專利名稱：纖連蛋白結(jié)合蛋白；單克隆抗體以及它們對(duì)防止細(xì)菌粘附的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的多肽和單克隆抗體，它們的制備以及在防止傷口、外科移植和其它內(nèi)置器械(如導(dǎo)管)部位的感染方面的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及編碼這個(gè)多肽的核酸的分離以及將編碼這個(gè)多肽的DNA轉(zhuǎn)化重組的宿主細(xì)胞。
與移植材料和內(nèi)置器械的臨床應(yīng)用相關(guān)的主要并發(fā)癥之一是細(xì)菌感染。特別是葡萄球菌經(jīng)常影響到與醫(yī)療裝置相關(guān)的感染(Dankertet al 1986，CRC Rev Biocompatability 2，219-301)。感染一旦發(fā)生實(shí)際上是不能治愈的而導(dǎo)致移植失敗。
有人曾經(jīng)提出微生物對(duì)表面的粘附是形成這類感染的最初步驟(Quie and Belani，1987，J.Infec.Dis 156543-547)，而且目前有證據(jù)表明外體感染的發(fā)病機(jī)理是一種特殊的粘附機(jī)制(Vaudaux，et al，1990，J.Biomat.Appl.5134-153)。內(nèi)置材料，如用于靜脈插管和假體移植的材料，在與血液接觸不久，便馬上被覆蓋一層細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(Cottanaro et al 1981，Transactiohs of the American Society for Artificial InternalOrgans 27391-395)，特別是該層包含血漿纖連蛋白，而且葡萄球菌被認(rèn)為能夠通過細(xì)菌細(xì)胞表面受體蛋白-纖連蛋白結(jié)合蛋白(Fbp)與纖連蛋白結(jié)合。然而，一些研究表明血液蛋白不促進(jìn)葡萄球菌對(duì)生物材料的粘附(eg.Muller et al 1991，Infect.Immun.593323-3326)，因此阻止了對(duì)這些細(xì)菌和這些蛋白相互作用的研究，而它有可能成為防止對(duì)生物材料粘附的手段。
纖連蛋白結(jié)合蛋白已從金黃色釀膿葡萄球菌中分離出來，繼而核苷酸順序也得到確定[Signas，C.et al，(1989)Proc.Nat.Acad.Sci 86，699-703，Jonsson，K.et al，(1991)Eur.J.Biochem.202，1041-1048](分別是FbpA和FbpB)。這個(gè)蛋白主要的纖連蛋白結(jié)合區(qū)已確定是一個(gè)同源單位(一般是38個(gè)氨基酸)重復(fù)三次(D1-D3區(qū)域)，部分重復(fù)第四次(D4區(qū)域)。
阻擋葡萄球菌對(duì)移植體粘附先試驗(yàn)了為阻擋蛋白的粘附而進(jìn)行的對(duì)假體材料表面的修飾，如覆蓋一層“無粘性”的材料(如PTFE)，或表面聯(lián)上抗生素(Kamal et al，1991，J.Amer.Med.Assoc.265，2364-2368)。
也有建議使用非甾類抗炎藥物來阻止葡萄球菌對(duì)醫(yī)療聚合物的粘附(Farber and Wolff 1992，J.Infect.Dis.166861-865)。
EP 0163623，EP 0294349，EP 0397633和WO92/02555公開了某些從金黃色釀膿葡萄球菌分離的纖連蛋白結(jié)合多肽。
本發(fā)明采用的一個(gè)方法是用一種結(jié)合在基質(zhì)結(jié)合蛋白如纖連蛋白結(jié)合蛋白的單克隆抗體，來阻斷細(xì)菌對(duì)基質(zhì)蛋白的粘附。
因此，本發(fā)明在一個(gè)廣義的方面是指一種單克隆抗體(Mab)的應(yīng)用，或者它的一個(gè)片段，它們與基質(zhì)結(jié)合蛋白的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇結(jié)合以防止細(xì)菌尤其是革蘭氏陽(yáng)性菌的粘附，也可與內(nèi)置設(shè)施或傷口的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合。本發(fā)明特別涉及這些用途的藥劑的制作。
單抗或其片段的作用是封閉與基質(zhì)蛋白的結(jié)合有關(guān)的基質(zhì)結(jié)合蛋白上的部件。
內(nèi)置設(shè)施包括外科移植、假體設(shè)備和導(dǎo)管即導(dǎo)入病人身體并在某個(gè)部位保留一段持續(xù)時(shí)間的裝置。這種裝置包括例如人工關(guān)節(jié)、心臟瓣膜、起搏器、血管移植、血管導(dǎo)管、腦脊髓液體分流器、尿?qū)Ч?、連續(xù)非臥床腹膜透析(CAPD)導(dǎo)管等。
本發(fā)明特別涉及單克隆抗體的應(yīng)用，它將阻止如金黃色釀膿葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌以及表皮葡萄球菌等葡萄球菌對(duì)這些內(nèi)置設(shè)施之粘附。因此，該單克隆抗體最好針對(duì)從這些細(xì)菌分離的基質(zhì)結(jié)合蛋白的抗原決定簇。
該單克隆抗體識(shí)別的基質(zhì)結(jié)合蛋白最好是纖連蛋白結(jié)合蛋白。已知纖連蛋白結(jié)合蛋白中D1-D4區(qū)域尤其適于與纖連蛋白結(jié)合(Signas.C.et al.1989 op.cit)。
因此，在優(yōu)選的實(shí)施例中單克隆抗體對(duì)應(yīng)纖連蛋白結(jié)合蛋白D1-D4結(jié)構(gòu)域上的某抗原決定簇或它的某一組成單元。
上述新的單克隆抗體以及它們的片段構(gòu)成發(fā)明的另一方面。
抗體可以是分子量約為150,000的完整抗體或一個(gè)它的衍生物，比如象Skerra，A.and Pluckthun，A(1988)Science 240 1038-1040.所述的Fab片段或Fv片段。如果存在兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)域，每個(gè)區(qū)域可對(duì)應(yīng)不同的抗原決定簇——稱作“雙特異”抗體。
該抗體或其衍生物可由常規(guī)方法制得，如通過已建立的單抗技術(shù)(Kohler，G.and Milstein，C.(1975)，Nature，256，495-497)或用重組方法如建立文庫(kù)(Huse，W.D.et al.，(1989)Science246，1275-1281)。
優(yōu)選該抗體或其衍生物通過在一個(gè)合適的表達(dá)系統(tǒng)編碼目的抗體的DNA多聚體的表達(dá)制得。表達(dá)系統(tǒng)的載體選擇一部分由宿主決定，宿主可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌(最好是B株)sp.鏈霉菌或者真核細(xì)胞，如小鼠C127、小鼠骨髓瘤、人Hela細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、絲狀或單細(xì)胞霉菌或昆蟲細(xì)胞。宿主也可以是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物[如Hiatt，A et al，(1989)Nature 34，76-78所述]。合適的載體包括質(zhì)粒、噬菌體、裝配型質(zhì)粒以及如從桿狀病毒和牛痘中分離來的重組病毒。
Fab片段也可以通過酶處理從其母體單抗得到，例如用香本瓜酶從Fc部分切割Fab部分。
單抗最初可利用纖連蛋白結(jié)合蛋白或其D1-D4區(qū)域作免疫原得到。
金黃色釀膿葡萄球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白已知存在于至少兩個(gè)變異株Fbp A和Fbp B中[Jonsson et al，(1991)，op.cit.]。
上述纖連蛋白結(jié)合蛋白任一種的結(jié)合區(qū)域都可用作免疫原來產(chǎn)生本發(fā)明的一種Mab。
我們相信我們已確證金黃色釀膿葡萄球菌J2385的一種新纖連蛋白結(jié)合蛋白是一個(gè)新化合物(特見實(shí)施例2)。
特別是我們已經(jīng)分離到一種新化合物，一種基本包含金黃色釀膿葡萄球菌J2385 Fbp的D1-D4區(qū)域的多肽。
金黃色釀膿葡萄球菌J2385已存放在National Collection ofIndustrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，阿伯丁，蘇格蘭，號(hào)碼為NCIMB 40532，日期為1992年12月18日。
D1-D4區(qū)域具有列于下面表2的氨基酸順序。
這種新的Fbp和D1-D4多肽以及它們抗原性或免疫學(xué)上等同的衍生物形成本發(fā)明的一個(gè)更深入的方面。
在此使用的術(shù)語“抗原上等同的衍生物”包含一種肽或其等價(jià)物，它們能特異地被某種抗體識(shí)別，依據(jù)本發(fā)明當(dāng)抗體聚集多肽時(shí)，可阻止葡萄球菌對(duì)內(nèi)置醫(yī)療設(shè)施的粘附。
在此使用的術(shù)語“免疫學(xué)上等同的衍生物”包含一種肽或其等價(jià)物，當(dāng)它們被用于一種合適的組合在某種脊椎動(dòng)物中產(chǎn)生抗體，則該抗體起到阻止葡萄球菌對(duì)內(nèi)置醫(yī)療設(shè)施的粘附。
特別地，比本發(fā)明肽鏈稍長(zhǎng)或稍短的衍生物也可以使用。除此之外，在肽鏈合成前或后一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被修飾也可使用。這些肽可以通過如取代、加成、或氨基酸重排或它的化學(xué)修飾來制備。所有這些取代和修飾作用基本上被肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知。
D1-D4多肽可以通過質(zhì)粒pBROC520在大腸桿菌中的表達(dá)得到。這種質(zhì)粒的制備以及D1-D4多肽的表達(dá)和純化在下面的實(shí)施例中描述。
編碼此多肽的DNA是本發(fā)明的另一方面。核苷酸順序在下面表1中列出。
其它D1-D4多肽，如FbpA和FbpB的D1-D4多肽能類似地通過從染色體DNA得到合適質(zhì)粒的類似物而得到表達(dá)。
編碼FbpA D1-D4多肽的DNA見下面表1。
該D1-D4多肽或某種抗原性或免疫學(xué)上等同的多肽或它的某種融合蛋白作為一種抗原用于免疫小鼠、或如大鼠、雞的其它動(dòng)物。融合蛋白提供對(duì)多肽的穩(wěn)定性?？乖赏ㄟ^如結(jié)合與某種免疫原載體蛋白，如牛血清清蛋白(BSA)或鎖眼帽貝血藍(lán)蛋白(KLH)結(jié)合。或者由多拷貝的D1-D4多肽或其抗原性或免疫學(xué)上等同的多肽組成的某種多抗原肽也可有足夠的抗原性來改善免疫原作用以排除載體的使用。
用Kohler和Milstein(1975Nature256，495-497)的方法，被免疫哺乳動(dòng)物中的含有抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
該雜交瘤經(jīng)過篩選，選擇一種與其它葡萄球菌屬有高結(jié)合親合力和較好交叉反應(yīng)的細(xì)胞株，用一種或多種原始Fbp、D1-D4多肽和/或融合蛋白來篩選。選好的細(xì)胞株被培養(yǎng)來得到需要的Mab。
分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株是本發(fā)明的另一方面。
此外，噬菌體顯示技術(shù)也能用來選擇具有對(duì)Fbp或D1-D4結(jié)合活性的抗體基因，它可從已篩選具有抗Fbp的人淋巴細(xì)胞經(jīng)PCR擴(kuò)增的全部v-基因或原文庫(kù)中選擇(McCafferty，J.et al.，(1990)，Nature348，552-554；Marks，J.et al，(1992)Biotechnology10，779-783)。這些抗體的親合性也能通過鏈混合提高(Clackson，T.et al，(1991)Nature 352，624-628)。
抗體或其衍生物最好經(jīng)修飾，在病人體內(nèi)具較小免疫原性。例如，假如病人是人，抗體最好是“人性化”的；在此，雜交瘤產(chǎn)生的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)移植到人的單克隆抗體中，實(shí)例見Jones，P.et al(1986)，Nature 321，522-525或Tempest et al.，(1991)，Biotechnology 9，266-273。
修飾不必限于一種“人性化”，也可用其它的靈長(zhǎng)目動(dòng)物序列(實(shí)例見Newman，R.et al.1992，Biotechnology，10，1455-1460)。
抗體應(yīng)該再次篩選，以對(duì)Fbp，D1-D4多肽和/或融合蛋白具高親合力。
如上所述，要制備最終抗體的一個(gè)片段。
人化單克隆抗體或它的具有結(jié)合活性的片段形成本發(fā)明的另一方面。
在另一更廣的方面，本發(fā)明提供了從金黃色釀膿葡萄球菌Fbp中分離D1-D4多肽和它在防止細(xì)菌尤其是革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)內(nèi)置設(shè)施或傷口的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的粘附。本發(fā)明進(jìn)一步涉及此用途藥劑的制作。
特別地，革蘭氏陽(yáng)性菌包括葡萄球菌如金黃色釀膿葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌如表皮葡萄球菌。
分離的D1-D4多肽是指一種序列上包含整個(gè)D1、D2、D3和D4區(qū)任選在PIVP終止并且從金黃色釀膿葡萄球菌Fbp的1-5壁區(qū)(WR)中任選的多肽。
依宿主表達(dá)系統(tǒng)，多肽可包含一個(gè)N-末端蛋氨酸殘基。
對(duì)應(yīng)下列FbpA區(qū)的上述區(qū)域在Signas et al.(1989)，op.cit.描述D1 G709-H746 WR1 P843-T856D2 G747-H784 WR2 P857-T870D3 G785-S823 WR3 P871-T884D4 G824-P838 WR4 P885-K898WR5 P899-K912最好的情況下，多肽包含最多三個(gè)壁區(qū)。優(yōu)選實(shí)施例包括對(duì)應(yīng)金黃色釀膿葡萄球菌FbpA G709到T886和G709到P838(P838→T任選)的殘基。Fbp優(yōu)選自金黃色釀膿葡萄球菌J2385具有表2所給序列。
本發(fā)明也提供編碼多肽的分離的核酸分子，包括mRNAs，DNAs和cDNAs。
本發(fā)明還提供重組載體，如在多肽的重組生產(chǎn)和包含新核酸序列的原核和/或真核細(xì)胞重組中有用的克隆和表達(dá)質(zhì)粒。
本發(fā)明還提供包含編碼多肽的一種核酸分子的轉(zhuǎn)移基因非人的動(dòng)物。
“復(fù)制子”是任何遺傳元件(如質(zhì)粒、染色體、病毒)，其功能為體內(nèi)DNA復(fù)制的獨(dú)立單位；即能夠自主復(fù)制。
“載體”是一個(gè)復(fù)制子，如質(zhì)粒、噬菌體或裝配型質(zhì)粒，另一個(gè)DNA片段可以連接到它上面從而使連接片段得到復(fù)制。
“雙鏈DNA分子”指脫氧核苷酸(堿基為腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)在一種雙鏈螺旋(松馳和超螺旋)的聚合形式。這個(gè)術(shù)語只指分子的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，并不限制其特殊的三級(jí)形式。因此，這個(gè)術(shù)語包括發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA，特別在線性DNA分子(如限制性片段)、病毒、質(zhì)粒和染色體。在討論尤其是雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)中，這里描述的序列依據(jù)通常慣例只給沿DNA非轉(zhuǎn)錄鏈5′到3′方向的序列(即具有該序列的鏈與mRNA同源)。
某種蛋白的DNA“編碼序列”或“編碼核苷酸序列”是當(dāng)置于適宜的調(diào)節(jié)序列控制下能轉(zhuǎn)錄和翻譯成某多肽的DNA序列。
“啟動(dòng)子序列”是一個(gè)在細(xì)胞中能結(jié)合RNA聚合酶并啟動(dòng)下游編碼序列(3′方向)轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。為了限定本發(fā)明，啟動(dòng)子序列通過編碼序列的翻譯起始密碼子(如ATG)連在3′末端并向上游(5′方向)延伸，包含在高于背景的可檢測(cè)水平上啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所必需的最小數(shù)量的堿基或元件。在啟動(dòng)子序列中將發(fā)現(xiàn)一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)部位(用核酸酶S1可方便地確認(rèn))和結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合區(qū)域(交感序列)。真核細(xì)胞的啟動(dòng)子通常但不總是包含“TATA”盒和“CAT”盒。原核細(xì)胞的啟動(dòng)子除10和-35交感序列外包含Shine-Dalgarno序列。
DNA“控制序列”總指啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合部位、多聚腺苷化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)控區(qū)、增強(qiáng)因子和其它在宿主細(xì)胞中為表達(dá)(即轉(zhuǎn)錄和翻譯)某編碼序列所需的類似成份。
控制序列在細(xì)胞中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)，這時(shí)RNA聚合酶與啟動(dòng)子序列結(jié)合并將編碼序列轉(zhuǎn)錄到mRNA，然后翻譯成編碼序列的多肽。
“宿主細(xì)胞”是一種已被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或者能被外源DNA序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
當(dāng)某種外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜時(shí)，該細(xì)胞便被該外源DNA“轉(zhuǎn)化”。外源DNA可以或也許不整合到染色體DNA上構(gòu)成細(xì)胞的基因組。例如在原核細(xì)胞和酵母中，該外源DNA可以保留在一個(gè)附加元件中，如質(zhì)粒。而對(duì)真核細(xì)胞，一個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞其外源DNA已整合到染色體中，這樣通過染色體復(fù)制將其遺傳到子代細(xì)胞。這種穩(wěn)定性通過真核細(xì)胞建立包含帶有外源DNA的子細(xì)胞群的細(xì)胞株或克隆的能力得到證明。
“克隆”是從單個(gè)細(xì)胞或有絲分裂的共同祖先得到細(xì)胞群?！凹?xì)胞株”是能在體外穩(wěn)定生長(zhǎng)數(shù)代的原代細(xì)胞的克隆。
DNA構(gòu)成物的“異源”區(qū)是一個(gè)DNA的可辨別片段，它包含于或連在另一個(gè)DNA分子中實(shí)際上出現(xiàn)沒連在其它分子上。
本發(fā)明提供編碼多肽的核酸分子。分離的核酸尤其是DNAs能通過將DNA有效地連接到基因表達(dá)所需的表達(dá)控制區(qū)(如調(diào)節(jié)區(qū))，而導(dǎo)入表達(dá)載體。載體可通過本領(lǐng)域所知的方法(Ausubel et.al，supra)導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，如原核細(xì)胞(如細(xì)菌)或真核細(xì)胞(如酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物)。已制備或分離的目的蛋白的編碼序列能被克隆入一個(gè)合適的載體或復(fù)制子。許多克隆載體已被本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知，合適克隆載體選擇只是一個(gè)選擇的問題。用于克隆的重組DNA載體以及可轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的實(shí)例包括噬菌體入(大腸桿菌)，pBR322(大腸桿菌)，pACYC177(大腸桿菌)，pKT230(革蘭氏陰性菌)，pGV1106(革蘭氏陰性菌)，pLAFR1(革蘭氏陰性菌)，pME290(非大腸桿菌的革蘭氏陰性菌)，pHV14(大腸桿菌和枯草桿菌)，pBD9(桿菌)，pIJ61(鏈霉菌)，pUC6(鏈霉菌)，YIp5(酵母)，一個(gè)桿狀病毒昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)，YCp19(酵母)?？傄姟癉NACloningVols.I&II，Glover et.al.ed.IRL Press Oxford(1985)(1987)和；T.Maniatis et al.(“Molecular Clonig”Cold Spring Harbor Laboratory(1982)。
基因可位于啟動(dòng)子的控制、核糖體結(jié)合部位(細(xì)菌表達(dá))及任意操縱子(在此總指控制元件)之下，以便編碼目的蛋白的DNA序列在被含有此表達(dá)結(jié)構(gòu)的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為RNA。編碼序列可含有或不含有一信號(hào)肽或先導(dǎo)序列。本發(fā)明的多肽可用如大腸桿菌tac啟動(dòng)子或蛋白A基因(spa)啟動(dòng)子和信號(hào)序列表達(dá)。先導(dǎo)序列在宿主翻譯過程中能被細(xì)菌宿主移去。見如U.S.Patent Nos.4,431,739；4,425,437；4,338,397。
除控制序列外，最好加上調(diào)節(jié)序列，它利于調(diào)節(jié)有關(guān)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)序列的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，例如包括對(duì)化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)的反應(yīng)使某基因的表達(dá)開啟或關(guān)閉。載體中還可存在其它類型的調(diào)節(jié)元件，如增強(qiáng)子序列。
構(gòu)建表達(dá)載體使特殊編碼序列與合適的調(diào)節(jié)序列位于載體中，相對(duì)于控制序列的編碼序列的位置和方向應(yīng)為編碼序列在控制序列的“控制”下轉(zhuǎn)錄(即在控制序列與DNA分子結(jié)合的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄編碼序列)。編碼序列的修飾對(duì)獲得此目的是需要的。例如，在某些情況下也許有必要修飾該序列使它以合適的方向與控制序列相連接，即保持閱讀框架?？刂菩蛄泻推渌{(diào)節(jié)序列在插入某載體前可連接到編碼序列上，克隆載體如上所述?；蛘呔幋a序列直接克隆到已含有控制序列和合適限定部位的表達(dá)載體上。
在某些情況下，最好加入使多肽從宿主體中分泌出來的序列，并隨后切掉分泌信號(hào)。
一些原核表達(dá)載體在本領(lǐng)域已知。見，如U.S.Patent Nos.4,578,355；4,440,859；4,436,815；4,431,740；4,431,739；4,428,941；4,425,437；4,41 8,1 49；4,411,994；4,366,246；4,342,832；see also U.K.Patent Appl ications GB2,121,054；GB 2,008,123；GB 2,007,675；and EuropeanPatent Application103,395。酵母表達(dá)載體也在本領(lǐng)域已知，見如U.S.Patent Nos.4,446,235；4,443,539；4,430,428；see also European Patent Applications 103,409；100,561；96,491。pSV2neo(見J.Mol.Appl.Genet 1327-341)用SV40后啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)或pCDNA 1neo，從pCDNA1(Mol.Cell.Biol.74125-29)分離的載體，用CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。后面兩種載體都可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中暫時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)(用G418抗性)。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，如果蠅也有用，見PCT applications WO90/06358和WO92/06212和EP application EP0290261 。
依賴于所選宿主和表達(dá)系統(tǒng)，本發(fā)明的多肽可通過上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)的宿主細(xì)胞在目的多肽表達(dá)的條件下制得，該多肽然后從宿主細(xì)胞中分離出來并純化。如果表達(dá)系統(tǒng)將多肽分泌到培養(yǎng)基中，則多肽可直接從培養(yǎng)基中純化。如果多肽不被分泌，則從細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中分離或從細(xì)胞膜成分中回收。合適生長(zhǎng)條件的選擇和回收方法見本工藝技術(shù)。
本發(fā)明的另一方面是包含上述D1-D4多肽或Mab、活性片段及藥物可接受載體的藥物組成。
在治療和預(yù)防劑中，D1-D4多肽或Mab或片段可作為可注射成分給病人使用，如滅菌水溶性分散，最好等滲。
或者該成分配制來局部使用，如軟膏、乳劑、乳液、眼用軟膏、滴眼液、滴耳液、漱口、浸漬敷料、縫線和煙霧劑，還可含有合適的常規(guī)添加劑，包括如防腐劑、幫助藥物滲透的溶劑、軟膏和乳劑中的潤(rùn)滑劑。這些局部配方還可含有適合的常規(guī)載體，如乳劑或軟膏主劑，乳液里的乙醇或油醇。這些載體可占配方重量的1％到98％；最常見的是最多占到配方重量的約80％。
本發(fā)明的成分可通過注射給藥在放入內(nèi)置設(shè)施之前基本抵御相應(yīng)的細(xì)菌。手術(shù)后在裝置存留體內(nèi)的時(shí)間里可持續(xù)用藥。此外，該成分還可用于外科技術(shù)的擴(kuò)大手術(shù)前后的覆蓋物以防止葡萄球菌對(duì)傷口感染。
許多矯形外科醫(yī)生考慮到裝有假關(guān)節(jié)的病人在治牙前應(yīng)考慮到抗生素預(yù)防，否則會(huì)產(chǎn)生菌血癥。晚期深度感染是一種嚴(yán)重的并發(fā)癥有時(shí)導(dǎo)致失去假關(guān)節(jié)，而且常伴有嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率。在這種情形下，有可能擴(kuò)展D1-D4多肽或某種治療的單抗的應(yīng)用作為預(yù)防抗生素的替代品。
病人服用時(shí)，活性成分的每日劑量水平可從0.01到10mg/kg，局部大約1mg/kg。在任何情況下，醫(yī)生應(yīng)使實(shí)際劑量對(duì)每個(gè)病人是最合適的，并因病人的年齡、體重和特殊性而異。上述劑量是一般情況下的范例。當(dāng)然個(gè)別情況下的較高或較低劑量范圍是允許的，這點(diǎn)也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在所示劑量范圍下，沒觀察到本發(fā)明的化合物的相反毒副作用，那將妨礙對(duì)適宜病人的用藥。
除上述的治療外，本發(fā)明的組成可一般用于傷口處理劑以防止細(xì)菌對(duì)暴露在傷口組織的基質(zhì)蛋白，尤其是纖連蛋白的粘附，而且在治療牙齒時(shí)替代或與預(yù)防抗生素并用起預(yù)防作用。另外，本發(fā)明的組成可在插入前不久用來浸洗內(nèi)置裝置。浸洗傷口或內(nèi)置裝置時(shí)，活性劑優(yōu)選濃度為1μg/ml到10mg/ml。
上述Mabs或片段也可作為診斷試劑，用來檢測(cè)含有Fbp的細(xì)菌、Fbp本身、Fbp的D1-D4多肽的存在。
雖然本發(fā)明的單克隆抗體方面在用Fbp的D1-D4多肽產(chǎn)生抗體上已基本闡述，當(dāng)然Fbp本身在起始免疫計(jì)劃中也可用作抗原。
下列實(shí)施例解釋用作抗原和抗粘附劑的D1-D4多肽的制備。實(shí)施例用于制備、分離和分析D1-D4多肽以及歸屬實(shí)施例的主要試劑a)pBROC413載體的構(gòu)建pT7-7質(zhì)粒[Tabor，S(1990)，Current Protocols inMolecular Biology，F(xiàn).A.Ausubel，Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith，and K.Struhl，eds.]pp.16.2.1-16.2.11.Greene Publ ishing and Wiley-Interscience，New York.]含有相應(yīng)pBR322的2065-4362核苷酸的DNA并如pBR322那樣能在第三種質(zhì)粒ColK存在下通過連接質(zhì)粒被誘動(dòng)。ColK編碼的誘動(dòng)蛋白作用于nic位點(diǎn)的pBR322第2254核苷酸從這一點(diǎn)起始動(dòng)用。pT7-7經(jīng)LspI和BglII消化并用DNA聚合酶I的Klenow片段補(bǔ)上5′突出端。質(zhì)粒DNA片段用瓊脂糖凝膠電泳純化，平端相連接用Bio-Rad Gene Pulset并接制造商推薦條件通過電穿孔轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH1中。得到的pBROC413(

圖1)通過質(zhì)粒DNA的限制性酶分析鑒定。
pBROC413中從φ10啟動(dòng)子上游的Lsp I位點(diǎn)到pT7-7第434核苷酸的BglII位點(diǎn)的缺失，缺失了相應(yīng)于pBR322第2065-2297核苷酸的DNA。nic位點(diǎn)及相鄰序列被缺失，因此使pBROC41 3不能誘動(dòng)。b)生物素化纖連蛋白探針的制備纖連蛋白(FN)在Gelatin Sepharose上從人血漿成分(Dr.D.Pepper，Scottish Blood Transfusion Service贈(zèng)送)中純化，基本上按Miekka et al(1982)Thromb.Res.27，1-14所述。11.2mg FN(2.0ml)溶于0.05M Tris/0.1M NaCl pH7.5加入9.2ml0.05M Na2B4O7pH8.6緩沖液制成1.0mg/ml。加入在干燥二甲基甲酰胺中濃度為5.0mg/ml的N-羥基丁二酰亞胺生物素(AmershamUK)80μl，該混和物室溫下孵育并攪拌1小時(shí)。反應(yīng)通過將緩沖液換成含有0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的Dulbecco′s“A”磷酸鹽緩沖液，用5個(gè)Sephadex G25柱(PD10，Pharmacia)終止。c)纖連蛋白Sepharose CL4B的合成上述純化的100mg人纖連蛋白在室溫下依制造商建議，加入7g溴化氰活化的Sepharose CL4B(Pharmacia)，得到25ml基質(zhì)膠。FN-Sepharose使用前用下面純化中使用的所有緩沖液沖洗。實(shí)施例中氨基酸殘基的編號(hào)在下列實(shí)施例中氨基酸殘基的編號(hào)依照Sigmas et.al(1989)op.cit相應(yīng)于FbpA的殘基。FbpA709-838殘基對(duì)應(yīng)于表2中所列的金黃色釀膿葡萄球菌J2385序列的1-130殘基，F(xiàn)bpA709-886殘基對(duì)應(yīng)于1-174殘基。實(shí)施例1從金黃色釀膿葡萄球菌J2385分離編碼纖連蛋白結(jié)合蛋白的纖連蛋白結(jié)合區(qū)的DNAS.aureus J2385是Cookson et.alTHELANCET ofAugust 15th，page387所述的B株。它是從一種皮膚損傷中分離到的臨床株。染色體DNA的制備是通過將細(xì)胞在培養(yǎng)基中過夜振搖收集后用溶葡球菌酶裂解并用酚/氯仿除去細(xì)胞蛋白。從這種未純化的DNA制品中，編碼纖連蛋白結(jié)合蛋白的纖連蛋白結(jié)合區(qū)的DNA片段用PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得。PCR反應(yīng)中使用的寡核苷酸引物是FIB15’-GGGAATTCATATGGGCCAAAATAGCGGTAACCAGTC-3′FIB25’-GCGGATCCTTACGTTGGTGGCACGATTGGAGGTG-3′PCR擴(kuò)增使用S.aureus J2385染色體DNA(10ng)，F(xiàn)IB1(1micrcmolar)，F(xiàn)IB2(1micromolar)，Tris-HCl pH8.3(10mM)，KCl(50mM)，MgCl2(1.5mN)，明膠(0.001％)，NadGTP(200micromolar)，NadATP(200micromolar)，NadTTP(200micromolar)，NadCTP(200micromolar)及Taq DNA聚合酶(2.5units)用蒸餾水定容至100microlitres。該水溶液用80microlitres液體石蠟封面，進(jìn)行94℃(1min)、60℃(1min)、72℃(2min)循環(huán)30次以使擴(kuò)增進(jìn)行。擴(kuò)增后當(dāng)10microlitres反應(yīng)水溶液通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙錠0.5micrograms/ml)檢測(cè)時(shí)，通過與已知大小的DNA片段樣品比較出現(xiàn)得到一種大約500堿基對(duì)的DNA片段。實(shí)施例2用FIB1和FIB2引物通過PCR擴(kuò)增S.aureus J2385染色體DNA得到的DNA片段的序列的獲得實(shí)施例1所述的條件下獲得的PCR片段的大小(約500bp)并非如引物FIB1和FIB2預(yù)期設(shè)計(jì)的與S.aureus纖連蛋白結(jié)合蛋白基因(如Signas C.，et al.P.N.A.S.USA Vol86，699-703所述)各位點(diǎn)同源，據(jù)報(bào)道存在大約400bp的區(qū)別。為了鑒定DNA片段的實(shí)質(zhì)，該片段克隆入pUC19并測(cè)序。從一個(gè)PCR反應(yīng)中得到的DNA與EcoRI和BamHI限制性酶溫育并克隆到相似處理的pUC19中(Yanisch-Perron，C.et al(1985)Gene，33，103)并測(cè)序產(chǎn)生pBROC519a。因?yàn)镻CR過程有時(shí)在擴(kuò)增的DNA中有缺失和堿基替換，J2385 DNA的類似克隆被保留與pBROC 519a一起測(cè)序，以證明結(jié)果。pBROC519a用從United States Biochemical得到的SEQUENASE II kit將兩條鏈進(jìn)行了測(cè)序。得到的序列顯示編碼S.aureus J2385 DNA 524bp的克隆片段。該序列與Signas et.al(loc.cit.)公布的相比較時(shí)，很明顯它與S.aureus基因的2350-2885區(qū)很大同源，但具有主要區(qū)別(見表1)。特別地，推知的氨基酸順序與公布的序列在殘基752(ASN→ASP)、803(SER→ASN)、821(LYS→GLN)、825(GLN→HIS)表現(xiàn)出氨基酸差異，并有4個(gè)氨基酸缺失(838→841)，見表2。這些差異通過對(duì)單獨(dú)克隆的PCR擴(kuò)增DNA進(jìn)行測(cè)序而證實(shí)。當(dāng)推知的S.aureus J2385 DNA的氨基酸順序與S.aureus纖連蛋白結(jié)合蛋白的A型蛋白(Signas et al(1989)和B型蛋白(Jonsson et al.(1991)EUR.J.BIOCHEM.vol202pages1041-1048)的相應(yīng)區(qū)域比較時(shí)，很清楚S.aureus J2385蛋白的纖連蛋白結(jié)合區(qū)與A型和B型蛋白各自的區(qū)域十分相似，但與兩者均不相同(表2)。這便提示S.aureus J2385蛋白應(yīng)表示為C型。實(shí)施例3大腸桿菌BL21(DE3)中pBROC520的制備為了表達(dá)由S.aureus J2385 DNA編碼的蛋白片段，使用如Tabor.S.所述的T7聚合酶/啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)(see CurrentProtocols in Molecular Biology[F.A.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith and K.Struhl，eds.]pp.16.2.1-16.2.11.Greene Publishingand Wiley-Interscience，New York)。宿主是可誘導(dǎo)表達(dá)T7聚合酶基因的大腸桿菌BL21(DE3)(見Studier F.W.and MoffatB.A.J.Mol.Biol.vol.189，113-130)。
通過限制性酶切和低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳，從pBROC519a(3microgrammes)中分離到S.aureus J2385來源DNA的0.5Kb BamHI/NdeI片段。它(100nanogrammes)再用來與BamHI/NdeI切的pBROC413DNA(500nanogrammes)進(jìn)行連接反應(yīng)。連接的DNA電轉(zhuǎn)染入E.coli Delta M15(see Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.andManiatis，T.editorsMolecular Cloning，A LaboratoryManual(second edition)page 2.57for details of the lacZDelta M15 mutation)，轉(zhuǎn)化株在含有氨芐青霉素(50microgrammes/ml)的LB瓊脂上篩選。
從五個(gè)氨芐抗性克隆中制備質(zhì)粒DNA，并通過限制性酶切圖譜顯示均為含有S.aureus來源DNA片段的pBROC413。一種質(zhì)粒制品(指明pBROC520)用于轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)以給出期望的表達(dá)構(gòu)建/宿主組合。pBROC520編碼SEQ ID NO6給出的肽，此后指D1-D4(709-886)。實(shí)施例4 pBROC520在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)的J2385D1-D4(709-886)多肽的表達(dá)、分離和純化a)表達(dá)載有pBROC413(非編碼)質(zhì)?；騪BROC520(編碼D1-D4(709-886))的E.coli BL21(DE3)單克隆接種到含有下列成分的帶蓋容器(universals)中。10ml NZCYM培養(yǎng)基(1％(w/v)Bactotryptone，0.5％(w/v)Baeto yeast extract，0.5％(w/v)NaCl，0.1％(w/v)酪蛋白水解物和0.2％(w/v)MgSO4·7H2O pH7.0)和75μg/ml氨芐。培養(yǎng)液在37℃、230rpm保溫過夜。過夜培養(yǎng)液再接種到250ml NZCYM培養(yǎng)基中(含150μg/ml氨芐)。該培養(yǎng)液在37℃ 230rpm保溫至A600達(dá)0.5吸收單位。然后將培養(yǎng)液用1mM IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)并在相同條件下再保溫4小時(shí)。取出誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后1、2、3、4小時(shí)的樣品各1ml。每份樣品在eppendorf管中離心1分鐘，去除上清。沉淀再懸于100μl還原緩沖液中(50mM Tris.HCl pH6.8，100mM二硫蘇糖醇(DTT)，0.1％(w/v)溴酚蘭，2％(w/v)SDS，10％(w/v)甘油)或非-還原液中(省去DTT)。樣品在90℃加熱3mins然后貯存于-40℃。b)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)含有pBROC413(非編碼質(zhì)粒)或pBROC520(編碼D1-D4(709-886))的E.coli重懸樣品在含有4-20％聚丙烯酰胺的十二烷基硫酸鈉凝膠中分離(Novex British Biotechnology Ltd.)，基本如制造商所述。分離的蛋白用Sartoblot II印跡裝置依制造商說明轉(zhuǎn)移到Immobilon(Millipore(UK)Ltd.)上。印跡中未反應(yīng)的部位通過在10mM NaH2PO4/0.15M NaCl/0.02％(w/v)Ficoll/0.02％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮/0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)pH7.4中室溫不斷攪拌保溫1小時(shí)來封閉。印跡用生物素化的纖連蛋白200μg/ml作探針，緩沖液為0.02M NaH2PO4/0.3M NaCl/0.5％(w/v)Tneen80/1.0％(w/v)BSA pH7.4，于室溫不斷攪動(dòng)反應(yīng)4小時(shí)。使用Streptavidin Gold/Silver染色系統(tǒng)(AmershamUK)依制造商說明進(jìn)行顯帶。稱為D1-D4(709-886)多肽在pBROC520泳道中證明是一條新帶。c)增溶的D1-D4(709-886)的分離基本上按a)中所述制備E.coli BL21(DE3(pBROC520))的凍存細(xì)胞沉淀，并使用3h的誘導(dǎo)階段然后在4℃2h凍融并懸于50mM Tris/50mM NaCl/1mM EDTA/0.1mM PMSF pH8.0(30ml)。懸液轉(zhuǎn)至一個(gè)100ml玻璃燒杯中超聲破碎(加熱系統(tǒng)-UltrasonicsW380；70Watts，50×50％pulse，脈沖時(shí)間＝5秒)。超聲后馬上離心(6000g/4℃。/10min)棄沉淀。含有增溶的D1-D4(709-886)的上清調(diào)至pH7.4，-40℃保存。d)D1-D4(709-886)產(chǎn)品的純化(i)上述制備的D1-D4(709-886)上清上樣至用Dulbecco′s“A”磷酸鹽緩沖液(PBS)/0.4M NaCl/0.1mM PMSF平衡的FN-Sepharose柱(1.6×13.2cm)。D1-D4(709-886)用PBS/2M胍·HCl從柱中洗脫，然后使用濾過分子量為10,000的膜(Amicon)超濾濃縮至4.0ml。此D1-D4貯留液用2根Sephadex G25柱(PD10，Pharmacia)將緩沖液換為PBS配入產(chǎn)品中。通過RP-HPLC和SDS PAGE鑒定純度為1.5mg＞90％，得到D1-D4(709-886)產(chǎn)品；通過N-末端測(cè)序和Western blotting(用生物素化的纖連蛋白作探針)證實(shí)該材料為D1-D4(709-886)。這種分離純化的多肽用電子噴射質(zhì)子光譜測(cè)得分子量為19,970。理論分子量為19,969。SDS PAGE的分子量分析顯示D1-D4(709-886)多肽具有與大約35000(非還原)或40,000(還原)的蛋白相應(yīng)的遷移率這里使用的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)是Low Molecular Weight kit(pharmacia)。(ii)還建立了另一種純化方法基本按實(shí)施例4c所述制備的D1-D4(709-886)1∶1稀釋于0.1M NaH2PO4pH7.6(最終pH調(diào)至7.6)并上樣于已由0.1MNaH2PO4pH7.6平衡好的Q Sepharose(Pharmacia)柱(i.d.7.8cm；h，5cm)。 D1-D4(709-886)吸收到柱中并用0.1MNaH2PO4/0.5M NaCl pH7.6洗脫。然后用濾過分子量為10,000的膜(Amicon)進(jìn)行超濾濃縮至30ml。到這一步D1-D4(709-886)純度約為50％。該D1-D4(709-886)貯留液用一根SephadexG25(Pharmacia)柱(id2.6cm，h21cm)換成50mM甲酸緩沖液，共得40ml產(chǎn)物。D1-D4(709-886)產(chǎn)物進(jìn)一步通過走4次反相HPLC進(jìn)行純化。因而，10ml D1-D4(709-886)上樣到用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡的Aquapore C4柱(AppliedBiosystems)(id1cm，h10cm)D1-D4(709-886)從柱上用0.085％TFA/70％丙腈、0到100％線性梯度、大約4-5個(gè)柱體積的緩沖液洗脫。重復(fù)四次流程得到的含D1-D4(709-886)組分收集起來象上面超濾濃縮至30ml。該D1-D4(709-886)貯留液換成50mM甲酸緩沖液(如上)并冷凍干燥后配入終產(chǎn)品。
用反相HPLC分析柱和SDS PAGE測(cè)得純度50mg≥95％，得到了D1-D4(709-886)；該材料通過N-末端測(cè)序和Westernblotting(探針為生物素化的纖連蛋白)證實(shí)為D1-D4(709-886)。當(dāng)再溶到水或50mM甲酸中時(shí)，冷凍干燥的D1-D4(709-886)產(chǎn)品的溶解度為35-40mg/ml。(iii)建立另一個(gè)替換C4反相步驟的純化方法如(ii)所述從Q Sepharose柱上洗脫下來的D1-D4(709-886)(48ml)與4M(NH4)2SO4(16ml)混和，上樣到用1.0M(NH4)2SO4/0.1M NaH2PO4pH7.0(Buffer A)平衡的Toyopcarl Butyl柱(TosoHaas)。該柱用大約三倍床體積的BufferA沖洗。被基質(zhì)吸附的D1-D4(709-886)從柱上用大約3倍柱體積的0.1M NaH2PO4pH7.0在Buffer A中以30％到100％的線性梯度洗脫。含D1-D4(709-886)組分用SDS PAGE鑒定后，收集起來用濾過分子量10,000的膜(Amicon)進(jìn)行超濾濃縮至20ml。D1-D4(709-886)貯留液用Sephaelex G25柱(Pharmacia)(id2.6cm；h，21cm)換成50mM甲酸緩沖液，冷凍干燥后配入最終產(chǎn)品。
得到的D1-D4(709-886)產(chǎn)品用反相HPLC和SDS PAGE測(cè)得純度為50mg≥98％。實(shí)施例5D1-D4(709-886)多肽的發(fā)酵生物反應(yīng)器從含50μg/ml氨芐的LB瓊脂培基中復(fù)蘇E.coli BL21(DE3)pBROC520單克隆，并接種2×100ml含75μg/ml氨芐的菌種培基(NCYZM)。第一和第二次菌種階段發(fā)酵在500ml振搖燒瓶中進(jìn)行，每批量為100ml NCYZM培基。第一和第二菌種發(fā)酵條件如下37℃，在50mm擺度的軌道振搖器上230rpm。初始菌種溫育時(shí)間為9小時(shí)。將它再用來接種到6份100ml第二階段菌種培養(yǎng)基(NCYZM)中(0.1％v/v)，保溫14.5小時(shí)。
兩個(gè)15升Biolafitte發(fā)酵器，每只每批用10升NCYZM培養(yǎng)基和0.01％(v/v)Dow Corning DC1510抗泡沫。加培養(yǎng)基的容器用121℃蒸氣消毒45分鐘。氨芐用微孔濾膜滅菌(0.2μm)無菌加入容器的培基中，終濃度為150μg/ml。發(fā)酵器按第二次菌種培基2.5％(v/v)水平接種。最后階段溫育條件為37℃，振蕩300rpm，空氣流動(dòng)5 L/min(0.5vvm)。最后階段的發(fā)酵在接種前、接種后0小時(shí)及后面的大約每個(gè)小時(shí)無菌取樣。樣品用來檢測(cè)光密度(550nm)的增加。當(dāng)OD550≥1.0時(shí)，加入IPTG使終濃度為1mM。發(fā)酵再保溫大約3小時(shí)。
每次離心7000g 35分鐘或在15000g連續(xù)離心收集細(xì)胞。細(xì)胞總產(chǎn)量為73.5克，用1.0升Oxoid磷酸鹽緩沖液(Dulbecco“A”)pH7.2洗一次。離心并沖洗的細(xì)胞冷凍在-20℃，等待下一步操作。
NCYZM培養(yǎng)基組成Difco Bacto胰酶體胨 10g/lFisons AR NaCl 5g/lDifco Bacto酵母提取物 5g/lDifco Bacto酪蛋白水解物 1g/lFisons AR MgSO4·7H2O 2g/l去離子水 950ml用5M NaOH調(diào)pH至7.0，然后定容至1000ml。實(shí)施例6 pBROC533的構(gòu)建，一種表達(dá)主要含有S.aureus J2385纖連蛋白結(jié)合蛋白D1-D4區(qū)多肽的質(zhì)粒。
下列寡聚多核苷酸(A)及其互補(bǔ)序列在Pharmacia LKB GereAsscmbler Plus DNA合成儀上合成CGGAATTCGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGACGTAAGATCTGG ATCCGCATGC GAATTCCG這兩種寡核苷酸制品(每種0.14μg)混合后，加熱至94℃5分鐘，然后37℃退火10分鐘。雙鏈DNA用EcoRI酶消化然后克隆到pUC19的EcoRI位點(diǎn)(2μg EcoRI消化載體/連接)得到pBROC528在E.coli Dclta M15中。
然后將BamHI消化的帶有卡那霉素抗性標(biāo)志的pUC4K(從Pharmacia獲得)，編號(hào)27-4958-01)克隆入得到的構(gòu)建質(zhì)粒pBROC528中唯一的BglII位點(diǎn)得到pBROC529。
pBROC529質(zhì)粒DNA(5μg)在E.coli Delta M15中生長(zhǎng)，具有HincII/SphI雙酶切位點(diǎn)。編碼卡那霉素抗性基因的大約1.4kbDNA片段，由原來合成的寡核苷酸編碼的纖連蛋白結(jié)合蛋白部分用低熔點(diǎn)瓊脂糖分離。該DNA與被HincII部分消化、被SphI完全消化的pBROC519a(見實(shí)施例2)質(zhì)粒DNA進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移入E.coli Delta M15，進(jìn)行卡那霉素抗性篩選。用這種方法證明分離pBROC530的可能，該質(zhì)粒通過葡萄球菌DNA HincII位點(diǎn)間的測(cè)序以及限制片酶切圖譜確定，它載有編碼S.aureus J2385纖連蛋白結(jié)合蛋白D1-D2-D3-D4區(qū)(表2中1-129殘基)的DNA片段。該DNA片段在多肽的C末端還編碼一個(gè)蘇氨酸殘基。
然后，pBROC530的葡萄球菌DNA通過對(duì)質(zhì)粒DNA制品NdeI/BamHI酶切從質(zhì)粒載體移出克隆到相似消化的pBROC413中(見主要試劑a)得到pBROC531。
pBROC531在E.coli Delta M15的轉(zhuǎn)化株中生長(zhǎng)，然后用SalI酶切移去卡那霉素抗性基因再連接產(chǎn)生pBROC533。完成這一步是為了防止pBROC531中從T7啟動(dòng)子的卡那霉素抗性基因不必要的過度表達(dá)，因?yàn)樗鼤?huì)不利于葡萄球菌DNA的最大表達(dá)。
pBROC533轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)組裝E.coli BL21(DE3)，pBROC533。
質(zhì)粒pBROC531的變株還可用下列寡聚多核苷酸(B)及其互補(bǔ)鏈構(gòu)建CGGAATTCGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGCCGTAAGATCTGG ATCCGCATGC GAATTCCG末端蘇氨酸被脯氨酸置換后，它給出與上面相同的多肽。實(shí)施例7 E.coli BL21(DE3)中pBROC533表達(dá)的D1-D4(709-838(P838T))多肽的表達(dá)、分離和純化a)表達(dá)這一步的完成是使用實(shí)施例4a)所述的方法，只是實(shí)施例6中的質(zhì)粒pBROC533換成pBROC520。b)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)使用實(shí)施例4b)的方法完成。D1-D4(709-828(P838T))在pBROC532泳道確定為一個(gè)新帶。c)分離此步基本按實(shí)施例4c)所述進(jìn)行，只是用E.coli BL21(DE3)(pBROC533)細(xì)胞沉淀，起始培養(yǎng)體積為1.2升，細(xì)胞沉淀懸于32ml緩沖液。最終上清體積為40ml。d)純化上述制備的D1-D4(709-828(P828T))上清液用0.1MNaH2PO4pH7.6 1∶1稀釋并用HCl調(diào)pH至7.6，上樣于用0.1MNaH2PO4pH7.6平衡的Q Sepharose(Pharmacia)柱(id，4.1cm；h4.7cm)。多肽被該柱吸收，用0.1M NaH2PO4/0.5N NaCl pH7.6洗脫。從Q Sepharose洗脫下來的多肽溶液(50ml)與4M(NH4)2SO4(16ml)混和，上樣到用1.0M(NH4)2SO4/0.1MNaH2PO4pH7.0(BufferA)平衡的Toyopeal Butyl柱(TosoHaas)(id1.6cm；h15cm)。該柱用大約三倍床體積的Buffer A沖洗。吸附到基質(zhì)的多肽用至少3倍柱體積的0.1M NaH2PO4pH7.0在Buffer A中以30％到100％的線性梯度洗脫。含有多肽的組分用SDS PAGE鑒定，收集起來用濾過分子量10,000的膜(Amicon)進(jìn)行超濾濃縮至20ml。該貯留液用一個(gè)Sephadex G25柱(Pharmacia)(id2.6cm；h21cm)將緩沖液換成50mM甲酸，冷凍干燥后配入最終產(chǎn)品。
冷干品的一部分溶解，該材料在非還原條件下SDS PAGE上顯示一條大約Mr＝22000的主帶。
生物學(xué)評(píng)價(jià)A.D1-D4(709-886)對(duì)體外葡萄球菌對(duì)涂有纖連蛋白的多聚甲基異丁烯酸酯(PMMA)蓋片的粘附的作用(i)細(xì)菌株金黃色釀膿葡萄球菌8325-4(實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株)金黃色釀膿葡萄球菌J-2385表皮葡萄球菌(SE902和SE903，兩種從臨床上外體感染分離到的菌株)。(ii)粘附試驗(yàn)如Vaudaux et al，Infection and Immunity 45768-774，1984所述的體外粘附試驗(yàn)通常被用于測(cè)量葡萄球菌對(duì)包被纖連蛋白表面的粘附作用以及測(cè)定D1-D4(709-886)多肽的抗粘附性質(zhì)。(iii)細(xì)菌的制備葡萄球菌株在Mucller-Hinton Broth中37℃生長(zhǎng)過夜(MHB，Difco Laboratorics)?？偭繛?×107cfu的過夜培養(yǎng)物與100μCi[甲基-3H]-胸腺嘧啶(Amersham)在1ml MHB中保溫，在37℃生長(zhǎng)3小時(shí)至1×108-2×108cfu/ml。通過兩次洗滌(3000×g，10分鐘)去除未結(jié)合的放射活性，標(biāo)記的菌株懸于1ml 0.15M NaCl。(iv)纖連蛋白對(duì)PMMA蓋片的吸附將所有PMMA蓋片(0.75×0.75cm)浸在37℃ 95％乙醇中10分鐘，然后干燥并于120℃加熱30分鐘。蓋片于室溫下先在明膠(1mg/ml，Difco Laboratorics)中預(yù)保溫60分鐘，用PBS(無Ca2+、Mg2+，Gibco Laboratories)潤(rùn)洗。蓋片再浸于含有純化的人纖連蛋白的溶液中，有兩種濃度0.5μg/ml用于S.aureus株，4μg/ml用于S.epidermidis株，37℃保溫60分鐘。蓋片再轉(zhuǎn)至含有PBS的新管中沖洗。(v)粘附試驗(yàn)D1-D4(709-886)多肽稀釋到需要的濃度(從100μg/ml到100pg/ml)，用補(bǔ)充以陽(yáng)離子(Gibco Laboratories)和白蛋白(20％，Sigma)(PBS++/HSA)的PBS稀釋。洗過的放射性培養(yǎng)物(40μ1)加到塑料管中960μl的已稀釋的D1-D4(709-886)多肽。包被纖連蛋白的蓋片加到細(xì)菌懸液中，37℃保溫60分鐘并不斷振搖(100圈/分鐘)。
排出液體，蓋片轉(zhuǎn)到新管中，用鹽(1ml)在室溫洗兩次，每次5分鐘和30分鐘。液體排干，將蓋片轉(zhuǎn)入加有5ml閃爍液的閃爍瓶中并計(jì)數(shù)。(iv)每種菌株的cpm和cfu評(píng)價(jià)部分3個(gè)小時(shí)放射性標(biāo)記的培養(yǎng)物(10μl)在閃爍瓶中計(jì)數(shù)。一份100μl的以1∶10,000稀釋并將20μl鋪在Mueller-Hinton瓊脂上，并將存活的計(jì)數(shù)。此外，100μl稀釋菌(用于粘附試驗(yàn))的cpm含量也進(jìn)行測(cè)定，使你可以計(jì)數(shù)粘附于包放纖連蛋白PMMA蓋片的cfu′s數(shù)目。(vii)結(jié)果
*蓋片包被0.5μg/ml纖連蛋白**蓋片包被4.0μg/ml纖連蛋白S.aureus8325-4是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株，它對(duì)包被人纖連蛋白的不同材料的粘附能力已被廣泛研究。該菌對(duì)包被纖連蛋白表面的粘附含因包被表面纖連蛋白濃度的增高而加快。因此，S.aureus8325-4作為一種合適的菌株被選用于測(cè)試可能阻斷葡萄球菌和纖連蛋白包被表面相互作用的試劑的作用。
D1-D4(709-886)是一種S.aureus8325-4對(duì)包被纖連蛋白蓋片粘附的潛在抑制劑。當(dāng)D1-D4(709-886)的濃度降至10ng/ml時(shí)，仍可測(cè)到最高95％的粘附抑制率。純化的人IgG(Pierce)用來做對(duì)照，因?yàn)橛眠@個(gè)試驗(yàn)(Vaudaux et al J.Invest.Sury，2397-408 1989)早先已顯示出它對(duì)S.aureus與包被纖連蛋白表面粘附的抑制作用，在1mg/ml抑制70％。
此外，當(dāng)增加用于包被PMMA蓋片的纖連蛋白的濃度時(shí)，S.aureus J2385對(duì)包被纖連蛋白蓋片的粘附也加快了。然而，標(biāo)準(zhǔn)操作方法中蓋片的明膠預(yù)處理被刪去了，因?yàn)樗鼘?dǎo)致一些菲特異性結(jié)合，從而干擾粘附試驗(yàn)。證明該菌株對(duì)非流動(dòng)的纖連蛋白的粘附是重要的，因?yàn)樵撗芯克玫闹亟MD1-D4(709-886)多肽是從S.aureusJ-2385中得到的。D1-D4(709-886)多肽能夠抑制S.aureus J2385對(duì)包被纖連蛋白表面的粘附。
當(dāng)用于包被蓋片的纖連蛋白的濃度增加時(shí)，S.epidermidis的粘附也加快了。注意到與S.aureus8325-4(0.5μg/ml)相比，需要高濃度(4μg/ml)的纖連蛋白才使顯著數(shù)目的細(xì)菌粘附。D1-D4(709-886)多肽也抑制S.epidermidis對(duì)纖連蛋白(1μg/ml時(shí)95％粘附)的粘附提示我們D1-D4(709-886)能做為-種治療劑來抵抗凝固酶-陰性葡萄球菌，具有抗粘附活性。B.對(duì)S.aureus與皮膚基質(zhì)粘附的抑制作用(i)介紹本研究用的皮膚組織是從試劑盒(Skin2)從Advanced TissueSciences(La Jolla，California，USA)得到。此人工皮膚生長(zhǎng)的全部細(xì)節(jié)隨試劑盒提供。該人工皮膚通過接種人新生成纖維細(xì)胞到一個(gè)中性醫(yī)用級(jí)尼龍網(wǎng)上形成。成纖維細(xì)胞粘到網(wǎng)上在網(wǎng)的小間隙內(nèi)繁殖。在這個(gè)過程中，他們分泌天然可見的生長(zhǎng)因子并淤積細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如纖連蛋白和膠原，從而形成了人工皮膚。這個(gè)模型已被成功地用于代替皮膚組織暴露在傷口上。(ii)體外S.aureus8325-4的皮膚粘附實(shí)驗(yàn)該程序基本與上面A中描述的相同，只是人工皮膚替代了包被FN的蓋片。S.aureus8325-4在Mueller-Hinton Broth(MHB，Difco)中生長(zhǎng)過夜。從過夜培養(yǎng)物中取總量為2×107cfu在1ml MHB中與100μCi[甲基-3H]-胸腺嘧啶保溫，37℃生長(zhǎng)3小時(shí)至1×108到2×108cfu/ml。兩次離心(3,000×g，10分鐘)除去游離放射活性，標(biāo)記的菌株懸于0.5％HSA(Sigma)中防止對(duì)細(xì)胞/基質(zhì)蛋白的非特異結(jié)合。皮膚基質(zhì)在加入放射性標(biāo)記細(xì)菌前用無血清培養(yǎng)基和PBS沖洗。(iii)D1-D4(709-886)對(duì)皮膚基質(zhì)粘附的作用D1-D4(709-886)多肽在補(bǔ)充陽(yáng)離子(Gibco Laboratories)和人血清白蛋白(20％，Sigma)(PBS++，HSA)的PBS中稀釋至所需濃度。洗過的細(xì)菌(40μl)加到稀釋的D1-D4(709-886)(960μl)樣品中。然后將皮膚組織加到含D1-D4(709-886)的細(xì)菌懸液中，振搖(100圈/分)37℃保溫。液體排出，將皮膚組織轉(zhuǎn)到試管中，室溫下用鹽溶液(1ml)分別洗5和30分鐘。液體排出并將皮膚組織轉(zhuǎn)至加有5ml閃爍液的閃爍瓶中計(jì)數(shù)。(iv)結(jié)果D1-D4(709-886)對(duì)S.aureus8325-4和皮膚組織的粘附具有濃度-依賴的抑制作用。D1-D4(709-886)的濃度降至1μg/ml仍有顯著粘附抑制作用。這些結(jié)果顯示與包被纖連蛋白PMMA蓋片的粘附實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果有良好的相關(guān)性。此外，結(jié)果證實(shí)了皮膚組織上存在的纖連蛋白與S.aureus相互作用的重要。作為此觀察的結(jié)論，D1-D4(709-886)多肽局部用藥以防止手術(shù)中的傷口感染是預(yù)防上有用的。C.給大鼠皮下移植時(shí)的葡萄球菌和尼龍插管粘附的抑制作用(i)體內(nèi)外作感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腕w重230-250g的雄性CD大鼠(Charles River(UK)Limited)用來作此研究。在無菌條件下，每只大鼠皮下移植3或4只柔韌的乙烯插管(1.5mm×2cm)。動(dòng)物用Hypnorm(0.05ml)i.m然后0.05mli.m valium麻醉。脊柱背面中間作1cm切口，用鈍器分離打開皮下區(qū)域。移植插管，切口用小夾夾住。在麻醉蘇醒前，傷口噴灑木卡因。小夾6天后移去。在插入插管時(shí)通過向傷口內(nèi)放細(xì)菌培養(yǎng)物(見下)，使移植部位感染。(ii)用于感染模型的細(xì)菌的制備細(xì)胞過夜生長(zhǎng)于MHB(Difco)。過夜培養(yǎng)物(20μl)用來接種新鮮MHB(1ml)，培養(yǎng)物在37℃生長(zhǎng)3小時(shí)或16小時(shí)(指數(shù)期培養(yǎng))。細(xì)菌洗滌2次(9000×g，10分鐘)并懸于0.85％PBS(1ml)得到8.3log10cfu/ml。細(xì)菌懸液1比10稀釋得到大約7log10cfu/ml，0.1ml該懸液用于感染大鼠。因此，每個(gè)傷口用約6log10cfu感染。
為了測(cè)試D1-D4(709-886)在體內(nèi)對(duì)粘附的作用，在加到傷口部位前，先將D1-D4(709-886)多肽加到細(xì)菌懸液中使終濃度為500μg/ml。因此，每個(gè)傷口部位施以50μg D1-D4(709-886)。(iii)在D1-D4(709-886)多肽存在下，在體內(nèi)細(xì)菌粘附/移生的評(píng)價(jià)感染后1，6，24，72.168，192和240小時(shí)，每組取一只大鼠通過腹腔注射0.5ml Expiral處死。取出所有插管，用滅菌PBS潤(rùn)洗并將每個(gè)放到1ml新鮮PBS(磷的鹽緩沖液，0.9％)中，在超聲水浴中超聲2分鐘以除去附著的細(xì)菌。取出樣品鋪到Maeller-Hinton瓊脂上計(jì)數(shù)粘附的、活的細(xì)菌數(shù)。(iv)結(jié)果在大鼠皮下移植過程中，D1-D4(709-886)多肽抑制S.aureus8325-4對(duì)插管的粘附。移植6小時(shí)后取出的插管，四分之三完全沒有粘附的細(xì)菌，粘附到第4根插管的細(xì)菌數(shù)比對(duì)照組(沒加D1-D4(709-886))也少得多。雖然移植8天后插管上發(fā)現(xiàn)有些粘附細(xì)菌，但有D1-D4(709-886)處理的導(dǎo)管上的細(xì)菌數(shù)(3.0±1.3log10cfu)比未處理的對(duì)照組少得多(5.4±1.4log10cfu)。考慮到用于感染傷口的細(xì)菌數(shù)是106，這應(yīng)該超過手術(shù)時(shí)操作區(qū)污染生物的數(shù)目。
D1-D4(709-886)感染后至少10天內(nèi)抑制S.aureus I20(一種臨床分離的致病力強(qiáng)的)的粘附。感染后6、24、72、168、240小時(shí)取出插管，在未處理的插管中在持續(xù)研究時(shí)間內(nèi)可見細(xì)菌數(shù)在4到6log1cfu。然而，在任何時(shí)間內(nèi)D1-D4(709-886)處理的插管上沒發(fā)現(xiàn)或幾乎沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌。
在兩株S.epidermidis中也看到類似結(jié)論。盡管這些菌株的粘附有一個(gè)明顯的延遲，但是未處理的插管感染后10天可見高數(shù)目的細(xì)菌，有5-6log10cfu。這時(shí)D1-D4(709-886)處理的插管上未見細(xì)菌。因此，D1-D4(709-886)局部使用用于預(yù)防時(shí)，能有效地阻止葡萄球菌對(duì)內(nèi)置醫(yī)療裝置的粘附。D.D1-D4(709-838(P838T))對(duì)葡萄球菌粘附的作用(i)體外粘附實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)條件同A中評(píng)價(jià)D1-D4(709-886)多肽所述的相同。(ii)結(jié)果D1-D4(709-838(P838T))多肽能抑制S.aureus8325-4和S.epidermidis SE902對(duì)包被纖連蛋白蓋片的粘附。D1-D4(709-838(P838T))的粘附抑制作用與用D1-D4(709-886)所觀察到的相同。在此研究中，100ng/ml多肽能抑制S.aureus8325-4粘附達(dá)9 5％，100μg/ml多肽能抑制S.epidermidis SE902粘附達(dá)85％。(iii)體內(nèi)粘附實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)條件與C中評(píng)價(jià)D1-D4(709-886)多肽所述的相同。(iv)結(jié)果D1-D4(709-838(P838T))多肽在大鼠皮下移植過程中能抑制S.aureus I20和S.epidermidis SE902對(duì)乙烯插管的粘附。到實(shí)驗(yàn)的第10天，與未處理的對(duì)照組相比D1-D4(709-838(P838T))處理的插管上未出現(xiàn)粘附生物，而對(duì)照組發(fā)現(xiàn)S.aureusI20 4.5log10cfu及S.epidermidis SE902 6log10cfu。表1.編碼S.aureus纖連蛋白結(jié)合蛋白A型的纖連蛋白結(jié)合區(qū)DNA與S.aureus J2385 DNA序列的比較- - - - -1 GGCCAAAATAGCGGTAACCAGTCATTCGAGGAAGACACAGAAGAAGATAA 50 - J2385|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||+||2350 GGCCAAAATAGCGGTAACCAGTCATTCGAGCAAGACACAGAAGAAGACAA 2399 Typc A- - - - -51 ACCTAAATATGAACAAGGTGGCAATATCCTAGATATCGATTTCGATAGTG 100 J2385||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||+|||||||2400 ACCTAAATATGAACAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTG 2449 Type A- - - - -101 TACCTCAAATTCATGGTCAAAATAAAGGTGATCAGTCATTCGAAGAAGAT 150 J2385|||||||||||||||||||||||||||||*|||||||||||||+||||||2450 TACCTCAAATTCATGGTCAAAATAAAGGTAATCAGTCATTCGAGGAAGAT 2499 Type A- - - -151 ACAGAGAAAGACAAGCCTAAATATGAACATGGTGGTAATATCATTGATAT 200 J2385|||||+||||||||+|||||+|||||||||||+|||||+|||||||||||2500 ACAGAAAAAGAGAAACCTAAGTATGAACATGGCGGTAACATCATTGATAT 2549 Type A- - - - -201 CGACTTCGACAGCGTGCCACATATTCATGGATTCAATAAGCACACTGAAA 250 J2385||||||||||||+||||||||||||||+||||||||||||||||||||||2550 CGACTTCGACAGTGTGCCACATATTCACGGATTCAATAAGCACACTGAAA 2599 Type A- - - - -251 TTATTGAAGAAGATACAAACAAAGATAAACCAAATTATCAATTCGGTGGA 300 J2385|||||||||||||||||||+|||||||||||||*||||||||||||||||2600 TTATTGAAGAAGATACAAATAAAGATAAACCAAGTTATCAATTCGGTGGA 2649 Type A- - - - -301 CACAATAGTGTTGACTTTGAAGAAGATACACTTCCACAAGTAAGTGGTCA 350 J2385||||||||||||||||||||||||||||||||||||*|||||||+||+||2650 CACAATAGTGTTGACTTTGAAGAAGATACACTTCCAAAAGTAAGCGGCCA 2699 Type A- - - - -351 TAATGAAGGTCAACAAACGATTGAAGAAGATACAAC............GC 388 J2385*|||||||||||||||||||||||||||||||||||||2700 AAATGAAGGTCAACAAACGATTGAAGAAGATACAACACCTCCAATCGTGC 2749 Type A- - - - -389 CGCCAACACCACCAACACCAGAAGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACA 438 J2385|+|||||+|||||+||||||||||||||||||||||||||||i||||||+2750 CACCAACGCCACCGACACCAGAAGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACG 2799 Type A- - - - -439 CCACCGACACCAGAAGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACACCGCCAAC 488 J2385|||||+||||||||||||||||||||||||||||||||||||||+||+||2800 CCACCAACACCAGAAGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACACCACCGAC 2849 Type A- - -489 ACCAGAGGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACACC 524 J2385||||||+||+||+||||||||+|||||+||||||||2850 ACCAGAAGTGCCGAGTGAGCCAGAAACTCCAACACC 2885 Type A+同義突變氨基酸改變表2.比較金黃色釀膿葡萄球菌(如公布的)和金黃色釀膿葡萄球菌J2385的纖連蛋白結(jié)合蛋白的纖連蛋白結(jié)合區(qū)的氨基酸順序。
金黃色釀膿葡萄球菌順序a包含709-886氨基酸殘基(如Signas et al.loc.cit.)1→ D1 -→ D2 50J2385 GQNSGNQSFE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NKGDQSFEEDStaphaGQNSGNQSEE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NKGNQSFEEDStaphbGQNSGNQSFE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NNGNQSFEED51 -→ D3 100J2385 TEKDKPKYEH GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPNYQFGGStaphaTEKDKPKYEH GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPSYQFGGStaphbTEKDKPKYEQ GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPNYQFGG101 -→ D4 -→ WR1 146J2385 HNSVDEEEDT LPQVSGHNEG QQTIEEDTT. ...PPTPPTP EVPSEPETPTStaphaHNSVDFEEDT LPKVSGQNEG QQTIEEDTTP PIVPPTPPTP EVPSEPETPTStaphbHNSVDFEEDT LPQVSGHNEG QQTIEEDTTP PIVPPTPPTP EVPSEPETPT174J2385 PPTPEVPSEP ETPTPPTPEV PSEPETPTStaphaPPTPEVPSEP ETPTPPTPEV PSEPETPTStaphbPPTPEVPSEP ETPTPPTPEV PTEP....
圖1是pBROC413質(zhì)粒的圖示。Bla表示氨芐抗性基因，φ10表示T7RNA聚合酶啟動(dòng)子，rbs表示核糖體結(jié)合位點(diǎn)。φ10和bla的箭頭給出了轉(zhuǎn)錄方向。多接點(diǎn)位點(diǎn)已表示出來。質(zhì)粒未按比例畫，其尺寸是近似的。
列出序列SEQ ID NO1FIB 1GGGAATTCAT ATGGGCCAAA ATAGCGGTAA CCAGTCSEQ ID NO2FIB 2GCGGATCCTT ACGTTGGTGG CACCATTGGA GGTGSEQ ID NO3寡核苷酸(A)CGGAATTCGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGACG TAAGATCTGGATCCGCATGC GAATTCCGSEQ ID NO4寡核苷酸(B)CGGAATTCGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGCCG TAAGATCTGGATCCGCATGC GAATTCCGSEQ ID NO5GGCCAAAATA GCGGTAACCA GTCATTCGAG GAAGACACAG AAGAAGATAAACCTAAATAT GAACAAGGTG GCAATATCGT AGATATCGAT TTCGATAGTGTACCTCAAAT TCATGGTCAA AATAAAGGTG ATCAGTCATT CGAAGAAGATACAGAGAAAG ACAAGCCTAA ATATGAACAT GGTGGTAATA TCATTGATATCGACTTCGAC AGCGTGCCAC ATATTCATGG ATTCAATAAG CACACTGAAATTATTGAAGA AGATACAAAC AAAGATAAAC CAAATTATCA ATTCGGTGGACACAATAGTG TTGACTTTGA AGAAGATACA CTTCCACAAG TAAGTGGTCATAATGAAGGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGCCG CCAACACCACCAACACCAGA AGTACCAAGT GAGCCGGAAA CACCAACACC ACCGACACCAGAAGTACCAA GTGAGCCGGA AACACCAACA CCGCCAACAC CAGAGGTACCAAGTGAGCCG GAAACACCAA CACCTCCAAT CGTGCCACCA ACGTAA -SEQ ID NO6 D1-D4(709-886)GQNSGNQSFE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NKGDQSFEEDTEKDKPKYEH GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPNYQFGGHNSVDFEEDT LPQVSGHNEG QQTIEEDTTP PTPPTPEVPS EPETPTPPTPEVPSEPETPT PPTPEVPSEP ETPTPPIVPP TSEQ ID NO7 D1-D4(709-838(P838T))(實(shí)施例7)GQNSGNQSFE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NKGDQSFEEDTEKDKPKYEH GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPNYQFGGHNSVDFEEDT LPQVSGHNEG QQTIEEDTTTSEQ ID NO8 D1-D4(709-838)GQNSGNQSFE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NKGDQSFEEDTEKDKPKYEH GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPNYQFGGHNSVDFEEDT LPQVSGHNEG QQTIEEDTTPSEQ ID NO9 J2385 DNA(表1)GGCCAAAATA GCGGTAACCA GTCATTCGAG GAAGACACAG AAGAAGATAAACCTAAATAT GAACAAGGTG GCAATATCGT AGATATCGAT TTCGATAGTGTACCTCAAAT TCATGGTCAA AATAAAGGTG ATCAGTCATT CGAAGAAGATACAGAGAAAG ACAAGCCTAA ATATGAACAT GGTGGTAATA TCATTGATATCGACTTCGAC AGCGTGCCAC ATATTCATGG ATTCAATAAG CACACTGAAATTATTGAAGA AGATACAAAC AAAGATAAAC CAAATTATCA ATTCGGTGGACACAATAGTG TTGACTTTGA AGAAGATACA CTTCCACAAG TAAGTGGTCATAATGAAGGT CAACAAACGA TTGAAGAAGA TACAACGCCG CCAACACCACCAACACCAGA AGTACCAAGT GAGCCGGAAA CACCAACACC ACCGACACCAGAAGTACCAA GTGAGCCGGA AACACCAACA CCGCCAACAC CAGAGGTACCAAGTGAGCCG GAAACACCAA CACCSEQ ID NO10 J2385(表2)GQNSGNQSFE EDTEEDKPKY EQGGNIVDID FDSVPQIHGQ NKGDQSFEEDTEKDKPKYEH GGNIIDIDFD SVPHIHGFNK HTEIIEEDTN KDKPNYQFGGHNSVDFEEDT LPQVSGHNEG QQTIEEDTTP PTPPTPEVPS EPETPTPPTPEVPSEPETPT PPTPEVPSEP ETPT
權(quán)利要求
1.從一種金黃色釀膿葡萄球菌Fbp分離的D1-D4多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，在序列上。它由完整的D1、D2、D3和D4區(qū)組成任意在PIVP終止，并且任選金黃色釀膿葡萄球菌Fbp的1至5壁區(qū)(WR)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2含有最多3個(gè)壁區(qū)的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽，它由對(duì)應(yīng)于金黃色釀膿葡萄球菌FbpA的G709到T886加PPIVPPT殘基，G709到P838或G709到P838(P838→T)殘基組成。
5.根據(jù)前面任何權(quán)利要求的多肽，其中Fbp是來自S.aureusJ2385，DNA序列為SEQ ID NO5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，具有SEQ ID NO6，SEQ ID NO7或SEQ ID NO8序列的多肽。
7.權(quán)利要求1至6中任意一種編碼多肽的分離的核酸。
8.SEQ ID NO5的DNA。
9.權(quán)利要求7或8包含分離核酸的重組質(zhì)粒。
10.用權(quán)利要求9的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
11.制備權(quán)利要求1至6任意一種多肽的方法，包括編碼所述多肽DNA的表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的回收。
12.結(jié)合到基質(zhì)結(jié)合蛋白的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇的單克隆抗體(Mab)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的單克隆抗體，其中基質(zhì)結(jié)合蛋白是葡萄球菌的一種細(xì)胞表面蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的單克隆抗體，其中基質(zhì)結(jié)合蛋白是纖連蛋白結(jié)合蛋白(Fbp)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的單克隆抗體，它與Fbp的D1-D4區(qū)上的一個(gè)抗原決定簇結(jié)合。
16.根據(jù)權(quán)利要求13、14、或15的單克隆抗體，其中細(xì)菌是S.aureus或S.epidermidis的一個(gè)株。
17.根據(jù)權(quán)利要求12的單克隆抗體，用下述各項(xiàng)作抗原均可得到Fbp，或Fbp的D1-D4區(qū)，或與Fbp或D1-D4區(qū)衍生物的免疫學(xué)上或抗原性上相同的多肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求12的單克隆抗體，用下述各項(xiàng)作抗原均可得到S.aureus J2385(NCIMB 40532)上的Fbp，或Fbp的D1-D4區(qū)的一個(gè)多肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求12到18中任意一種已被人性化的單克隆抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求12到19任意一種包含Mab結(jié)合區(qū)的多肽，它是該單克隆抗體的一個(gè)片段。
21.存在于S.aureus J2385(NCIMB 40532)上的一種Fbp的多肽，它具有氨基酸順序?yàn)镾EQ ID NO6的D1-D4區(qū)。
22.根據(jù)權(quán)利要求6或21多肽的衍生物并具有相同免疫學(xué)或抗原活性的多肽。
23.制備單克隆抗體的過程，其中動(dòng)物用根據(jù)權(quán)利要求1至6、21或22中任意一種多肽進(jìn)行免疫，該動(dòng)物產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與一個(gè)連續(xù)細(xì)胞株融合，該雜交瘤細(xì)胞被克隆并篩選出產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求12至18中任意一個(gè)的抗體的克隆。
24.分泌根據(jù)權(quán)利要求12至18中任意一種抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
25.質(zhì)粒pBROC520或pBROC533。
26.一種從樣品中純化正如權(quán)利要求1至6或20到22定義的任意一種多肽的方法，包括將能夠特異地結(jié)合所述多肽的單克隆抗體固定在一種基質(zhì)上，在合適的條件下將樣品與固定的單克隆抗體接觸使多肽與所述抗體結(jié)合，再分離未結(jié)合樣品并從固定的單克隆抗體上將多肽洗脫下來。
27.權(quán)利要求12至19中所定義的任一種單克隆抗體的用途，用于定量或定性地測(cè)定正如權(quán)利要求1至6或20至22定義的任何一種多肽。
28.測(cè)定權(quán)利要求1至6或20至22所定義的任意一種多肽的測(cè)試試劑盒，包括根據(jù)權(quán)利要求12至19的任意一種單克隆抗體以及任選其它的單克隆或多克隆抗體和/或附屬物，它們?cè)谝粋€(gè)合適的包裝中。
29.包含根據(jù)權(quán)利要求12至19中任意一種單克隆抗體或根據(jù)權(quán)利要求1至6或20的任意一種多肽以及一種藥物可接受載體的一種藥物組合物。
30.根據(jù)權(quán)利要求1至6或20的任一種多肽或根據(jù)權(quán)利要求12至19任一種Mab在制做一種藥劑中的用途，它用于防止細(xì)菌對(duì)內(nèi)置裝置上的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或傷口上的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的粘附。
31.一種防止細(xì)菌與內(nèi)置裝置上細(xì)胞外基質(zhì)蛋白粘附的方法，它包括用有效量的某種多肽或某Mab在手術(shù)內(nèi)置裝置的前、后或過程中處理病人，該多肽是根據(jù)權(quán)利要求1至6或20的任一種，Mab是根據(jù)權(quán)利要求12至19的任一種。
32.一種防止細(xì)菌與傷口上的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白粘附的方法，包括用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至6或20的任一種多肽或根據(jù)權(quán)利要求12至19的任一種Mab處理受傷的病人。
33.根據(jù)權(quán)利要求30、31或32的用途或方法，其中該細(xì)菌是革蘭氏陽(yáng)性菌。
全文摘要
一種能與基質(zhì)結(jié)合蛋白的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇以及一種從金黃色釀膿葡萄球菌分離到的D1-D4多肽結(jié)合的單克隆抗體(Mab)或它的一個(gè)片段；以及它們?cè)诜乐辜?xì)菌(尤其是革蘭氏陽(yáng)性菌)對(duì)內(nèi)置裝置上的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或傷口中的基質(zhì)蛋白粘附方面的用途。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1119026SQ94191388
公開日1996年3月20日 申請(qǐng)日期1994年2月4日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月5日
發(fā)明者M·K·R·賓漢姆, I·喬普拉, I·A·克里奇利, D·J·C·諾里斯 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆有限公司