專利名稱：制備單克隆抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備單克隆抗體的方法。本發(fā)明尤其涉及比常規(guī)方法更快速制備和篩選單克隆抗體的高通量方法。
25年前，Kohler和Milstein描述了用B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合制備單克隆抗體的方法(Kohler和Milstein，1975年)。從那以后，單克隆抗體在幫助人類了解生理、生化和遺傳方面起著重要的作用。單克隆抗體是常用的檢測(cè)、定位特異性生物分子的靈敏方法。單克隆抗體可以作用于任何細(xì)胞分子，從而使該分子能被區(qū)別、定位和純化。在一些實(shí)例中，單克隆抗體也可以幫助確定與其結(jié)合的分子的功能。
七十年代中期雜交瘤技術(shù)的發(fā)展使人們認(rèn)識(shí)到單克隆抗體在診斷和治療中的作用。單克隆抗體已經(jīng)成為眾多臨床診斷試劑中的主要組分。此外，許多已被認(rèn)證的藥物中含有單克隆抗體，并且許多正在研發(fā)的藥物也是單克隆抗體。通過(guò)最小化其不良反應(yīng)促進(jìn)了單克隆抗體在臨床上的使用。然而，盡管單克隆抗體在醫(yī)療和分子生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，但是自Kohler和Milstein在七十年代提出單克隆抗體學(xué)說(shuō)以來(lái)，制備和篩選單克隆抗體的進(jìn)展卻很緩慢。制備針對(duì)某一抗原的單克隆抗體的方法需要用某一抗原對(duì)小鼠或者大鼠進(jìn)行免疫，促使成熟B細(xì)胞活化和增值，進(jìn)而產(chǎn)生抗原特異性抗體，這一免疫過(guò)程需要幾周時(shí)間。體細(xì)胞融合前對(duì)小鼠進(jìn)行免疫并定期測(cè)定血清免疫球蛋白滴度。融合后，通過(guò)免疫方法篩選雜交瘤上清，以確定針對(duì)某一抗原的高特異性單克隆抗體。使用這種方法制備單克隆抗體需要的時(shí)間通常在3到9個(gè)月。
RIMMS(重復(fù)，多位點(diǎn)免疫策略)技術(shù)的發(fā)展使體細(xì)胞融合在免疫起始后8到14天即發(fā)生(Kilpatrick等人，1997)。由此獲得的雜交瘤上清可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的免疫測(cè)定方法進(jìn)行篩選，這使分離針對(duì)某一抗原的單克隆抗體變得非常迅速。然而，即使使用RIMMS，制備和篩選大量針對(duì)不同抗原的單克隆抗體也需要消耗相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間和資源。隨著越來(lái)越多新蛋白的發(fā)現(xiàn)，有必要建立更快速更高效的制備、篩選針對(duì)這些蛋白的單克隆抗體的方法，以便對(duì)其進(jìn)一步表征。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供了一種制備單克隆抗體的方法，該發(fā)明包括下述步驟a)將至少一種候選抗原導(dǎo)入動(dòng)物；b)從所述動(dòng)物收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞，并使這些細(xì)胞成為單細(xì)胞懸液；c)從所述單細(xì)胞懸液制備永生化細(xì)胞系；d)用其上展示有候選抗原的蛋白質(zhì)芯片篩選所述永生化細(xì)胞系的上清液；和e)選擇與所述候選抗原結(jié)合的抗體作為所述單克隆抗體。
本發(fā)明的方法相對(duì)于目前制備單克隆抗體的方法具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)。如同已討論的，在當(dāng)前制備單克隆抗體的方法中，每一種抗原的免疫和分離都需要復(fù)雜的操作。相比之下，本發(fā)明的方法中，動(dòng)物體內(nèi)可以導(dǎo)入多種抗原，從而可以同時(shí)制備針對(duì)多種抗原的單克隆抗體，這使制備單克隆抗體的速度和效率大大提高。本發(fā)明中的蛋白質(zhì)芯片可以結(jié)合導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)的抗原，蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用加速了單克隆抗體的篩選和檢測(cè)過(guò)程。此外，蛋白質(zhì)芯片相對(duì)于其他常規(guī)篩選方法(例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))具有更高的靈敏度，使一些常規(guī)方法無(wú)法檢測(cè)的雜交瘤分泌蛋白易于檢測(cè)，從而使檢測(cè)效率提高。此外，本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)芯片使針對(duì)抗原的上清液被篩選多次，并且只需使用常規(guī)篩選(例如ELISA)方法所需抗原量的一部分既可。例如，針對(duì)某一抗原的每種上清液能被同時(shí)一式兩份、三份或四份篩選。
本發(fā)明方法中的步驟a)中的動(dòng)物可以是任何非人類的哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的動(dòng)物是小鼠、大鼠、兔、倉(cāng)鼠或者豚鼠。優(yōu)選的是小鼠。
步驟a)中的候選抗原優(yōu)選的是純化的候選抗原。純化的候選抗原或者純化候選抗原的混合物都可以導(dǎo)入動(dòng)物。純化的候選抗原是指同質(zhì)的抗原制劑，不含有任何其他組分。純化候選抗原的混合物是指用于免疫的抗原中含有一種以上的純化抗原，但是該抗原混合物中不含有可能引起抗體產(chǎn)生的其他組分。例如，使用常規(guī)的操作在動(dòng)物體內(nèi)導(dǎo)入均勻的組織，使動(dòng)物對(duì)多種抗原免疫，但是這樣的免疫并不表示是由此處所述純化的候選抗原引起的免疫，因?yàn)樵摽乖驯患?xì)胞碎片污染。
任何數(shù)量的純化候選抗原可以導(dǎo)入動(dòng)物。優(yōu)選的是將1到50種純化抗原導(dǎo)入動(dòng)物。優(yōu)選的是一種以上的純化候選抗原導(dǎo)入動(dòng)物。例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50種或50種以上純化候選抗原可以導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)?？乖梢砸曰旌系姆绞酵瑫r(shí)導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，也可以分別依次導(dǎo)入。不同抗原的導(dǎo)入可以有幾天的間隔。優(yōu)選的不同抗原的導(dǎo)入時(shí)間間隔是短于48小時(shí)，優(yōu)選短于24小時(shí)。優(yōu)選的導(dǎo)入方法涉及將抗原注射入動(dòng)物。
術(shù)語(yǔ)“候選抗原”是指當(dāng)其導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)可以引起免疫應(yīng)答的物質(zhì)。因此候選抗原包括蛋白物質(zhì)和非蛋白物質(zhì)。
蛋白物質(zhì)包括蛋白質(zhì)及其衍生物，例如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白和多肽。這些蛋白質(zhì)的片段也包括在上述“抗原”中。優(yōu)選的這些片段包括抗原決定簇。非蛋白質(zhì)抗原包括多糖、脂多糖和核酸。尤其，術(shù)語(yǔ)“抗原”包括核酸分子，該核酸分子能誘導(dǎo)針對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。這些非蛋白質(zhì)片段也包括在術(shù)語(yǔ)“抗原”中。術(shù)語(yǔ)“抗原”進(jìn)一步包括和載體相連的能引起免疫反應(yīng)蛋白質(zhì)或者非蛋白質(zhì)，例如脂類、半抗原和載體相連后能夠使前兩者具有抗原性。本發(fā)明的抗原可以是天然物質(zhì)，也可以通過(guò)本領(lǐng)域的方法合成。
純化抗原用于免疫時(shí)，優(yōu)選抗原是蛋白質(zhì)或者核酸分子。純化抗原是蛋白質(zhì)物質(zhì)時(shí)，可以單獨(dú)或者以融合蛋白的方式導(dǎo)入。尤其本發(fā)明的抗原也可以是表達(dá)于重組病毒表面的融合蛋白，該重組病毒可注射入動(dòng)物。Lindley等人在2000年已描述，使用編碼蛋白質(zhì)抗原的核酸序列構(gòu)建重組病毒。
一種以上抗原用于免疫時(shí)，可以使用任何純化抗原組合。可以只給動(dòng)物注射蛋白質(zhì)抗原或者非蛋白質(zhì)抗原，也可以是兩者的混合物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所用的純化抗原都是蛋白質(zhì)成分。純化抗原可以是來(lái)源于相同蛋白或者不同蛋白的片段。純化抗原可以是來(lái)源于cDNA文庫(kù)的重組病毒體，每種重組病毒體在其表面表達(dá)一種cDNA編碼的蛋白質(zhì)。
根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，本發(fā)明提供了多種純化抗原以核酸分子形式導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)的方法，該核酸分子編碼可以誘導(dǎo)產(chǎn)生單克隆抗體的蛋白質(zhì)。核酸分子可以是DNA分子、cDNA分子或者RNA分子。本發(fā)明在這一方面優(yōu)選將cDNA導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)。因此，有可能給動(dòng)物體內(nèi)注射某些核苷酸，這些核苷酸編碼身份不確定的蛋白質(zhì)，如下所述，細(xì)胞芯片可以用來(lái)分離針對(duì)某一蛋白質(zhì)的抗體，該抗體反過(guò)來(lái)又可以使蛋白質(zhì)被純化。
純化抗原是核酸分子時(shí)，優(yōu)選該核酸分子包括或者由DNA、cDNA或者RNA序列組成，這些核酸序列編碼一種可以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)。核酸分子可以是裸露的核酸分子，也可以以載體的形式存在。
載體可以是病毒載體，優(yōu)選是一種反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)、皰疹病毒、α-病毒或者其他任何合適的載體，這些載體被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。核酸分子也可以以非病毒載體的形式存在，優(yōu)選質(zhì)粒載體。許多這樣的載體已被公眾所了解并在本領(lǐng)域報(bào)導(dǎo)(參考，例如FernandezJ.M.&Hoeffler J.P.基因表達(dá)系統(tǒng)。Using nature for the art of expression ed.學(xué)術(shù)雜志，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto，1998).這些載體可以附加含有調(diào)節(jié)序列，例如在基因的5’和3’非翻譯區(qū)含有增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止信號(hào)序列，這些序列可以保證編碼序列的正確轉(zhuǎn)錄和翻譯。
核酸分子也可以以聚陽(yáng)離子濃縮DNA的形式存在，該DNA結(jié)合或者未結(jié)合滅活的腺病毒，例如參見(jiàn)Curiel(1992)Hum Gene 20 Ther3147-154，或者以配體結(jié)合DNA的形式存在，例如參見(jiàn)Wu(1989)JBiol Chem 26416985-16987。核酸分子可以以DNA覆蓋的膠乳珠形式存在。核酸分子也可以存在于脂質(zhì)體中，例如WO95/13796，WO94/23697，WO91/14445和EP-524，968.SA 91(24)11581-11585。
抗原可以通過(guò)任何合適的方法導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)。優(yōu)選的導(dǎo)入方法包括注射。純化的抗原可以通過(guò)脾內(nèi)注射、靜脈注射、腹膜內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、皮下注射或者任何合適的途徑導(dǎo)入動(dòng)物對(duì)其進(jìn)行免疫?？梢酝ㄟ^(guò)一種以上的方法在動(dòng)物體內(nèi)導(dǎo)入一種或者多種純化的抗原使之免疫。例如，一些抗原可以通過(guò)腹膜內(nèi)注射導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，而另一些則可以通過(guò)皮下注射導(dǎo)入。注射的具體方法取決于被注射的抗原的特性。例如，注射核酸分子時(shí)可能需要使用手持的基因轉(zhuǎn)移槍(如US5149655中所述)來(lái)注射核酸分子。蛋白質(zhì)抗原的劑量范圍優(yōu)選在0.01到1000微克。
本發(fā)明的方法中優(yōu)選包含附加的步驟，即在獲取抗體產(chǎn)生細(xì)胞之前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)劑量的一些或所有抗原免疫。在第一次注射后的1到365天給予動(dòng)物加強(qiáng)劑量的免疫。動(dòng)物加強(qiáng)免疫的優(yōu)選次數(shù)是1到20次。
優(yōu)選本發(fā)明方法使用的免疫操作規(guī)程簡(jiǎn)短，給動(dòng)物導(dǎo)入一種以上抗原以避免某一種抗原在免疫應(yīng)答中占據(jù)主導(dǎo)。優(yōu)選地，動(dòng)物接受一種以上抗原免疫，在第一次注射3天后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行每種抗原的加強(qiáng)免疫或者一種以上抗原的合并加強(qiáng)免疫，在第5天再進(jìn)行一次免疫，在第6天到第15天去除脾組織或者淋巴結(jié)。當(dāng)希望免疫過(guò)程較長(zhǎng)時(shí)，可在第一次注射21天后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行每種抗原的加強(qiáng)免疫或者多種抗原的同時(shí)加強(qiáng)免疫，在第26天去除脾組織和淋巴結(jié)。
動(dòng)物的免疫可以使用或者不使用藥學(xué)載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖、脂類聚集物(例如油滴或者脂質(zhì)體)和滅活的病毒顆粒。這些載體為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。此外，這些載體可以起到免疫刺激劑(佐劑)的作用。除了藥學(xué)載體，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫可以使用或者不使用佐劑。
優(yōu)選的增強(qiáng)組合物有效性的佐劑包括、但不僅限于以下所列佐劑(1)鋁鹽(礬)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鋁等；(2)水包油乳劑(含或不含特異性免疫增強(qiáng)劑，例如胞壁酰肽(參見(jiàn)下述)或者細(xì)菌細(xì)胞壁成分)，例如(a)MF59TM(WO90/14837；Chapter 10in Vaccine designthe subunit and adjuvant approach，eds.Powell & Newman，Plenum Press)含有5％鯊烯、0.5％吐溫80和0.5％司盤85(可選擇性包括MTP-PE)，其在微液化器作用下形成亞微粒，(b)SAF，含有10％鯊烯、0.4％吐溫80、5％普朗尼克封閉的聚合物L(fēng)121和t hr-MDP，其可以通過(guò)微液化成為亞微粒乳劑或者通過(guò)旋渦產(chǎn)生體積稍大的乳劑(大小為5)，(c)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)，(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)含有2％鯊烯、0.2％吐溫80和一種或者多種細(xì)菌細(xì)胞壁成分，該細(xì)胞壁成分選自單磷脂A(MPL)、海藻糖(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選的是MPL+CWS(DetoxTM)；(3)可以使用皂甙佐劑，例如QS21或者StimulonTM(CambridgeBioscience，Worcester，MA)，或者使用皂甙佐劑產(chǎn)生的顆粒，例如ISCOMs(免疫刺激復(fù)合物)，該ISCOMs可以不含另外的去污劑例如WO00/07621；(4)完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)；(5)細(xì)胞因子，例如白介素(如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12(WO99/44636)等)，干擾素(如γ-干擾素)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)單磷酰酯A(MPL)或者3-O-脫酰基酶(3dMPL)例如GB-2220221，EP-A-0689454可選地當(dāng)和肺炎球菌糖類共同使用時(shí)基本缺失明礬，例如WO00/56358；(7)3dMPL和QS21和/或者水包油乳劑的組合，例如EP-A-0835318，EP-A-0735898，EP-A-0761231；(8)寡核苷酸，其包括CpG基序(Roman等人Nat.Med，1997，3，20 849-854；Weiner等人，PNAS USA，1997，94，10833-10837；Davis等人，J.Immunol，1998，160，870-876；Chu等人，J.Exp.Med.，1997，186，1623-1631；Lipford等人，Eur.J.Immunol，1997，27，2340-2344；Moldoveanu等人，Vaccine，1988，16，1216-1224，Krieg等人，Nature，1995，374，546-549；Klinman等人，PNAS USA，1996，93，2879-2883；Ballas等人，J.Immunol，1996，157，1840-1845；Cowdery等人，J.Immunol，1996，156，4570-4575；Halpern等人，Cell Immunol，1996，167，72-78；Yamamoto等人，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey等人，J.Immunol，1996，157，2116-2122；Messina等人，J.Immunol，1991，147，1759-1764；Yi等人，J.Immunol，1996，157，4918-4925；Yi等人，J.Immunol，1996，157，5394-5402；Yi等人，J.Immunol，1998，160，4755-4761；and Yi等人，J.Immunol，1998，160，5898-5906；國(guó)際專利號(hào)為WO96/02555，WO98/16247，WO98/18810，WO98/40100，WO98/55495 WO98/37919和WO98/52581等的專利中至少包括一個(gè)CG二核苷酸，并且在胞嘧啶處可以選擇性地用5-甲基胞嘧啶取代；(9)聚氧乙烯醚或者聚氧化乙烯酯等WO99/52549；(10)一種聚氧化乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑與辛苯昔醇組合(WO01/21207)；或者一種聚氧化乙烯烷基醚或酯表面活性劑連同至少一種附加的非離子型表面活性劑，例如一種辛苯昔醇(WO01/21152)；(11)一種皂甙和一種免疫刺激寡核苷酸(例如一種CpG寡核苷酸)(WO00/62800)；(12)一種免疫刺激劑和一種金屬鹽顆粒，例如WO00/23105；(13)一種皂甙和一種水包油乳劑，例如WO99/11241；(14)一種皂甙(例如QS2 1)+3dMPL+IL-12(可選擇性加一種甾醇)，例如WO98/57659；(15)其他用作免疫增強(qiáng)劑的物質(zhì)可以提高組合物的有效性。其他可以使用的佐劑的例子包括Montanide ISA 50，Hunter′s TiterMax和Gerbu佐劑。
優(yōu)選地，本發(fā)明中的抗體制備細(xì)胞包括B細(xì)胞、T細(xì)胞和干細(xì)胞。這些用于本發(fā)明的抗體制備細(xì)胞可以通過(guò)去除動(dòng)物免疫系統(tǒng)的任何合適的細(xì)胞組分獲得。優(yōu)選的抗體制備細(xì)胞通過(guò)去除脾、淋巴結(jié)、骨髓或其部分。根據(jù)本發(fā)明的步驟b)，通過(guò)合適的方法使上述組織成為單細(xì)胞懸液。優(yōu)選地，從動(dòng)物取得的脾組織、淋巴結(jié)或者骨髓通過(guò)機(jī)械碾磨或者蛋白酶消化的方法獲得單細(xì)胞懸液。紅細(xì)胞則通過(guò)低滲裂解從細(xì)胞懸液中去除。
本發(fā)明的方法的步驟c)中的永生化細(xì)胞系優(yōu)選是雜交瘤細(xì)胞，由單細(xì)胞懸液中的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生體細(xì)胞融合制備得到。單細(xì)胞懸液中的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在融合劑作用下發(fā)生融合。所使用的骨髓瘤細(xì)胞包括SP2、NS1和NS0。優(yōu)選的融合劑可以是PEG、病毒或者通過(guò)電融合的方法(Zimmermann等人，1990)。
單細(xì)胞懸液中的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞需要進(jìn)一步培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞在最初階段優(yōu)選在一種選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這種選擇性培養(yǎng)基如偶氮絲氨酸次黃嘌呤或者次黃嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶脫氧核苷，然后轉(zhuǎn)移入一種非選擇性培養(yǎng)基中。優(yōu)選雜交瘤細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，然后用非選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。這可以保證在篩選之前細(xì)胞生長(zhǎng)速率增加。雜交瘤制備的步驟優(yōu)選采用自動(dòng)化操作，這可以加速操作過(guò)程。本發(fā)明的實(shí)例展示了一種自動(dòng)化制備雜交瘤的方法。
永生化細(xì)胞系也可以由一種永生化病毒感染單細(xì)胞懸液制備得到。優(yōu)選的永生化病毒是Epstein-Bar病毒(參見(jiàn)Epstein Barr病毒操作手冊(cè)，Eds.Wilson and May，Humana Press；ISBN0896036901)。
本發(fā)明步驟d)包括篩選永生化細(xì)胞系的上清液，優(yōu)選這種細(xì)胞系是一種雜交瘤細(xì)胞系，該上清液中含有和蛋白質(zhì)芯片作用的抗體，蛋白質(zhì)芯片中含有候選抗原，而候選抗原就是用來(lái)免疫動(dòng)物的抗原。如此處所使用的，蛋白質(zhì)芯片表面展示有候選抗原，這些抗原排列成矩陣形狀。當(dāng)僅一種純化抗原導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，該純化抗原可以錨定在蛋白質(zhì)芯片上。當(dāng)超過(guò)一種純化抗原導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，每個(gè)純化的抗原可以分別處在蛋白質(zhì)芯片的不同位置上，優(yōu)選處于預(yù)先已經(jīng)確定的位置上。蛋白質(zhì)芯片的每個(gè)位置可以有一個(gè)不同的抗原?；蛘撸嗤目乖辉诿恳慌呕蛘呙恳涣猩?，使每一列或者每一排上具有不同的抗原。在某些情況，使用一種以上抗原免疫一種動(dòng)物時(shí)，也可能有必要使每一種抗原在不同的芯片上。一片蛋白質(zhì)芯片可以含有多種抗原，例如含有1到1000種純化抗原，這些抗原包被在預(yù)先確定了位置的芯片上。
該領(lǐng)域任何已知的蛋白質(zhì)芯片都可以應(yīng)用于本發(fā)明中。例如該蛋白質(zhì)芯片可以是錨定有純化抗原或抗源的玻璃片。當(dāng)只有一種抗原需要檢測(cè)時(shí)，該玻璃片可以用氨基酸硅烷(Ansorge，F(xiàn)aulstich)覆蓋，繼而在玻璃片上滴加含有抗原的溶液，然后干燥。覆蓋有氨基酸硅烷的玻璃片可以從Telechem和Pierce獲得用于包被純化抗源。該玻璃片優(yōu)選覆蓋有(6-aminohexil)氨基硅烷。
其他種類的應(yīng)用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片包括3D凝膠墊(Arkenov等人，2000)和微孔芯片。根據(jù)本發(fā)明，各種目前技術(shù)還沒(méi)有成熟、將來(lái)研制成功的蛋白質(zhì)芯片將有充分的理由適用于本發(fā)明中，這些為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)芯片”也包括表達(dá)目的cDNAs的細(xì)胞構(gòu)成的微陣列(Ziauddin等人，2001)，此處即指“細(xì)胞芯片”。在該技術(shù)中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)于玻璃片上，玻璃片的不同位置含有不同的cDNAs。在確定位置上生長(zhǎng)的細(xì)胞攝取和表達(dá)cDNAs。當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)需要注射cDNA或cDNA文庫(kù)、重組病毒體或者cDNA文庫(kù)制備的病毒體時(shí)，細(xì)胞芯片尤其有用。在這些情況，cDNA序列編碼的蛋白質(zhì)可能還沒(méi)有分離得到。給動(dòng)物注射編碼蛋白的cDNAs序列或者表達(dá)cDNAs的重組病毒體，可能產(chǎn)生針對(duì)cDNAs表達(dá)蛋白的單克隆抗體。如果使用細(xì)胞芯片表達(dá)同樣的cDNAs，這些抗體將和細(xì)胞芯片結(jié)合，并可通過(guò)如下所述方法檢測(cè)這種結(jié)合。假如可以獲得編碼蛋白的核酸序列，本發(fā)明可以使一種單克隆抗體的檢測(cè)和分離變得可行。該單克隆抗體和核酸序列編碼的蛋白結(jié)合，可以用作蛋白質(zhì)本身的純化。
篩選抗體或者篩選產(chǎn)生抗體的永生化細(xì)胞系，將永生化細(xì)胞系的上清液點(diǎn)樣于蛋白質(zhì)芯片的確定位置。上清液的點(diǎn)樣優(yōu)選自動(dòng)化完成，例如使用一種Genemachines Ominigrid點(diǎn)樣儀。優(yōu)選上清液點(diǎn)樣于表面覆蓋有甘油的蛋白質(zhì)芯片，甘油可以起到簡(jiǎn)化玻璃片上抗體干燥和固定的操作。例如可以使用0到99.9％濃度的甘油。然后清洗芯片以去除任何未結(jié)合的上清液。在這個(gè)階段，任何永生化細(xì)胞系產(chǎn)生的、隨后分泌到上清液中的單克隆抗體和芯片表面的抗原結(jié)合。
通過(guò)使用不同的洗脫條件，該方法可以粗略量化單克隆抗體和其配體的親和力?？梢允褂玫南疵撘喊}酸胍或者濃度在10umol到8mol之間的尿素或者濃度在0.01％到100％(w/v)的乙二醇水溶液。洗脫也可以使用甘氨酸的水溶液或者非水溶液、濃度從0.01mol到飽和(優(yōu)選200mM)，溶液的pH值在l到9之間，優(yōu)選pH為3.2。pH值高的洗脫可以使用三乙胺的水溶液或者非水溶液、濃度在1umol到飽和，優(yōu)選濃度為100mM，pH值在8到13之間，優(yōu)選pH值為11.5。
本發(fā)明步驟e)包括和抗原結(jié)合的單克隆抗體的篩選。優(yōu)選該步驟中包含有檢測(cè)步驟，例如加入一種標(biāo)記物，該標(biāo)記物和單克隆抗體結(jié)合用于指示單克隆抗體的存在。優(yōu)選的標(biāo)記物是酶或者熒光標(biāo)記，后兩者使單克隆抗體便于檢測(cè)。例如，該標(biāo)記物可以是標(biāo)記的蛋白質(zhì)A或者蛋白質(zhì)G。蛋白質(zhì)A和G可以用熒光標(biāo)記如Cy3或者Cy5。蛋白質(zhì)A或者蛋白質(zhì)G也可以用酶標(biāo)記，例如生物素，其存在能通過(guò)標(biāo)記的鏈霉素或者抗生物素蛋白檢測(cè)。
優(yōu)選的標(biāo)記物是一種和第一抗體結(jié)合的抗體。優(yōu)選該抗體用酶或者熒光標(biāo)記。優(yōu)選該抗體用熒光標(biāo)記，因?yàn)檫@可以使用于DNA芯片檢測(cè)的設(shè)備適用于蛋白質(zhì)檢測(cè)。
優(yōu)選檢測(cè)結(jié)合抗原的單克隆抗體的方法進(jìn)一步包括對(duì)單克隆抗體進(jìn)行分型。優(yōu)選檢測(cè)和對(duì)單克隆抗體進(jìn)行分型的步驟包括在蛋白質(zhì)芯片中加入同型特異的抗免疫球蛋白抗體，其中每種含有不同標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體，以及檢測(cè)所述標(biāo)記的存在。這種方法使單克隆抗體和其免疫球蛋白分型同時(shí)得到檢測(cè)。
本方法中使用許多不同的型特異性抗免疫球蛋白抗體，這些型特異性免疫球蛋白抗體是由動(dòng)物免疫產(chǎn)生，都含有不同的標(biāo)記。例如，一種動(dòng)物例如小鼠注射了某種抗原，檢測(cè)并區(qū)分同型單克隆抗體的步驟包括加入用第一標(biāo)記物標(biāo)記的抗IgA抗體和/或者用第二標(biāo)記物標(biāo)記的抗IgD抗體和/或者用第三標(biāo)記物標(biāo)記的抗IgE抗體和/或者用第四標(biāo)記物標(biāo)記的抗IgG1抗體和/或者用第五標(biāo)記物標(biāo)記的抗IgG2a抗體和/或者用第六標(biāo)記物標(biāo)記的抗IgG2b抗體和/或者用第七標(biāo)記物標(biāo)記的抗IgG3抗體和/或者用第八標(biāo)記物標(biāo)記的抗IgG4抗體和/或者用第九標(biāo)記物標(biāo)記的抗IgM抗體。檢測(cè)并區(qū)分同型單克隆抗體的步驟也包括加入同型特異性抗免疫球蛋白抗體，該抗體和可能的亞型相結(jié)合。優(yōu)選該同型特異性抗免疫球蛋白抗體包括標(biāo)記有第一標(biāo)記物的抗IgM抗體和標(biāo)記有第二標(biāo)記物的抗IgG抗體。優(yōu)選標(biāo)記是熒光標(biāo)記。標(biāo)記的檢測(cè)表明結(jié)合抗原的單克隆抗體的存在，該步驟優(yōu)選自動(dòng)化完成。標(biāo)記是熒光標(biāo)記時(shí)，標(biāo)記的檢測(cè)以及單克隆抗體的存在可以通過(guò)使用掃描蛋白質(zhì)芯片的設(shè)備完成。例如，蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)可以由GenePix 4000B掃描儀(Axon Instruments，Inc.)或者Tecan LS200或LS400掃描儀操作。掃描可以在1到4的激光條件下進(jìn)行操作，并且?guī)追N濾光片聯(lián)合使用以檢測(cè)多種熒光標(biāo)記。雖然多種熒光標(biāo)記的檢測(cè)可以依次檢測(cè)，但是優(yōu)選同時(shí)進(jìn)行。
掃描圖片可以獲得并用適當(dāng)?shù)能浖鏕enePix Pro(AxonInstruments，Inc.)、Chipskipper(Schwager，Ansorge)或者TecanLS200、LS400進(jìn)行分析。
為了保證單克隆抗體檢測(cè)的可靠性，篩選方法優(yōu)選使用各種控制條件。例如，對(duì)于表面僅覆蓋有一種抗原的蛋白質(zhì)芯片，不僅本發(fā)明制備的永生化細(xì)胞系上清液需要點(diǎn)樣于蛋白質(zhì)芯片表面，而且陽(yáng)性和陰性對(duì)照也需要點(diǎn)樣于芯片表面。
陽(yáng)性對(duì)照可以用以前測(cè)定過(guò)的單克隆抗體，也可以使用通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買的多克隆抗體?；蛘?，陽(yáng)性對(duì)照可以由稀釋或未稀釋的、預(yù)先從免疫動(dòng)物獲取的血清組成，該血清在加強(qiáng)劑量的抗原注射后獲得，也可以在處死動(dòng)物收集B細(xì)胞時(shí)獲取。
陰性對(duì)照可以選用模擬上清液，并點(diǎn)樣于確定的位置。每種上清液篩選幾種抗原時(shí)需要選用其他的對(duì)照。獲得的信號(hào)僅針對(duì)一種抗原被認(rèn)為是有力的含有單克隆抗體的上清液。
蛋白質(zhì)芯片表面的陽(yáng)性信號(hào)可以追蹤確定特異的永生化細(xì)胞系，按照本發(fā)明的步驟e)使該單克隆抗體能被分離。隨后可以對(duì)該分離得到的抗體進(jìn)行進(jìn)一步的特性確定。
對(duì)抗體進(jìn)一步表征的方法包括進(jìn)一步確證抗體的特異性。例如，本發(fā)明分離得到的一種單克隆抗體可以用來(lái)檢測(cè)另一種蛋白質(zhì)芯片，該蛋白質(zhì)芯片包被有眾多不同的蛋白質(zhì)，從而確定單克隆抗體是否特異性地結(jié)合另一種抗原。上述用于蛋白質(zhì)鑒定的掃描方法可以用來(lái)檢測(cè)其特異性。本發(fā)明制備的單克隆抗體的特異性和親和力可以通過(guò)改變蛋白質(zhì)芯片表面的濃度或洗脫條件進(jìn)行進(jìn)一步確定。
進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明第一方面的實(shí)施方案，提供了建立一種產(chǎn)生目的單克隆抗體的永生化細(xì)胞系的方法，該方法包括以下步驟a)將至少一種候選抗原導(dǎo)入動(dòng)物；b)從所述動(dòng)物獲取抗體制備細(xì)胞并使這些細(xì)胞成為單細(xì)胞懸液；c)從所述單細(xì)胞懸液制備永生化細(xì)胞系；d)用蛋白質(zhì)芯片篩選所述永生化細(xì)胞系的上清液，所述蛋白質(zhì)芯片表面展示有候選抗源。
e)篩選其上清液中含有與所述候選抗原結(jié)合抗體者作為永生化細(xì)胞系。
由該方法建立的永生化細(xì)胞系在特異性抗體制備方面有著廣泛的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明第一方面的一個(gè)特殊實(shí)施方案，提供了一種制備多種單克隆抗體的高通量方法，每種制備得到的單抗和一種不同的候選抗原結(jié)合，該方法包括如下步驟a)將多種候選抗原導(dǎo)入動(dòng)物；b)從該動(dòng)物收集抗體制備細(xì)胞并使這些細(xì)胞成為單細(xì)胞懸液；c)從該單細(xì)胞懸液中建立永生化細(xì)胞系；d)用一種或多種蛋白質(zhì)芯片篩選該永生化細(xì)胞系的上清液，這些蛋白質(zhì)芯片的表面展示有候選抗原；e)選擇與所述候選抗原結(jié)合的抗體作為所述單克隆抗體。
如上所述，候選抗原優(yōu)選是純化的候選抗原。動(dòng)物體內(nèi)導(dǎo)入候選抗原、收集抗體制備細(xì)胞、建立永生化細(xì)胞系和永生化細(xì)胞系上清液的篩選方法同樣如上所述。
以前本領(lǐng)域制備單克隆抗體的方法需要復(fù)雜的操作并且耗時(shí)很長(zhǎng)。相比之下，該方法使同時(shí)制備和篩選多種抗體變得可行。使用蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行抗體大量篩選的方法相對(duì)于常規(guī)方法具有非常高的效率和準(zhǔn)確性，并且只需較少的候選抗原。
如上所述，優(yōu)選地，該實(shí)例的步驟e)進(jìn)一步包括單克隆抗體進(jìn)行分型的方法。這使本發(fā)明相對(duì)于本領(lǐng)域以前的發(fā)明具有另一優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)楹笳卟荒軐?duì)單克隆抗體同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，也不能區(qū)分同型單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種通過(guò)本發(fā)明的方法制備的單克隆抗體。本發(fā)明也可以用于制備抗體庫(kù)，其特異性覆蓋整個(gè)生物體的蛋白質(zhì)組。該抗體文庫(kù)構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，建立了一種永生化細(xì)胞系，優(yōu)選雜交瘤細(xì)胞系，該雜交瘤細(xì)胞系根據(jù)本發(fā)明的第二方面可以制備單克隆抗體。本發(fā)明的該方面也包括建立永生化細(xì)胞系庫(kù)，優(yōu)選雜交瘤細(xì)胞系文庫(kù)。本發(fā)明也可以用于構(gòu)建雜交瘤細(xì)胞系文庫(kù)，例如，可以產(chǎn)生整個(gè)生物體蛋白質(zhì)組的細(xì)胞系文庫(kù)。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了制備大量單克隆抗體的方法，每種抗體結(jié)合一種不同的純化候選抗原。該方法包括在一種動(dòng)物體內(nèi)導(dǎo)入多種候選抗原。
優(yōu)選每種候選抗原具有不同來(lái)源。根據(jù)該方法，每種抗原來(lái)源于不同的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)。本發(fā)明的這一方面不包括給動(dòng)物注射同一蛋白質(zhì)的不同片段進(jìn)行抗體制備的方法。例如，如果抗原不是來(lái)源于同一蛋白的全片段，那么純化候選抗原可以都是蛋白質(zhì)物質(zhì)。
該方法相對(duì)于本領(lǐng)域以前的方法具有另一優(yōu)點(diǎn)，即該方法使同時(shí)制備一種以上單克隆抗體變得可行，這些單克隆抗體分別結(jié)合不同的純化候選抗原。
可以使用任何技術(shù)給動(dòng)物注射純化候選抗原。例如，本發(fā)明該方面的方法進(jìn)一步包括收集抗體制備細(xì)胞如B細(xì)胞、T細(xì)胞和干細(xì)胞的步驟，這些細(xì)胞來(lái)源于免疫動(dòng)物。獲取細(xì)胞的方法如去除動(dòng)物脾、淋巴結(jié)或者骨髓，并使這些組織器官成為單細(xì)胞懸液。該方法進(jìn)一步包括通過(guò)單細(xì)胞懸液和骨髓瘤細(xì)胞融合構(gòu)建永生化細(xì)胞系，優(yōu)選是雜交瘤細(xì)胞系。優(yōu)選地，本發(fā)明該方面的方法包括這些步驟，也包括篩選永生化細(xì)胞系上清液的步驟，優(yōu)選雜交瘤細(xì)胞系，這些上清液中的抗體和一種或多種蛋白質(zhì)芯片表面的候選抗原結(jié)合；篩選和抗原結(jié)合的單克隆抗體，優(yōu)選分離這些抗體和/或者產(chǎn)生這些抗體的永生化細(xì)胞系。建立永生化細(xì)胞系的正確操作以及隨后的上清液篩選和本發(fā)明第一方面描述的方法相類似。如上所述，尤其是檢測(cè)單克隆抗體的步驟包括同時(shí)檢測(cè)單克隆抗體和對(duì)其進(jìn)行分型。
通過(guò)本發(fā)明這一方面的方法提供了一種制備單克隆抗體的方法。本發(fā)明的這一方面可以用來(lái)制備抗體庫(kù)，其包含，例如，和所有生物體蛋白質(zhì)組有特異親和力的抗體。該抗體庫(kù)代表本發(fā)明的進(jìn)一步成果。
本發(fā)明也構(gòu)建了永生化細(xì)胞系，優(yōu)選雜交瘤細(xì)胞系，所述細(xì)胞系如上所述能夠產(chǎn)生單克隆抗體。本發(fā)明也可以用來(lái)構(gòu)建永生化細(xì)胞系文庫(kù)，例如優(yōu)選構(gòu)建雜交瘤細(xì)胞系庫(kù)，該細(xì)胞系庫(kù)能夠產(chǎn)生包含所有生物體的蛋白質(zhì)組的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，可以產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體，該抗獨(dú)特型抗體根據(jù)本發(fā)明的第二方面可以結(jié)合單克隆抗體。因?yàn)榭躬?dú)特型抗體含有可變區(qū)域，該可變區(qū)域模擬原抗體所針對(duì)分子的結(jié)構(gòu)。因此抗獨(dú)特型抗體具有取代原抗體所針對(duì)分子進(jìn)行治療的作用?？梢酝ㄟ^(guò)本發(fā)明第一或者第四方面的方法，使用依據(jù)本發(fā)明第二方面制備的單克隆抗體制備抗獨(dú)特性抗體作為純化的候選抗原。
因此，本發(fā)明的該方面提供了一種制備抗獨(dú)特型抗體的方法，所述抗獨(dú)特型抗體與根據(jù)本發(fā)明第二方面的單克隆抗體結(jié)合。該方法包括根據(jù)本發(fā)明的第二方面使用單克隆抗體作為純化的候選抗原，該純化的候選抗原用于本發(fā)明的第一方面或者第四方面中。本發(fā)明也包括通過(guò)該方法制備的抗獨(dú)特型抗體。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面可以制備抗抗獨(dú)特型抗體，該抗體結(jié)合根據(jù)本發(fā)明第五方面制備的抗獨(dú)特型抗體。該抗抗獨(dú)特型抗體可以通過(guò)本發(fā)明第一或者第四方面的方法使用如上所述的抗獨(dú)特型抗體作為純化的候選抗原。因此本發(fā)明該方面提供了一種制備抗抗獨(dú)特型抗體的方法，該抗體結(jié)合根據(jù)本發(fā)明第五方面制備的抗獨(dú)特型抗體，該方法包括使用一種如上所述的抗獨(dú)特型抗體作為純化的候選抗原，該候選抗原用于本發(fā)明第一或第四方面的方法中。本發(fā)明的各個(gè)方面和實(shí)施方案將通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)進(jìn)行描述。應(yīng)當(dāng)理解在不偏離本發(fā)明內(nèi)容的前提下對(duì)細(xì)節(jié)可進(jìn)行修改。
附圖簡(jiǎn)述附

圖1掃描芯片的全圖，圖中綠色和紅色的點(diǎn)分別表示產(chǎn)生陽(yáng)性IgG和IgM的上清液。芯片中特殊區(qū)域進(jìn)行了放大以顯示細(xì)節(jié)，這些特殊的區(qū)域可以觀察到某些有效點(diǎn)。
附圖2比較芯片分析和ELISA篩選。第一張圖中是陰性樣品(Ia＜0.5)，而其他的則是陽(yáng)性樣品。平均Ic表示3片芯片上的點(diǎn)的平均總強(qiáng)度。Ia相對(duì)于三片芯片總強(qiáng)度，平均每個(gè)點(diǎn)的比例(％)。
附圖3比較了ELISA(■)或者芯片分析方法(□)篩選結(jié)合B5抗原的培養(yǎng)上清液所測(cè)得的相對(duì)于總強(qiáng)度的比例(附圖3A)。本底值在圖3B中顯示。顯示了許多通過(guò)芯片分析和/或者ELISA方法測(cè)得的陽(yáng)性上清液。
附圖4比較了ELISA(■)或者芯片分析的方法(□)篩選結(jié)合B5抗原的培養(yǎng)上清液所測(cè)得的相對(duì)于總強(qiáng)度的比例(附圖4A)。本底值在圖4B中顯示。顯示了一種通過(guò)芯片分析和ELISA方法測(cè)得的陽(yáng)性上清液。
附圖5比較了ELISA(■)或者芯片分析的方法(□)篩選結(jié)合Ket94/95抗原的培養(yǎng)上清液所測(cè)得的相對(duì)于總強(qiáng)度的比例(附圖5A)。本底值在圖5B中顯示。顯示了許多通過(guò)芯片分析和/或者ELISA方法測(cè)得的陽(yáng)性上清液。
附圖6比較了ELISA(■)或者芯片分析的方法(□)篩選結(jié)合Ket94/95抗原的培養(yǎng)上清液所測(cè)得的相對(duì)于總強(qiáng)度的比例(附圖6A)。本底值在圖6B中顯示。通過(guò)ELISA或者芯片分析方法沒(méi)有測(cè)得陽(yáng)性上清液。
實(shí)施例實(shí)施例1用10種蛋白抗原進(jìn)行免疫免疫給出生8周的雌性Balb/c小鼠脾內(nèi)注射10種蛋白質(zhì)抗原，各10μg，這些抗原用100μl磷酸緩沖鹽(PBS)溶解。在隨后的第三天，在小鼠脾內(nèi)再次注射各1μg的這10種蛋白質(zhì)抗原，抗原仍然用100μ1PBS溶解。在第五天，給這些小鼠靜脈注射各0.1μg的這10種蛋白質(zhì)抗原。在第八天，通過(guò)頸脫臼的方法處死小鼠并分離脾臟，把脾臟保存于DMEM培養(yǎng)基中(DMEMLife Technologies Inc.)融合所有的步驟在無(wú)菌的層流通風(fēng)櫥中完成。通過(guò)兩塊磨沙顯微載波片的機(jī)械碾磨使脾臟成為單細(xì)胞懸液。用一種70μm的尼龍細(xì)胞濾器(BD Falcon)收集上清液到容積為50ml、條形碼編碼的圓錐形底試管中(BD Falcon)，轉(zhuǎn)移給自動(dòng)化操作系統(tǒng)。
SP2骨髓瘤融合伴侶(ATCC)在融合前用HM20(DMEM，20％精制胎牛血清(Hyclone)、10mM的L-谷氨酰胺、50μm慶大霉素)培養(yǎng)5天。在融合當(dāng)天轉(zhuǎn)移到HM20/HCF/2xOPI(含10％雜交瘤克隆因子(Origen)和2％OPI克隆補(bǔ)充劑(Sigma)的HM20)中，在37℃、5％CO2的條件培養(yǎng)至少1小時(shí)。
通過(guò)條形碼識(shí)別設(shè)備讀取條形碼，Genesis FreedomSystem(Tecan)的RoMa臂把50ml的Falcon試管裝入轉(zhuǎn)筒。轉(zhuǎn)筒通過(guò)工作臺(tái)裝入離心機(jī)。
試管在室溫條件(RT)、100g速度下離心10分鐘，然后從離心機(jī)中取出轉(zhuǎn)筒，再?gòu)霓D(zhuǎn)筒中取出試管，通過(guò)條形碼加以區(qū)分。細(xì)胞在室溫條件用5ml紅細(xì)胞裂解液(Sigma)作用9分鐘。HM20加至50ml，然后再一次在室溫的條件離心10分鐘，自然停止。棄上清重懸細(xì)胞于預(yù)熱至37℃的DMEM中。每次離心和重懸步驟至少洗滌細(xì)胞兩次。50μl的細(xì)胞懸液用自動(dòng)化設(shè)備吸至1.5ml的微量離心管中。通過(guò)血球計(jì)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
同時(shí)，用相似的方式洗滌SP2細(xì)胞3次，取50μl細(xì)胞懸液移至1.5ml微型離心管中并通過(guò)血球計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。SP2骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞以1∶5的比例混合，在100g條件下離心10分鐘，自然停止。
完全棄去上清，將溶于50％HEPES的PEG1500預(yù)熱至37℃并通過(guò)自動(dòng)化裝置加入，加入過(guò)程中試管置于Te-shake振動(dòng)器(Tecan AG)上以450rpm的轉(zhuǎn)速振搖并且滴加的時(shí)間應(yīng)超過(guò)1分鐘以保證充分的混合。細(xì)胞/PEG混合物在37℃溫孵1分鐘，溫孵過(guò)程輕輕攪拌。37℃條件下，邊攪拌邊加入1ml的DMEM，1分鐘以上加完?；旌衔镌?7℃條件溫孵1分鐘，溫孵過(guò)程輕輕攪拌。通過(guò)自動(dòng)化裝置在37℃條件再次加入1ml DMEM，加入時(shí)間在1分鐘以上，邊加邊攪拌。然后在相似條件再孵育1分鐘。37℃條件下通過(guò)自動(dòng)化裝置加入7ml HM20，加入的時(shí)間在3分鐘以上，邊加邊攪拌。然后試管在90g條件下旋轉(zhuǎn)5分鐘，通過(guò)制動(dòng)的方式停止離心。吸棄上清液，重懸細(xì)胞于20ml的HM20/HCF/OPI/AH(HM20/HCF/OPI加10％偶氮絲氨酸次黃嘌呤(Sigma))中。
圓錐形試管再次置于自動(dòng)化工作臺(tái)，通過(guò)自動(dòng)化設(shè)備的液體移液臂的8個(gè)吸頭吸取融合后的細(xì)胞混懸液，然后將200μl的細(xì)胞混懸液加到96孔深孔板的每個(gè)孔中(Greiner Masterblock)。
通過(guò)自動(dòng)化裝置將該深孔板轉(zhuǎn)移到位于Genesis工作臺(tái)上的TeMo96孔自動(dòng)移液器處，把該96孔板的液體吸出置于無(wú)菌96孔組織培養(yǎng)板中。
融合后混合物通過(guò)自動(dòng)設(shè)備加至20個(gè)96孔無(wú)菌板中(Nunc)，每孔100μl，該96孔無(wú)菌板固定于整合于機(jī)器人的自動(dòng)化傳送盤。將該96孔無(wú)菌板置于集成的37℃孵箱中，該孵箱通過(guò)氣壓表的CO2含量是10％。培養(yǎng)板儲(chǔ)存于孵箱中含有的傳送盤。
細(xì)胞培養(yǎng)在融合后的第三天，將細(xì)胞從孵箱自動(dòng)化轉(zhuǎn)移到工作臺(tái)，并通過(guò)自動(dòng)化裝置再加入100μl HM20/HCF/OPI/AH。然后將培養(yǎng)板自動(dòng)化放回孵箱。
在第七天，培養(yǎng)板再次從孵箱轉(zhuǎn)移到工作臺(tái)，棄去每孔200μl的上清液，重新加入150μl新鮮HM20/HCF。
在第11天，培養(yǎng)板自動(dòng)化轉(zhuǎn)移到工作臺(tái)，收集每孔30μl的上清液并轉(zhuǎn)移到384孔培養(yǎng)板中，該384孔培養(yǎng)板通過(guò)傳送帶(Tecan Inc)位于工作臺(tái)上。
微陣列篩選滴加40μl含有1到5μg抗原的雙蒸水至氨基硅烷覆蓋的玻璃片上，并在其表面覆蓋一張22×60毫米的蓋玻片，在室溫條件濕潤(rùn)環(huán)境下保存60分鐘，使蓋玻璃片表面均一包被純化抗原。
包被的玻璃片用PBS簡(jiǎn)單清洗并用含5％牛奶的PBS和0.1％吐溫阻斷60分鐘，然后用PBS清洗10分鐘。在2000rpm速度下離心10秒干燥芯片。培養(yǎng)上清液通過(guò)Beckman Biomek FX自動(dòng)化裝置統(tǒng)一置于384孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)上清液通過(guò)一種GeneMachines OmniGrid微陣列加樣器加載到三張同樣的抗原包被的玻璃片上，每張玻璃片上含9600個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)的大小在120μm左右。
微陣列芯片在37℃條件、濕潤(rùn)環(huán)境下孵育60分鐘，然后用含0.1％吐溫的PBS(PBST)清洗5分鐘，共5次。
40μl Cy3偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG特異性抗體和Cy5偶聯(lián)的羊抗小鼠IgM特異性抗體按照1∶1000的比例用PBST稀釋并混合，然后均一地置于芯片上，用22×60mm的蓋玻片覆蓋，室溫條件在潮濕環(huán)境孵育30分鐘。然后芯片依次用PBST、PBS和雙蒸水洗兩次，每次10分鐘。該芯片在2000rpm條件下離心10秒干燥。
Hit-Picking在每象素10μm分辨率下，用GenePix4000B掃描儀(AxonInstruments)掃描芯片。Cy3和Cy5通道的PMT電壓分別是540v和610v。兩種激光射線都設(shè)定為100％強(qiáng)度。每種掃描的芯片賦予合適的柵格，并且所有的點(diǎn)用GenePixPro 3.0(Axon Instruments)分析。
所有的芯片用GenePixPro 3.0軟件分析，確定芯片上每個(gè)點(diǎn)在Cy3和Cy5通道的相對(duì)于校正強(qiáng)度(Ic)的信息。從這些數(shù)據(jù)我們得到了每個(gè)點(diǎn)相對(duì)于每個(gè)通道總校正強(qiáng)度的比例((Ic/Σ19600Ic)×100).]]>將每個(gè)點(diǎn)的每個(gè)通道的三個(gè)值平均求值，該平均校正強(qiáng)度用作數(shù)據(jù)集最后的分析。我們把大于0.5％的值當(dāng)作“可能是陽(yáng)性”的樣品，把超過(guò)1.5％的值作為“確定的陽(yáng)性”樣品。
篩選后處理重懸陽(yáng)性孔中得到的細(xì)胞并將20μl轉(zhuǎn)移到一塊96孔深孔板中，該96孔板預(yù)先加入了1.5ml的HM20/HCF，然后置于孵箱，在37℃、5％CO2條件下孵育48小時(shí)。
1.4ml的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移入另一深孔板中，然后將剩余的100μl培養(yǎng)液用來(lái)重懸細(xì)胞，將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移入凍存管，每管含90％胎牛血清/10％DMSO(Sigma)，再將凍存管置于-80℃保存2小時(shí)，最后放進(jìn)液氮罐保存。然后將培養(yǎng)上清液用于所產(chǎn)生單克隆抗體的評(píng)價(jià)和進(jìn)一步表征。
結(jié)果微陣列篩選的結(jié)果見(jiàn)圖1。該圖表示許多陽(yáng)性單克隆抗體結(jié)合玻璃片上的候選抗原后被檢測(cè)到。綠色的點(diǎn)表示IgG單克隆抗體，該抗體結(jié)合候選抗原；而紅色的點(diǎn)表示IgM單克隆抗體，該抗體結(jié)合候選抗原。圖1表示本發(fā)明的方法能用來(lái)鑒定結(jié)合候選抗原的單克隆抗體，同時(shí)也能確定這些單克隆抗體的型別。
ELISA方法和蛋白質(zhì)芯片方法進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，如圖2所示(參見(jiàn)微陣列結(jié)果和ELISA結(jié)果比較)許多結(jié)合候選抗原的單克隆抗體可以通過(guò)蛋白質(zhì)芯片方法測(cè)得，但是用ELISA方法卻無(wú)法鑒定。一種通過(guò)微陣列方法篩選是陰性(Ia0.234)的上清液用ELISA方法測(cè)定仍然是陰性。然而，有四種用微陣列篩選是陽(yáng)性結(jié)果(Ia5.18，1.96，3.64，2.02)的上清液用ELISA(參見(jiàn)圖2)方法測(cè)定只有兩種是陽(yáng)性結(jié)果。有必要指出在ELISA試驗(yàn)中是陰性結(jié)果的上清液怎么會(huì)通過(guò)更精確更靈敏的微陣列方法測(cè)得陽(yáng)性結(jié)果。
實(shí)施例2用9種抗原進(jìn)行免疫免疫給小鼠體內(nèi)注射9種劑量為25μg的抗原，其中包括25μg抗原B5和Ket94/95的融合體，每種抗原和10μg的CpG DNA混合并吸附于明礬佐劑(Pierce)。每種抗原的一半通過(guò)脾內(nèi)注射導(dǎo)入，另外一半則通過(guò)皮下注射導(dǎo)入。
21天后給予小鼠10μg每種抗原、10μg的CpG DNA和明礬佐劑的混合物進(jìn)行加強(qiáng)，每種抗原的一半通過(guò)脾內(nèi)注射導(dǎo)入，另一半則通過(guò)皮下導(dǎo)入。
加強(qiáng)劑量的抗原注射后去除脾臟。
融合和細(xì)胞培養(yǎng)融合和細(xì)胞培養(yǎng)如實(shí)施例1所述。
針對(duì)抗原B5和Ket94/95的抗體的微陣列篩選滴加40μl含有5μg純化B5抗原的雙蒸水至氨基硅烷覆蓋的玻璃片上，并在其表面覆蓋一張22×60毫米的蓋玻片，在室溫條件濕潤(rùn)環(huán)境下保存60分鐘，使蓋玻璃片表面均一包被有純化抗原。用同樣的方法制備一張表面包被有純化Ket94/95抗原的氨基硅烷玻璃片。
除了用含3％BSA的PBS代替含5％牛奶的PBS阻斷玻璃片以外，清洗、阻斷和干燥玻璃片的方法如實(shí)例1所述。
如實(shí)施例1所述培養(yǎng)的上清液統(tǒng)一置于384孔板中，然后用Microgrid610微陣列點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣到包被有B5和Ket94/95的玻璃片上，每孔設(shè)3個(gè)重孔，每張芯片含大約16000個(gè)孔，每孔的大小在150um左右(ApogentDiscoveries)。
孵育微陣列芯片，并加入Cy3偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG和Cy5偶聯(lián)的羊抗小鼠IgM特異性抗體，如實(shí)施例1所述。
Hit-Picking如實(shí)例1所述的方法掃描芯片，求得三個(gè)培養(yǎng)上清液(一式三份)的平均校正強(qiáng)度。
微陣列篩選和ELISA方法比較用ELISA方法檢測(cè)每種培養(yǎng)上清液進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)。每孔內(nèi)含200ngB5或者Ket94/95抗原，加入每種培養(yǎng)上清液于孔中，培養(yǎng)上清液中和抗原結(jié)合的單克隆抗體通過(guò)常規(guī)ELISA試驗(yàn)測(cè)定。
用ELISA需要一周的時(shí)間篩選5376種培養(yǎng)上清液，這5376種培養(yǎng)上清液產(chǎn)生5376種結(jié)果，每個(gè)樣品對(duì)應(yīng)一個(gè)結(jié)果。相比之下，使用微陣列芯片可以在48小時(shí)以內(nèi)篩選5376種培養(yǎng)上清液，并且每種上清液可以設(shè)3個(gè)孔，因此可以產(chǎn)生16128種結(jié)果，這表明微陣列篩選相對(duì)于ELISA方法更有效。
此外，微陣列篩選只需5μg的B5和Ket94/95抗原，每片芯片也只需5μg抗原。相比之下，每塊ELISA板需要96微克抗原，并且篩選每種抗原需要5塊ELISA板。因此通過(guò)ELISA方法的篩選比微陣列篩選費(fèi)用更高且耗時(shí)更長(zhǎng)。
每塊ELISA板的數(shù)據(jù)給出的是每種培養(yǎng)上清液相對(duì)于總強(qiáng)度的百分比。微陣列篩選得到上清液復(fù)孔的均值強(qiáng)度也可以和ELISA數(shù)據(jù)相比較。
當(dāng)用ELISA方法篩選培養(yǎng)上清液中結(jié)合B5的抗體時(shí)，在超過(guò)5塊ELISA板中發(fā)現(xiàn)了53種陽(yáng)性上清液。使用微陣列篩選方法篩選同樣的培養(yǎng)上清液時(shí)發(fā)現(xiàn)了48種陽(yáng)性上清液，是用ELISA方法篩選的90.57％。微陣列篩選也鑒定了四種未能被ELISA所鑒定的新的陽(yáng)性上清液。
當(dāng)用ELISA方法篩選培養(yǎng)上清液中結(jié)合Ket94/95的單克隆抗體時(shí)，在一塊ELISA板上鑒定了15種陽(yáng)性上清液。用微陣列篩選對(duì)同樣的上清液進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)了13種陽(yáng)性上清液，為ELISA鑒定結(jié)果的88.66％。微陣列篩選也確定了8種新的未能被ELISA方法鑒定的陽(yáng)性上清液。
從這些結(jié)果可以看出，微陣列篩選在鑒定結(jié)合特異抗原的單克隆抗體方面至少和ELISA同樣有效。事實(shí)上，微陣列篩選能鑒定不能通過(guò)ELISA方法測(cè)定的上清液表明其靈敏性高于ELISA。此外微陣列篩選還具有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，即該篩選方法同時(shí)還可以確定鑒定的單克隆抗體是IgG型還是IgM型。
圖3A比較了用ELISA方法(■)測(cè)定含結(jié)合B5抗原的陽(yáng)性樣品的上清液相對(duì)于總強(qiáng)度的百分比值和用B5包被的玻璃片(□)對(duì)相同培養(yǎng)上清液進(jìn)行微陣列篩選所得到校正的百分比值。圖3B表示這些試驗(yàn)中的本底水平。由圖中可見(jiàn)，和ELISA方法相比，用微陣列篩選法測(cè)得的陽(yáng)性上清液具有更高的相對(duì)于總強(qiáng)度的比值。因此，微陣列篩選和ELISA方法測(cè)得的本底和陽(yáng)性上清液有顯著性差異，這可以更容易更精確地測(cè)定陽(yáng)性上清液。
圖4A比較了用ELISA方法(■)測(cè)定含結(jié)合B5抗原的陽(yáng)性樣品的上清液相對(duì)于總強(qiáng)度的百分比值和用B5包被的玻璃片(□)對(duì)相同培養(yǎng)上清液進(jìn)行微陣列篩選所得到校正的百分比值。圖4B表示這些試驗(yàn)的本底水平，由圖中可知，在本底背景下微陣列篩選方法比ELISA方法更易于測(cè)定陽(yáng)性樣品。
圖5A比較了用ELISA方法(■)測(cè)定含結(jié)合Ket94/95抗原的陽(yáng)性樣品的上清液相對(duì)于總強(qiáng)度的百分比值和用Ket94/95包被的玻璃片(□)對(duì)相同培養(yǎng)上清液進(jìn)行微陣列篩選所得到的校正的百分比值。如圖5B所示，在本底背景下使用微陣列篩選方法比ELISA方法更易于測(cè)定陽(yáng)性樣品。
圖6A比較了用ELISA(■)和微陣列篩選方法(□)測(cè)定的不含陽(yáng)性上清液的數(shù)據(jù)。如圖6B所示，兩種方法的數(shù)據(jù)歸因于本底值。
這些結(jié)果表示本發(fā)明的方法能同時(shí)鑒定針對(duì)一種以上抗原的單克隆抗體。本發(fā)明中的微陣列篩選比常規(guī)的抗體篩選方法(比如ELISA)更快速、廉價(jià)并且更精確。
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權(quán)利要求
1.一種制備單克隆抗體的方法，該方法包括下述步驟a)將至少一種候選抗原導(dǎo)入動(dòng)物；b)從所述動(dòng)物收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞，并使這些細(xì)胞成為單細(xì)胞懸液；c)從所述單細(xì)胞懸液制備永生化細(xì)胞系；d)用其上展示有候選抗原的蛋白質(zhì)芯片篩選所述永生化細(xì)胞系的上清液；和e)選擇與所述候選抗原結(jié)合的抗體作為所述單克隆抗體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述動(dòng)物是小鼠、大鼠、豚鼠或兔。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述候選抗原是純化的候選抗原。
4.權(quán)利要求3的方法，其中將1到50種不同的純化的候選抗原導(dǎo)入動(dòng)物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中將0.001到1000微克的各種抗原導(dǎo)入動(dòng)物。
6.權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的方法，其包括給予動(dòng)物加強(qiáng)劑量的一些或全部抗原的附加步驟，所述抗原在抗體產(chǎn)生細(xì)胞去除之前導(dǎo)入動(dòng)物。
7.權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的方法，其中抗體產(chǎn)生細(xì)胞是B細(xì)胞、T細(xì)胞或者干細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的方法，其中抗體產(chǎn)生細(xì)胞通過(guò)動(dòng)物的脾組織、淋巴結(jié)或者骨髓的去除而收集。
9.權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的方法，其中永生化細(xì)胞系是雜交瘤細(xì)胞系，所述雜交瘤細(xì)胞系通過(guò)單細(xì)胞懸液中的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生體細(xì)胞融合而制備。
10.權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)芯片是平整的玻璃片、3D凝膠墊芯片、微孔芯片或者細(xì)胞芯片。
11.權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)與抗原結(jié)合的單克隆抗體的步驟進(jìn)一步包括對(duì)單克隆抗體進(jìn)行分型。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述檢測(cè)和對(duì)單克隆抗體進(jìn)行分型的步驟包括在所述蛋白質(zhì)芯片中加入同型特異性抗免疫球蛋白抗體，其中每一具有不同同型特異性的抗免疫球蛋白抗體有不同的標(biāo)記，和檢測(cè)所述標(biāo)記的存在。
13.權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括用包含所述抗原的蛋白質(zhì)芯片評(píng)估每種分離的單克隆抗體與抗原結(jié)合的特異性。
14.一種制備多種單克隆抗體的高通量方法，其中每種結(jié)合不同的候選抗原，包括以下步驟a)將多種候選抗原導(dǎo)入動(dòng)物；b)從所述動(dòng)物收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞并使這些細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液；c)從所述單細(xì)胞懸液制備永生化細(xì)胞系；d)用其上展示有候選抗原的一種或多種蛋白質(zhì)芯片篩選所述永生化細(xì)胞系的上清液；和e)選擇與所述候選抗原結(jié)合的抗體作為所述單克隆抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其進(jìn)一步包括權(quán)利要求1到13中任一項(xiàng)所述的任一步驟。
16.制備產(chǎn)生目的單克隆抗體的永生化細(xì)胞系的方法，所述方法包括下述步驟a)將至少一種候選抗原導(dǎo)入動(dòng)物；b)從所述動(dòng)物收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞并使這些細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液；c)從所述單細(xì)胞懸液制備永生化細(xì)胞系；d)用其上展示有候選抗原的蛋白質(zhì)芯片篩選所述永生化細(xì)胞系的上清液；和e)選擇所產(chǎn)生的上清液含有與所述候選抗原結(jié)合抗體者作為所述永生化細(xì)胞系。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法分離的永生化細(xì)胞系。
18.制備多種單克隆抗體的方法，每種抗體結(jié)合不同的純化的候選抗原，其包括將多種純化的候選抗原導(dǎo)入動(dòng)物，每種純化的候選抗原具有不同來(lái)源。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其進(jìn)一步包括權(quán)利要求1到13中任一項(xiàng)所述的任一步驟。
20.根據(jù)權(quán)利要求1到16或18到19中任一項(xiàng)所述方法分離的單克隆抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的抗體，其是抗獨(dú)特型抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其是抗-抗獨(dú)特型抗體。
23.產(chǎn)生權(quán)利要求20、21或22中所述單克隆抗體的永生化細(xì)胞系。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的永生化細(xì)胞系，其是雜交瘤細(xì)胞系。
25.根據(jù)權(quán)利要求20、21或者22所述抗體的庫(kù)。
26.根據(jù)權(quán)利要求15、21或者22所述永生化細(xì)胞系的庫(kù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備單克隆抗體的方法。本發(fā)明尤其涉及比常規(guī)方法更快速制備和篩選單克隆抗體的高通量方法。
文檔編號(hào)C12N15/06GK1659185SQ03813353
公開(kāi)日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月17日
發(fā)明者A·M·薩耶, F·德馬斯 申請(qǐng)人:歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室