白進(jìn)行了特別的描述。該重組融合蛋白，簡稱ANV:KPI，采用對(duì)L－磷脂酰絲氨酸有著高親和力的ANV與各種Kunitz蛋白酶抑制物的結(jié)合，特異性地抑制凝血連鎖反應(yīng)中與生物膜相連的血液凝固復(fù)合物中的絲氨酸蛋白酶。ANV:KPIs作為可對(duì)具有致血栓形成活性的血管壁及相連的血栓進(jìn)行局部掩蓋抑制的藥物有著良好的前景。文檔編號(hào)C12N1/21GK1659180SQ03812999公開日2005年8月24日申請(qǐng)日期2003年6月4日優(yōu)先權(quán)日2002年6月6日發(fā)明者溫子堅(jiān)申請(qǐng)人:溫子堅(jiān)