專利名稱：抗前列腺特異性膜抗原(psma)的人單克隆抗體的制作方法
相關(guān)申請本申請要求2002年1月28日申請的美國用途申請登記號No.10/059,989的優(yōu)先權(quán)，它是2000年7月26日申請的PCT國際申請PCT/US00/20247的繼續(xù)部分申請，后者要求了1999年7月29日申請的美國臨時申請系列號No.60/146,285，1999年10月12日申請的美國臨時申請系列號No.60/158,759和2000年3月9日申請的美國臨時申請登記號No.60/188,087的優(yōu)先權(quán)。這些專利申請的全部內(nèi)容在此引作參考。
背景技術(shù)：
前列腺癌是男性發(fā)病率和死亡率主要原因。對于前列腺癌的治療包括手術(shù)，激素，放射療法，和化學(xué)療法。對于轉(zhuǎn)移性前列腺疾病幾乎沒有有效治療。因此，代表診斷和預(yù)后標(biāo)記，以及治療靶物的基因和/或基因產(chǎn)物的鑒定是關(guān)鍵的。前列腺特異性抗原(PSA)是一種在前列腺癌的臨床診斷和分級中有用的這樣的癌標(biāo)記。但是，在4-10ng/ml范圍內(nèi)PSA不能區(qū)別良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎或者前列腺癌，因此，需要證實適當(dāng)診斷的細(xì)胞學(xué)和/或組織學(xué)評定(Barren，R.J.等(1998)Prostate 36181-188)。
前列腺特異性膜抗原(PSMA)是與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體具有54％同源性的大約110kD的II型跨膜糖蛋白，具有750個氨基酸。PSMA具有三個結(jié)構(gòu)域，包括一個19個氨基酸的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，一個24個氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域，和一個707個氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域。PSMA蛋白質(zhì)顯示神經(jīng)羧肽酶和葉酸水解酶活性，據(jù)報道參與前列腺生長和分化的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)(Heston，W.D.(1996)Urologe-Ausgabe A.35400-407)。PSM′是位于細(xì)胞質(zhì)中的PSMA的另一種剪接形式。
PSMA主要由前列腺上皮細(xì)胞表達(dá)。在前列腺癌中，特別是在分化不好的，轉(zhuǎn)移的，和激素難以治療的癌中PSMA的表達(dá)增加(Gregorakis，A.K.等(1998)Seminars in Urologic Oncology 162-12；Silver，D.A.(1997)Clinical Cancer Research 381-85)。前列腺外的組織例如小腸，唾液腺，十二指腸粘膜，近端腎小管，和腦中發(fā)現(xiàn)低水平PSMA表達(dá)(Silver，D.A.(1997)Clinical Cancer Research 381-85)。在一些惡性腫瘤，包括腎細(xì)胞癌和結(jié)腸癌的腫瘤外周和腫瘤內(nèi)區(qū)域中的毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中也表達(dá)PSMA，但是在正常組織血管中不表達(dá)。另外，據(jù)報道PSMA與腫瘤血管生成相關(guān)(Silver，D.A.(1997)Clinical Cancer Research 381-85)。
因此，PSMA代表用于前列腺癌和特征在于PSMA表達(dá)的各種各樣的其他疾病的治療的有價值靶物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供與人前列腺特異性膜抗原(PSMA)結(jié)合的分離的人單克隆抗體，以及免疫偶聯(lián)物，雙特性分子，和單獨地或者與另外的治療物質(zhì)組合的含有這樣的抗體的其他治療組合物。特別地，在人效應(yīng)細(xì)胞，例如，多形核細(xì)胞，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，和樹狀細(xì)胞的存在下，本發(fā)明的人抗體與人PSMA上的天然蛋白質(zhì)表位(例如，位于人PSMA的胞外結(jié)構(gòu)域中的表位)結(jié)合，并且抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞生長和/或介導(dǎo)處死這樣的細(xì)胞(例如，通過溶胞作用或吞噬作用)。因此，在與PSMA表達(dá)相關(guān)的疾病，特別是PSMA-表達(dá)腫瘤和癌，例如前列腺癌，結(jié)腸癌，和腎癌的診斷，治療，和/或預(yù)防的各種方法中能夠使用這些抗體。
本發(fā)明的分離的人抗體包括各種抗體同種型，例如IgG1，(例如，IgG1k)，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgAsec，IgD，和IgE。所述抗體可以是全長抗體(例如，IgG1或IgG3)或者可以只包括抗原-結(jié)合部分(例如，F(xiàn)ab，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v，或者單鏈Fv片段)。
本發(fā)明的特定治療抗體包括人單克隆抗體(HuMAb)4A3，7F12，8A11，8C12，16F9，和功能等價抗體，其例如，(a)由其可變區(qū)內(nèi)分別包含SEQ ID NOs1，3，5，7或9和SEQ ID NOs2，4，6，8，或10中列出的核苷酸序列的人重鏈和人輕鏈核酸及其保守性修飾物編碼，和/或(b)包括分別包含SEQ ID NOs11，12，13，14，或15，和SEQ ID NOs16，17，18，19，或20列出的氨基酸序列的重鏈和輕鏈可變區(qū)及其保守性修飾物。
本發(fā)明的其他特殊人抗體包括包含具有人重鏈和輕鏈CDR1區(qū)，人重鏈和輕鏈CDR2區(qū)，和人重鏈和輕鏈CDR3區(qū)的CDR結(jié)構(gòu)域的那些，
其中(a)人重鏈區(qū)的CDR1，CDR2，和CDR3包含選自

圖19所示CDR1，CDR2，和CDR3區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NOs21-35)，及其保守性序列修飾物的氨基酸序列，和(b)人輕鏈區(qū)的CDR1，CDR2，和CDR3包含選自圖22和23所示CDR1，CDR2，和CDR3區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NOs36-50)，及其保守性序列修飾物的氨基酸序列。
本發(fā)明的其他特殊抗體包括與抗體4A3，7F12，8A11，8C12，或16F9確定的表位結(jié)合，和/或與抗體4A3，7F12，8A11，8C12，或16F9競爭與PSMA的結(jié)合，或者具有抗體4A3，7F12，8A11，8C12，或16F9表現(xiàn)出的其他功能性結(jié)合特征的人單克隆抗體。這樣的抗體包括，例如，以10-7M或更低，例如10-8M或更低，10-9M或更低，10-10M或更低，或者甚至更低(例如，10-11M或更低)的離解常數(shù)(KD)與PSMA結(jié)合的那些。這樣的抗體還包括與鼠抗-PSMA抗體3C6(ATCC保藏號HB 12491)交叉反應(yīng)，但是不表現(xiàn)出與鼠抗-PSMA抗體4D4(ATCC保藏號HB 12493)或1G9(ATCC保藏號HB 12495)交叉反應(yīng)的那些。
在本發(fā)明的另一個方面中，人抗-PSMA抗體被衍生化，與另一種功能分子例如另一種肽或蛋白質(zhì)(例如，F(xiàn)ab′片段)連接或共同表達(dá)。例如，本發(fā)明的抗體或抗原-結(jié)合部分可以與一個或多個其他分子實體，例如另一種抗體(例如，產(chǎn)生雙特異性抗體或多特異性抗體)，細(xì)胞毒素，細(xì)胞配體或抗原功能性連接(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)，基因融合，非共價締合或者其他)。因此，本發(fā)明包括各種各樣的抗體偶聯(lián)物，雙特異性和多特異性分子，以及融合蛋白，它們都與表達(dá)PSMA的細(xì)胞結(jié)合并且使其他分子靶向細(xì)胞，或者其與PSMA和與其他分子或細(xì)胞結(jié)合。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明包括雙特異性或多特異性分子，其包括至少一種對于PSMA的結(jié)合特異性，其是人抗-PSMA抗體(或者其片段或模擬物)，和對于Fc受體，例如，人FcγRI或人Fcα受體，或者抗原呈遞細(xì)胞(APC)上的另一種抗原的第二結(jié)合特異性。所述第二結(jié)合特異性也可以是抗體或者其片段(例如，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v，或單鏈Fv)，例如人抗體或者其片段，或者″嵌合″或″人源化″抗體或者其部分(例如，具有可變區(qū)，或者至少一個互補決定區(qū)(CDR)，從非人抗體衍生的(例如，鼠)帶有人源保留部分)。
因此，本發(fā)明包括與人PSMA和與Fc受體，例如，人IgG受體，例如，F(xiàn)c-γ受體(FcγR)，例如FcγRI(CD64)，F(xiàn)cγRII(CD32)，和FcγRIII(CD16)兩者結(jié)合的雙特異性或多特異性分子。其他Fc受體，例如人IgA受體(例如FcαRI)，也可以被靶向。Fc受體優(yōu)選位于效應(yīng)細(xì)胞，例如，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或激活的多形核細(xì)胞的表面上。在優(yōu)選的實施方案中，雙特異性和多特異性分子在與受體的免疫球蛋白Fc(例如，IgG或IgA)結(jié)合位點不同的位點處的Fc受體結(jié)合。因此，雙特異性和多特異性分子的結(jié)合不被免疫球蛋白生理水平所阻斷。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供免疫偶聯(lián)物，例如，免疫毒素，其包括與治療劑例如細(xì)胞毒性藥物，具有酶活性的毒素，或者其片段，放射性同位素，或者小分子抗癌藥物偶聯(lián)的全人抗-PSMA抗體。
或者，本發(fā)明的人抗體能與這樣的治療劑和細(xì)胞毒性藥物共同施用，但是不與它們連接。它們可以與這樣的藥物同時共同施用(例如，以單一的組合物或者分開施用)或者能在施用這樣的藥物之前或之后施用。這樣的藥物可以包括化療藥物，例如阿霉素(亞德里亞霉素)，順鉑博萊霉素硫酸鹽，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，環(huán)磷酰胺羥基脲和它們的組合。本發(fā)明的人抗體還可以與放射療法聯(lián)合施用。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了組合物，例如，藥物組合物和診斷組合物/試劑盒，含有藥學(xué)可接受載體和至少一種人抗-PSMA抗體，或者其抗原-結(jié)合部分。在一個實施方案中，組合物含有人抗體或其抗原-結(jié)合部分的組合，優(yōu)選地其各自結(jié)合不同的表位。例如，含有在效應(yīng)細(xì)胞的存在下介導(dǎo)高效殺傷靶細(xì)胞的人單克隆抗體的藥物組合物能與抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞生長的另一種人單克隆抗體聯(lián)合。因此，這種聯(lián)合提供特制提供最大治療利益的多功能治療法。組合物，例如，藥物組合物，含有至少一種人抗-PSMA抗體，或其抗原-結(jié)合部分，和至少一種本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子的聯(lián)合，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過使細(xì)胞接觸(例如施用給受者)一種或幾種本發(fā)明的人抗體和/或含有上述抗體的相關(guān)治療組合物，衍生物等而抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞增殖和/或生長，和/或誘導(dǎo)表達(dá)PSMA的細(xì)胞殺傷的方法。在特定的實施方案中，所述方法包括在人效應(yīng)細(xì)胞的存在下表達(dá)PSMA的細(xì)胞體外或體內(nèi)接觸一種本發(fā)明的人抗-PSMA抗體或者組合。所述方法可以在例如體外或來自體內(nèi)的培養(yǎng)物(例如含有表達(dá)PSMA的細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)物)中應(yīng)用。例如，可以體外培養(yǎng)含有表達(dá)PSMA的細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的樣品，并且和本發(fā)明的抗體組合?；蛘?，例如，可以作為體內(nèi)(例如治療或預(yù)防)方案的一部分對受試者施用本發(fā)明的方法。
對于在PSMA介導(dǎo)的疾病的體內(nèi)治療和預(yù)防中的應(yīng)用，使用本領(lǐng)域公知的施用以抗體為基礎(chǔ)的臨床產(chǎn)物的任何常規(guī)的合適的途徑以治療有效劑量(例如，抑制，減輕或防止表達(dá)PSMA的細(xì)胞生長)對患者(例如人受試者)施用，例如通過注射或灌注。
因此，通過對患有特征在于PSMA表達(dá)的各種疾病的患者施用合適劑量(或連續(xù)劑量)的本發(fā)明的抗體，可以使用本發(fā)明的人抗體來治療和/或預(yù)防各種這樣的疾病。利用本發(fā)明的方法和組合物能治療(例如改善)或預(yù)防的舉例的疾病包括但不限于癌癥，例如前列腺癌，結(jié)腸癌，和腎癌。
在本發(fā)明的特定實施方案中，患者可以另外接受化學(xué)治療劑，放療，或調(diào)節(jié)例如增強Fc受體，例如，F(xiàn)cγ受體或Fcα受體，例如細(xì)胞因子的表達(dá)或活性的藥物治療。治療期間施用的典型的細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞集落-刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落-刺激因子(GM-CSF)，干擾素-γ(IFN-γ)，和腫瘤壞死因子(TNF)。典型的治療劑包括抗腫瘤藥物，例如阿霉素(亞德里亞霉素)，順鉑博萊霉素硫酸鹽，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，和環(huán)磷酰胺羥基脲等。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供例如用于診斷PSMA-相關(guān)疾病的體外或體內(nèi)檢測PSMA或PSMA表達(dá)細(xì)胞存在的方法。這能通過例如使要測試的樣品，任選地和對照樣品一起，在允許形成抗體和PSMA之間的復(fù)合體的條件下，和本發(fā)明的人單克隆抗體(或者其抗原結(jié)合部分)接觸。然后檢測復(fù)合體的形成(例如，使用ELISA)。當(dāng)使用對照樣品和試驗樣品時，檢測兩個樣品中的復(fù)合體，并且樣品之間復(fù)合體形成中的任何統(tǒng)計學(xué)差異是試驗樣品中存在PSMA的指征。
另一方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因非人動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠(這里也稱作″HuMAb小鼠″)，它表達(dá)結(jié)合PSMA的全人單克隆抗體。在一個特定實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因非人動物是具有包括編碼本發(fā)明的全部或部分抗-PSMA抗體的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠。為了產(chǎn)生人抗-PSMA抗體，可以用PSMA抗原的純化的或富集的制劑和/或表達(dá)PSMA的細(xì)胞免疫轉(zhuǎn)基因非人動物。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因非人動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠，通過進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生抗PSMA的人單克隆抗體的多種同種型(例如，IgG，IgA和/或IgM)。同種型轉(zhuǎn)換可以通過例如經(jīng)典或非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換而發(fā)生。
因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供來自如上所述的轉(zhuǎn)基因非人動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠的分離的B-細(xì)胞，它表達(dá)人抗-PSMA抗體。然后通過與無限增殖化細(xì)胞融合提供人抗-PSMA抗體源(例如雜交瘤)而使得分離的B-細(xì)胞無限增殖化。這樣的雜交瘤(即，產(chǎn)生人抗-PSMA抗體的)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
根據(jù)這里舉例說明的，能從表達(dá)抗體的雜交瘤直接獲得人抗-PSMA抗體，或者能在宿主細(xì)胞，例如轉(zhuǎn)染瘤(例如，由無限增殖化CHO細(xì)胞或淋巴細(xì)胞組成的轉(zhuǎn)染瘤)中克隆和重組表達(dá)。因此，本發(fā)明提供用于制備與人PSMA結(jié)合的人單克隆抗體的方法。在一個特定實施方案中，該方法包括用人PSMA抗原和/或表達(dá)人PSMA的細(xì)胞的純化或富集制劑免疫轉(zhuǎn)基因非人動物，例如，先前所描述的轉(zhuǎn)基因小鼠(例如，具有包括編碼抗-PSMA抗體的全部或部分的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組)。然后獲得動物的B細(xì)胞(例如，脾B細(xì)胞)并且與骨髓瘤細(xì)胞融合形成無限增殖化的雜交瘤細(xì)胞，它分泌抗PSMA的人單克隆抗體。
在另一方面，本發(fā)明提供編碼人單克隆抗-PSMA抗體的全部或部分(例如，編碼抗體的至少一個輕鏈或重鏈)的核酸，以及包括這樣的核酸的重組表達(dá)載體，和用這樣的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括通過培養(yǎng)這樣的宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法。本發(fā)明提供的具體核酸包括SEQID NOs1，3，5，7，或9和SEQ ID NOs2，4，6，8，或10中所示核苷酸序列，它們分別編碼人抗-PSMA抗體(HuMAbs)4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9的重鏈和輕鏈。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點從不應(yīng)該視為限制的下面詳細(xì)描述和實施例而顯現(xiàn)。本申請引述的所有的參考文獻(xiàn)，專利文獻(xiàn)和公開的專利申請的內(nèi)容特意在此引作參考。
附圖簡述圖1是說明HuMAb 11C10與全長PSMA和含有相應(yīng)于氨基酸1-173，134-437，和438-750的PSMA片段的細(xì)菌表達(dá)的融合蛋白的反應(yīng)性(固相ELISA)的柱形圖。使用鼠7E11抗體作為對照物進(jìn)行測試。
圖2是說明人抗-PSMA單克隆抗體與來自人前列腺腺癌LNCaP和PC3細(xì)胞的膜級分的反應(yīng)性(固相ELISA)的圖。405nm的背景吸光度是0.05。
圖3是說明分離的PSMA的熱變性對抗體結(jié)合的影響的柱形圖。純化的PSMA，在熱變性和沒有熱變性的情況下，包被到96-孔板上并且用指明的抗體處理。通過ELISA檢測結(jié)合的抗體。
圖4說明使用HuMAbs的PSMA從LNCaP細(xì)胞洗滌劑溶胞產(chǎn)物的免疫沉淀。通過SDS凝膠電泳分離免疫沉淀出的蛋白質(zhì)，印跡到PVDF膜上，并且用鼠抗-PSMA 4D8抗體探測(2-7道)。1道說明總的LNCaP細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。2-7道說明分別用下面的抗體的免疫沉淀無關(guān)的人IgGI，4A3，7F12，8A11，8C12和16F9。箭頭指示PSMA和PSM′的位置。
圖5說明測定使用LNCaP細(xì)胞靶物和來自兩位捐獻(xiàn)者的PBMC′s(A道和B道)，各自E∶T之比是100∶1的HuMAbs 4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)反應(yīng)的圖。
圖6說明全人雙特異性分子，14A8×8C12，其結(jié)合CD89(FcaR)并且結(jié)合PSMA。該分子含有抗-CD89Fab′抗體片段(從人單克隆抗-CD89抗體衍生，14A8)，該片段通過二硫鍵與抗-PSMA Fab′抗體片段(從人單克隆抗-PSMA抗體衍生，8C12)化學(xué)連接。
圖7，A圖是說明通過圖6所示14A8×8C12雙特異性分子的PSMA-表達(dá)細(xì)胞的單核細(xì)胞-介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)作為雙特異性分子濃度的函數(shù)的圖。測定的結(jié)果是使用沒有加入抑制劑，50微克/毫升游離抗-FcRαR(14A8)F(ab′)2和50微克/毫升游離抗-FcγRI(H22)F(ab′)2的特異細(xì)胞溶胞作用的百分比；B圖是說明在效應(yīng)物與靶物之比是100∶1的情況下通過雙特異性分子14A8×8C12和單克隆抗體8C12的LNCaP細(xì)胞的單核細(xì)胞-介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的圖；C圖是說明沒有抑制劑存在下，或者在存在過量的14A8F(ab′)2或H22F(ab′)2，并且效應(yīng)物與靶物之比是100∶1的情況下，通過14A8×8C12雙特異性分子的LNCaP細(xì)胞的單核細(xì)胞-介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的圖。
圖8，A圖是說明通過圖6所示14A8×8C12雙特異性分子的PSMA-表達(dá)細(xì)胞的嗜中性白細(xì)胞-介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)作為雙特異性分子濃度的函數(shù)的圖。測定的結(jié)果是使用沒有加入抑制劑，25微克/毫升游離抗-FcRαR(14A8)F(ab′)2和25微克/毫升游離抗-FcγRI(H22)F(ab′)2的特異細(xì)胞溶胞作用的百分比；B圖是說明沒有抑制劑存在下，或者在存在過量的14A8F(ab′)2或H22F(ab′)2，并且效應(yīng)物與靶物之比是200∶1的情況下，通過14A8×8C12雙特異性分子的LNCaP細(xì)胞的嗜中性白細(xì)胞-介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的圖。
圖9，A圖是說明通過圖6所示14A8×8C12雙特異性分子的PSMA-表達(dá)細(xì)胞的全血-介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)作為雙特異性分子濃度的函數(shù)的圖。測定的結(jié)果是使用沒有加入抑制劑，25微克/毫升游離抗-FcRαR(14A8)F(ab′)2和25微克/毫升游離抗-FcγRI(H22)F(ab′)2的特異細(xì)胞溶胞作用的百分比；B圖是說明沒有抑制劑存在下，或者在存在過量的14A8F(ab′)2或H22F(ab′)2下，通過14A8×8C12雙特異性分子的LNCaP細(xì)胞的全血-介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的圖。
圖10是說明單核細(xì)胞產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞(MDM)對PSMA表達(dá)(LNCaP)細(xì)胞的雙特異性分子(14A8×8C12)-介導(dǎo)的吞噬作用的圖(圓)。測定的結(jié)果是存在或不存在過量的作為抑制劑的14A8抗體(方塊)和作為對照物的H22抗體(菱形)下吞噬作用的百分比。
圖11是說明單核細(xì)胞產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞(MDM)對LNCaP腫瘤細(xì)胞的雙特異性分子(14A8×8C12)-介導(dǎo)的吞噬作用和抗體(8C12)-介導(dǎo)的吞噬作用的圖。
圖12是說明單核細(xì)胞產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞(MDM)對LNCaP腫瘤細(xì)胞的雙特異性分子(14A8×8C12)-介導(dǎo)的吞噬作用的圖(圓)。插圖是說明在過量14A8F(ab′)2或H22F(ab′)2存在下14A8×8C12雙特異性分子(1微克/毫升)介導(dǎo)的吞噬作用的圖。
圖13是說明帶有LNCaP細(xì)胞腫瘤的裸鼠中125I-4A3的生物學(xué)分布。通過尾靜脈對動物注射100微克的125I-4A3，并且在注射之后0.25和24小時處死小鼠。測定各種組織中存在的放射性的量。數(shù)據(jù)說明每個時間點雙份動物的結(jié)果。
圖14是說明培養(yǎng)物中LNCaP細(xì)胞對125I-標(biāo)記的HuMAb的內(nèi)化和處理的圖。用碘化抗體標(biāo)記LNCaP細(xì)胞，充分洗滌，并且在指定的時間點測定內(nèi)化并且轉(zhuǎn)化為TCA可溶產(chǎn)物的細(xì)胞表面結(jié)合的標(biāo)記物的量。對于碘化后保留抗原結(jié)合性質(zhì)的三種HuMAbs，以及無關(guān)的人IgG，作為陰性對照，給出結(jié)果。
圖15是說明用125I碘化對一些抗-PSMA HuMAbs的抗原結(jié)合能力的影響的圖，結(jié)果表明與固定化天然純化LNCaP PSMA結(jié)合的125I-標(biāo)記的HuMAb的量是抗體稀釋系數(shù)的函數(shù)。
圖16包括表示DOTA-標(biāo)記對一些抗-PSMA HuMAbs的抗原結(jié)合能力的影響的圖。結(jié)果表明ELISA測定的DOTA-標(biāo)記HuMAb量，或者沒有偶聯(lián)的抗體，與PSMA結(jié)合，是抗體的量的效價的函數(shù)(以微克/毫升)表示。
圖17A和B表示分別來自各種HuMAb 4A3，7F12，8C12，8A11，和16F9的VH-和VL-區(qū)的核苷酸序列。
圖18是HuMAbs 4A3，7F 12，8A 11，8C 12，16F9的重鏈V區(qū)的核苷酸序列與種系核苷酸序列的相應(yīng)鏈V區(qū)的比對。
圖19是HuMAbs 4A3，7F 12，8A 11，8C 12，16F9的重鏈V區(qū)的氨基酸序列與種系氨基酸序列的相應(yīng)鏈V區(qū)的比對。
圖20是HuMAbs 4A3，7F 12，8C 12的輕(κ)鏈V區(qū)的核苷酸序列與種系核苷酸序列的相應(yīng)鏈V區(qū)的比對。
圖21是HuMAbs 8A11，16F9的輕(κ)鏈V區(qū)的核苷酸序列與種系核苷酸序列的相應(yīng)鏈V區(qū)的比對。
圖22是HuMAbs 4A3，7F12，8C12的輕(κ)鏈V區(qū)的氨基酸序列與種系氨基酸序列的相應(yīng)鏈V區(qū)的比對。
圖23是HuMAbs 8A11，16F9的輕(κ)鏈V區(qū)的氨基酸序列與種系氨基酸序列的相應(yīng)鏈V區(qū)的比對。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供用于治療和診斷特征在于前列腺特異性膜抗原(本文稱之為″PSMA″)表達(dá)的疾病的新的以抗體為基礎(chǔ)的治療法。本發(fā)明的治療法使用與PSMA上存在的表位結(jié)合的分離的單克隆抗體和/或含有抗體的相關(guān)的組合物。在本文舉例說明的具體的實施方案中，在經(jīng)歷V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換能產(chǎn)生抗PSMA人單克隆抗體的多個同種型(例如，IgG，IgA和/或IgE)的非人轉(zhuǎn)基因動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生人抗體。因此，本發(fā)明的各方面不僅包括抗體，抗體片段，及其藥物組合物，還包括非人轉(zhuǎn)基因動物，B-細(xì)胞和產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的抗體體外或體內(nèi)檢測表達(dá)PSMA的細(xì)胞，或者抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞生長，分化和/或運動性的方法。
為了使本發(fā)明更容易理解，首先定義一些術(shù)語。貫穿詳細(xì)描述的說明書提出其它的定義。
術(shù)語″前列腺特異性膜抗原″，″PSMA″和″PSMA抗原″在這里互換使用，并且包括人PSMA的變體，同種型和物種同源物。因此，本發(fā)明的人抗體在某些情況下可以與不是人的物種的PSMA或者與人PSMA結(jié)構(gòu)相關(guān)的其他蛋白質(zhì)(例如人PSMA同源物)交叉反應(yīng)。在其它情況下，抗體對于人PSMA是完全特異性的并且不表現(xiàn)出物種或其它類型的交叉反應(yīng)。
根據(jù)這里使用的，術(shù)語″抑制生長″(例如，指細(xì)胞)意在包括當(dāng)與沒有接觸抗-PSMA抗體的相同的細(xì)胞相比較時接觸抗-PSMA抗體的生長的任何可測量的降低，例如，細(xì)胞生長抑制至少大約10％，20％， 30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，99％，或100％。
這里提到的術(shù)語″抗體″包括整個抗體和任何抗原結(jié)合片段(即，″抗原結(jié)合部分″)或者其單鏈。″抗體″指包括由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白，或者其抗原結(jié)合部分。每一條重鏈由重鏈可變區(qū)(這里縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域CH1，CH2和CH3組成。每一條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(這里縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步再分成高變區(qū)，稱為互補決定區(qū)(CDR)，其中散布著更保守的區(qū)，稱作構(gòu)架區(qū)(FR)。每條VH和VL由三個CDRs和四個FRs構(gòu)成，按照下面的順序從氨基-末端向羧基-末端排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。
這里使用的術(shù)語抗體的″抗原-結(jié)合部分″(或者簡單地″抗體部分″)，指保持與抗原(例如，PSMA)特異性結(jié)合能力的抗體的一個或幾個片段。已經(jīng)證明抗體的抗原-結(jié)合功能能由全長抗體的片段實現(xiàn)?？贵w的″抗原-結(jié)合部分″包括的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL，VH，CL和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的一價片段；(ii)F(ab′)2片段，包括通過在鉸鏈區(qū)由二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(iv)由抗體的一條臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段，(v)由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341544-546)；和(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域，VL和VH，由不同的基因編碼，但是可以利用重組方法通過能使它們成為其中VL和VH區(qū)配對形成一價分子的單鏈蛋白質(zhì)的合成接頭將它們連接在一起(已知為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等(1988)Science 242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。這樣的單鏈抗體也包括在術(shù)語抗體的″抗原-結(jié)合部分″中。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段，并且對片段篩選和完整抗體一樣的應(yīng)用。
術(shù)語″表位″意思是能與抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)例如氨基酸或糖側(cè)鏈構(gòu)成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定的電荷特征。構(gòu)象表位和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于與前者而不與后者的結(jié)合在變性劑的存在下消失。
術(shù)語″天然構(gòu)象表位″或″天然蛋白質(zhì)表位″在這里互換使用，并且包括PSMA分子的線性序列的不同位置的氨基酸在三維空間中一起緊密接近時產(chǎn)生的PSMA分子的構(gòu)象折疊產(chǎn)生的蛋白質(zhì)表位。這樣的構(gòu)象表位分布在質(zhì)膜細(xì)胞外側(cè)上。
術(shù)語″雙特異性分子″意在包括具有兩個不同的結(jié)合特異性的任何物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)，肽，后者蛋白質(zhì)或肽復(fù)合體。例如，所述分子可以與下面的物質(zhì)結(jié)合或相互作用(a)細(xì)胞表面抗原和(b)效應(yīng)細(xì)胞表面上的Fc受體。術(shù)語″多特異性分子″或″雜特異性分子″意在包括具有兩個以上不同的結(jié)合特異性的任何物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)，肽，后者蛋白質(zhì)或肽復(fù)合體。例如，所述分子可以與下面的物質(zhì)結(jié)合或相互作用(a)細(xì)胞表面抗原和(b)效應(yīng)細(xì)胞表面上的Fc受體，和(c)至少一種另一種成分。因此，本發(fā)明包括但不限于針對細(xì)胞表面抗原例如PSMA，和針對其他靶物，例如效應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體的雙特異性，三特異性，四特異性，和其他多特異性分子。
術(shù)語″雙特異性抗體″還包括雙抗體。雙抗體是其中在多肽單鏈上表達(dá)VL和VH結(jié)構(gòu)域，但是使用太短不能在相同的鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一個鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對并且產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點的二價雙特異性抗體(參見例如，Holliger，P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure 21121-1123)。
術(shù)語″人抗體衍生物″指抗體的任何修飾形式，例如抗體和另一種物質(zhì)或抗體的偶聯(lián)物。
如這里使用的，如果抗體是例如通過免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或者通過篩選人免疫球蛋白基因文庫，從使用人免疫球蛋白序列的系統(tǒng)獲得的，則人抗體是從特定種系序列“衍生的”。通過將人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列相比較，能鑒定從人種系免疫球蛋白序列“衍生的”人抗體就是這樣。選擇的人抗體氨基酸序列與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列一般至少90％相同，并且含有當(dāng)與其他物種(例如，鼠種系序列)的種系免疫球蛋白氨基酸序列相比較時鑒定人抗體是人源的氨基酸殘基。在一些情況下，人抗體氨基酸序列與種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列至少95％，或者甚至至少96％，97％，98％，或99％相同。典型地，從特定人種系序列衍生的人抗體顯示與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列少于10個氨基酸的差異。在一些情況下，人抗體顯示與種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序不多于5個，或者甚至不多于4，3，2，或1個氨基酸差異。
根據(jù)這里使用的，術(shù)語″異抗體″指其中至少兩個具有不同的特異性的兩個或多個抗體，抗體結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab)，其衍生物，或者連接在一起的抗原結(jié)合區(qū)。這些不同的特異性包括對效應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體的結(jié)合特異性，和靶細(xì)胞上例如腫瘤細(xì)胞上的抗原或表位的結(jié)合特異性。這里使用的術(shù)語″人抗體″意在包括具有從人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，體外隨機或定點誘變或者體內(nèi)軀體細(xì)胞突變誘導(dǎo)的突變)。但是，這里使用的術(shù)語″人抗體″沒有意在包括其中從另一種哺乳動物物種衍生的CDR序列嫁接到人構(gòu)架序列上的抗體。
這里使用的術(shù)語″單克隆抗體″或″單克隆抗體組合物″指單分子成分的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物顯示對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。因此，術(shù)語″人單克隆抗體″指具有從人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恒定區(qū)的顯示單一結(jié)合特異性的抗體。在一個實施方案中，包括從具有包括與無限增殖化細(xì)胞融合的人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的B細(xì)胞的雜交瘤產(chǎn)生人單克隆抗體。
這里使用的術(shù)語″重組人抗體″包括通過重組方法制備，表達(dá)，產(chǎn)生或分離的所有的人抗體，例如(a)從對于人免疫球蛋白基因來說是轉(zhuǎn)基因的或轉(zhuǎn)染色體的動物(例如小鼠)或者從中制備的雜交瘤(下文第I章進(jìn)一步描述)分離的抗體，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞，例如，從轉(zhuǎn)染瘤分離的抗體，(c)從重組的，組合人抗體文庫分離的抗體，和(d)通過涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他方法制備，表達(dá)，產(chǎn)生或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有從人種系免疫球蛋白序列衍生的可變區(qū)和恒定區(qū)。但是，在一些實施方案中，讓這樣的重組人抗體體外誘變(或者，當(dāng)在體內(nèi)軀體誘變中使用對于人Ig序列是轉(zhuǎn)基因的動物)，并且這樣的重組體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，當(dāng)從人種系VH和VL序列衍生并且相關(guān)的同時，可能在人抗體種系體內(nèi)所有組成成分中天然并不存在。
根據(jù)這里使用的，″異源抗體″與產(chǎn)生這樣的抗體的轉(zhuǎn)基因非人生物相關(guān)被定義，該術(shù)語指具有相應(yīng)于在不包括轉(zhuǎn)基因非人動物的生物體中發(fā)現(xiàn)的，并且一般來自除了轉(zhuǎn)基因非人動物的物種的氨基酸序列或編碼核酸序列的抗體。
根據(jù)這里使用的″異雜合抗體″指具有不同生物來源的輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有與鼠輕鏈締合的人重鏈的抗體是一種異雜合抗體。異雜合抗體的例子包括上文討論的嵌合和人源化抗體。
這里使用的″分離的抗體″意指基本上沒有其他的具有不同的抗原特異性的抗體的抗體(例如，與PSMA特異性結(jié)合的分離的抗體基本上沒有與除了PSMA之外的抗原特異性結(jié)合的抗體)。但是，與人PSMA的一個表位，同種型或變體特異性結(jié)合的分離的抗體具有與其他相關(guān)抗原例如來自其他物種的相關(guān)抗原(例如，PSMA物種同源物)的交叉反應(yīng)。此外，分離的抗體可以基本上沒有其他細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施方案中，具有不同特異性的“分離的”單克隆抗體的組合是在完全確定的成分中組合的。
根據(jù)這里使用的，″特異性結(jié)合″指與預(yù)定抗原的抗體結(jié)合。典型地，抗體以10-7M或更小的離解常數(shù)(KD)結(jié)合，并且以比其與除了預(yù)定抗原之外的非特異性抗原(例如，BSA，酪蛋白)或者密切相關(guān)抗原結(jié)合的KD至少小兩倍的KD與預(yù)定抗原結(jié)合。短語″識別抗原的抗體″和″對抗原特異性的抗體″在這里與術(shù)語″與抗原特異性結(jié)合的抗體″互換使用。
根據(jù)這里使用的，對于IgG抗體的″高親和性″指具有10-8M或更小，更優(yōu)選10-9M或更小并且甚至更優(yōu)選10-10M或更小的KD的抗體。結(jié)合親和性至少大約107M-1，優(yōu)選至少大約109M-1，更優(yōu)選至少大約1010M-1，1011M-1，1012M-1或更大，例如，大至1013M-1或更大。但是，″高親和性″結(jié)合能根據(jù)其他抗體同種型而不同。例如，對于IgM同種型的″高親和性″結(jié)合指具有10-7M或更小，更優(yōu)選10-8M或更小的KD的抗體。
根據(jù)這里使用的，術(shù)語″Kassoc″或″Ka″，意指特定抗體-抗原相互作用的締合速度，而這里使用的術(shù)語“Kdis”或″Kd″意指特定抗體-抗原相互作用的離解速度。根據(jù)這里使用的，術(shù)語″KD″意指離解常數(shù)，從Kd與Ka之比(即，Kd/Ka)獲得，并且以摩爾濃度(M)表示。
根據(jù)這里使用的，″同種型″指重鏈恒定區(qū)基因編碼的一類抗體(例如，IgM或IgG1)。
根據(jù)這里使用的，″同種型轉(zhuǎn)換″指抗體的類型或同種型從一種Ig類變化為另一種Ig類的現(xiàn)象。
根據(jù)這里使用的，″非轉(zhuǎn)換同種型″指當(dāng)沒有發(fā)生同種型轉(zhuǎn)換時產(chǎn)生的重鏈的同種型類別；編碼非轉(zhuǎn)換同種型的CH基因一般是在功能重排的VDJ基因下游的第一個CH基因。同種型轉(zhuǎn)換分類為經(jīng)典的或非經(jīng)典的同種型轉(zhuǎn)換。通過轉(zhuǎn)基因中涉及至少一個轉(zhuǎn)換序列區(qū)的重組作用發(fā)生經(jīng)典的同種型轉(zhuǎn)換。通過例如人σμ和人∑μ(δ-締合缺失)之間的同源重組，可以發(fā)生非經(jīng)典的同種型轉(zhuǎn)換?？梢园l(fā)生另一種非經(jīng)典的轉(zhuǎn)換機理，包括例如轉(zhuǎn)基因間和/或染色體間重組作用，并且完成同種型轉(zhuǎn)換。
這里使用的術(shù)語″轉(zhuǎn)換序列″指負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)換重組作用的那些DNA序列。一個″轉(zhuǎn)換供體″序列，典型地一個μ轉(zhuǎn)換區(qū)，是轉(zhuǎn)換重組作用期間要缺失的構(gòu)建體區(qū)的5′(即，上游)?！遛D(zhuǎn)換受體″區(qū)是在要缺失的構(gòu)建體區(qū)之間并且置換恒定區(qū)(例如，γ，ε等)。因為沒有重組作用總是發(fā)生的特定位點，最后的基因序列一般從構(gòu)建體不能預(yù)計。
根據(jù)這里使用的，″糖基化模式″定義為與蛋白質(zhì)，更具體地，與免疫球蛋白共價連接的糖單元的模式。異源抗體的糖基化模式可以表征為與非人轉(zhuǎn)基因動物物種產(chǎn)生的抗體上天然存在的糖基化模式基本上相類似，此時本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到異源抗體的糖基化模式比從中衍生轉(zhuǎn)基因CH基因的物種相比與非人轉(zhuǎn)基因動物物種的糖基化模式更相似。
這里使用的術(shù)語″天然存在的″當(dāng)對一個對象使用時，指自然界能發(fā)現(xiàn)這個對象的事實。例如，能從自然界來源分離的生物體(包括病毒)中存在的并且沒有經(jīng)人在實驗室故意改變的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
這里使用的術(shù)語″重排的″指重鏈或輕鏈免疫球蛋白位點的構(gòu)型，其中V片段位于基本上分別編碼完整VH或VL結(jié)構(gòu)域的構(gòu)型中緊鄰D-J或J片段。重排的免疫球蛋白基因座可以通過與種系DNA相比較而鑒定；重排基因座將具有至少一個重組七聚體/九聚體同源元件。
這里關(guān)于V片段的術(shù)語″非重排″或″種系構(gòu)型″指其中V片段不被重組使得與D或J片段緊鄰的構(gòu)型。
這里使用的術(shù)語″核酸分子″意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但是優(yōu)選是雙鏈DNA。
這里關(guān)于編碼與PSMA結(jié)合的抗體或抗體部分(例如，VH，VL，CDR3)的核酸的術(shù)語″分離的核酸分子″意指其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列沒有編碼結(jié)合除了PSMA之外的抗原的抗體或抗體部分的其他核苷酸序列的核酸分子，而其他序列可能天然在人基因組DNA核酸側(cè)翼。在一個實施方案中，人抗-PSMA抗體，或者其部分，包括4A3，7F12，8A11，8C12，或6F9的核苷酸或氨基酸序列，以及分別具有SEQ ID NOs1，3，5，7，或9和2，4，6，8，或10所示序列的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)。
根據(jù)這里公開的和要求保護(hù)的，SEQ ID NOs1-58中給出的序列包括″保守性序列修飾″，即，不顯著影響或改變核苷酸序列編碼的或包含氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征的核苷酸和氨基酸序列修飾。這樣的保守性序列修飾包括核苷酸和氨基酸取代，添加和缺失?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)向SEQ ID NOs1-58引入修飾作用，例如定點誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變。保守性氨基酸取代包括其中具有相似側(cè)鏈的氨基酸側(cè)鏈置換氨基酸殘基的那些。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括下面的氨基酸具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸)，β-支化側(cè)鏈(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。因此人抗-PSMA抗體中預(yù)計非必須氨基酸殘基優(yōu)選被來自相同的側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基置換。
或者，在另一個實施方案中，例如通過飽和誘變，沿著抗-PSMA抗體編碼序列的全部或部分隨機導(dǎo)入突變，對得到的修飾的抗-PSMA抗體篩選結(jié)合活性。
因此，這里公開的(重鏈和輕鏈可變區(qū))核苷酸序列編碼的和/或包含這里公開的(重鏈和輕鏈可變區(qū))氨基酸序列(即，SEQ ID NOs1-50)的抗體包括由保守性修飾的序列編碼的或者包含保守性修飾的相似序列的基本上相似的抗體。下面提供有關(guān)怎樣以這里公開的部分(即重鏈和輕鏈可變區(qū))序列如SEQ ID NOs1-50為基礎(chǔ)產(chǎn)生這樣的基本上相似的抗體。
對于核酸，術(shù)語″顯著的同源性″指當(dāng)最佳排列并且比較時，兩個核酸，或者指定的序列，至少大約80％的核苷酸，通常至少大約90％至95％，更優(yōu)選至少大約98％至99.5％的核苷酸是相同的，有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔??；蛘?，?dāng)片段在選擇性雜交條件下與該鏈的補體雜交時存在顯著的同源性。
兩條序列之間的同一性百分比是序列所共有的相同位置數(shù)目的函數(shù)(即，％同一性＝相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)×100)，考慮空位的數(shù)目，各空位的長度，兩條序列的最佳比對需要引入這些。利用下面非限制性實施例中描述的數(shù)學(xué)算法實現(xiàn)兩條序列之間的序列比較和同一性百分比的確定。
使用NWSgapdna.CMP矩陣和40，50，60，70，或80的空位權(quán)重和1，2，3，4，5，或6的長度權(quán)重，使用GCG軟件包(在http//www.gcg.com可獲得)中的GAP程序測定兩個核苷酸序列之間的同一性百分比。使用PAM120權(quán)重殘余表，12的空位長度罰分和4的空位罰分，使用插入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988))也能測定兩個核苷酸或氨基酸序列之間的同一性百分比。另外，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，和16，14，12，10，8，6，或4的空位權(quán)重和1，2，3，4，5，或6的長度權(quán)重，使用插入到GCG軟件包(在http//www.gcg.Com可獲得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48444-453(1970))算法，測定兩個氨基酸序列之間的同一性百分比。
本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列能進(jìn)一步被用作″查詢序列″對公眾數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，例如，鑒定相關(guān)的序列。利用Altschul，等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)能進(jìn)行這樣的檢索。使用NBLAST程序，得分＝100，字長＝12能進(jìn)行BLAST核苷酸檢索，獲得與本發(fā)明的核酸分子的核苷酸序列同源性。使用XBLAST程序，得分＝50，字長＝3能進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)檢索，獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列同源性。為了獲得比較目的的有空位的比對，根據(jù)Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402所述能應(yīng)用有空位的BLAST。當(dāng)使用BLAST和Gapped BLAST程序時，能使用各程序(例如，XBI，AST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov.。
核酸可以在全細(xì)胞中，細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中，以部分純化的或基本上純的形式存在。當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括堿/SDS處理，CsC1帶，柱層析法，瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域公知的其他方法，從其他細(xì)胞成分或其他污染物例如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)分離時，核酸是″分離的″或″使得基本上純″。參見，F(xiàn).Ausubel，等編著，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
本發(fā)明的核酸成分，雖然經(jīng)常是在天然序列中(除了修飾的限制位點等)，可以從cDNA，基因組或混合物突變，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提供基因序列。關(guān)于編碼序列，這些突變可以根據(jù)需要影響氨基酸序列。特別地，包括與這里描述的天然V，D，J，恒定區(qū)，轉(zhuǎn)換和其他這樣的序列基本上同源或者從這里描述的天然V，D，J，恒定區(qū)，轉(zhuǎn)換和其他這樣的序列衍生的DNA序列(其中″衍生的″指一個序列與另一個序列相同或者從另一個序列修飾)。
當(dāng)與另一個氨基酸序列有功能關(guān)系時，核酸是″可操作連接的″。例如，如果它影響序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子或增強子與編碼序列可操作連接。關(guān)于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，可操作連接意思是連接的DNA序列是連續(xù)的，并且在需要連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)時，是連續(xù)的并且在讀框內(nèi)。對于轉(zhuǎn)換序列，可操作連接指序列能影響轉(zhuǎn)換重組。
這里使用的術(shù)語″載體″意指能將另一種核酸轉(zhuǎn)運給它所連接的核酸的核酸分子。一種類型的載體是″質(zhì)?！?，指其中可以連接另外的DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中另外的DNA片段可以連接到病毒基因組中。一些載體能在它們所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時能整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨著宿主細(xì)胞基因組復(fù)制。此外，一些載體能指導(dǎo)它們所可操作連接的基因的表達(dá)。這樣的載體在這里稱作″重組表達(dá)載體″(或者簡單地，″表達(dá)載體″)。一般情況下，重組DNA技術(shù)中應(yīng)用的表達(dá)載體經(jīng)常是質(zhì)粒形式。在本發(fā)明說明書中，″質(zhì)粒″和″載體″可以互換使用，而質(zhì)粒是載體最通常的使用形式。但是，本發(fā)明意在包括表達(dá)載體的其他這樣的形式，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷逆病毒，腺病毒和腺-相關(guān)病毒)，它們有著等價功能。
這里使用的術(shù)語″重組宿主細(xì)胞″(或者簡單地″宿主細(xì)胞″)，意指導(dǎo)入重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)該明白這樣的術(shù)語意在不僅指特定的受者細(xì)胞而且還指這樣的細(xì)胞的后代。因為承繼世代中由于突變或環(huán)境因素可能發(fā)生一些修飾，這樣的后代事實上可能與親代細(xì)胞不一樣，但是仍然包括在這里使用的術(shù)語″宿主細(xì)胞″的范圍內(nèi)。重組宿主細(xì)胞包括，例如，CHO細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。
這里使用的術(shù)語″受試者″包括任何人或非人動物。術(shù)語″非人動物″包括所有的脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長目動物，綿羊，狗，牛，雞，兩棲動物，爬行動物等。
術(shù)語″轉(zhuǎn)基因非人動物″指具有包含一個或多個人重鏈和/或輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的基因組(整合或沒有整合到動物天然基因組DNA中)并且能表達(dá)全人抗體的非人動物。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可以具有人輕鏈轉(zhuǎn)基因和或者人重鏈轉(zhuǎn)基因或人重鏈轉(zhuǎn)染色體，這樣當(dāng)用PSM抗原和/或表達(dá)PSMA的細(xì)胞免疫時，小鼠產(chǎn)生人抗-PSMA抗體。人重鏈轉(zhuǎn)基因能整合到小鼠染色體DNA中，這是對轉(zhuǎn)基因例如HuMAb小鼠的情況，或者人重鏈轉(zhuǎn)基因能保持在染色體之外，這是WO 02/43478所述的轉(zhuǎn)染色體小鼠(例如，KM)的情況。這樣的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠經(jīng)歷V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換，能產(chǎn)生多種同種型的抗PSMA人單克隆抗體(例如，IgG，IgA和/或IgE)。
在下面的部分進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的各個方面。
I.抗PSMA人抗體的制備通過各種技術(shù)能制備本發(fā)明的人單克隆抗體(mAbs)，包括常規(guī)的單克隆抗體方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature 256495的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。雖然體細(xì)胞雜交技術(shù)是優(yōu)選的，但是原則上，能使用制備單克隆抗體的其他技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌基因轉(zhuǎn)化。
制備雜交瘤的優(yōu)選的動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。用小鼠產(chǎn)生雜交瘤是一種完善確立的程序。免疫方法和用于融合的免疫脾細(xì)胞的分離是本領(lǐng)域公知的。融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合方法也是公知的。
在優(yōu)選的實施方案中，使用帶有部分人免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠而不是小鼠系統(tǒng)能產(chǎn)生直接抗PSMA的人單克隆抗體。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括這里分別稱作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且這里通稱作″轉(zhuǎn)基因小鼠″。
HuMAb小鼠包含編碼沒有重排的人重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)和滅活內(nèi)源μ和κ鏈基因座(loci)(Lonberg，等(1994)Nature 368(6474)856-859)。因此，小鼠表現(xiàn)出減少的小鼠IgM或κ的表達(dá)，并且對免疫有反應(yīng)，導(dǎo)入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷種類轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變，產(chǎn)生高親和性人IgGκ單克隆(Lonberg，N.等(1994)，上文；綜述Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 11349-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93，和Harding，F(xiàn).和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546)。HuMAb小鼠的制備詳細(xì)描述于下面的II部分和Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 206287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 903720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12821-830；Tuaillon等(1994)R Immunol.1522912-2920；Lonberg等，(1994)Natute 368(6474)856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 11349-101；Taylor，L.等(1994)International Immunology 6579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93；Harding，F(xiàn).和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546；Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology 14845-851，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容全文在此引作參考。進(jìn)一步參見，美國專利Nos.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；都屬于Lonberg和Kay，和GenPharmInternational；Surani等的美國專利5,545,807；1998年6月11日公開的國際公開Nos.WO 98/24884；1994年11月10日公開的WO94/25585；1993年6月24日公開的WO 93/1227；1992年12月23日公開的WO 92/22645；1992年3月19日公開的WO 92/03918，所有這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容全部在此引作參考?；蛘?，描述于實施例2的HCO12轉(zhuǎn)基因小鼠能被用來產(chǎn)生人抗-PSMA抗體。
免疫法為了產(chǎn)生抗PSMA全人單克隆抗體，根據(jù)Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)856-859；Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology 14845-851和WO 98/24884所述，用純化的或富集的PSMA抗原和/或表達(dá)PSMA的細(xì)胞制劑免疫HuMAb小鼠。優(yōu)選地，第一次輸入時小鼠是6-16周齡。例如，可以使用純化的或富集的PSMA抗原(例如，從PSMA-表達(dá)LNCaP細(xì)胞純化)的制劑(5-20微克)腹膜內(nèi)免疫HuMAb小鼠。在使用純化的或富集的PSMA抗原制劑免疫不產(chǎn)生抗體的事件中，還可以用表達(dá)PSMA的細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞系免疫小鼠，來促進(jìn)免疫應(yīng)答。
用各種抗原積累的經(jīng)驗證明，當(dāng)最初使用弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)(IP)免疫，接著隔周用弗氏不完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫(最多共六次)，接著隔周用弗氏不完全佐劑中的抗原IP/SC免疫(最多共10次)時，HuMAb轉(zhuǎn)基因小鼠典型地最好地應(yīng)答。免疫過程中用眶后取血獲得的血漿樣品監(jiān)測免疫應(yīng)答。通過ELISA(如下所述)篩選血漿，使用抗-PSMA人免疫球蛋白效價足夠的小鼠進(jìn)行融合。在處死之前3天用抗原對小鼠靜脈內(nèi)加強免疫并且取出脾。預(yù)期對于每一種抗原需要融合2-3次。每一種抗原免疫幾只小鼠。例如，能免疫總共12只HCO7和HCO12品種的HuMAb小鼠。
制備分泌抗PSMA的人單克隆抗體的雜交瘤為了制備分泌抗PSMA的人單克隆抗體的雜交瘤，從接受免疫的小鼠分離脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞，并且與合適的無限增殖細(xì)胞系例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。對得到的雜交瘤篩選抗原特異性抗體的產(chǎn)生。例如，使用50％PEG，來自接受免疫的小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液能與六分之一數(shù)目的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL1580)融合。細(xì)胞以大約2×105在平底微量滴定板中平板培養(yǎng)，接著在含有20％克隆胎血清，18％″653″條件培養(yǎng)基，5％origen(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，5mM HEPES，0.055mM 2-巰基乙醇，50單位/毫升青霉素，50mg/ml鏈霉素，50mg/ml氫大霉素和1X HAT的選擇性培養(yǎng)基(Sigma；融合之后24小時加入HAT)中溫育兩周。大約兩周之后，在其中用HT替換了HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后通過ELISA對各孔篩選人抗-PSMA單克隆IgM和IgG抗體。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長，通常在10-14天之后觀察培養(yǎng)基。對分泌抗體的雜交瘤再次平板培養(yǎng)，再次篩選，如果對于人IgG，抗-PSMA單克隆抗體仍然是陽性，則能通過限制性稀釋至少亞克隆兩次。然后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于表征。
制備分泌抗PSMA的人單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤利用，例如，本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)結(jié)合基因轉(zhuǎn)染方法(例如，Morrison，S.(1985)Science 2291202)，在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中也能產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。
例如，為了表達(dá)抗體，或者其抗體片段，能通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，PCR擴增，定點誘變)，能獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNAs，并且插入到表達(dá)載體中，使得基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可操作連接。在上下文中，術(shù)語″可操作連接″意思是抗體基因連接到載體中使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的想要的功能。選擇表達(dá)載體和表達(dá)控制序列與使用的表達(dá)宿主細(xì)胞匹配?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因能被插入到分開的載體中，或者，更典型地，兩個基因通過標(biāo)準(zhǔn)方法插入到相同的表達(dá)載體中(例如，抗體基因片段上互補限制性位點和載體連接，或者如果不存在限制性位點，則平端連接)。通過插入到已經(jīng)編碼期望的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得VH片段與載體中的CH片段可操作連接，而VL，片段與載體中的CL片段可操作連接，這里描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)能被用來產(chǎn)生任何抗體同種型的全長抗體基因。另外，或者，重組表達(dá)載體能編碼促進(jìn)抗體鏈從宿主細(xì)胞分泌的信號肽?？贵w鏈基因能被克隆到載體中使得信號讀框內(nèi)與抗體鏈基因的氨基末端連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白蛋白質(zhì)的信號肽)。
除了抗體鏈基因，本發(fā)明的重組表達(dá)載體帶有控制抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語″調(diào)節(jié)序列″意在包括啟動子，增強子和控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他表達(dá)控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。這樣的調(diào)節(jié)序列例如描述于Goeddel；Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到，表達(dá)載體的設(shè)計，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，可以取決于象要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，期望的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等這樣的因素。用于哺乳動物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中高水平蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，例如來自巨細(xì)胞病毒(CMV)，猿病毒40(SV40)，腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動子和/或增強子。或者，可以使用非病毒調(diào)節(jié)序列，例如遍在蛋白啟動子或β-珠蛋白啟動子。
除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以攜帶另外的序列，例如調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中載體的復(fù)制(例如，復(fù)制起點)和選擇標(biāo)記基因?？蛇x擇標(biāo)記基因有利于將載體導(dǎo)入其中的宿主細(xì)胞的選擇(參見，例如，美國專利Nos.4,399,216，4,634,665和5,179,017，都屬于Axel等)。例如，典型地，可選擇標(biāo)記基因給其中導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞帶來抗藥性，例如G418，潮霉素或甲氨喋呤。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(對于在dhfr-宿主細(xì)胞中使用，使用甲氨喋呤選擇/擴增)和neo基因(對于G418選擇)。
對于輕鏈和重鏈的表達(dá)，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。各種形式的術(shù)語″轉(zhuǎn)染″意在包括常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞中的各種技術(shù)，例如，電穿孔，磷酸鈣沉淀，DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。雖然理論上有可能在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是抗體在真核細(xì)胞中表達(dá)是優(yōu)選的，最優(yōu)選在哺乳動物宿主細(xì)胞中表達(dá)，因為這樣的原核細(xì)胞，特別是哺乳動物細(xì)胞中，比原核細(xì)胞更可能組裝和分泌適當(dāng)折疊和免疫活性抗體。據(jù)報道，抗體基因的原核表達(dá)對于高產(chǎn)率生產(chǎn)活性抗體是無效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 612-13)。
用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選的哺乳動物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細(xì)胞)(包括dhfr-CHO細(xì)胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，和DHFR可選擇標(biāo)記一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621)所述，，COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。特別地，與NSO骨髓瘤細(xì)胞使用，另一種優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是WO 87/04462，WO89/01036和EP 338,841公開的GS基因表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞中時，將宿主細(xì)胞培養(yǎng)足以使得抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)，更優(yōu)選抗體分泌到宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中的時間，產(chǎn)生抗體。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基回收抗體。
表達(dá)完整抗體的部分抗體序列的使用抗體主要通過位于六個重鏈和輕鏈互補決定區(qū)(CDRs)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。因為這原因，CDRs中的氨基酸殘基在各個抗體之間比在CDRs外的序列更變化多。因為CDR序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，通過構(gòu)建包括來自嫁接到來自不同的抗體的具有不同的性質(zhì)的構(gòu)架序列的特異的天然存在的抗體的CDR序列的表達(dá)載體，有可能表達(dá)模擬特異的天然存在的抗體的性質(zhì)的重組抗體(參見，例如，Riechmann，L.等，1998，Nature 332323-327；Jones，P.等，1986，Nature 321522-525；和Queen，C.等，1989，Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.8610029-10033)。這樣的構(gòu)架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫獲得。這些種系序列與成熟抗體基因序列不同，因為它們不包括完全裝配的可變基因，所述可變基因是在B細(xì)胞成熟過程中通過V(D)J連接形成的。種系基因序列與在各個平均跨可變區(qū)的高親和性二抗所有組成成分的序列不同。例如，在構(gòu)架區(qū)的氨基-末端部分體細(xì)胞突變相對不頻繁。例如，在構(gòu)架區(qū)1的氨基末端部分和構(gòu)架區(qū)4的羧基末端部分體細(xì)胞突變相對不頻繁。此外，很多體細(xì)胞突變不顯著改變抗體的結(jié)合性質(zhì)。因為這個原因，為了產(chǎn)生具有與原抗體相似的結(jié)合性質(zhì)的完整重組抗體，不需要獲得特定抗體的全DNA序列(參見1999年3月12日提出的PCT/US99/05535，這里為了全部的目的作為參考)?？鏑DR區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列一般對于該目的是足夠的。使用部分序列測定對重組抗體可變基因有貢獻(xiàn)的種系可變和連接基因片段。然后使用種系序列填充可變區(qū)的缺失部分。重鏈和輕鏈前導(dǎo)序列在蛋白質(zhì)成熟期間裂解并且對最終抗體的性質(zhì)沒有貢獻(xiàn)。為了這個原因，必須使用相應(yīng)的表達(dá)載體的種系前導(dǎo)序列。為了添加缺失序列，通過連接或PCR擴增，克隆的cDNA序列能與合成的寡核苷酸組合。或者，可以將完整可變區(qū)合成為一套短的重疊的寡核苷酸，并且通過PCR擴增組合，產(chǎn)生完整合成可變區(qū)克隆。這個方法具有一些優(yōu)點，例如消除或或包含特定限制位點，或者優(yōu)化特定密碼子。
使用來自雜交瘤的重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄本的核苷酸序列來設(shè)計合成的寡核苷酸的重疊部分，產(chǎn)生具有和天然序列一樣的相同氨基酸編碼能力的合成的V序列。合成的重鏈和κ鏈序列和天然序列的不同在三個方面插入重復(fù)核苷酸堿基鏈以有利于寡核苷酸合成和PCR擴增；根據(jù)Kozak′s規(guī)則(Kozak，1991，J.Biol.Chem.26619867-19870)插入最佳翻譯起始點；通過基因工程使HindIII位點位于翻譯起始點的上游。
對于重鏈和輕鏈可變區(qū)兩者，優(yōu)化編碼，和相應(yīng)的非編碼鏈序列在相應(yīng)的非編碼寡核苷酸的中間點裂解成大約30-50個核苷酸。因此，對于每條鏈，寡核苷酸可以組裝成跨150-400個核苷酸片段的重疊雙鏈部分。然后使用這些庫作為模板制備150-400個核苷酸的PCR擴增產(chǎn)物。典型地，單一可變區(qū)寡核苷酸部分裂解成兩個部分，分別被擴增產(chǎn)生兩個重疊PCV產(chǎn)物。這些重疊產(chǎn)物然后通過PCR擴增組合生成整個可變區(qū)。還期望PCR擴增中包括重鏈或輕鏈恒定區(qū)的重疊片段(包括κ輕鏈的BbsI位點，或γ重鏈的AgeI位點)，產(chǎn)生能容易被克隆到表達(dá)載體構(gòu)建體中的片段。
再次構(gòu)建的重鏈和輕鏈可變區(qū)然后與克隆的啟動子，翻譯起始點，恒定區(qū)，3′非翻譯區(qū)，聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終點序列組合，產(chǎn)生表達(dá)載體構(gòu)建體。重鏈和輕鏈表達(dá)構(gòu)建體能組合成單一載體，共同轉(zhuǎn)染，系列轉(zhuǎn)染，或者分別轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。細(xì)胞然后融合形成表達(dá)兩種鏈的宿主細(xì)胞。
用于人IgGκ的表達(dá)載體的構(gòu)建中使用的質(zhì)粒在下文中描述。構(gòu)建質(zhì)粒，使得PCR擴增的V重鏈和Vκ輕鏈cDNA序列可以被用來重新構(gòu)建完整重鏈和輕鏈小基因。這些質(zhì)粒可以被用來完整表達(dá)人或嵌合IgG1κor IgG4κ抗體。為了表達(dá)其他重鏈異種型，或者為了表達(dá)包括λ輕鏈的抗體，可以構(gòu)建類似的質(zhì)粒。
因此，本發(fā)明的另一方面，利用本發(fā)明人抗-PSMA抗體的結(jié)構(gòu)特征，4A3，7F12，8A11，8C12或16F9，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上相關(guān)的至少保留本發(fā)明的抗體的一種功能性質(zhì)例如與PSMA結(jié)合的人抗-PSMA抗體。更具體地說，4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的一個或幾個CDR區(qū)能與已知的人構(gòu)架區(qū)和CDR重組組合，產(chǎn)生本發(fā)明的另外的重組基因工程的人抗-PSMA抗體。
因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供制備抗-PSMA抗體的方法，包括制備包括(1)和(2)的抗體(1)人重鏈構(gòu)架區(qū)和人重鏈CDRs，其中人重鏈CDRs中至少一個包括選自圖19所示CDRs的氨基酸序列(SEQ ID NOs21-35)；和(2)人輕鏈構(gòu)架區(qū)和人輕鏈CDRs，其中人輕鏈CDRs中至少一個包括選自圖22和23所示CDRs的氨基酸序列(SEQ ID NOs36-50)；其中抗體保持與PSMA結(jié)合的能力。
應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合分析例如實施例中提出的那些，能測定抗體結(jié)合PSMA的能力(例如，ELISA)。
因為本領(lǐng)域公知，重鏈和輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域在抗體對抗原的結(jié)合特異性/親和性中起著特別重要的作用，如上所述制備的重組抗體優(yōu)選包括4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的重鏈和輕鏈CDR3s?？贵w進(jìn)一步包括4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的CDR2s?？贵w進(jìn)一步包括4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的CDR1s。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了抗-PSMA抗體，包括(1)人重鏈構(gòu)架區(qū)，人重鏈CDR1區(qū)，人重鏈CDR2區(qū)，和人重鏈CDR3區(qū)，其中人重鏈CDR3區(qū)選自圖19所示4A3，7F12，8A11，8C12和16F9的CDR3s(SEQ ID NOs23，26，29，32，或35)；和(2)人輕鏈構(gòu)架區(qū)，人輕鏈CDR1區(qū)，人輕鏈CDR2區(qū)，和人輕鏈CDR3區(qū)，其中人輕鏈CDR3區(qū)選自圖22和23所示4A3，7F12，8A11，8C12和16F9的CDR3s(SEQ ID NOs38，41，44，47，或50)，其中抗體結(jié)合PSMA?？贵w可以進(jìn)一步包括4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的重鏈CDR2和/或輕鏈CDR2?？贵w可以進(jìn)一步包括4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的重鏈CDR1和/或輕鏈CDR1。
優(yōu)選地，上述工程抗體的CDR1，2，和/或3包括這里公開的和4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的那些一樣的精確的氨基酸序列。但是，普通技術(shù)人員明白與4A3，7F 12，8A11，8C 12和16F9的精確CDR序列的某些偏差是可能的，但是仍然保留抗體選擇性結(jié)合PSMA的能力(例如，保守性取代)。因此，在一個實施方案中，工程抗體可以由例如與4A3，7F12，8A11，8C12或16F9的一個或幾個CDRs90％，95％，98％或99.5％相同的一個或幾個CDRs構(gòu)成。
除了簡單結(jié)合PSMA外，例如上面所描述的工程抗體可以對本發(fā)明的抗體的其他功能性質(zhì)的保留進(jìn)行選擇，例如1)與表達(dá)人PSMA的活細(xì)胞結(jié)合；2)與人PSMA結(jié)合的KD是10-8M或更小(例如，10-9M或10-10M或更小)；3)與PSMA上的獨特表位結(jié)合(消除當(dāng)組合使用時具有互補活性的單克隆抗體與和相同的表位的結(jié)合相競爭的可能性)；4)表達(dá)PSMA的腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長抑制；和/或5)在人效應(yīng)細(xì)胞的存在下表達(dá)PSMA的細(xì)胞的吞噬作用和/或殺傷作用(例如，在ADCC分析中)。
人單克隆抗體與PSMA結(jié)合的表征通過，例如，標(biāo)準(zhǔn)ELISA，可以對本發(fā)明的人單克隆抗體測定與PSMA的結(jié)合，簡要地說，以PBS中0.25微克/毫升的純化的PSMA包被微量滴定板，然后用PBS中5％牛血清白蛋白封閉。向各個孔加入來自PSMA-免疫小鼠的血漿的稀釋液并且在37℃下溫育1-2小時。培養(yǎng)板用PBS/Tween洗滌之后和與堿性磷酸酶的山羊-抗-人IgG Fc-特異性多克隆試劑在37℃下溫育1小時。清洗之后，培養(yǎng)板用pNPP底物(1mg/ml)顯影，并且在OD405-650下分析。優(yōu)選地，顯示高效價的小鼠用于融合。
如上所述的ELISA分析也可以用來篩選表現(xiàn)出與PSMA免疫原有陽性反應(yīng)性的雜交瘤。以高親合力結(jié)合PSMA的雜交瘤被亞克隆并且進(jìn)一步表征。從每一個雜交瘤篩選保留母細(xì)胞反應(yīng)性的一個克隆(通過ELISA)，制備5-10小瓶細(xì)胞庫，在-140℃下保存，并且用于抗體純化。
為了純化人抗-PSMA抗體，在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)選擇的雜交瘤。過濾上清液并且濃縮，然后用蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠(Pharmacia，Piscataway，NJ)進(jìn)行親和層析。通過凝膠電泳和高效液相色譜檢查洗脫的IgG以確保純度。將緩沖溶液換成PBS，并且使用1.43消光系數(shù)通過OD280測定濃度。將單克隆抗體分成等份并且在-80℃下保存。
為了測定篩選的人抗-PSMA單克隆抗體是否與獨特表位結(jié)合，使用商售試劑(Pierce，Rockford，IL)將各種抗體生物素化。如上所述，使用PSMA包被-ELISA板能進(jìn)行使用沒有標(biāo)記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體的競爭研究。使用鏈球菌-抗生物素蛋白-堿性磷酸酶探針能檢測生物素化mAb結(jié)合。
為了測定純化抗體的同種型，進(jìn)行同種型ELISAs。4℃下微量滴定板的孔用10微克/毫升抗-人Ig包被過夜。用5％BSA封閉之后，室溫下平板與10微克/毫升的單克隆抗體或純化的同種型對照物反應(yīng)2小時?？兹缓笈c人IgG1或人IgM-特異性堿性磷酸酶-偶聯(lián)的探針。如上所述使平板顯影并且分析。
為了證明單克隆抗體與表達(dá)PSMA的活細(xì)胞結(jié)合，可以使用流式細(xì)胞計數(shù)器。簡要地說，表達(dá)PSMA的細(xì)胞系(在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下生長)在含有0.1％Tween 80和20％小鼠血清的PBS中與各種濃度的單克隆抗體混合，并且在37℃下溫育1小時。清洗之后，在和一抗染色相同的條件下細(xì)胞與熒光素-標(biāo)記的抗-人IgG抗體反應(yīng)。利用光和側(cè)面散射性質(zhì)在單細(xì)胞上大開通道通過FACScan掃描儀分析樣品。(除了或者代替)流式細(xì)胞器測定，可以應(yīng)用使用熒光顯微鏡的另一種測定。如上所述可以將細(xì)胞精確染色并且通過熒光顯微鏡檢查。該方法使眼睛觀察各個細(xì)胞，但是根據(jù)抗原密度可以減小靈敏性。
通過Western印跡對抗-PSMA人IgGs進(jìn)一步測定與PSMA抗原的反應(yīng)性。簡要地說，能制備來自表達(dá)PSMA的細(xì)胞的細(xì)胞提取物并且進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳之后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移給硝基纖維素膜，用20％小鼠血清封閉，用要測試的單克隆抗體探測。使用抗-人IgG堿性磷酸酶檢測人IgG結(jié)合并且用BCIP/NBT底物片劑顯影(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)。
人單克隆抗體對PSMA的吞噬細(xì)胞的和細(xì)胞殺傷的活性除了與PSMA特異性結(jié)合，可以對人單克隆抗-PSMA抗體測定它們介導(dǎo)表達(dá)PSMA細(xì)胞的吞噬作用和殺傷的能力。體外測定單克隆抗體的活性在體內(nèi)模型分析之前提供最初的篩選。簡要地說，通過FicollHypaque密度離心，接著溶解污染紅細(xì)胞，能純化來自健康供者的多形核細(xì)胞(PMN)，或者其他效應(yīng)細(xì)胞。洗滌過的PMNs能懸浮于補充有10％熱滅活胎牛血清的RPMI中，并且以效應(yīng)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的各種比例(效應(yīng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞)，與51Cr標(biāo)記的表達(dá)PSMA的細(xì)胞混合。然后以各種濃度加入純化的人抗-PSMA IgGs。無關(guān)的人IgG能被用作陰性對照。測試可以在37℃下進(jìn)行0-120分鐘。通過測定釋放到培養(yǎng)物上清液中的51Cr對樣品測定細(xì)胞溶解。還可以在相互組合中分析抗-PSMA單克隆抗體，測定細(xì)胞溶解是否富集多克隆抗體。
也可以在體內(nèi)模型(例如，小鼠)中分析結(jié)合PSMA的人單克隆抗體，測定它們在介導(dǎo)表達(dá)PSMA是細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞的吞噬作用和殺傷。例如以下面的不是為了排它的標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，可以選擇這些抗體1)與表達(dá)人PSMA的活細(xì)胞結(jié)合；2)結(jié)合PSMA的高親和性；3)與PSMA上的獨特表位結(jié)合(消除當(dāng)組合使用時具有互補活性的單克隆抗體與和相同的表位的結(jié)合相競爭的可能性)；4)表達(dá)PSMA的細(xì)胞的調(diào)理作用；5)在人效應(yīng)細(xì)胞的存在下介導(dǎo)表達(dá)PSMA的細(xì)胞的生長抑制，吞噬作用和/或殺傷作用。
本發(fā)明的優(yōu)選的人單克隆抗體符合這些條件的一項或幾項，優(yōu)選全部。在特定的實施方案中，在例如含有兩種后幾種抗-PSMA單克隆抗體或者其片段的藥物組合物這樣的組合中使用人單克隆抗體。例如，在一項治療方案中能聯(lián)合具有不同的但是互補的活性的人抗-PSMA單克隆抗體，實現(xiàn)期望的治療或診斷效果。這方面的詳細(xì)說明是與抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞生長的另一種人抗-PSMA單克隆抗體聯(lián)合的含有在效應(yīng)細(xì)胞的存在下介導(dǎo)高效靶細(xì)胞殺傷的抗-PSMA人單克隆抗體的組合物。
II.產(chǎn)生人單克隆抗-PSMA抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物的產(chǎn)生另一方面，本發(fā)明提供能表達(dá)與PSMA特異性結(jié)合的人單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體非人動物，例如轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，使得當(dāng)用PSMA和/或表達(dá)PSMA的細(xì)胞免疫時小鼠產(chǎn)生人抗-PSMA抗體的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠。人重鏈轉(zhuǎn)基因能整合到小鼠的染色體DNA中，這是轉(zhuǎn)基因例如小鼠的情況，這里詳細(xì)描述并且舉例說明?；蛘撸酥劓溵D(zhuǎn)基因能保持在染色體之外，這是WO 02/43478中描述的轉(zhuǎn)染色體(例如，KM)小鼠的情況。這樣的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體動物經(jīng)歷V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換能產(chǎn)生抗PSMA人單克隆抗體的多個同種型(例如，IgG，IgA和/或IgE)。同種型轉(zhuǎn)換可以通過常規(guī)的或非常規(guī)的同種型轉(zhuǎn)換而發(fā)生。
使用異源抗體所有組成成分設(shè)計反應(yīng)外來抗原刺激的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人動物，要求B-細(xì)胞發(fā)育途徑始終在轉(zhuǎn)基因動物功能中正確含有異源免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因。這包括，例如，異源重鏈轉(zhuǎn)基因的同種型轉(zhuǎn)換。因此，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因使得產(chǎn)生同種型轉(zhuǎn)換和一種或幾種下面的作用(1)高水平和細(xì)胞類型特異性表達(dá)，(2)功能基因重排，(3)等位基因排斥的激活和反應(yīng)，(4)充分的主要所有組成成分的表達(dá)，(5)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，(6)體細(xì)胞高變，(7)免疫應(yīng)答中轉(zhuǎn)基因抗體基因座的控制。
不需要全部符合上面的條件。例如，在其中轉(zhuǎn)基因動物的內(nèi)源免疫球蛋白基因座被功能性破壞的那些實施方案中，轉(zhuǎn)基因不需要激活等位基因排斥。此外，在其中轉(zhuǎn)基因包括功能性重排重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白基因的那些實施方案中，功能基因重排的第二條件不是必需的，至少對于已經(jīng)重排的那個轉(zhuǎn)基因。有關(guān)分子免疫學(xué)背景，參見，F(xiàn)undamental Immunology，第二版(1989)，Paul William E.，編著，Raven Press，N.Y.，這里引作參考。
在一些實施方案中，用來產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人動物在轉(zhuǎn)基因動物種系中包含重排的，沒有重排的或者重排的和沒有重排異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因組合。每一個重鏈轉(zhuǎn)基因至少包括一個CH基因。另外，重鏈轉(zhuǎn)基因可以含有功能同種型轉(zhuǎn)換序列，它在轉(zhuǎn)基因動物的B-細(xì)胞中能支持編碼多個CH基因的異源轉(zhuǎn)基因的同種型轉(zhuǎn)換。這樣的轉(zhuǎn)換序列可以是來自作為轉(zhuǎn)基因CH基因來源的物種的種系免疫球蛋白基因座中天然存在的那些，或者這樣的轉(zhuǎn)換序列可以從接受轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的物種(轉(zhuǎn)基因動物)中天然存在的那些衍生。例如，如果它插入了與小鼠重鏈基因座中天然存在的那些類似的轉(zhuǎn)換序列，則用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的人轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體可以產(chǎn)生較高頻率的同種型轉(zhuǎn)換作用，根據(jù)推測小鼠轉(zhuǎn)換序列被優(yōu)化和小鼠轉(zhuǎn)換重組酶系統(tǒng)發(fā)揮功能，而人轉(zhuǎn)換序列則不是如此。可以分離轉(zhuǎn)換序列并且通過常規(guī)克隆方法克隆，或者可以從以與免疫球蛋白轉(zhuǎn)換區(qū)序列相關(guān)的公開的序列信息為基礎(chǔ)設(shè)計的重疊合成寡核苷酸從頭合成(Mills等，Nucl.Acids Res.157305-7316(1991)；Sideras等，Intl.Immunol.1631-642(1989)，這里引作參考)。對于上述各種轉(zhuǎn)基因動物，在轉(zhuǎn)基因動物的B-細(xì)胞的有效級分中發(fā)現(xiàn)功能重排的異源重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因(至少10％)。
用來產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的轉(zhuǎn)基因包括包括編碼至少一個可變基因片段，一個多樣性基因片段，一個連接基因片段和至少一個恒定區(qū)基因片段的DNA的重鏈轉(zhuǎn)基因。免疫球蛋白輕鏈轉(zhuǎn)基因包括包括編碼至少一個可變基因片段，一個多樣性基因片段，一個連接基因片段和至少一個恒定區(qū)基因片段的DNA。編碼輕鏈和重鏈片段的基因片段與轉(zhuǎn)基因非人動物的異源之處在于它們從編碼來自不是由轉(zhuǎn)基因非人動物構(gòu)成的物種的免疫球蛋白的DNA衍生，或者相應(yīng)于這樣的DNA。在本發(fā)明的一方面，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因使得各個基因片段不重排，即，不重排使得編碼功能免疫球蛋白輕鏈或重鏈。當(dāng)暴露給PSMA抗原時，這樣的不重排轉(zhuǎn)基因支持V，D，和J基因片段的重組(功能重排)，并且優(yōu)選支持在得到的轉(zhuǎn)基因非人動物中重排的免疫球蛋白重鏈中D區(qū)基因片段的全部或部分的插入。
在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因包括沒有重排的″小基因座″。這樣的轉(zhuǎn)基因一般包括C，D，和J片段的大部分以及V基因片段的亞片段。在這樣的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中，各種調(diào)節(jié)序列，例如啟動子，增強子，經(jīng)典轉(zhuǎn)換區(qū)，RNA加工的剪接-供體和剪接-受體序列，重組信號等，包括從異源DNA衍生的相應(yīng)的序列。這樣的調(diào)節(jié)序列可以被插入到來自本發(fā)明中使用的非人動物相同的或相關(guān)的物種的轉(zhuǎn)基因中。例如，人免疫球蛋白基因片段可以在轉(zhuǎn)基因中與嚙齒動物免疫球蛋白增強子序列組合用于轉(zhuǎn)基因小鼠?；蛘?，合成的調(diào)節(jié)序列可以插入到轉(zhuǎn)基因中，其中這樣的合成的調(diào)節(jié)序列與已知在哺乳動物的基因組中天然存在的功能DNA序列不同源。根據(jù)一致原則設(shè)計合成的調(diào)節(jié)序列，例如，剪接-受體位點或啟動子/增強子基序指定允許的序列的那些。例如，小基因座包括與天然存在的種系Ig基因座相比具有至少一個非基本DNA部分(例如，插入序列；內(nèi)含子或其部分)的內(nèi)部缺失的基因組免疫球蛋白基因座的一部分。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，用來產(chǎn)生抗PSMA的人抗體的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動物包含至少一個，典型地2-10，有時25-50或更多個WO 98/24884的實施例12中描述的轉(zhuǎn)基因(例如，pHC1或pHC2)，WO98/24884的實施例12繁殖了包含WO 98/24884的實施例5，6，8，或14中描述的輕鏈轉(zhuǎn)基因的一個拷貝的動物，后代繁殖了WO 98/24884的實施例中描述的JH缺失的動物，這些內(nèi)容表達(dá)上引作參考。對于這三種方案的每一個，飼養(yǎng)動物至純合性。這樣的動物具有下面的遺傳型人重鏈沒有重排的小基因座的一個拷貝(每個染色體單倍體)(WO98/24884的實施例12中描述的)，沒有重排的人κ輕鏈構(gòu)建體的一個拷貝(每個染色體單倍體)(WO 98/24884的實施例14中描述的)，和去除所有的功能JH片段的每一個內(nèi)源小鼠重鏈基因座的缺失(WO98/24884的實施例10中描述的)。用對于缺失JH片段是純合的小鼠飼養(yǎng)這樣的動物(WO 98/24884的實施例10)，產(chǎn)生對于JH缺失是純合的并且對于人重鏈和輕鏈構(gòu)建體是半合子的后代。對得到的動物注射抗原并且用于生產(chǎn)抗這些抗原的人單克隆抗體。
從這樣的動物分離的B細(xì)胞就人重鏈和輕鏈?zhǔn)菃翁禺愋缘?，因為它們只包含各個基因的一個拷貝。此外，它們就人或小鼠重鏈來說是單特異性的，因為兩個內(nèi)源小鼠重鏈基因拷貝由于如WO 98/24884的實施例9和12所述導(dǎo)入的JH區(qū)的缺失而沒有功能。此外，B細(xì)胞的重要級分就人或小鼠輕鏈來說是單特異性的，因為重排的人κ輕鏈基因的單拷貝的表達(dá)等位基因和同種型排除B細(xì)胞的重要級分中內(nèi)源小鼠κ和λ鏈基因的重排。
優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體非人動物，例如小鼠，表現(xiàn)出這樣的免疫球蛋白生產(chǎn)，即有效的全部成分實質(zhì)上理想地與天然小鼠的相似。這樣，例如，在其中內(nèi)源Ig基因被滅活的實施方案中，總的免疫球蛋白水范圍是大約0.1至10mg/ml血清，優(yōu)選0.5至5mg/ml，理想地至少大約1.0mg/ml。當(dāng)將能實現(xiàn)IgM向IgG轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因小鼠時，成年小鼠血清IgG與IgM之比優(yōu)選是大約10∶1。IgG與IgM之比比未成熟小鼠的低得多。一般情況下，多于大約10％，優(yōu)選40-80％的脾細(xì)胞和淋巴結(jié)B細(xì)胞僅表達(dá)人IgG蛋白質(zhì)。
所有組成成分理想的是接近的，如天然小鼠所證明的，通常至少大約10％這樣高，優(yōu)選25-50％或更高。一般情況下，主要根據(jù)導(dǎo)入到小鼠基因組中的不同的V，J和D區(qū)的數(shù)目，產(chǎn)生至少大約一千不同的免疫球蛋白(理想地IgG)，優(yōu)選104至106或更多。這些免疫球蛋白一般識別大約一半或更多的高抗原性蛋白質(zhì)，例如，葡萄球菌蛋白質(zhì)A。典型地，免疫球蛋白表現(xiàn)出對預(yù)先選擇的至少大約107M-1，優(yōu)選至少大約109M-1，更優(yōu)選至少大約1010M-1，1011M-1，1012M-1，或更多，例如，至多，1013M-1或更多抗原的親和性。
在一些實施方案中，優(yōu)選產(chǎn)生有限制對預(yù)定抗原型反應(yīng)的抗體中存在的V基因的選擇的預(yù)定所有的成分的非人動物。具有預(yù)定全部成分的重鏈轉(zhuǎn)基因可以包括，例如，在人對預(yù)定抗原型反應(yīng)的抗體中優(yōu)先使用的人VH基因?；蛘?，為了各種原因(例如對于預(yù)定抗原具有編碼高親和性V區(qū)的低可能性；具有經(jīng)歷體細(xì)胞突變和親和性加重的低傾向性；或者對某些人的免疫原性)，可以從確定的所有成分中排除一些VH基因。因此，在含有各種重鏈或輕鏈基因片段的轉(zhuǎn)基因重排之前，例如通過雜交或DNA測序，可以容易地從除了轉(zhuǎn)基因動物之外的生物物種鑒定這樣的基因片段。
例如用如上所述的純化的PSMA和/或表達(dá)PSMA的細(xì)胞或其重組制劑能免疫轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體非人動物，例如如上所述的小鼠?；蛘?，用編碼人PSMA的DNA能免疫轉(zhuǎn)基因動物。動物然后產(chǎn)生B細(xì)胞，其通過轉(zhuǎn)基因內(nèi)轉(zhuǎn)換重組(順式轉(zhuǎn)換)經(jīng)歷經(jīng)典轉(zhuǎn)換，并且表達(dá)與PSMA反應(yīng)的免疫球蛋白。免疫球蛋白可以是人抗體(也稱作″人序列抗體″)，其中人轉(zhuǎn)基因序列編碼重鏈和輕鏈多肽，所述人轉(zhuǎn)基因序列包括體細(xì)胞突變和V區(qū)重組連接衍生的序列，和種系-編碼序列；可以認(rèn)為這些人抗體與人VL或VH基因片段和人JL或JH片段編碼的多肽序列基本上相同，但是作為體細(xì)胞突變和不同的V-J和V-D-J重組連接的結(jié)果可以存在其他非種系序列。在重鏈，D，基因片段的情況下，各個抗體鏈的可變區(qū)一般由人種系V，J，和在重鏈的情況下，D，基因片段編碼至少80％；轉(zhuǎn)基因上存在的人種系序列常常編碼至少可變區(qū)的85％；轉(zhuǎn)基因上存在的人種系序列經(jīng)常編碼可變區(qū)的90％或95％或更多。但是，因為體細(xì)胞突變和VJ與VDJ連接導(dǎo)入非種系序列，人序列抗體常常具有不是由小鼠種系中人轉(zhuǎn)基因中發(fā)現(xiàn)的人V，D，或J片段編碼的一些可變區(qū)序列(和，不經(jīng)常地，恒定區(qū)序列)。典型地，這樣的非種系序列(或者各位置)簇集在CDRs中或附近，或者已知體細(xì)胞突變簇集的區(qū)。
與預(yù)定抗原結(jié)合的人抗體可以來自同種型轉(zhuǎn)換，這樣產(chǎn)生包括人序列γ鏈(例如γ1，γ2，γ3，或γ4)和人序列輕鏈(例如κ)的人抗體。這樣的同種型轉(zhuǎn)換人序列抗體經(jīng)常含有一個或幾個體細(xì)胞突變，一般在可變區(qū)中，作為親和性成熟和抗原對B細(xì)胞的選擇的結(jié)果，特別是作為第二(或接著的)抗原攻擊的結(jié)果，經(jīng)常位于CDR得到大約10個殘基中或之內(nèi)。這些高親和性人序列抗體可以具有10-7M或更小，例如10-8M或更小，10-9M或更小，或10-10M或更小，或者甚至更小的KD。
本發(fā)明的另一方面提供如上所述轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人動物產(chǎn)生的B細(xì)胞?？梢杂肂細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)以高親和性與PSMA結(jié)合的人單克隆抗體的雜交瘤(例如，KD是10-7M或更小)。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生具有10-7M或更小，例如10-8M或更小，10-9M或更小，或10-10M或更小，或者甚至更小的KD的人抗體的雜交瘤，其中抗體包括由下面構(gòu)成的人序列輕鏈(1)具有與人VL基因片段和人JL片段編碼的多肽序列基本上相同的多肽序列的輕鏈可變區(qū)，和(2)具有與人CL基因片段編碼的多肽序列基本上相同的多肽序列的輕鏈恒定區(qū)；和由下面構(gòu)成的人序列重鏈(1)具有與人VH基因片段，任選地D區(qū)，和人JH基因片段編碼的多肽序列基本上相同的多肽序列的重鏈可變區(qū)，和(2)具有與人CH基因片段編碼的多肽序列基本上相同的多肽序列的恒定區(qū)。
通過擴大具有包括整合的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠中人可變區(qū)基因片段文庫的方法有利于開發(fā)高親和性抗PSMA的人單克隆抗體，所述方法包括向基因組中導(dǎo)入包括所述整合的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因中不存在的V區(qū)基因片段的V基因轉(zhuǎn)基因。經(jīng)常是，V區(qū)轉(zhuǎn)基因是酵母人工染色體，包括人VH或VL(Vk)基因片段陣列的一部分，其在人基因組中可能天然存在或者通過重組方法可以分別剪接在一起，其中各部分可以包括不按順序或者缺V基因片段。經(jīng)常是YAC上包含至少5個或多個功能V基因片段。在這個變化中，有可能通過所有的成分?jǐn)U增的方法制備轉(zhuǎn)基因小鼠，其中小鼠表達(dá)包括V區(qū)轉(zhuǎn)基因上存在的V區(qū)基因片段編碼的可變區(qū)序列和人Ig轉(zhuǎn)基因上編碼的C區(qū)的免疫球蛋白鏈。利用V所有組成成分?jǐn)U增方法，能產(chǎn)生具有至少5個不同的V基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；這樣小鼠能包含至少大約24個V基因或更多。一些V基因片段可以是沒有功能的(例如，假基因等)；如果期望，通過本領(lǐng)域可獲得的重組方法可以保留這些片段或者可以選擇性缺失。
一旦小鼠種系經(jīng)工程化包含具有擴增的V片段所有組成成分的功能YAC，而在含有J和C基因片段的人Ig轉(zhuǎn)基因中基本上不存在，這個特征可以繁殖并且繁殖到其他遺傳背景中，包括其中具有擴增的V片段所有組成成分的功能YAC繁殖成具有不同的人Ig轉(zhuǎn)基因的小鼠種系。具有擴增的V片段成分的多個功能YAC可以繁殖成與人Ig轉(zhuǎn)基因(或多個人Ig轉(zhuǎn)基因)工作的種系。雖然這里提到是YAC轉(zhuǎn)基因，這樣的轉(zhuǎn)基因當(dāng)整合到基因組中時可以實質(zhì)上缺乏酵母序列，例如在酵母中自主復(fù)制需要的序列；在不要需要的在酵母中復(fù)制之后(即，導(dǎo)入到小鼠ES細(xì)胞或小鼠原合子之前)，通過遺傳工程(例如，限制消化和脈沖場凝膠電泳或其他合適的方法)可以任選地去除這樣的序列。繁殖人序列免疫球蛋白表達(dá)特征的方法，包括飼養(yǎng)具有人Ig轉(zhuǎn)基因，和任選地還具有具有擴增的V片段成分的功能YAC的轉(zhuǎn)基因小鼠。YAC上可以存在VH和VL基因片段。從業(yè)者可以將轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)成任何期望的背景，包括攜帶其他人轉(zhuǎn)基因的背景，包括人Ig轉(zhuǎn)基因和/或編碼其他人淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因，本發(fā)明還提供具有擴增的V區(qū)成分YAC轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的高親和性人序列免疫球蛋白。雖然上文描述了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)選的實施方案，但是也包括其他實施方案，下面將它們分為四類I.含有未重排的重鏈和重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；II.含有未重排的重鏈和未重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；III.含有重排的重鏈和未重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；和IV.含有重排的重鏈和重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物。
這些種類的轉(zhuǎn)基因動物中，優(yōu)先的優(yōu)選順序如下II＞I＞III＞IV，其中通過同源重組(或其他方法)敲除內(nèi)源輕鏈基因(或者至少K基因)，和I＞II＞III＞IV，其中內(nèi)源輕鏈基因沒有被敲除，并且通過等位基因排斥一定占優(yōu)勢。
III.與PSMA結(jié)合的雙特異性/多特異性分子在本發(fā)明的另一個實施方案中，抗PSMA人單克隆抗體，或者其抗原結(jié)合部分可以被衍生化或者與另一個功能分子連接，例如，另一種肽或蛋白質(zhì)(例如，F(xiàn)ab′片段)，產(chǎn)生與多個結(jié)合位點或靶表位結(jié)合的雙特異性或多特異性分子。例如，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分能被功能連接于(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)，基因融合，非共價締合或者類似方法)一個或幾個其他結(jié)合分子，例如另一種抗體，抗體片段，肽或結(jié)合模擬物。
因此，本發(fā)明包括包括至少一種對于PSMA的第一結(jié)合特異性和對于第二靶表位的第二結(jié)合特異性的雙特異性和多特異性分子。在本發(fā)明的具體實施方案中，第二靶表位是Fc受體，例如，人FcγRI(CD64)或人Fcα受體(CD89)。因此，本發(fā)明包括能與FcγR，F(xiàn)cαR或表達(dá)FcαR的效應(yīng)細(xì)胞(例如，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞(PMNs))，和與表達(dá)PSMA的靶細(xì)胞兩者結(jié)合的雙特異性和多特異性分子。這些雙特異性和多特異性分子使得表達(dá)PSMA的細(xì)胞導(dǎo)向效應(yīng)細(xì)胞，象本發(fā)明的人單克隆抗體，引發(fā)Fc受體-介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞活性，例如PSMA表達(dá)細(xì)胞的吞噬作用，抗體依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，細(xì)胞因子釋放，或過氧化物陰離子的產(chǎn)生。
本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子除了抗-Fc結(jié)合特異性和抗-PSMA結(jié)合特異性之外，能進(jìn)一步包括第三結(jié)合特異性。在一個實施方案中，所述第三結(jié)合特異性是抗-增強因子(EF)部分，例如，與細(xì)胞毒性活性中涉及的表面蛋白質(zhì)結(jié)合從而加強抗靶細(xì)胞免疫應(yīng)答的分子?！蹇?增強因子部分″可以是抗體，功能抗體片段或與給定分子例如抗原或受體結(jié)合從而導(dǎo)致結(jié)合決定簇對Fc受體或靶細(xì)胞抗原的作用增強的配體。″抗-增強因子部分″能結(jié)合Fc受體或靶細(xì)胞抗原?；蛘撸?增強因子部分能與第一和第二結(jié)合特異性與之結(jié)合的個體不同的個體結(jié)合。例如，抗-增強因子部分能結(jié)合細(xì)胞毒性T-細(xì)胞(例如通過CD2，CD3，CD8，CD28，CD4，CD40，ICAM-1或?qū)е驴拱屑?xì)胞的增強的免疫應(yīng)答的其他免疫細(xì)胞)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包括作為結(jié)合特異性的至少一種抗體，或者其抗體片段，包括，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v，或單鏈Fv?？贵w還可以是輕鏈或重鏈二聚體，或者其任何最小片段例如Fv或單鏈構(gòu)建體，如1990年8月7日公開的Ladner等美國專利No.4,946,778中所描述的，該專利文獻(xiàn)內(nèi)容表達(dá)上引作參考。
在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包括對于效應(yīng)細(xì)胞表面上存在的FcγR或FcαR的結(jié)合特異性，和對于靶細(xì)胞抗原例如PSMA的第二結(jié)合特異性。
在一個實施方案中，人單克隆抗體提供對于Fc受體的結(jié)合特異性，其結(jié)合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻斷。根據(jù)這里使用的，術(shù)語″IgG受體″指位于染色體1上的8個γ-鏈基因的任一個。這些基因編碼12種跨膜或溶解受體異種型的全部，它們分成三類Fcγ受體FcγRI(CD64)，F(xiàn)cγRII(CD32)，和FcγRIII(CD16)。在一個優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)cγ受體是人高親和性FcγRI。人FcγRI是一種72kDa分子，它對于單體IgG具有高親和性(108-109M-1)。
Fanger等在PCT申請WO 88/00052和美國專利No.4,954,617中描述了這些優(yōu)選的單克隆抗體的制備和表征，其中教導(dǎo)全部在此引作參考。這些抗體與和受體的Fcγ結(jié)合位點完全不同的位點處的FcγRI，F(xiàn)cγRII，或FcγRIII的表位結(jié)合，這樣，它們的結(jié)合基本上不被生理水平的IgG阻斷。本發(fā)明中使用的特異性抗-FcγRI抗體是mAb22，mAb 32，mAb 44，mAb 62和mAb 197。從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type Culture Collection)可獲得產(chǎn)生mAb 32的雜交瘤，ATCC保藏號No.HB9469。在另外的實施方案中，抗-Fcγ受體抗體是單克隆抗體22的人源化形式(H22)。H22抗體的產(chǎn)生和表征描述于Graziano，R.F.等(1995)J.Immunol 155(10)4996-5002和PCT/US93/10384。產(chǎn)生H22抗體的細(xì)胞系保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，名稱是HA022CL1，保藏號是no.CRL 11177。
在其他更優(yōu)選的實施方案中，與人IgA受體例如Fc-α受體(FcαRI(CD89))結(jié)合的抗體提供對于Fc受體的結(jié)合特異性，其結(jié)合優(yōu)選不被人免疫球蛋白A(IgA)阻斷。術(shù)語″IgA受體″意在包括位于染色體19的一個α-基因的基因產(chǎn)物(FcαRI)。已知這個基因編碼幾個非此即彼的剪接的55-110kDa的跨膜同種型。FcαRI(CD89)在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，嗜酸性和嗜中性粒細(xì)胞上組成型表達(dá)，而在非效應(yīng)細(xì)胞上不表達(dá)。FcαRI對于IgA1和IgA2兩者具有中等親和性(5×107M-1)，其當(dāng)暴露給細(xì)胞因子例如G-CSF或GM-CSF時增大(Morton，H.C.等(1996)Critical Reviews in Immunology 16423-440)。有人描述過四種FcαRI-特異性單克隆抗體鑒定為A3，A59，A62和A77，其結(jié)合IgA配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的FcαRI，(Monteiro，R.C.等，1992，J.Immunol.1481764)。
FcαRI和FcγRI優(yōu)選觸發(fā)本發(fā)明中使用的受體，因為它們是(1)主要在免疫效應(yīng)細(xì)胞例如單核細(xì)胞，PMNs，巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞上表達(dá)；(2)以高水平表達(dá)(例如，5,000-100,000/細(xì)胞)；(3)細(xì)胞毒性活性的傳遞介質(zhì)(例如，ADCC，吞噬作用)；(4)介導(dǎo)增強的抗原呈遞，包括導(dǎo)向它們的自身抗原。
在其他實施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子進(jìn)一步包括識別，例如結(jié)合靶細(xì)胞抗原例如PSMA的結(jié)合特異性。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體提供結(jié)合特異性。
這里使用的″效應(yīng)細(xì)胞特異性抗體″指結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體的抗體或功能抗體片段。本發(fā)明中使用的優(yōu)選抗體結(jié)合內(nèi)源免疫球蛋白沒有發(fā)現(xiàn)的位點處的效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體。
根據(jù)這里使用的，術(shù)語″效應(yīng)細(xì)胞″指與免疫應(yīng)答的認(rèn)知和激活期相對的免疫應(yīng)答的效應(yīng)期中涉及的免疫細(xì)胞。例示的免疫細(xì)胞包括髓細(xì)胞樣或淋巴樣源的細(xì)胞，例如，淋巴細(xì)胞(例如，B細(xì)胞和T細(xì)胞包括溶細(xì)胞T細(xì)胞(CTLs))，殺傷細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，嗜酸性細(xì)胞，嗜中性細(xì)胞，多形核細(xì)胞，粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞，和嗜堿細(xì)胞。一些效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)特異Fc受體并且?guī)в刑禺愋悦庖吖δ?。在?yōu)選的實施方案中，效應(yīng)細(xì)胞能誘導(dǎo)抗體-依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，例如，能誘導(dǎo)ADCC的嗜中性細(xì)胞。例如，表達(dá)FcR的單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞在靶細(xì)胞特異性殺傷和向免疫系統(tǒng)的其他成分呈遞抗原，或與呈遞抗原的細(xì)胞結(jié)合中涉及。在其他實施方案中，效應(yīng)細(xì)胞能吞噬靶抗原，靶細(xì)胞，或微生物。效應(yīng)細(xì)胞上特定FcR的表達(dá)能受體液因子例如細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。例如，發(fā)現(xiàn)FcγRI的表達(dá)受干擾素γ(IFN-γ)上調(diào)。這種增強的表達(dá)提高FcγRI-攜帶細(xì)胞抗靶物的細(xì)胞毒性活性。效應(yīng)細(xì)胞能吞噬或溶解靶抗原或靶細(xì)胞。
″靶細(xì)胞″意思是本發(fā)明的成分(例如，人單克隆抗體，雙特異性或多特異性分子)能導(dǎo)向的受試者(例如人或動物)的任何不期望的細(xì)胞。在優(yōu)選的實施方案中，靶細(xì)胞是表達(dá)或超表達(dá)PSMA的細(xì)胞。表達(dá)PSMA的細(xì)胞一般包括腫瘤細(xì)胞，例如膀胱，乳腺，結(jié)腸，腎，卵巢，前列腺，腎細(xì)胞，鱗狀細(xì)胞，肺(非小細(xì)胞)和頭頸腫瘤細(xì)胞。其他靶細(xì)胞包括滑液成纖維細(xì)胞。
雖然人單克隆抗體是優(yōu)選的，但是本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子中能使用其他抗體，是鼠抗體，嵌合抗體和人源化單克隆抗體。
通過本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)能制備嵌合小鼠-人單克隆抗體(即，嵌合抗體)。例如，用限制酶消化編碼鼠(或其他物種)單克隆抗體分子的Fc恒定區(qū)的基因，去除編碼鼠Fc的區(qū)，并且取代編碼人Fc恒定區(qū)的基因的等價部分。(參見Robinson等，國際專利公開PCT/US86/02269；Akira，等，歐洲專利申請184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496；Morrison等，歐洲專利申請173,494；Neuberger等，國際申請WO 86/01533；Cabilly等美國專利No.4,816,567；Cabilly等，歐洲專利申請125,023；Better等(1988Sciehce 2401041-1043)；Liu等(1987)PNAS 843439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)PNAS 84214-218；Nishimura等，1987，Cane.Res-47999-1005；Wood等(1985)Nature 314446-449；和Shaw等，1988，J.Natl CancerInst.801553-1559)。
通過用來自人Fv可變區(qū)的等價序列置換抗原結(jié)合中不直接涉及的Fv可變區(qū)的序列，能將嵌合抗體進(jìn)一步人源化。Morrison，S.L.，1985，Science 2291202-1207和Oi等，1986，BioTechniques 4214中提供了有關(guān)人源化嵌合抗體的一般綜述。這些方法包括從重鏈或輕鏈中的至少一種分離編碼免疫球蛋白Fv可變區(qū)的全部或部分的核酸序列的分離，操作，和表達(dá)。這樣的核酸的來源對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，并且例如可以從產(chǎn)生抗-GPIIbIIIa抗體的雜交瘤7E3獲得。然后可以將編碼嵌合抗體或者其片段的重組DNA克隆到合適的表達(dá)載體中?；蛘咄ㄟ^CDR取代能制備合適的人源化抗體。美國專利5,225,539；Jones等，1986 Nature 321552-525；Verhoeyan等1988Science 2391534；和Beidler等1988 J.Immunol.1414053-4060。
用至少一部分非人CDR可以置換特定人抗體的CDR的全部或者用非人CDR可以只置換CDRs中的一些。只需要置換一些人源化抗體與Fc受體結(jié)合所述需要的CDRs。
通過能用非人抗體衍生的CDR置換人抗體的CDR的至少一部分的任何方法能將抗體人源化。Winter描述了可以用來制備本發(fā)明的人源化抗體的方法(UK專利申請GB 2188638A，1987年3月26日)，其內(nèi)容表達(dá)上引作參考。根據(jù)發(fā)明名稱是抗人單核吞噬細(xì)胞上免疫球蛋白G的Fc受體的人源化抗體的國際申請WO 94/10332中的描述，利用寡核苷酸定點誘變，可以用非人CDRs置換人CDR。
落在本發(fā)明的范圍內(nèi)的還有特異氨基酸被取代，缺失或添加的嵌合和人源化抗體。特別地，優(yōu)選的人源化抗體構(gòu)架區(qū)中有氨基酸取代作用，使得提高對抗原的結(jié)合。例如，在具有小鼠CDRs的人源化抗體中，用小鼠抗體相應(yīng)的位置處的氨基酸能置換人構(gòu)架區(qū)中的氨基酸。已知這樣的取代作用在某些情況下改進(jìn)人源化抗體對抗原的結(jié)合。其中氨基酸被添加，缺失，或取代的抗體這里稱作修飾的抗體或改變的抗體。
術(shù)語修飾的抗體還意在包括通過例如缺失，添加或取代抗體的部分的抗體，例如單克隆抗體，嵌合抗體，和人源化抗體。例如，通過缺失恒重區(qū)并且用意在提高抗體的半壽期，例如血清半壽期，穩(wěn)定性或親和性的恒定區(qū)置換它，能修飾抗體。任何修飾作用都在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要雙特異性和多特異性分子具有至少一個對于FcγR特異的抗原結(jié)合區(qū)并且觸發(fā)至少一個效應(yīng)物功能。
利用化學(xué)技術(shù)(參見例如，D.M.Kranz等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 785807)，″polydoma″技術(shù)(參見美國專利4,474,893，閱讀)，或重組DNA技術(shù)，能制備本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子。
特別地，利用本領(lǐng)域公知的方法和這里提供的實施例所述，通過使構(gòu)成結(jié)合特異性，例如，抗-FcR和抗-PSMA結(jié)合特異性偶聯(lián)，能制備本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子。例如，能分開產(chǎn)生雙特異性和多特異性分子的各結(jié)合特異性，然后彼此偶聯(lián)在一起。當(dāng)結(jié)合特異性是肽或蛋白質(zhì)時，可以使用各種各樣的偶聯(lián)或交聯(lián)劑用于共價偶聯(lián)。交聯(lián)劑的例子包括蛋白質(zhì)A，碳二亞胺，N-琥珀酰亞氨基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)，5，5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，鄰-亞苯基二馬來酰亞胺(oPDM)，N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)，和磺基琥珀酰亞氨基4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(參見例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.1601686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 828648)。其他方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等(Science(1985)22981-83)，和Glennie等(J.Immunol.(1987)1392367-2375)描述的那些。優(yōu)選的偶聯(lián)劑是SATA和磺化-SMCC，這兩種都可以從Pierce ChemicalCo.(Rockford，IL)獲得。
當(dāng)結(jié)合特異性是抗體時(例如，兩種人源化抗體)，能通過兩個重鏈的C-末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵合而將它們偶聯(lián)。在特別優(yōu)選的實施方案中，在偶聯(lián)之前，對鉸鏈區(qū)修飾使它含有奇數(shù)優(yōu)選一個巰基殘基。
或者，在同一個載體中能編碼這兩個結(jié)合特異性并且表達(dá)并且在相同的宿主細(xì)胞中組裝。該方法是特別有用的，其中雙特異性和多特異性分子是mAb×mAb，mAb×Fab，F(xiàn)abxF(ab′)2或配體x Fab融合蛋白。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子，例如，雙特異性分子可以是單鏈分子，例如單鏈雙特異性抗體，含有一個單鏈抗體和結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子，含有兩個決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性和多特異性分子還可以是單鏈分子或者可以包括至少兩個單鏈分子。制備雙特異性和多特異性分子的方法描述于例如美國專利號5,260,203；美國專利號5,455,030；美國專利號4,881,175；美國專利號5,132,405；美國專利號5,091,513；美國專利號5,476,786；美國專利號5,013,653；美國專利號5,258,498；和美國專利號5,482,858中。
通過酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，F(xiàn)ACS分析，生物測試(例如，生長抑制)，或Western印跡能證實雙特異性和多特異性分子對它們特定靶物的結(jié)合。這些測試的每一項一般通過使用對感興趣的復(fù)合物特異性的標(biāo)記試劑(例如抗體)來檢測特別令人感興趣的蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合體的存在。例如，利用，例如識別和特異性結(jié)合抗體-FcR復(fù)合體的酶聯(lián)抗體或抗體片段能檢測FcR-抗體復(fù)合體。或者，利用各種各樣的其他免疫分析能檢測復(fù)合體。例如，對抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記并且在放射免疫分析(RIA)中使用(參見，例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，3月，1986，這里引作參考)。通過象使用γ計數(shù)器或閃爍計數(shù)器這樣的方法或者通過放射自顯影方法，能檢測放射性同位素。
IV.抗體偶聯(lián)物/抗毒素另一方面，本發(fā)明特征在于與另一個治療性部分例如細(xì)胞毒素，藥物或放射性同位素偶聯(lián)的人抗-PSMA單克隆抗體或者其片段。當(dāng)與細(xì)胞毒素偶聯(lián)時，這些抗體偶聯(lián)物稱作″抗毒素″。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括對(例如殺傷)細(xì)胞有害的或者抑制它們生長的任何試劑。實施例包括紫杉醇，細(xì)胞松弛素B，短桿菌肽D，溴乙啡啶，吐根堿，絲裂霉素，依托泊苷，tenoposide，長春新堿，長春堿，秋水仙素，阿霉素，柔紅霉素，二羥基炭疽菌素二酮，二羥蒽二酮，光輝霉素，放線菌素D，1-脫氫睪酮，糖皮質(zhì)激素，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛爾，和嘌呤霉素和它的類似物或同系物。治療劑還包括，例如，抗代謝物(例如，甲氨喋呤，6-巰基嘌呤，6-硫代鳥嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化劑(例如，氮芥，thioepa苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，卡莫司汀(BSNU)和羅氮芥(CCNU)，環(huán)磷酰胺，白消安，二溴甘露糖醇，鏈唑霉素，絲裂霉素C，和順-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)，蒽環(huán)霉素(例如，道諾紅菌素(以前是柔紅霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放線菌素D(以前是放線菌素)，博萊霉素，光輝霉素，和安曲霉素(AMC))，和抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春堿)。能與本發(fā)明的抗體偶聯(lián)的治療性細(xì)胞毒素的例子包括calicheamicins和duocarmycins。
本發(fā)明的人抗體還可以與放射性同位素例如放射性碘偶聯(lián)，產(chǎn)生用于治療或診斷PSMA-相關(guān)疾病(例如，腫瘤)的細(xì)胞毒性或非細(xì)胞毒性放射性藥物。
可以使用本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物來修飾給定生物學(xué)反應(yīng)，藥物部分不認(rèn)為局限于常規(guī)治療劑。例如，藥物部分可以是具有期望的生物性活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)可以包括，例如，酶活性毒素，或者其活性片段，例如紅豆毒素，蓖麻毒A，假單胞菌外毒素，或白喉毒素；蛋白質(zhì)，例如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或者，生物反應(yīng)修飾劑例如，淋巴因子，白介素-1(″IL-1″)，白介素-2(″IL-2″)，白介素-6(″IL-6″)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(″GM-CSF″)，粒細(xì)胞集落刺激因子(″G-CSF″)，或者其他生長因子。
將這樣的治療部分與抗體偶聯(lián)的技術(shù)是公知的，例如，參見，Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of DrugsIn Cancer Therapy″，見Monoclonal Antibodies And CancerTherapy，Reisfeld等(編著)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，″Antibodies For Drug Delivery″，見Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等(編著)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody CarriersOf Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review″，見Monoclonal Antibodies′84Biological And ClinicalApplications，Pinchera等(編著)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，見MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(編著)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，″ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates″，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。
V.藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，例如，含有與藥學(xué)可接受載體配制在一起的本發(fā)明的人單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部分中的一種或聯(lián)合的藥物組合物。一些組合物可以包括本發(fā)明的(例如兩個或多個不同的)人抗體中的一種或聯(lián)合。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供含有與人PSMA上不同的表位結(jié)合并且具有補充活性例如作為藥物組合物的人抗-PSMA的聯(lián)合的治療組合物。例如，在效應(yīng)細(xì)胞的存在下介導(dǎo)靶細(xì)胞的高效殺傷的人單克隆抗體可以與抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞的生長的另一種人單克隆抗體聯(lián)合。
在另一個實施方案中，治療性組合物含有本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物或雙特異性(或多特異性)分子中的一種或聯(lián)合。
本發(fā)明的藥物組合物還可以在聯(lián)合治療中施用，即與其他藥物聯(lián)合。例如，聯(lián)合治療可以包括本發(fā)明的組合物和至少一種抗腫瘤藥物或者其他常規(guī)治療法。
根據(jù)這里使用的，″藥學(xué)可接受載體″包括生理相容的任何和所有的溶劑，分散介質(zhì)，包衣，抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，等張劑和吸收延遲劑等等。優(yōu)選地，載體適合靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，腸胃外，脊柱或表皮施用(例如，通過注射或灌注)。根據(jù)給藥途徑，活性化合物，即，抗體，雙特異性和多特異性分子，可以用保護(hù)化合物不受酸的作用和可能使化合物失去活性的其他天然條件的材料包衣。
″藥學(xué)可接受鹽″指保留了母體化合物的生物學(xué)活性但是不帶來任何不期望的毒理學(xué)作用的鹽(參見例如，Berge，S.M.，等(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括從無毒性無機酸衍生的那些，例如鹽酸，硝酸，磷酸，硫酸，氫溴酸，氫碘酸，亞磷酸等，以及從無毒性有機酸衍生的那些，例如脂肪族一元和二元羧酸，苯基-取代的鏈烷酸，羥基鏈烷酸，芳香酸，脂肪族和芳香族磺酸等。堿加成鹽包括從堿土金屬衍生的那些，例如鈉，鉀，鎂，鈣等，以及從無毒性有機胺衍生的，例如N，N′-二芐基乙二胺，N-甲基葡糖胺，氯普魯卡因，膽堿，二乙醇胺，亞乙基二胺，普魯卡因等。
本發(fā)明的組合物可以通過本領(lǐng)域公知的各種方法施用。技術(shù)人員明白，給藥途徑和/或方式根據(jù)期望的結(jié)果而不同。使用保護(hù)化合物不快速釋放的載體能制備活性化合物，例如緩釋制劑，包括植入物，透皮貼，和微膠囊送遞系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到?，生物相容聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐類，聚羥基乙酸，膠原，聚原酸酯，和聚乳酸。制備這樣的制劑的很多方法是專利或者一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。參見，例如，Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems，J.R.Robinson，編著，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
為了通過一些途徑施用本發(fā)明的化合物，需要用防止化合物失活的材料將化合物或者共同施用的化合物包衣。例如，可以自阿合適的載體，例如脂質(zhì)體或稀釋劑中對受者施用化合物。藥學(xué)可接受稀釋劑包括鹽水和緩沖水溶液。脂質(zhì)體包括水包油包水CGF乳液和常規(guī)的脂質(zhì)體(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.727)。
藥學(xué)可接受載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時制備無菌注射液或分散液的粉末劑。使用這樣的用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑是本領(lǐng)域公知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或與活性化合物不相容的試劑范圍外，包括在本發(fā)明的藥物組合物中使用。還可以向組合物中摻入補充的活性化合物。
治療組合物一般必須是滅菌的并且在制備和貯存條件下穩(wěn)定?？梢詫⒔M合物配制成溶液。組合物可以配制成溶液，微乳狀液，脂質(zhì)體，或者其他適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有例如水，乙醇，多元醇(例如，丙三醇，聚乙二醇，和液體聚乙二醇等等)，和它們的合適的混合物的溶劑或分散劑。能保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?，例如，通過使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情況下通過保持要求的粒度和通過使用表面活性劑能保持流動性。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包括等張劑，例如，糖，多元醇例如甘露糖醇，山梨糖醇或氯化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收劑，例如一硬脂酸鹽和明膠，能使可注射組合物延遲吸收。
通過將活性化合物以要求的量混入合適的溶劑中，并且根據(jù)需要，加入列舉的成分的一種或組合，接著滅菌微過濾，能制備無菌注射液。一般情況下，通過將活性化合物摻入到含有堿性分散介質(zhì)和需要的來自上面列舉的那些的其他成分的滅菌賦形劑中制備分散劑。在用于制備無菌注射液的滅菌粉末劑的情況下，制備的優(yōu)選方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，得到活性成分的粉末劑加來自前面其滅菌過濾溶液的任何另外的期望的成分。
調(diào)節(jié)劑量給藥方案，提供最佳的期望的反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以施用單一大丸劑，可以隨時間施用幾次分開的劑量或者根據(jù)治療情形的緊急狀況指示的，劑量可以按比例減小或增加。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易施用并且配藥均勻的單位劑量形式。這里使用的單位劑量形式指適合對要治療的受試者的單位劑量的物理不連續(xù)單位；每一個單位含有經(jīng)計算與必需的藥學(xué)載體組合的期望的治療效果的預(yù)定量的活性化合物。根據(jù)或者直接根據(jù)下面的陳述本發(fā)明的單位劑量形式的說明(a)活性化合物的獨特特性和要實現(xiàn)的特定治療效果，和(b)配制這樣的用于治療個體靈敏性的活性化合物的本領(lǐng)域固有的限制。
藥學(xué)可接受抗氧化劑的例子包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸，鹽酸胱氨酸，硫酸氫鈉，偏亞硫酸氫鈉，亞硫酸鈉等等；(2)油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酸酯，丁酸化羥基茴香醚(BHA)，丁化羥基甲苯(BHT)，卵磷脂，沒食子酸丙酯，α-生育酚，等等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸，等等。
有關(guān)治療組合物，本發(fā)明的制劑包括適合口服，鼻，局部(包括頰和舌下)，直腸，陰道和/或腸胃外給藥的那些。制劑可以常規(guī)地以單位劑量形式存在并且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域公知的方法制備?？梢耘c載體材料混合制備單一劑量形式的活性成分的量隨著要治療者和特定的給藥方式而不同?？梢耘c載體材料混合制備單一劑量形式的活性成分的量一般是產(chǎn)生治療效果的成分的量。一般，以百分比來計，這個量的范圍是大約0.01％至大約99％的活性成分，優(yōu)選大約0.1％至大約70％，最優(yōu)選大約1％至大約30％。
適合陰道給藥的本發(fā)明的制劑還包括含有本領(lǐng)域公知是適合的載體的陰道栓，塞子，乳膏，凝膠，糊劑，泡沫劑或噴霧劑。用于局部或經(jīng)皮施用本發(fā)明的組合物的劑量形式包括粉末劑，噴霧劑，軟膏，糊劑，乳膏，洗劑，凝膠，溶液，貼和吸入劑?；钚曰衔锟梢栽跍缇鷹l件下與藥學(xué)可接受載體混合，與任何必需的防腐劑，緩沖劑，或推進(jìn)劑混合。
這里使用的短語″腸胃外給藥″和″腸胃外施用”意思是除了腸道和局部給藥之外的給藥方式，通常通過注射，包括，非限制性地，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，動脈內(nèi)，鞘內(nèi)，囊內(nèi)，眼眶內(nèi)，心內(nèi)，真皮內(nèi)，腹膜內(nèi)，經(jīng)氣管，皮下，表皮下，關(guān)節(jié)內(nèi)，囊下，蛛網(wǎng)膜下，脊柱內(nèi)，硬膜外和胸骨內(nèi)注射和灌注。
可以在本發(fā)明的藥物組合物中使用的合適的含水和不含水載體的例子包括水，乙醇，多元醇(例如丙三醇，丙二醇，聚乙二醇，等等)，和它們的合適的混合物，植物油，例如橄欖油，和可注射有機酯，例如油酸乙酯。通過使用包衣材料例如卵磷脂，在分散劑的情況下通過保持必需的粒度，和通過使用表面活性劑，能保持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴?br> 這些組合物還可以含有輔助劑，例如防腐劑，濕潤劑，乳化劑和分散劑。通過上文的滅菌程序，和通過含有各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚山梨酸等，可以保證防止存在微生物。還期望組合物包括等張劑，例如糖，氯化鈉等。另外，通過含有延遲吸收劑例如一硬脂酸鋁和明膠，可以帶來可注射藥學(xué)形式的延遲吸收。
當(dāng)作為藥物對人和動物施用本發(fā)明的化合物時，可以單獨給藥化合物，或者作為含有與藥學(xué)可接受載體混合的例如0.01至99.5％(更優(yōu)選，0.1至90％)的活性成分的藥物組合物給藥。
不考慮選擇的給藥途徑，將可以是合適的水合形式的本發(fā)明的化合物，和/或本發(fā)明的藥物組合物通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法配制成藥學(xué)可接受劑量形式。
本發(fā)明的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化，使得獲得對于特定患者，組合物，和給藥方式有效實現(xiàn)期望的治療反應(yīng)而對患者沒有毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于各種藥物動力學(xué)因素，包括使用的本發(fā)明的特定組合物，或者它的酯，鹽或酰胺的活性，給藥途徑，給藥時間，使用的特定化合物的排泄速度，治療時間，與使用的特定組合物聯(lián)合的其他藥物，化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡，性別，體重，狀況，一般健康和以前的用藥史，和藥學(xué)領(lǐng)域公知的類似因素。
本領(lǐng)域普通醫(yī)生或獸醫(yī)容易確定和制定必需的藥物組合物的有效量。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可以以比為了實現(xiàn)期望的治療效果所必須的量更低的水平開始施用藥物組合物中使用的本發(fā)明的化合物，并且逐漸加大劑量，直到實現(xiàn)期望的效果。一般情況下，本發(fā)明的組合物的合適的日劑量是有效產(chǎn)生治療效果最低劑量的化合物的量。這樣的有效劑量一般取決于上述因素。優(yōu)選給藥是通過靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，或皮下，優(yōu)選接近靶位位點給藥。如果期望，在一天內(nèi)可以以合適的時間間隔兩次，三次，四次，五次，六次或更多次亞劑量分開給藥施用有效日劑量的治療組合物，任選地，以單位劑量形式。單獨施用本發(fā)明的化合物是可能的，但是優(yōu)選施用作為藥物制劑(組合物)的化合物。
可以用本領(lǐng)域公知的藥學(xué)裝置施用本發(fā)明的治療組合物。例如，在優(yōu)選的實施方案中，使用無針頭皮下注射裝置可以施用本發(fā)明的治療組合物，例如美國專利Nos.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公開的裝置。本發(fā)明中有用的公知的植入物和模塊的例子包括美國專利No.4,487,603，它公開了以可控速度送遞藥物的可植入微輸入泵；美國專利No.4,486,194，它公開了用于施用通過皮膚的藥物的治療裝置；美國專利No.4,447,233，它公開了用于以精確輸入速度送遞藥物的藥物輸入泵；美國專利No.4,447,224，它公開了用于連續(xù)藥物送遞的可變流動可植入輸入裝置；美國專利No.4,439,196，它公開了具有多腔分隔室的滲透藥物送遞系統(tǒng)；和美國專利No.4,475,196，它公開了一種滲透藥物送遞系統(tǒng)。這些專利文獻(xiàn)在此引作參考。很多其他這樣的植入物，送遞系統(tǒng)和組件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
在一些實施方案中，能配制本發(fā)明的人單克隆抗體，保證在體內(nèi)適當(dāng)分布。例如，血腦屏障(BBB)排斥很多高親水性化合物。為了保證本發(fā)明的化合物跨越BBB(如果期望)，可以例如在脂質(zhì)體中配制這些化合物。加工脂質(zhì)體的方法參見，例如，美國專利4,522,811；5,374,548；和5,399,331.脂質(zhì)體可以包括選擇性送遞給特定細(xì)胞或器官中的一個或幾個部分，這樣強化定向藥物送遞(參見，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。舉例的定向部分包括葉酸鹽或生物素(參見，例如，美國專利5,416,016，Low等)；甘露糖苷(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗體(P.G.Bloeman等(1995)FEBSLett.357140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39180)；表面活性劑蛋白質(zhì)A受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physio.1233134)，可以含有本發(fā)明的制劑，以及本發(fā)明的分子成分的不同的物質(zhì)；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.2699090)；還參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4273。在本發(fā)明的實施方案中，在脂質(zhì)體中配制本發(fā)明的治療化合物；在更優(yōu)選的實施方案中，脂質(zhì)體包括定向部分。在最優(yōu)選的實施方案中，脂質(zhì)體中的治療化合物被通過大丸劑注射送遞到接近腫瘤或注射的位點。組合物必須是液體，其到容易注射的程度。其在加工和貯存的條件下必須是穩(wěn)定的，并且受到保護(hù)，有微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。
相對于沒有接受治療的患者，″治療有效劑量″優(yōu)選將腫瘤生長抑制至少大約20％，更優(yōu)選至少大約40％，甚至更優(yōu)選大約60％，更優(yōu)選至少大約80％。在預(yù)測對人腫瘤的有效性的動物模型系統(tǒng)中能評價化合物抑制癌癥的能力?；蛘?，通過檢查化合物的抑制能力來評價組合物的這個性質(zhì)，這樣的體外抑制作用通過技術(shù)人員公知的測試確定。治療有效量的治療化合物能減小患者腫瘤大小，或者另外減輕癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)象受者體重，患者癥狀的嚴(yán)重程度，選擇的施用的特定組合物或給藥途徑這樣的因素，能確定這樣的量。
組合物必須是無菌和液體，到通過注射能送遞組合物的程度。除了水之外，載體可以是等張緩沖鹽水，乙醇，多元醇(例如，丙三醇，丙二醇，和液體聚乙二醇等等)，和它們的合適的混合物。通過使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情況下通過保持要求的粒度和通過使用表面活性劑能保持合適的流動性。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包括等張劑，例如，糖，多元醇例如甘露糖醇，或山梨糖醇和氯化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收劑，例如一硬脂酸鹽或明膠，能使可注射組合物長時間吸收。
當(dāng)如上所述適當(dāng)保護(hù)活性化合物時，例如可以用惰性稀釋劑或可同化可食用載體口服施用化合物。
VI.本發(fā)明的使用和方法本發(fā)明的人單克隆抗-PSMA抗體和相關(guān)的衍生物/偶聯(lián)物和組合物有著很多體外和體內(nèi)診斷和治療用途。例如，可以對例如體外或來自體內(nèi)的培養(yǎng)物中的細(xì)胞施用這些分子。或者，可以對接受治療的患者體內(nèi)施用，預(yù)防或診斷各種PSMA相關(guān)疾病。根據(jù)這里使用的，術(shù)語″受試者″意在包括人和非人動物。優(yōu)選的受試者包括有特征在于PSMA表達(dá)，典型地PSMA異常表達(dá)(例如超表達(dá))的疾癌的人患者。因此，本發(fā)明的方法和組合物可以用來治療有特征在于存在表達(dá)PSMA的腫瘤細(xì)胞的腫瘤發(fā)生疾病的受試者，例如，前列腺癌，結(jié)腸癌，和腎癌。術(shù)語本發(fā)明的″非人動物″包括所有的脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長目，綿羊，狗，牛，雞，兩棲動物，爬蟲類等。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供對患者治療前列腺癌的方法，包括對患者施用本發(fā)明的一種抗-PSMA抗體。在另一個實施方案中，以其中抗體與例如放射性試劑或細(xì)胞毒性藥物偶聯(lián)的偶聯(lián)物使用抗-PSMA抗體。在另一個實施方案中，以例如與抗-FcγRI或抗-Fcα連接的雙特異性分子施用抗-PSMA抗體。
最初對本發(fā)明的人抗體測試體外與治療或診斷用途相關(guān)的結(jié)合活性。例如，應(yīng)用如下實施例中描述的ELISA和流式細(xì)胞儀分析能測試本發(fā)明的成分。此外，能測定這些分子在觸發(fā)至少一種效應(yīng)物介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性中的活性，包括表達(dá)PSMA細(xì)胞的細(xì)胞溶解。下面的實施例中描寫了效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用測定方法。
本發(fā)明的人抗體在PSMA-相關(guān)疾病的治療和診斷中還有另外的用途。例如，使用人單克隆抗體，多特異性或雙特異性分子，例如，體內(nèi)或體外激發(fā)下面生物學(xué)活性中的一種或幾種調(diào)理表達(dá)PSMA的細(xì)胞；在人效應(yīng)細(xì)胞的存在下介導(dǎo)表達(dá)PSMA的細(xì)胞的吞噬作用或細(xì)胞溶解；或者抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞的生長。
施用本發(fā)明的抗體和組合物的合適的方法是本領(lǐng)域公知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定合適的劑量，并且取決于患者的年齡和體重和使用的特定藥物。
本發(fā)明的人抗-PSMA抗體還可以與其他治療劑例如化學(xué)治療劑共同給藥，或者可以與其他已知的治療法例如抗癌治療法，例如放射療法共同施用。這樣的治療劑其中包括抗腫瘤藥物，例如阿霉素(亞德里亞霉素)，順鉑博萊霉素硫酸鹽，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，和環(huán)磷酰胺羥基脲，它們本身只有在對患者有毒性或亞毒性的水平才有效。順鉑是每四周一次以100mg/m2劑量靜脈內(nèi)施用，阿霉素是每21天一次以60-75mg/m2劑量靜脈內(nèi)施用。本發(fā)明的人抗-PSMA抗體或者其抗原結(jié)合片段與化學(xué)治療劑共同給藥提供兩種抗癌藥物，它們通過不同的機理操作，得到對人腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。這樣的共同給藥能解決由于產(chǎn)生對藥物的抗藥性或者腫瘤細(xì)胞抗原性的變化而使得它們與抗體不反應(yīng)的問題。
與本發(fā)明的人抗體，多特異性或雙特異性分子連接的靶-特異性效應(yīng)細(xì)胞，例如效應(yīng)細(xì)胞也能用作治療劑。用于定向的效應(yīng)細(xì)胞可以是人白細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞，嗜中性細(xì)胞或單核細(xì)胞。其他細(xì)胞包括嗜酸性細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞和其他IgG-或IgA-受體攜帶細(xì)胞。如果期望，可以從要治療的患者獲得效應(yīng)細(xì)胞。靶-特異性效應(yīng)細(xì)胞，可以作為細(xì)胞在生理可接受溶液中的懸浮液而施用。施用細(xì)胞的數(shù)目可以是108-109級，但是根據(jù)治療目的而不同。一般情況下，這個量足以獲得在靶細(xì)胞的定位，例如表達(dá)PSMA的腫瘤細(xì)胞，通過例如吞噬作用實施細(xì)胞殺傷。給藥途徑也可以變化。
與其他去除靶細(xì)胞的技術(shù)聯(lián)合能實施靶-特異性效應(yīng)細(xì)胞治療。例如，使用本發(fā)明的成分(例如人抗體，多特異性和雙特異性分子)和/或與這些成分連接的效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤治療可以與化療聯(lián)合使用。另外，可以使用聯(lián)合免疫療法指導(dǎo)兩個不同的細(xì)胞毒性效應(yīng)物種群朝向腫瘤細(xì)胞排斥。例如，可以與IgG-或IgA-受體特異性結(jié)合試劑聯(lián)合使用與抗-Fc-γRI或抗-CD3連接的抗-PSMA抗體。
本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子還可以用來調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞上FcγR或FcαR水平，例如通過將細(xì)胞表面上的受體封端和消除。還可以將抗-Fc受體的混合物用于該目的。
在補體的存在下還可以使用具有補體結(jié)合位點的本發(fā)明的成分(例如人抗體，多特異性和雙特異性分子)，例如來自結(jié)合補體的IgG1，-2，或-3或IgM的部分。在一個實施方案中，通過加入補體或含有補體的血清，能補充使用本發(fā)明的結(jié)合劑和合適的效應(yīng)細(xì)胞對包括靶細(xì)胞的細(xì)胞群體的來自體內(nèi)的治療。通過補體蛋白質(zhì)的結(jié)合能改進(jìn)用本發(fā)明的結(jié)合劑包被的靶細(xì)胞的吞噬作用。在另一個實施方案中，補體也能溶解用本發(fā)明的成分(例如人抗體，多特異性和雙特異性分子)包被的靶細(xì)胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明的成分不激活補體。
本發(fā)明的成分(例如人抗體，多特異性和雙特異性分子)還可以與補體一起施用。因此，在本發(fā)明范圍內(nèi)的還有含有人抗體，多特異性或雙特異性分子和血清或補體的組合物。這些組合物的有利之處在于補體位于最接近人抗體，多特異性或雙特異性分子?；蛘撸景l(fā)明的人抗體，多特異性或雙特異性分子和補體或血清可以分開施用。
也在本發(fā)明范圍內(nèi)的還有包括本發(fā)明的成分(例如人抗體，多特異性和雙特異性分子)和使用說明的試劑盒。試劑盒可以進(jìn)一步包括至少一種另外的試劑，例如補體，或者本發(fā)明的一種或幾種人抗體(例如，具有與第一人抗體不同的與PSMA抗原中的表位結(jié)合的補體活性的人抗體)。
在其他實施方案中，使用調(diào)節(jié)，例如增強或抑制Fcγ或Fcα受體的表達(dá)或活性，通過例如用細(xì)胞因子治療患者，來對患者進(jìn)一步治療。用多特異性分子治療期間給藥的優(yōu)選的細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，干擾素-γ(IFN-γ)，和腫瘤壞死因子(TNF)。
本發(fā)明的成分(例如人抗體，多特異性和雙特異性分子)還可以用來定向表達(dá)FcγR或PSMA的細(xì)胞，例如用于標(biāo)記這樣的細(xì)胞。對于這樣的應(yīng)用，結(jié)合劑能與被檢測的分子連接。因此，本發(fā)明提供來自體內(nèi)或體外定位表達(dá)Fc受體，例如FcγR，或PSMA的細(xì)胞的方法?？蓹z測標(biāo)記是，例如放射性同位素，熒光化合物，酶，或酶輔助因子。
通過在抗體和PSMA之間形成復(fù)合體的條件下使樣品(例如，和對照樣品一起)接觸人單克隆抗體，本發(fā)明的人抗體還可以用來檢測樣品中PSMA抗原的存在。然后檢測復(fù)合體的形成，其中與對照樣品相比較，樣品之間形成不同的復(fù)合體是樣品中存在PSMA抗原的指征。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供體內(nèi)或體外檢測Fc-表達(dá)細(xì)胞的存在和量的方法。該方法包括(i)對患者施用與可檢測標(biāo)記物偶聯(lián)的本發(fā)明的成分(例如多特異性或雙特異性分子)或者其片段；(ii)將患者暴露給檢測所述可檢測標(biāo)記物的工具，鑒定含有Fc-表達(dá)細(xì)胞的區(qū)域。
通過下面的實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實施例不應(yīng)該認(rèn)為是進(jìn)一步的限定。該申請中引述的所有的圖和所有的參考文獻(xiàn)，專利文獻(xiàn)和公開的專利申請的內(nèi)容表達(dá)上在此引作參考。
實施例方法和材料PSMA-特異性單克隆抗體的篩選試驗利用固相ELISA-為基礎(chǔ)的試驗檢測PSMA-HuMAbs。使用來自LNCaP的免疫親和純化PSMA，或者細(xì)菌表達(dá)的含有PSMA衍生片段的融合蛋白在4℃下溫育過夜包被Maxi-Sorp(Nunc，Rochester，NY)96-孔板。培養(yǎng)板用PBS-0.2％Tween-20洗滌并且用PBS中5％BSA溶液在室溫下封閉1小時。向PSMA-包被的孔加入來自雜交瘤培養(yǎng)的50微升上清液，并且將培養(yǎng)極在室溫下溫育2小時。如上清洗培養(yǎng)板并且向各個孔中加入50微升的1∶1000稀釋的兔-抗-人IgG H & L鏈(ICN，Costa Mesa，CA)。室溫下溫育1小時之后，如上清洗培養(yǎng)板并且向各個孔中加入50微升的1∶2000稀釋的HRP-偶聯(lián)蛋白-A(Sigma，St.Louis，MO)。室溫下溫育1小時之后，如上清洗培養(yǎng)板并且向各個孔中加入500ml的0.1M檸檬酸，pH4.35)/H2O2(每10毫升ABTS溶液10微升30％H2O2)chromagen/底物溶液中的100微升ABTS(150mg 2，2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸。溫育5分鐘之后加入100微升中止溶液(SDS/二甲基甲酰胺)中止反應(yīng)，并且在微板讀數(shù)器上讀取405nm吸收度。通過有限稀釋并且進(jìn)行附加分析，克隆具有高A405值的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的上清液。
抗體蛋白質(zhì)的分離使用含有1-5％Fetalclone(Hyclone，Logan，UT)的RPMI-1640培養(yǎng)基從Cellmax生物反應(yīng)器(Cellco，Laguna Hills，CA)分離單克隆抗體。根據(jù)廠商說明(KPL，Gaithersburg，MD)，在ProteinA-Agarose柱子上色譜法純化單克隆抗體。
LNCaP細(xì)胞膜的制備從塑料皿上刮取LNCaP細(xì)胞，在PBS中充分清洗，再懸浮于10體積的去離子水，并且用Dounce勻漿器三次勻漿。通過在15,000xg下離心45分鐘來分離膜級分，并且將沉淀再懸浮于PBS。使用Pierce(Rockford，IL)BCA試劑盒測定膜沉淀物的蛋白質(zhì)濃度。
熱變性實驗通過煮沸10分鐘將來自LNCaP細(xì)胞(40g/ml，PBS中)的免疫親和純化PSMA等份加熱變性并且在冰上冷卻。這樣的樣品，和沒有加熱變性的相同的等份，以1∶4在PBS中稀釋，并且向96-孔Maxi-Sorp板(Nunc)的孔加入50微升，并且在4℃下包被過夜。包被之后，所有的培養(yǎng)板用5％BSA的PBS溶液封閉1小時，用PBS清洗，并且進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA，使用如上所述的指定的一抗。
Western印跡分折含有PSMA級分的SDS-PAGE之后進(jìn)行Western印跡分析并且轉(zhuǎn)移給PVDF膜。印跡在含有5％脫脂奶的TBS中封閉過夜并且與TBS中5微克/毫升的濃度存在的純化抗體溫育1小時。用含有0.5％Tween-20(TBS-T)的TBS將印跡沖洗5次，使用LumiGLO化學(xué)發(fā)光底物試劑盒(KPL，Gaithersburg，MD)T使印跡顯影，并且通過暴露X-射線膠片目測觀察。
免疫沉淀研究通過向LNCaP細(xì)胞加入含有1％NP-40的PBS，并且溫育1小時，并且離心去除顆粒物，來制備LNCaP細(xì)胞的去污溶胞產(chǎn)物。通過對每毫升溶胞產(chǎn)物加入150微克不相關(guān)人IgG，并且室溫下溫育1小時，接著對每毫升溶胞產(chǎn)物加入150微升壓實的ProteinG-Sepharose珠，使得溶胞產(chǎn)物預(yù)先澄清。離心去除珠之后使用上清液級分。每份100微升的預(yù)先澄清的溶胞產(chǎn)物與5微克抗體蛋白質(zhì)混合并且在4℃下溫育過夜。這個時期結(jié)束之后，向各個試管加入20微升壓實的Protein G-Sepharose珠，并且在4℃下將試管溫育1小時。用溶解緩沖液充分清洗之后，向各樣品加入50微升Laemmli樣品緩沖液(Bio-Rad)，并且在95℃下將試管加熱10分鐘。將試管離心2分鐘并且加載到SDS-PAGE凝膠上并且在175伏下電穿孔60分鐘。將電穿孔樣品電印跡到PVDF膜上進(jìn)行Western印跡分析，使用鼠抗-PSMA抗體4D8(5微克/毫升)并且如上所述顯影。
流式細(xì)胞術(shù)從組織培養(yǎng)瓶中新鮮收集LNCaP和PC-3細(xì)胞并且制備單細(xì)胞。對LNCaP細(xì)胞懸浮液用一抗直接染色或者用1％多聚甲醛的PBS溶液固定之后染色。在含有0.5％BSA和50-200微克/毫升一抗的PBS中再懸浮大約一百萬細(xì)胞，并且在冰上溫育30分鐘。將細(xì)胞用含有0.1％BSA，0.01％ NaN3的PBS清洗兩次，再懸浮于100微升的1∶100稀釋的FITC-偶聯(lián)的山羊-抗-人IgG(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)，并且在冰上又溫育30分鐘。將細(xì)胞再清洗兩次，再懸浮0.5毫升的清洗緩沖液，并且FACSCalibur血細(xì)胞計數(shù)器(Becton-Dickinson，San Jose，CA)上用CellQuest獲取軟件在分析熒光染色。
單克隆抗體的FITC標(biāo)記首先用0.3M碳酸鈉緩沖液，pH9.5對純化的單克隆抗體充分透析。通過將1毫克固體FITC溶解于1ml的DMSO中來制備異硫氰酸熒光素(FITC)溶液原液。滴加原液FITC，以一定量恒量混合，對每毫克抗體蛋白質(zhì)提供50微克FITC。一旦加入，將溶液在避光下在室溫下溫育1-3小時。通過在PBS平衡過的Sephadex G-I0柱子上凝膠過濾分離FITC-標(biāo)記的抗體。
4A3和7F12的DOTA標(biāo)記通過直接將DOTA的四個羧酸基團(tuán)中的一個與抗體蛋白質(zhì)的氨基偶聯(lián)將5毫克4A3和7F 12抗體蛋白質(zhì)DOTA標(biāo)記。DOTA(四氮雜環(huán)十二烷四酸)是用于絡(luò)合放射性核素的常用螯合劑。首先使用5×4ml的1％DTPA(二亞乙基三胺五乙酸)，pH5.0用25,000截留量的離心式濃縮器在大約1.5ml的PBS中將蛋白質(zhì)洗滌24小時。然后應(yīng)用相同的程序?qū)⒖贵w緩沖液變?yōu)?.1M磷酸鹽，pH 7.0。通過將30mg的DOTA(0.072mmol)in溶解于0.4毫升水并且用NaOH將pH調(diào)節(jié)到7.3產(chǎn)生DOTA的活化酯。然后加入10毫克的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺并且讓混合物在冰上冷卻1小時并且加給抗體溶液，并且在4℃下攪拌過夜。通過反復(fù)用0.3M NH4Oac洗滌并且離心濃縮，從過量的DOTA和其他反應(yīng)物分離得到的DOTA-抗體偶聯(lián)物。
抗體抑制研究最初，在冰上，用PBS中200微克/毫升純化的4A3，7F12，8A11，8C12，16F9，或無關(guān)的人IgG1抗體處理大約一百萬LNCaP細(xì)胞。清洗之后，在冰上細(xì)胞與50微克/毫升FITC偶聯(lián)人或鼠抗-PSMA單克隆抗體溫育1小時。清洗之后，細(xì)胞用10微克/毫升propidium iodide染色，并且在FACsCalibur上使用CellQuest軟件用流式細(xì)胞計數(shù)器分析。
125I-標(biāo)記的HuMAb在帶有LNCaP細(xì)胞腫瘤的裸鼠中的生物分布LNCaP細(xì)胞，2×106，在50％Matrigel(Becton-Dickinson(150微升總體積)中，對裸鼠皮下注射。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到大約0.5cm大小時，通過對尾靜脈注射100微克抗體(含有5-至35μCi的125I)通過靜脈內(nèi)施用用125I-標(biāo)記的抗體對動物體內(nèi)標(biāo)記。不同的時間點之后，處死動物并且測定各正常器官和組織，以及腫瘤組織中存在的125I-標(biāo)記水平。
使用lodobeads(Pierce)，根據(jù)生產(chǎn)商說明，用1-至1.5mCi的125I將1毫克抗體蛋白質(zhì)碘化。
125I-標(biāo)記的HuMAb的內(nèi)化LNCaP細(xì)胞在6-孔板上制成平板并且使達(dá)到接近匯合。然后去除培養(yǎng)基并且用PBS清洗孔以去除沒有附著的細(xì)胞。然后以新鮮培養(yǎng)基中1.5ml總體積中10微克/毫升濃度用125I-標(biāo)記的HuMAb或同種型匹配不相關(guān)人IgG標(biāo)記細(xì)胞，并且在37℃下溫育10分鐘。在這個階段結(jié)束時去除培養(yǎng)基，用PBS充分清洗細(xì)胞以去除沒有結(jié)合的標(biāo)記的抗體，加入1.5ml的培養(yǎng)基，使平板再回到37℃保溫箱溫育期望的時間。在溫育的0(加入培養(yǎng)基之后即刻)，4，18，和28小時時去除培養(yǎng)基，離心去除沒有附著的細(xì)胞。上清液級分在冰上冷卻，通過加入100％TCA進(jìn)行TCA沉淀，得到10％最終TCA濃度。在冰上溫育10分鐘之后，級分以1000xg離心10分鐘并且去除上清液。在γ計數(shù)器中測定TCA溶解和不溶級分中存在的放射性的量。使用胰蛋白酶釋放去除用于TCA沉淀的培養(yǎng)基之后孔中存在的附著細(xì)胞，并且放在試管中用于計數(shù)，用0.1N NaOH洗滌一次。在γ計數(shù)器中還測定與細(xì)胞結(jié)合的放射性.以內(nèi)化，加工，和分布到TCA溶解級分中的最初與細(xì)胞結(jié)合的總量的比例對時間作圖。
如上所述用1mCi的125I將0.5mg純化的抗體蛋白質(zhì)碘化。各抗體的標(biāo)記在0.4和1.6μCi/微克抗體蛋白質(zhì)之間。
HuMAbs的ADCC和CDC篩選使用LNCaP細(xì)胞作為靶細(xì)胞對ADCC和CDC測定4小時51Cr釋放分析。使用100∶1的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之比(E∶T之比)以三聯(lián)對每孔2500個靶物在96-孔板中進(jìn)行分析。效應(yīng)細(xì)胞是從一名男性和一名女性供者分離的PBMC′s。對于CDC分析，使用1∶200最終濃度的新鮮的人血漿作為補體源。
IHC對HuMAbs的組織交叉反應(yīng)性篩選對冷凍切片術(shù)之后用丙酮處理10分鐘或者僅在染色前立即用10％中性緩沖福爾馬林處理10秒而固定的冷凍組織切片，使用固定濃度的純化的沒有偶聯(lián)的人單克隆抗體(5微克/毫升)和不同濃度的生物素化山羊-抗-人IgG1二抗，首先優(yōu)化IHC交叉反應(yīng)性篩選的條件。根據(jù)這些條件，用不同濃度的HuMAb一抗，最佳二抗?jié)舛冗M(jìn)行第二次試驗以這些結(jié)果為基礎(chǔ)，在冷凍切片術(shù)時用丙酮處理10分鐘后在染色前立即用10％中性緩沖福爾馬林處理10秒而固定之后對人冷凍切片進(jìn)行組織篩選。用含有1.5mg/ml過量載體IgG的5微克/毫升濃度的一抗進(jìn)行染色，接著用含有1.5mg/ml過量載體IgG的7.5微克/毫升7.5生物素化山羊-抗-人IgG二抗進(jìn)行染色切片的蛋白質(zhì)阻斷中包括熱聚集兔(1mg/ml)，5％正常山羊血清，和1％BSA。
實施例1用于生產(chǎn)抗-PSMA人抗體的Cmu靶向小鼠的產(chǎn)生CMD靶向載體的構(gòu)建
質(zhì)粒pICEmu含有跨越mu基因的鼠Ig重鏈基因座的EcoRI/XhoI片段，該片段是從Balb/C基因組λ噬菌體文庫獲得的(Marcu等Cell 22187，1980)。該基因組片段亞克隆到質(zhì)粒pICEMI9H(Marsh等；Gene 32，481-485，1984)的XhoI/EcoRI位點。PICEmu中包括的重鏈序列在位于mu內(nèi)含子增強子的3′的EcoRI位點下游擴增到位于mu基因的最后的跨膜外顯子大約1kb下游的XhoI位點；但是，通過在大腸桿菌中傳代缺失了大多數(shù)mu轉(zhuǎn)換重復(fù)區(qū)。
如下構(gòu)建尋靶載體。從pICEmu切下一個1.3kb HindIII/SmaI片段并且亞克隆到HindIII/SmaI消化的pBluescript(Stratagene，LaJolla，CA)中。這個pICEmu片段從位于Cmu1中Cmu1至SmaI的大約1kb5′的HindIII位點擴增。得到的質(zhì)粒用SmaI/SpeI消化，并且插入從僅位于最后的Cmu外顯子下游的Cmu1 3′至XbaI位點中的SmaI位點擴增的來自pICEmu的大約4kb SmaI/XbaI片段。得到的質(zhì)粒，pTARI，在SmaI位點線性化，并且插入neo表達(dá)盒。該表達(dá)盒由小鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)啟動子(XbaI/TaqI片段；Adra等(1987)Gene6065-74)轉(zhuǎn)錄控制下的neo基因構(gòu)成，并且包含pgk多腺苷酸化位點(PvuII/HindIII片段；Boer等(1990)Biochemical Genetics 28299-308)。該表達(dá)盒從質(zhì)粒pKJ1(根據(jù)Tybulewicz等(1991)Cell 651153-1163所述)獲得，從這個質(zhì)粒切割出neo表達(dá)盒作為EcoRI/HindIII片段并且亞克隆到EcoRI/HindIII消化的pGEM-7Zf(+)，產(chǎn)生pGEM-7(KJ1)。通過EcoRI/SakI消化從pGEM-7(KJ1)切割neo表達(dá)盒，平端處理并且亞克隆到質(zhì)粒pTARI的SmaI位點，以基因組Cmu序列的相反方向。得到的質(zhì)粒用NotI線性化，并且插入單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)表達(dá)盒，使得富集帶有同源重組物的ES克隆，如Mansour等(1988)Nature 336348-352所述。該表達(dá)盒由小鼠pgk啟動子所包括的tk基因的編碼序列和多腺苷酸化位點構(gòu)成，根據(jù)Tybulewicz等(1991)Cell 651153-1163所述。得到的CMD尋靶載體包含與重鏈基因座的總共大約5.3kb的同源性，并且設(shè)計產(chǎn)生突變mu基因，在第一Cmu外顯子的獨特SmaI位點插入neo表達(dá)盒。尋靶載體用PvuI線性化，它在電穿孔到ES細(xì)胞之前在質(zhì)粒序列中切割。
靶向ES細(xì)胞的產(chǎn)生和分析基本上根據(jù)說明(Robertson，E.J.(1987)，Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cellsa Practical Approach(E.J.Robertson，ed.)OxfordIRL Press，p.71-112)，在有絲分裂滅活SNL76/7細(xì)胞供給層(ibid.)上使AB-1 ES細(xì)胞(McMahon，A.P.和Bradley，A.，(1990)Cell 621073-1085)生長。通過Hasty等描述的方法(Hasty，P.R.等(1991)Nature 350243-246)將線性化CMD尋靶載體電穿孔到AB-1細(xì)胞中。電穿孔的細(xì)胞以1-2×106細(xì)胞/培養(yǎng)皿的密度在100mm培養(yǎng)皿中平板培養(yǎng)。24小時之后，G418(200微克/毫升的活性成分)和FIAU(5×10-7M)加到培養(yǎng)基中，并且讓抗藥性克隆生長8-9天。采取克隆，受胰蛋白酶作用，分成兩部分，并且進(jìn)一步擴增。然后將從各個克隆產(chǎn)生的細(xì)胞的一半冷凍，并且對另一半分析載體和靶序列之間的同源性重組。
通過Southern印跡雜交進(jìn)行DNA分析。根據(jù)Laird等所述(Laird，P.W.等，(1991)Nucleic Acids Res.194293)從克隆分離DNA。分離的基因組DNA用SpeI消化并且用915bp Sad片段，探針A(見圖1)探測，它與mu內(nèi)含子增強子和mu轉(zhuǎn)換區(qū)之間的序列雜交。探針A檢測來自野生型基因座的9.9kb SpeI片段，和來自與CMD尋靶載體(含有SpeI位點的neo表達(dá)盒)同源重組的mu基因座的診斷7.6kb帶。Southern印跡分析篩選的1132 G418和FIAU抗性克隆中，3顯示mu基因座同源重組的7.6kb SpeI帶指征。這些3克隆進(jìn)一步用酶BgII，BstXI，和EcoRI消化，證實該載體同源整合到mu基因中。當(dāng)與探針A雜交時，用BgII，BstXI，或EcoRI消化的野生型DNA的Southern印跡分別產(chǎn)生15.7，7.3，和12.5kb的片段，而尋靶mu等位基因的存在分別由7.7，6.6，和14.3kb的片段指示。SpeI消化的所有的3陽性克隆顯示有助于診斷的neo表達(dá)盒插入到Cmu1外顯子中的預(yù)期的BgII，BstXI，和EcoRI限制片段。
帶有突變mu基因的小鼠的產(chǎn)生三個靶向ES克隆，指定號264，272，和408，被解凍并且注射給C57BL/6J胚泡，如Bradley(Bradley，A.(1987)在Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cellsa PracticalApproach.(E.J.Robertson，編著)OxfordIRL Press，p.113-151)中描述的。將接受注射的胚泡轉(zhuǎn)移給假妊娠雌性的子宮，產(chǎn)生帶有來自輸入的ES細(xì)胞和宿主胚泡產(chǎn)生的混合物的嵌合小鼠。ES細(xì)胞分布到嵌合體中的程度可以通過以C57BL/6J背景為黑色，從ES細(xì)胞系產(chǎn)生的刺鼠外表顏色的量目測估計?？寺?72和408只產(chǎn)生低百分比嵌合體(即低百分比的刺鼠著色)，而克隆264產(chǎn)生高百分比雄性嵌合體。這些嵌合體與C57BL/6J雌性繁殖產(chǎn)生刺鼠后代，指示ES細(xì)胞基因組的種系傳播。通過來自尾活組織檢查的BgII消化DNA的Southern印跡分析進(jìn)行對靶mu基因的篩選(如上文對ES細(xì)胞DNA的分析)。大約50％的刺鼠后代除了15.7kb野生型帶之外表現(xiàn)出7.7kb雜交BgII帶，證明靶mu基因的種系傳播。
mu基因功能失活轉(zhuǎn)基因小鼠的分析為了測定neo表達(dá)盒插入到Cmu1中是否使Ig重鏈基因失活，克隆264嵌合體與對于JHD突變是純合的小鼠繁殖，作為JH基因片段缺失的結(jié)果，它使重鏈表達(dá)失活(Chen等，(1993)Immunol.5647-656)。產(chǎn)生四個刺鼠后代。從1月齡的這些動物獲得血清，并且通過ELISA分析鼠IgM的存在。四個后代中的兩個完全缺失IgM(參見表1)。通過BgII消化和與探針A雜交(見圖1)，和通過StuI消化和與475bp EcoRI/StuI片段雜交(ibid.)，通過來自尾活組織檢查的DNA的Southern印跡分析確定基因型證明，不能表達(dá)血清IgM的動物是其中重鏈基因座中的一個等位基因帶有JHD突變，另一個等位基因有Cmu1突變的那些。對于JHD突變是雜合的小鼠顯示野生型血清Ig水平。這些數(shù)據(jù)證明Cmu1突變使mu基因的表達(dá)失活。
表1
表1說明通過ELISA檢測的對于帶有CMD和JHD突變的小鼠(CMD/JHD)，對于就JHD突變是雜合的小鼠(+/JHD)，對于野生型(129Sv x C57BL/6J)F1小鼠(+/+)，和對于就JHD突變是純合的B細(xì)胞缺陷小鼠(JHD/JHD)的血清IgM的水平。
實施例2用于抗-PSMA人抗體生產(chǎn)的HCO12轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生HCO12人重鏈轉(zhuǎn)基因通過共同注射80kb的pHC2的插入物(Taylor等，1994，Int.Immunol.，6579-591)和25kb的pVx6的插入物產(chǎn)生HCO12轉(zhuǎn)基因。如下所述構(gòu)建質(zhì)粒pVx6。
將8.5kb HindIII/SalI DNA片段，包括種系人VH1-18(DP-14)基因和大約2.5kb的5′側(cè)翼，和5kb的3′側(cè)翼基因組序列，被亞克隆到質(zhì)粒載體pSP72(Promega，Madison，WI)中，產(chǎn)生質(zhì)粒p343.7.16。7kb BamHI/HindlII DNA片段，包括種系人VH5-51(DP-73)基因和大約5kb的5′側(cè)翼，和1kb的3′側(cè)翼基因組序列，被亞克隆到pBR322為基礎(chǔ)的質(zhì)粒克隆載體(Taylor等1992，Nucleic AcidsRes.206287-6295)中，產(chǎn)生質(zhì)粒p251f。從pGP1f衍生的新的克隆載體，pGP1k，用EcoRV/BamHI消化，與包括種系人VH3-23(DP47)基因和大約4kb的5′側(cè)翼和5kb的3′側(cè)翼基因序序列的10kbEcoRV/BamHI DNA片段連接。得到的質(zhì)粒，pi 12.2RR.7，用BamHI/SalI消化并且與p251f的7kb純化的BamHI/SalI插入物連接。得到的質(zhì)粒，pVx4，用XhoI消化并且與p343.7.16的8.5kbXhoI/SalI插入物連接。
以和另兩個V基因相同的方面用VH1-18基因獲得一個克隆。這個克隆，指定為pVx6，然后用NotI消化并且和純化的26kb插入物共同連接(以1∶1摩爾比和pHC2的純化的80kb NotI插入物一起)連接到半天(C57BL/6J×DBA/2J)F2胚胎的原核中，如Hogan等(B.Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，第二版，1994，冷泉港實驗出版社，Plainview NY)。從發(fā)育自接受注射胚胎的小鼠建立含有來自Vx6和HC2的獨立的轉(zhuǎn)基因小鼠的三個獨立的種系。這些種系指定為(HCO12)14881，(HCO12)15083，和(HCO12)15087。然后，三個種系的每一個與包括實施例1描述的包括CMD突變，JKD突變(Chen等1993，EMBO J.12811-820)，和(KCo5)9272轉(zhuǎn)基因(Fishwild等1996，Nature Biotechnology 14845-851)的小鼠繁殖。在對于分布內(nèi)源小鼠重鏈和κ輕鏈轉(zhuǎn)基因是純合的背景中，得到的小鼠表達(dá)人免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈轉(zhuǎn)基因。
實施例3抗PSMA人單克隆抗體和雙特異性的產(chǎn)生抗原以兩種形式提供抗原(Northwest Biotherapeutics，Inc)(1)細(xì)胞膜和(2)從LNCaP細(xì)胞(Cat#CRL-1740；美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)分離的純化的蛋白質(zhì)(PSMA)。使用純化抗原(1.05mg/ml)，進(jìn)行一次免疫和最后的尾靜脈加強免疫。單克隆抗體7E11。C5從Cytogen，Inc，Princeton，NJ獲得。
來自LNCaP細(xì)胞的溶解的PSMA和膜與完全或不完全弗氏佐劑(CFA和IFA)混合。用0.2cc制備的抗原對小鼠腹膜內(nèi)腔注射。用無菌PBS中可溶性PSMA進(jìn)行最后的尾靜脈免疫。
轉(zhuǎn)基因小鼠在網(wǎng)籠中飼養(yǎng)小鼠并且在免疫，取血和融合的那天評價好的生理狀態(tài)。(CMD)++；(HCo12)15087+；(JKD)++；(KCo5)9272+基因型的雄性小鼠ID#17018產(chǎn)生雜交瘤4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9。各個轉(zhuǎn)基因命名在括號內(nèi)，接著是隨機整合轉(zhuǎn)基因的數(shù)。符號++和+指示純合或半合子；但是，因為利用對于隨機整合的人Ig轉(zhuǎn)基因不能區(qū)分雜合性和純合性的PCR-為基礎(chǔ)的測試常規(guī)篩選小鼠，可能對實際上對于這些要素是純合的小鼠給與了+命名。
免疫程序表2列出了免疫程序。在HCo7和HCo12基因型的一群10只小鼠中包括第112天融合的小鼠#17018。對腹膜內(nèi)腔注射所有的免疫。融合之前3和2天，進(jìn)行IV加強免疫。
表2
*有關(guān)效價，參見表3雜交瘤制備對于融合使用P3 X63 ag8.653骨髓瘤細(xì)胞系(ATCCCRL 1580，lot F-15183)。將原ATCC小瓶解凍并且在培養(yǎng)基中擴增。從擴增產(chǎn)物制備冷凍小瓶的原種。細(xì)胞在培養(yǎng)物中保持3-6個月，一周傳代兩次。P388D1(ATCC TIB-63FL)擴增到200mLs結(jié)束。上清液旋轉(zhuǎn)離心并過濾并且用作雜交瘤的添加基質(zhì)。當(dāng)新的小瓶解凍時，這個細(xì)胞系傳代3-6月。
高葡萄糖DMEM使用含有10％FBS和青霉素是-鏈霉素(Gibco，#11K1763)(Mediatech Cellgro，#1001233)培養(yǎng)P388D1細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。向雜交瘤生長培養(yǎng)基加入另外的培養(yǎng)基補充。
來自小鼠號#17018的脾大小正常并且得到1.78×108存活細(xì)胞。融合脾細(xì)胞。
融合之后7-10天進(jìn)行對人IgG，κ抗體的最初的ELISA篩選。然后在可溶性PSMA包被ELISA板上篩選人IgG，κ陽性孔。然后將抗原陽性雜交瘤轉(zhuǎn)移給24孔板，最后轉(zhuǎn)移給組織培養(yǎng)瓶。通過限制稀釋保證單克隆性，將PSMA特異性雜交瘤亞克隆。通過在DMEM，50％FBS加10％DMSO(Sigma，D2650)中冷凍細(xì)胞，在發(fā)育的幾個階段保存抗原陽性雜交瘤。
下面的表中給出小鼠#17018的效價。效價是Hu-抗原特異性-γ。反復(fù)免疫之后對抗原的應(yīng)答表明強的應(yīng)答水平，并且制備用于融合的小鼠。
表3
融合產(chǎn)生38HU-γ，κ雜交瘤，將它用抗原再次篩選。用抗原篩選之后(以ELISA為基礎(chǔ))，鑒定5個抗原特異性雜交瘤。對抗原再次進(jìn)行試驗，對所有5個克隆證明對靶物4A3，7F12，8A11，8C12和16F9是陽性的。對這5個雜交瘤的上清液進(jìn)一步評價。來自這5個克隆的抗體與LNCaP細(xì)胞上表達(dá)的PSMA的天然形式結(jié)合。所有5個抗體是γ1，κ基因型。
利用標(biāo)準(zhǔn)交聯(lián)方法(圖6)，通過二硫鍵，通過來自人抗-CD89抗體14A8或14A8抗體亞克隆的Fab′2片段，指定為14A8，和人抗-PSMA抗體，8C12，的化學(xué)偶聯(lián)，制備指定為14A8×8C12的雙特異性分子。
實施例4人抗-PSMA抗體的結(jié)合特征固相ELISA研究通過比較抗全長PSMA和細(xì)菌表達(dá)的含有PSMA蛋白質(zhì)的融合部分的融合蛋白的反應(yīng)性(固相ELISA)，研究抗-PSMA特異性抗體的結(jié)合特征。HuMAbs 4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9與純化的PSMA反應(yīng)，但是與含有PSMA序列的部分的任何融合蛋白不反應(yīng)(結(jié)果沒有給出)。相反，HuMAb 11 C 10與全長PSMA和含有PSMA氨基酸1-173序列的融合蛋白強烈反應(yīng)(圖1)。對氨基酸134-437PSMA片段還發(fā)現(xiàn)11C10抗體的較低水平的結(jié)合。
使用來自LNCaP和PC3細(xì)胞的質(zhì)膜級分，通過固相ELISA，還研究了人抗-PSMA特異性抗體的結(jié)合特征。在96-孔板上系列稀釋膜級分并風(fēng)干。平板用5％BSA封閉并且用PBS中5微克/毫升抗體處理1小時，然后利用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法檢測。
圖2中給出的結(jié)果表明，HuMAbs 4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9的結(jié)果證明在一定抗原濃度范圍下對于LNCaP細(xì)胞膜的高特異性。在該背景上幾乎沒有或沒有觀察到抗PC3細(xì)胞膜的抗體結(jié)合。利用類似測試還測定了雙特異性分子14A8×8C12與PSMA-表達(dá)LNCaP細(xì)胞和CD89-表達(dá)U937細(xì)胞結(jié)合的能力。雙特異性分子以劑量依賴形式結(jié)合LNCaP和U937細(xì)胞。
天然PSMA和細(xì)胞表達(dá)PSMA融合蛋白質(zhì)片段的ELISA結(jié)果表明，除了11 C 10，當(dāng)以天然構(gòu)象存在時，所有的HuMAbs對于PSMA是特異性的。為了正是這個發(fā)現(xiàn)，對與天然的和熱變性PSMA結(jié)合的抗體測試測定蛋白質(zhì)構(gòu)象對結(jié)合特異性的重要性。圖3給出使用天然的和熱變性PSMA的固相ELISA結(jié)果。使用對于由從蛋白質(zhì)的N-末端的頭六個氨基酸組成的表位是特異性的鼠抗-PSMA單克隆抗體7E11作為陽性對照。結(jié)果表明熱變性對7E11結(jié)合沒有影響，與其識別線性序列表位相一致。與這些結(jié)果相反，抗體4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9都強烈結(jié)合天然純化的PSMA。但是，PSMA的熱變性事實上破壞抗體結(jié)合，表明天然蛋白質(zhì)構(gòu)象對于抗體結(jié)合是必須的。與該結(jié)果相一致，抗體4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9在蛋白質(zhì)印跡分析中檢測PSMA是無效的(結(jié)果沒有給出)。
因此，HuMAbs 4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9不識別線性氨基酸序列表位，取而代之的是結(jié)合蛋白質(zhì)構(gòu)象表位，即，當(dāng)線性序列不同部分的氨基酸在三維空間上密切接近時產(chǎn)生的PSMA分子的構(gòu)象折疊產(chǎn)生的天然蛋白質(zhì)表位。這樣的構(gòu)象表位分布在質(zhì)膜的胞外側(cè)上。
PSMA從LNCaP細(xì)胞的免疫沉淀通過從LNCaP細(xì)胞的1％NP-40去污溶胞產(chǎn)物衍生的蛋白質(zhì)的免疫沉淀來研究抗體4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9的結(jié)合特異性。用抗體接著加入Protein G-Sepharose珠處理溶胞產(chǎn)物。將珠充分清洗并且將結(jié)合的免疫復(fù)合體進(jìn)行SDS凝膠電泳，并且用鼠線性PSMA序列表位特異性抗體4D8進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。結(jié)果如圖4所示。泳道1表明LNCaP細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中存在的PSMA和PSM′(從N-末端缺失頭57個氨基酸的另一種剪接變體)的蛋白質(zhì)印跡反應(yīng)性。泳道2表明同種型匹配(IgG1)不相關(guān)人抗體的免疫沉淀結(jié)果。泳道3至7表明分別使用抗體4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9的免疫沉淀的結(jié)果。在各種情況下，發(fā)現(xiàn)強的泳帶相應(yīng)于PSMA和PSM′，表明這些抗體與蛋白質(zhì)的胞外域中存在的蛋白質(zhì)表位結(jié)合。
HuMAb與活LNCaP細(xì)胞上表達(dá)的PSMA結(jié)合使用不相關(guān)人IgG1抗體作為對照物通過流式細(xì)胞儀研究抗體與活體或非活體(固定的)LNCaP細(xì)胞的結(jié)合?；罴?xì)胞是碘化丙啶陰性細(xì)胞群。在一抗處理之前用PBS中1％多聚甲醛處理固定化細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)抗體4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9對活細(xì)胞和固定化LNCaP細(xì)胞有強結(jié)合。使用PC3細(xì)胞或者當(dāng)和LNCaP細(xì)胞使用同種型匹配不相關(guān)人抗體時觀察到陰性染色。
通過比較，使用相同的活細(xì)胞和固定化細(xì)胞的制劑，使用鼠線性表位特異性抗體和不相關(guān)鼠抗體對照物得到的抗體結(jié)果證明，與活細(xì)胞的結(jié)合低得多。與固定化細(xì)胞的結(jié)合較高，但是，在任何條件下都沒有線性表位可與使用不相關(guān)人IgG1抗體作為對照物發(fā)現(xiàn)的用構(gòu)象HuMAbs觀察的結(jié)合相比較。使用PSMA陰性PC3No細(xì)胞的實驗中測定鼠或人構(gòu)象或線性表位抗體的結(jié)合(結(jié)果沒有給出)。
因此，HuMAbs表現(xiàn)出與LNCaP活細(xì)胞結(jié)合的強抗體，并且和與鼠構(gòu)象抗體3C6結(jié)合的相關(guān)的表位結(jié)合。
抗體結(jié)合競爭的FACS分析進(jìn)行抗體結(jié)合競爭研究，確定每一種抗體是否與PSMA上相同或不同的表位結(jié)合。在這些實驗中，首先用不相關(guān)人IgG1，或PSMA-特異性HuMAbs處理LNCaP細(xì)胞，充分洗滌，在流式細(xì)胞儀分析之前用FITC-標(biāo)記的各HuMAbs進(jìn)行標(biāo)記。測定沒有標(biāo)記的HuMAbs阻斷FITC-標(biāo)記的HuMAb的結(jié)合的能力。使用用不相關(guān)人IgG1預(yù)先處理的細(xì)胞在各種情況下發(fā)現(xiàn)FITC-標(biāo)記的抗體的強結(jié)合。相反，用抗-PSMA特異性HuMAbs預(yù)處理在各種情況下基本上抑制FITC-標(biāo)記的抗體結(jié)合。總之，數(shù)據(jù)表明7F12和16F9的競爭結(jié)合行為與其他HuMAbs最相似。使用不同的抗體對可見結(jié)合抑制程度的微小變化。例如，8C12有效抑制4A3，8A11，和8C12結(jié)合，但是對7F12的作用小得多?？傊?，稍微不同，但是密切分布的構(gòu)象表位被這些抗體識別。
使用鼠PSMA構(gòu)象抗體的HuMAb結(jié)合競爭開發(fā)指定為1G9，3C6，和4D4的鼠PSMA-特異性抗體，它們還直接抗蛋白質(zhì)構(gòu)象表位。根據(jù)流式細(xì)胞儀測定，利用抗體1G9，3C6，和4D4的抗體競爭測定HuMAbs是否識別鼠抗體普遍識別的表位。測定沒有標(biāo)記的HuMAbs阻斷FITC-標(biāo)記的1G9，3C6，和4D4的結(jié)合的能力。用HuMAbs預(yù)處理LNCaP細(xì)胞，接著用FITC-鼠4D4和1 G9標(biāo)記，表明幾乎沒有或沒有顯然的抑制作用的相似結(jié)果。相反，通過HuMAbs 4A3，7F12，8A11，8C12，和16F9觀察到的FITC-3C6的顯著抑制作用表明其分別與3C6識別的相似或緊密分布的表位結(jié)合。
構(gòu)象HuMAbs對LNCaP細(xì)胞上PSMA的結(jié)合親和性PSMA HuMAbs對于PSMA的天然構(gòu)象是高度靈敏的。使用純化的PSMA測定親和常數(shù)的多種實驗均不能提供可靠的或可重復(fù)的結(jié)果。進(jìn)行實驗，從LNCaP活細(xì)胞中表達(dá)的天然PSMA獲得一些親和性結(jié)合信息。為了測定每一種抗體對天然PSMA的結(jié)合親和性，使用流式細(xì)胞儀分析，其中對于固定數(shù)目的有過量FITC-標(biāo)記二抗的LNCaP細(xì)胞(1×106)改變一抗?jié)舛?。?中的數(shù)據(jù)表明以細(xì)胞標(biāo)記強度中最大半變化需要的抗體濃度表示的結(jié)果。這些結(jié)果證明使用抗體4A3，7F12，和16F9觀察到最高結(jié)合親和性?？贵w8C12具有比高親和性抗體低大約3-倍的結(jié)合親和性，接著是結(jié)合親和性低大約20倍的抗體8A11。
表4
實施例5人抗-PSMA抗體和雙特異性的ADCC和CDC活性I.人抗-PSMA抗體的抗體依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)活性在使用來自兩個供者的PBMC的實驗中，對上面實施例中描述的每一種構(gòu)象抗體測定抗-PSMA HuMAbs介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)或補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的能力。圖5A和B中給出的結(jié)果表明對于每一種HuMAb的強的ADCC。每一種HuMAb具有相似的效價，并且具有與作為陽性對照物Herceptin相似的反應(yīng)性(圖5B)。對于任何HuMAb沒有發(fā)現(xiàn)CDC反應(yīng)性(沒有給出數(shù)據(jù))。
II.人抗-PSMA雙特異性抗體的抗體依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)活性對雙特異性分子14A8×8C12(圖6所示)和單克隆抗體8C12分析標(biāo)記的PSMA-表達(dá)腫瘤的多形核細(xì)胞-介導(dǎo)的ADCC殺傷。
特別地，從健康供者分離單核細(xì)胞(單核細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞)，以及全血，并且與51Cr標(biāo)記的PSMA表達(dá)腫瘤細(xì)胞在雙特異性分子14A8×8C12的存在下溫育。大約4小時之后，收獲各孔中的培養(yǎng)上清液，并且在γ計數(shù)器上測定51Cr釋放。根據(jù)下面的式子測定特異性溶胞作用百分比(實驗CPM-靶滲漏CPM)/(去污溶解CPM-靶滲漏CPM)×100％。如圖7A，8A和9A所示結(jié)果證明，與對照抗體相比，通過單核細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞和全血，14A8×8C12介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的劑量依賴性溶胞作用。
在雙特異性分子14A8×8C12或單克隆抗體8C12的存在下，單核細(xì)胞和全血還與51Cr標(biāo)記的LNCaP腫瘤細(xì)胞溫育(圖7B，7C，8B和9B)。在37℃(5％CO2)下用100μCi的51Cr標(biāo)記LNCaP細(xì)胞1小時，然后與單核細(xì)胞和全血，以及各種濃度的雙特異性或單克隆抗體一起溫育。溫育16小時之后，收集上清液并且如上所述分析放射性。
單核細(xì)胞誘導(dǎo)的ADCC如圖7A所示，雙特異性分子14A8×8C12以劑量依賴方式介導(dǎo)表達(dá)PSMA腫瘤細(xì)胞的殺傷。加入50微克/毫升的14A8 Fab′2通過1微克/毫升的雙特異性分子14A8×8C12完全阻斷腫瘤細(xì)胞的ADCC，證明靶向細(xì)胞殺傷僅由效應(yīng)細(xì)胞上的CD89介導(dǎo)。如圖7B所示，雙特異性分子14A8×8C12和單克隆抗體8C12還介導(dǎo)通過LNCaP腫瘤細(xì)胞的單核細(xì)胞的劑量依賴性溶胞作用。此外，與H22F(ab)′2(人源化抗-FcγRI)相比較，加入過量的14A8 F(ab)′2完全抑制通過雙特異性分子14A8×8C12的腫瘤細(xì)胞的ADCC，表明靶向細(xì)胞殺傷通過CD89介導(dǎo)(參見圖7C)。
嗜中性細(xì)胞誘導(dǎo)的ADCC如圖8A所示，雙特異性分子14A8×8C12以劑量依賴方式介導(dǎo)嗜中性細(xì)胞對表達(dá)PSMA腫瘤細(xì)胞的殺傷。加入25微克/毫升的14A8Fab′2顯著阻斷雙特異性分子對于腫瘤細(xì)胞的ADCC，證明靶向細(xì)胞殺傷由CD89與效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合特異介導(dǎo)。如圖8B所示，雙特異性分子14A8×8C12還介導(dǎo)通過LNCaP腫瘤細(xì)胞的嗜中性細(xì)胞的劑量依賴性溶胞作用。與H22F(ab)′2(人源化抗-FcγRI)相比較，加入過量的14A8F(ab)′2完全抑制通過14A8×8C12的腫瘤細(xì)胞的ADCC，表明靶向細(xì)胞殺傷通過CD89介導(dǎo)。
全血誘導(dǎo)的ADCC如圖9A所示，雙特異性分子14A8×8C12以劑量依賴方式介導(dǎo)全血對表達(dá)PSMA腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞殺傷。加入25微克/毫升的14A8Fab′2顯著阻斷雙特異性分子對腫瘤細(xì)胞的ADCC，再次證明靶向細(xì)胞殺傷由CD89與效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合特異介導(dǎo)。類似地，如圖9B所示，雙特異性分子14A8×8C12還介導(dǎo)通過LNCaP腫瘤細(xì)胞的全血的劑量依賴性溶胞作用。與H22F(ab)′2(人源化抗-FcγRI)相比較，加入過量的14A8F(ab)′2完全抑制通過14A8×8C12的腫瘤細(xì)胞的ADCC，表明靶向細(xì)胞殺傷通過CD89介導(dǎo)。
III.在人效應(yīng)細(xì)胞的存在下人抗-PSMA抗體和雙特異性抗體介導(dǎo)表達(dá)PSMA的腫瘤細(xì)胞的吞噬作用和殺傷對雙特異性分子14A8×8C12和單克隆抗體8C12測定它們單獨的，以及在過量14A8(人抗-FcαR)Fab′2抗體或過量H22(人源化抗-FcγRI)Fab′2抗體作為對照物下，它們介導(dǎo)標(biāo)記的PSMA-表達(dá)腫瘤細(xì)胞(LNCaP細(xì)胞)的吞噬作用。
簡要地說，通過Munn等(1990)J.Exp.Med.172231-237描述的方法的改進(jìn)，檢查巨噬細(xì)胞(MDM)衍生的單核細(xì)胞對LNCaP細(xì)胞的雙特異性-介導(dǎo)的吞噬作用。在補加10％FBS和10ng/ml的M-CSF的巨噬細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，NY)中，從正常成年來源單核細(xì)胞leukopacs(ABI)純化的單核細(xì)胞在24-孔板(1×106/ml)中分化7-12天。用親脂性紅色熒光染料PKH 26(Sigma，St.Louis，MO)標(biāo)記LNCaP細(xì)胞。標(biāo)記的LNCaP細(xì)胞加給沒有或有雙特異性抗體(或?qū)φ湛贵w)的含有MDM的孔，并且在37℃溫育5-24小時(5％CO2)。用胰蛋白酶回收MDM和沒有吞噬的LNCaP細(xì)胞，并且在冰上用FITC-標(biāo)記的抗-CD33 mAb(251)和抗-CD14 mAb(AML-2-23)染色1小時(4℃)。將細(xì)胞清洗并且通過使用FACScan的雙色熒光進(jìn)行分析。根據(jù)雙陽性靶細(xì)胞(被MDM消化)的數(shù)目除以靶細(xì)胞總數(shù)×100％來計算吞噬作用百分比。
如圖10所示，雙特異性分子14A8×8C12以劑量依賴方式介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的加強特異性吞噬作用。加入14A8 Fab′2顯著阻斷雙特異性分子對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用，再次證明靶向吞噬作用由CD89與效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合特異性介導(dǎo)。類似地，如圖11所示，雙特異性分子14A8×8C12和單克隆抗體8C12也以劑量依賴方式介導(dǎo)LNCaP細(xì)胞的吞噬作用。圖12證明，與H22F(ab)′2(人源化抗-FcγRI)相比較，因為加入過量的14A8F(ab)′2抑制它，所以通過CD89介導(dǎo)14A8×8C12介導(dǎo)的LNCaP腫瘤細(xì)胞的吞噬作用。
上面的實施例證明以高親和性與PSMA特異反應(yīng)的人單克隆抗體和雙特異性的產(chǎn)生。這些抗體和雙特異性物質(zhì)識別分子的胞外結(jié)構(gòu)域中存在的天然構(gòu)象蛋白質(zhì)表位，而不是線性氨基酸序列確定的表位。另外，人抗-PSMA抗體和其雙特異性分子在效應(yīng)細(xì)胞的存在下介導(dǎo)細(xì)胞殺傷和吞噬作用，抗高水平表達(dá)PSMA的人腫瘤細(xì)胞。
實施例6125I-標(biāo)記的人抗-PSMA抗體對裸鼠中LNCaP細(xì)胞腫瘤的生物學(xué)分布通過下面的標(biāo)記的抗體向正常和腫瘤組織中的時間-依賴性吸收測定帶有LNCaP細(xì)胞腫瘤的裸鼠中125I-標(biāo)記的HuMAb的生物學(xué)分布。從兩個HuMAbs，4A3和7F12獲得結(jié)果。最初以適當(dāng)?shù)目贵w蛋白質(zhì)的結(jié)合親和性研究和有效性為基礎(chǔ)使用抗體7F 12。但是，后來的實驗證明7F 12的碘化事實上破壞該抗體結(jié)合抗原的能力。因此，只是對4A3獲得有用數(shù)據(jù)。圖13給出4A3的結(jié)果，并且表明標(biāo)記的抗體最初主要在血液和高血管化組織中。這隨著腫瘤吸收發(fā)生而減少并且在24小時之后與正常組織相比腫瘤標(biāo)記最大(與正常組織相比標(biāo)記大2-倍或更大)。因此，發(fā)生對腫瘤的有效生物學(xué)分布。隨吸收之后的時間的腫瘤標(biāo)記的程度可以，部分是，循環(huán)抗體和結(jié)合的抗體的抗體內(nèi)化的減小水平與標(biāo)記的抗體蛋白質(zhì)片段的細(xì)胞的結(jié)果釋放的函數(shù)。
實施例7LNCaP細(xì)胞對125I-標(biāo)記的人抗-PSMA抗體的內(nèi)化分析通過分析釋放到TCA可溶性125I計數(shù)的培養(yǎng)上清液中的時間依賴性釋放監(jiān)測125I-標(biāo)記的HuMAb蛋白質(zhì)的內(nèi)化。LNCaP細(xì)胞，表面用碘化抗體標(biāo)記，在37℃下溫育并且去除培養(yǎng)上清液，TCA沉淀，并且在圖14所示的時間測定上清液級分中存在的125I標(biāo)記的量。結(jié)果表明碘化抗體4A3，16F9，和8A11在0時間有效標(biāo)記LNCaP細(xì)胞。并且有效內(nèi)化到細(xì)胞中，降解，并且蛋白質(zhì)片段釋放到培養(yǎng)上清液中。用這些抗體的每一種溫育18小時之后，TCA可溶級分中回收大約50％的最初結(jié)合的抗體。
對于碘化HuMAbs 7F12和8C12獲得不同的細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化結(jié)果。特別地，使用碘化7F12和8C12抗體發(fā)現(xiàn)低得多的總LNCaP細(xì)胞標(biāo)記表明碘化作用可能對標(biāo)記的抗體結(jié)合抗原的能力有影響。為了分析該假設(shè)，使用固定化天然純化LNCaP細(xì)胞PSMA和碘化HuMAb進(jìn)行固相結(jié)合分析。圖15所示結(jié)果證明陽性對照碘化4A3抗體與PSMA結(jié)合，并且還證明碘化作用破壞7F 12和8C 12結(jié)合抗原的能力。因此，使用125I-標(biāo)記的7F12和8C12抗體不能對抗體7F12和8C12評價內(nèi)化速度。
實施例8HuMAbs 4A3和7F12的DOTA標(biāo)記對與PSMA結(jié)合的影響對抗體進(jìn)行DOTA-標(biāo)記，并且通過ELISA分析對抗體結(jié)合抗原的作用。DOTA(四氮雜環(huán)十二烷四乙酸)是能用于絡(luò)合放射性核素的常用螯合劑。圖16的結(jié)果證明DOTA-標(biāo)記的抗體保留高抗原結(jié)合能力，表明這些抗體在形成放射金屬螯合物中是有用的。
實施例9通過免疫組織化學(xué)的人抗-PSMA抗體結(jié)合正常和惡性人組織的組織反應(yīng)性使用對于PSMA中存在的構(gòu)象表位特異性的5種HuMAbs的結(jié)合免疫組織化學(xué)分析進(jìn)行與正常和惡性人組織的冷凍切片的交叉反應(yīng)篩選。來自各種組織類型的單一樣品的結(jié)果證明與非前列腺惡性的或者正常組織的前列腺上皮和腫瘤血管內(nèi)皮的強的結(jié)合。觀察到前列腺癌中血管內(nèi)皮沒有染色。發(fā)現(xiàn)其他較弱的反應(yīng)性，包括來自非腫瘤組織的腺上皮的不同的反應(yīng)性，腦組織中的有效交叉反應(yīng)性，肝中空腸淋巴細(xì)胞和星形細(xì)胞的染色。有一些問題涉及非前列腺染色結(jié)果，一些“正常”組織中的一些從表現(xiàn)出與腫瘤鄰近或附近有強的腫瘤血管染色的相同的供者獲得。淋巴細(xì)胞染色可能由于從原發(fā)腫瘤的抗原吸收。其他組織和要素對于這些抗體是陰性的。五種試驗的HuMAbs之間通過IHC沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異。
實施例10結(jié)合親和性使用LNCaP細(xì)胞利用流式細(xì)胞儀測定抗-PSMA HuMAbs的結(jié)合親和性，其中用一系列細(xì)胞試管稀釋HuMAb。使用飽和量存在的FITC-標(biāo)記的二抗檢測結(jié)合的抗體的量。如下是根據(jù)1/2最大變化(用飽和HuMAb見到的變化)必須的抗體蛋白質(zhì)的量分析的數(shù)據(jù)
表5
對HuMAbs 4A3和7F12的進(jìn)一步親和性研究使用放射性標(biāo)記的抗體(111In-DOTA-標(biāo)記抗體)并且與固定數(shù)目的LNCaP細(xì)胞結(jié)合。利用得到的抗體結(jié)合數(shù)據(jù)進(jìn)行Scatchard分析。兩種抗體(4A3和7F12)的結(jié)果證明相似的親和常數(shù)，KD＝0.5±0.1nM或10-10M)。
實施例11V區(qū)克隆使用mRNA分離和cDNA合成試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)從抗-PSMA雜交瘤制備PolyA+mRNA和第一鏈cDNA。使用相應(yīng)于人VH和VL(或VK)信號序列5′引物嵌段通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增4A3，7F12和8C12 V區(qū)。使用與構(gòu)架1中成熟V區(qū)序列的5′末端結(jié)合的引物擴增8A11和16F9 V區(qū)。3′VH和VKPCR引物分別含有下面的序列TGCCAGGGGGAAGACCGATGG(SEQ ID NO57) 和CGGGAAGATGAAGACAGATG(SEQ ID NO58)。為了監(jiān)測序列中潛在的PCR-引入的變化雙份進(jìn)行PCR，克隆和測序。
結(jié)論上面的實施例證明對于人PSMA上的構(gòu)象表位是特異性的五種全人單克隆抗體，和含有所述抗體的治療性雙特異性藥物的產(chǎn)生。所有的五種抗體具有高抗原特異性，和與天然的，但是沒有變性的PSMA的反應(yīng)性?？贵w有效地內(nèi)化到PSMA表達(dá)細(xì)胞中，具有強的抗體-依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)活性，對動物模型中PSMA表達(dá)腫瘤的生物學(xué)分布，并且在人組織的免疫-組織研究中實現(xiàn)相似性能。在人的免疫組織化學(xué)，進(jìn)行免疫組織學(xué)研究的性能。
等同方案本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)，或者確認(rèn)至多使用常規(guī)實驗，能獲得這里描述的本發(fā)明的具體實施例的很多等同方案。這樣的等同方案包括在下面的權(quán)利要求書中。
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序列表<110>Medarex，Inc.et al.
<120>抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)的人單克隆抗體<130>MXI-163CPPC<150>10/059989<151>2002-01-28<150>PCT/US00/20247<151>2000-07-26<150>60/146285<151>1999-07-29<150>60/158759<151>1999-10-12<150>60/188087<151>2000-03-09<160>58<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>357<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1gaggtgcagt tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60tcctgtaagg gttctggata cagttttacc agctactgga tcggctgggc gcgccagatg 120cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgttc ggccgctaat 300tcttctcact ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca357<210>2<211>325<212>DNA<213>人<400>2gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggttcca acagaaacct 120ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggctcatgta cacttttggc 300caggggacca agctggagat caaac 325<210>3<211>357<212>DNA<213>人<400>3caggtgcagc tgcaggagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60tcctgtaagg gttctggata tagttttacc agcttctgga tcggctgggc gcgccagatg 120cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240ctgcagtgga gtagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gaccgctaac 300tcctctttct ggaatttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca357<210>4<211>325<212>DNA<213>人<400>4gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggctcatgta cacttttggc 300caggggacca agctggagat caaac 325<210>5<211>357<212>DNA<213>人<400>5gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaacgc ccggggagtc tctgaagatc 60tcctgtaagg gctctggata cacctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120cccgggaaag gcccggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccttc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240ctgcagtgga acagcctgaa gacctcggac accgccatgt attactgtgc gaccgctaac 300ccctcttatt ggtatttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca357<210>6<211>325<212>DNA
<213>人<400>6gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcgact ggctcatgta cacttttggc 300caggggacca agctggagat caaac 325<210>7<211>341<212>DNA<213>人<400>7agtctggagc agaggtgaaa acgcccgggg agtctctgaa gatctcctgt aagggctctg 60gatacacctt taccaactac tggatcggct gggtgcgcca gatgcccggg aaaggcccgg 120agtggatggg gatcatctat cctggtgact ctgataccag atacagcccg tccttccaag 180gccaggtcac cttctcagcc gacaagtcca tcagcaccgc ctacctgcag tggagcagcc 240tgaagacctc ggacaccgcc atgtattact gtgcgaccgc taacccctct tattggtatt 300tcgatctctg gggccgtggc accctggtca ctgtctcctc a 341<210>8<211>302<212>DNA<213>人<400>8tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagcgtcacc atcacttgcc gggtgagtca 60gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca gggaaagttc ctaagctcct 120gatctatagt gcatccaatt tgcaacctgg agtcccatct cggttcagtg gcagtggatc 180tgggacagat ttcactctca ctatcaacag cctgcagcct gaagatgttg caacttatta 240cggtcaacgg acttacaatg ccccattcac tttcggccct gggaccaaag tggatatcaa 300ac302<210>9<211>341<212>DNA<213>人<400>9agtctggagc agaactgaaa aagcccgggg agtctctgaa gatctcctgt aagggttctg 60gatacagttt taccaactac tggatcggct gggcgcgcca gatgcccggg aaaggcctgg 120agtggatggg gatcatctat cctggtgact ctgataccag atacagtccg tccttccaag 180gccaggtcac catctctgcc gacaagtccg tcagcaccgc ctacctgcag tggaacagtc 240tgaaggcctc ggacaccgcc atgtattact gtgcgaccgc taactcctct ttctggaact 300tcgatctctg gggccgtggc accctggtca ctgtctcctc a 341
<210>10<211>302<212>DNA<213>人<400>10tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggtgagtca 60gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca gggaaagttc ctaagctcct 120gatgtatagt gcatccaatt tgcaatctgg agtcccatct cggttcagtg gcagtggatc 180tgggacagat ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct gaagatgttg caacttatta 240cggtcaacgg acttacaatg ccccattcac tttcggccct gggaccaaag tggatatcaa 300ac302<210>11<211>119<212>PRT<213>人<400>11Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Gly Trp Ala Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ser Ala Ala Asn Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>12<211>119<212>PRT<213>人<400>12Ala Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Phe20 25 30
Trp Ile Gly Trp Ala Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Thr Ala Asn Ser Ser Phe Trp Asn Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>13<211>119<212>PRT<213>人<400>13Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Thr Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met35 40 45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Gln Gly Gln Val Thr Phe Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Thr Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Thr Ala Asn Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>14<211>113<212>PRT<213>人<400>14Ser Gly Ala Glu Val Lys Thr Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys1 5 10 15Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg20 25 30
Gln Met Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly35 40 45Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Phe50 55 60Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu65 70 75 80Lys Thr Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Ala Asn Pro Ser85 90 95Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser100 105 110Ser<210>15<211>113<212>PRT<213>人<400>15Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys1 5 10 15Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly Trp Ala Arg20 25 30Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly35 40 45Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile50 55 60Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Asn Ser Leu65 70 75 80Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Ala Asn Ser Ser85 90 95Phe Trp Asn Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser100 105 110Ser<210>16<211>108<212>PRT<213>人<400>16Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met85 90 95Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>17<211>108<212>PRT<213>人<400>17Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met85 90 95Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>18<211>108<212>PRT<213>人<400>18Glu lle Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser ValSer Ser Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asp Trp Leu Met85 90 95Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>19<211>100<212>PRT<213>人<400>19Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys1 5 10 15Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys20 25 30Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln35 40 45Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe50 55 60Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr65 70 75 80Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys85 90 95Val Asp Ile Lys100<210>20<211>100<212>PRT<213>人<400>20Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys1 5 10 15Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys20 25 30Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln35 40 45Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe50 55 60Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr65 70 75 80Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys85 90 95
Val Asp Ile Lys100<210>21<211>5<212>PRT<213>人<400>21Ser Tyr Trp Ile Gly1 5<210>22<211>17<212>PRT<213>人<400>22Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15Gly<210>23<211>10<212>PRT<213>人<400>23Ala Asn Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Leu1 5 10<210>24<211>5<212>PRT<213>人<400>24Ser Phe Trp Ile Gly1 5<210>25<211>17
<212>PRT<213>人<400>25Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15Gly<210>26<211>9<212>PRT<213>人<400>26Ala Asn Ser Phe Trp Asn Phe Asp Leu1 5<210>27<211>5<212>PRT<213>人<400>27Ser Tyr Trp IIe Gly1 5<210>28<211>17<212>PRT<213>人<400>28Ile lle Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15Gly<210>29<211>10<212>PRT<213>人<400>29
Ala Asn Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu1 5 10<210>30<211>5<212>PRT<213>人<400>30Asn Tyr Trp Ile Gly1 5<210>31<211>17<212>PRT<213>人<400>31Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15Gly<210>32<211>10<212>PRT<213>人<400>32Ala Asn Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu1 5 10<210>33<211>5<212>PRT<213>人<400>33Asn Tyr Trp Ile Gly1 5<210>34<211>17
<212>PRT<213>人<400>34Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15Gly<210>35<211>10<212>PRT<213>人<400>35Ala Asn Ser Ser Phe Trp Asn Phe Asp Leu1 5 10<210>36<211>11<212>PRT<213>人<400>36Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>37<211>7<212>PRT<213>人<400>37Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr1 5<210>38<211>10<212>PRT<213>人<400>38Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met Tyr Thr1 5 10
<210>39<211>11<212>PRT<213>人<400>39Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>40<211>7<212>PRT<213>人<400>40Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr1 5<210>41<211>10<212>PRT<213>人<400>41Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met Tyr Thr1 5 10<210>42<211>11<212>PRT<213>人<400>42Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>43<211>7<212>PRT<213>人<400>43
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr1 5<210>44<211>10<212>PRT<213>人<400>44Gln Gln Arg Ser Asp Trp Leu Met Tyr Thr1 5 10<210>45<211>11<212>PRT<213>人<400>45Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn1 5 10<210>46<211>7<212>PRT<213>人<400>46Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser1 5<210>47<211>9<212>PRT<213>人<400>47Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr1 5<210>48<211>11<212>PRT<213>人
<400>48Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn1 5 10<210>49<211>7<212>PRT<213>人<400>49Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser1 5<210>50<211>9<212>PRT<213>人<400>50Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr1 5<210>51<211>98<212>PRT<213>人<400>51Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg
<210>52<211>94<212>PRT<213>人<400>52Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp85 90<210>53<211>103<212>PRT<213>人<400>53Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe85 90 95Thr Thr Lys Val Asp Ile Lys100<210>54<211>343<212>DNA<213>人<400>54
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gatactggta 300cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt cactgtctcc tca 343<210>55<211>283<212>DNA<213>人<400>55gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggc 283<210>56<211>322<212>DNA<213>人<400>56gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgcc gggtgagtca gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca 120gggaaagttc ctaagctcct gatctatagt gcatccaatt tgcaatctgg agtcccatct 180cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct 240gaagatgttg caacttatta cggtcaacgg acttacaatg ccccattcac tttcggccct 300gggaccaaag tggatatcaa ac 322<210>57<211>21<212>DNA<213>人<400>57tgccaggggg aagaccgatg g 21<210>58<211>20<212>DNA<213>人<400>58cgggaagatg aagacagatg 20
權(quán)利要求
1.一種分離的包括人重鏈可變區(qū)和人輕鏈可變區(qū)的人單克隆抗體，所述人重鏈可變區(qū)包括FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4序列，所述人輕鏈可變區(qū)包括FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4序列，其中(a)人重鏈可變區(qū)CDR3序列選自SEQ ID NOs23，26，29，32，和35，及其保守性修飾；(b)人輕鏈可變區(qū)CDR3序列選自SEQ ID NOs38，41，44，47，和50，及其保守性修飾；(c)人抗體以10-8M或更小的KD結(jié)合人PSMA；和(d)在抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)測定中，人抗體介導(dǎo)PSMA+腫瘤細(xì)胞的溶胞作用。
2.權(quán)利要求1的分離的人抗體，其中人重鏈可變區(qū)CDR2序列選自SEQ ID NOs22，25，28，31，和34，及其保守性修飾；人輕鏈可變區(qū)CDR2序列選自SEQ ID NOs37，40，43，46，和49，及其保守性修飾。
3.權(quán)利要求1或2的分離的人抗體，其中人重鏈可變區(qū)CDR1序列選自SEQ ID NOs21，24，27，30，和33，及其保守性修飾；人輕鏈可變區(qū)CDR1序列選自SEQ ID NOs36，39，42，45，和48，及其保守性修飾。
4.權(quán)利要求1-3任一項的分離的人抗體，其以10-9M或更小的KD結(jié)合人PSMA。
5.權(quán)利要求1-4任一項的分離的人抗體，其中人重鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列從人重鏈VH5-51種系序列衍生。
6.權(quán)利要求1-5任一項的分離的人抗體，其中人輕鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列從人輕鏈L6或04/014種系序列衍生。
7.一種分離的包括人重鏈可變區(qū)和人輕鏈可變區(qū)的人單克隆抗體，其中(a)人重鏈可變區(qū)包括選自SEQ ID NOs11，12，13，14，15的氨基酸序列，和與SEQ ID NOs11，12，13，14，和15至少80％同源的序列；(b)人輕鏈可變區(qū)包括選自SEQ ID NOs16，17，18，19，20的氨基酸序列，和與SEQ ID NOs16，17，18，19，和20至少80％同源的序列；(c)人抗體以10-8M或更小的KD結(jié)合人PSMA；和(d)在抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)測定中，人抗體介導(dǎo)PSMA+腫瘤細(xì)胞的溶胞作用。
8.權(quán)利要求7的分離的人抗體，其中抗體以10-9M或更小的KD結(jié)合人PSMA。
9.一種分離的包括從人重鏈VH5-51種系序列(SEQ ID NO54)衍生的人重鏈可變區(qū)和從人輕鏈L6(SEQ ID NO55)或04/014(SEQ IDNO56)種系序列衍生的人輕鏈可變區(qū)的人單克隆抗體，其中(a)人重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO12的氨基酸序列，或者與SEQID NO12至少80％同源的序列；(b)人輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO17的氨基酸序列，或與SEQ IDNO17至少80％同源的序列；(c)人抗體以10-9M或更小的KD結(jié)合人PSMA；和(d)在抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)測定中，人抗體介導(dǎo)PSMA+腫瘤細(xì)胞的溶胞作用。
10.一種分離的人單克隆抗體，包括分別包括SEQ ID NO11和SEQ ID NO16給出的氨基酸序列的人重鏈和人輕鏈可變區(qū)。
11.一種分離的人單克隆抗體，包括分別包括SEQ ID N012和SEQ ID NO17給出的氨基酸序列的人重鏈和人輕鏈可變區(qū)。
12.一種分離的人單克隆抗體，包括分別包括SEQ ID NO13和SEQ ID NO18給出的氨基酸序列的人重鏈和人輕鏈可變區(qū)。
13.一種分離的人單克隆抗體，包括分別包括SEQ ID NO14和SEQ ID NO19給出的氨基酸序列的人重鏈和人輕鏈可變區(qū)。
14.一種分離的人單克隆抗體，包括分別包括SEQ ID N015和SEQ ID NO20給出的氨基酸序列的人重鏈和人輕鏈可變區(qū)。
15.一種分離的人單克隆抗體，其與前面權(quán)利要求任一項的人單克隆抗體競爭與PSMA的結(jié)合。
16.通過雜交瘤產(chǎn)生的前面權(quán)利要求任一項的分離的人單克隆抗體，其中從與無限增殖化細(xì)胞融合的、從具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物獲得的B細(xì)胞制備雜交瘤。
17.前面權(quán)利要求任一項的人抗體，其與選自膀胱，乳腺，結(jié)腸，腎，卵巢，前列腺，腎細(xì)胞，鱗狀細(xì)胞，肺(非小細(xì)胞)和頭頸腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞結(jié)合。
18.前面權(quán)利要求任一項的人抗體，包括人IgG重鏈和人κ輕鏈。
19.前面權(quán)利要求任一項的人抗體，包括IgG1或IgG3重鏈。
20.一種含有前面權(quán)利要求任一項的人抗體和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。
21.一種與治療劑連接的前面權(quán)利要求任一項的人抗體的免疫偶聯(lián)物。
22.權(quán)利要求21的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是一種細(xì)胞毒素。
23.權(quán)利要求21的免疫偶聯(lián)物，其中所述治療劑是放射性同位素。
24.一種含有權(quán)利要求21-23任一項的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。
25.一種分離的編碼前面權(quán)利要求任一項的人抗體的核酸分子。
26.權(quán)利要求25的分離的核酸分子，其中所述核酸分子被插入到表達(dá)載體中。
27.包括權(quán)利要求25或26的分離的核酸的轉(zhuǎn)染瘤。
28.一種表達(dá)前面權(quán)利要求任一項的人抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中轉(zhuǎn)基因非人動物具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的基因組。
29.一種抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞生長的方法，包括讓細(xì)胞接觸有效量的根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的抗體，使得細(xì)胞生長被抑制。
30.一種治療或預(yù)防特征在于表達(dá)PSMA的腫瘤細(xì)胞生長的疾病的方法，包括對受者施用有效治療或預(yù)防該疾病的量的前面權(quán)利要求任一項的人抗體。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述疾病是癌癥。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述癌癥選自前列腺癌，結(jié)腸癌和腎癌。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述癌癥是前列腺癌。
34.權(quán)利要求29的方法，其中所述人抗體與一種治療劑偶聯(lián)。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述治療劑是細(xì)胞毒素。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述治療劑是放射性同位素。
全文摘要
本發(fā)明公開了與PSMA結(jié)合的分離的人單克隆抗體，并且涉及相關(guān)的抗體為基礎(chǔ)的組合物和分子。通過V－D－J重組和同種型轉(zhuǎn)換在能產(chǎn)生人單克隆抗體的多種同種型的非人轉(zhuǎn)基因動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠中能產(chǎn)生所述人抗體。還公開了含有所述人抗體的藥物組合物，非人轉(zhuǎn)基因動物，和產(chǎn)生人抗體的雜交瘤，以及使用所述人抗體的治療和診斷方法。
文檔編號C12N15/09GK1652821SQ03807371
公開日2005年8月10日 申請日期2003年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月28日
發(fā)明者Y·M·德奧, R·格拉奇爾諾, D·哈森, E·H·霍爾梅斯, W·T·蒂諾, A·布拉克 申請人:米德列斯公司