專利名稱：骨刺激因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及刺激骨生長的蛋白質(zhì)和多聚肽。
人們知道即使是成年人，其骨頭也可以更新。在一些部位，象內(nèi)聽囊，該器官形成后就再沒有明顯的更新。在另一些部位，特別是在中央骨骼中軸，在成年期更新也一直在持續(xù)著。骨更新發(fā)生于已有骨基質(zhì)的表面，該骨基質(zhì)由蛋白質(zhì)(主要是膠原蛋白)和無機質(zhì)組成。破骨細胞一破壞骨基質(zhì)，骨更新就開始了。破骨細胞是多核細胞，分泌酸和蛋白水解酶，導(dǎo)致膠原蛋白基質(zhì)蛋白質(zhì)的水解和無機質(zhì)釋放到細胞外體液分隔中。接著這個骨破壞的起始期或吸收期，開始形成新的骨蛋白基質(zhì)。新的骨蛋白被貯藏起來，一段時間以后，無機質(zhì)開始摻入到新形成的基質(zhì)中。骨基質(zhì)的形成及其后來的礦化作用都是單核細胞成骨細胞的作用。形成期后經(jīng)常有一段時間的不活動期(1，2)。再吸收看來和體內(nèi)形成(3)是緊密聯(lián)系的。因此，骨更新是一系列事件，已知其部位是骨新陳代謝單位(Bone Metabolism Unit)或BMU。骨更新推定介質(zhì)的成骨細胞和破骨細胞，被認為屬于兩個不同的細胞系。這兩種類型的細胞不是預(yù)先形成的，而是通過細胞活化作用從它們的前體分化而來(4，5，6)。
骨基質(zhì)的維持，或者通過骨更新的完全停止，就象內(nèi)聽囊之骨，或者通過形成和重吸收的平衡。在對骨骼變化與年齡的相關(guān)的許多研究中，觀察到在生長期身體骨骼總體積的增加并且在成年期的早骨骼物質(zhì)達到最大量。這種增加后隨著年齡的增長而骨體積減小。在女性中，在較慢的穩(wěn)定期之前常有一在近絕經(jīng)期間的較快的骨損失期。因此，女性的骨損失趨向于比男性嚴重得多。因此，對BMU內(nèi)骨平衡的認識是對認識骨骼老化的發(fā)病機理至關(guān)重要的?？刂乒歉碌乃袡C制都是很復(fù)雜的，目前對其還未充分認識清楚?？刂茩C制的復(fù)雜性導(dǎo)致了達到減少骨損失的變化。
一般說來，骨更新可以在兩個不同的時期進行調(diào)控。其可以在前體細胞的活化期進行調(diào)控。細胞活化的調(diào)控器不僅控制骨骼內(nèi)活化BMU的數(shù)量而且還可能控制單個BMU中破骨細胞和成骨細胞的數(shù)目。另外，骨更新可以在骨細胞分化的水平進行調(diào)控。骨細胞系統(tǒng)的復(fù)雜性使分別研究這兩種水平的調(diào)控很困難(3)。
骨細胞調(diào)控器看來分成兩類。第一類與細胞膜上特定的受體相作用。這些調(diào)控器的一個分類通過腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)與產(chǎn)生的細胞間環(huán)化AMP相作用，該環(huán)化AMP做為第二信使作用于蛋白激酶K系統(tǒng)。甲狀旁腺激素(PTH)和降鈣素(CT)屬于此類(7)。第二分類也和細胞膜上的受體相作用，結(jié)果使源子磷酸肌醇的分子在細胞內(nèi)釋放，該分子依次導(dǎo)致細胞間鈣的增加和激酶C的激活。第三分類調(diào)控器與細胞表面受體相互作用，但第二信號的產(chǎn)生及其后來的酪氨酸激酶的激活都由受體分子本身實現(xiàn)。許多生長因子看起來以這種方式起作用(8～15)。第二類的調(diào)控器不和細胞膜受體相作用，但能穿過細胞膜與細胞溶質(zhì)的受體相結(jié)合。然后由細胞溶質(zhì)受體將調(diào)控器轉(zhuǎn)運穿過核膜，與DNA相作用，導(dǎo)致特定基因轉(zhuǎn)錄的增加。甾類激素，包括維生素D看起來以這種方式起作用(16)。
許多激素刺激破骨細胞的增殖。這些包括1，25(OH)2D，PTH和前列腺素。破骨細胞內(nèi)的PTH和1，25(OH)2D的受體還沒有被明確確定。這兩種激素對培養(yǎng)的破骨細胞似乎沒有作用。然而，當破骨細胞和成骨細胞樣細胞系共培養(yǎng)時，PTH和1，25(OH)2D刺激破骨細胞的增殖。IL—1和TNF似乎以類似于PTH和1，25(OH)2D的方式起作用。其它生長因子，如EGF，TGF和PDGF似乎通過增加PEG的產(chǎn)量來刺激破骨細胞。已知降鈣素和皮質(zhì)類固醇與化學(xué)物質(zhì)為二膦酸一起是破骨細胞的抑制劑。
普遍認為白細胞介素1可以刺激膠原和非膠原骨蛋白及DNA的合成。消炎痛阻抑骨蛋白合成的效果，表明IL—1的這種作用是通過PGE中介的。消炎痛似乎對IL—1作用于成骨細胞的DNA合成的效果沒有影響。對成骨細胞樣細胞系的培養(yǎng)研究提示一些局部產(chǎn)生的生長因子刺激DNA和膠原蛋白的合成。骨細胞培養(yǎng)物中PTH和維生素D抑制膠原蛋白的合成。PTH的這種體外效果與從人體和試驗動物觀察到的效果相比較，證明大鼠和人類的甲狀旁腺機能亢進患者的PTH能刺激礦化的骨基質(zhì)的沉積。對用PTH1～34氨基酸片段治療骨質(zhì)疏松癥的效果的臨床試驗的初步研究表明該PTH片段能增加橫紋的體積。這種不相一致的原因還不能完全解釋清楚。
甲狀旁腺激素其成熟形式是—84氨基酸的肽。開始翻譯出的前—原—甲狀旁腺素是非常大的。當肽進入粗面內(nèi)質(zhì)肉時作為信號序列的前體序列斷裂，在高爾基體內(nèi)，原體序列(pro—sequenee)斷裂開生成完整的成熟的激素并包裝到分泌粒中?？磥矸置谒俾实恼{(diào)控不主要靠細胞內(nèi)肽產(chǎn)生的速率，而在于細胞內(nèi)破壞的速率和分泌速率。在細胞內(nèi)，成熟肽的氨基末端和羧基末端被截短。細胞外鈣濃度的下降能刺激成熟肽的分泌。另一方面，提高血清中鈣的濃度出現(xiàn)PTH分泌的抑制。一但進入循環(huán)，在肝內(nèi)成熟肽在該分子的許多位點包括第38氨基酸殘基處迅速斷裂。氨基末端的小片段，該片段包括開始的34個氨基酸，帶有根據(jù)其作用于腎、腸和骨的全部已知的生物活性。它也全部地同細胞膜受體相結(jié)合以刺激CAMP的產(chǎn)生。正常狀態(tài)下1～38片段在血清中的水平不能檢測到，表明其循環(huán)壽命短。較大的無活性的羧基未端片段具有相對長的半衰期，并且是循環(huán)系統(tǒng)中最高比例的免疫反應(yīng)的PTH。進入循環(huán)的所有片段最終在腎和肝內(nèi)被破壞掉。循環(huán)的無活性的PTH片段通行的腎機制之一就是腎小球的過濾作用。
PTH參與鈣和骨骼的體內(nèi)平衡。PTH刺激腎臟(腎小)管對鈣的再吸收而抑制近端腎小管對磷酸鹽和重碳酸鹽的再吸收。PTH對腎臟的第二個作用是刺激1，25(OH)2D的產(chǎn)生。此維生素D的代謝物是破骨細胞的體內(nèi)刺激物也是小腸鈣吸收的增強子(enhancer)。PTH刺激后小腸鈣吸收的增加由該維生素D代謝物中介。在體內(nèi)，PTH刺激破骨細胞的骨再吸收和鈣釋放到循環(huán)中。PTH也引起成骨細胞的增殖(18)。許多甲狀旁腺機能亢進的病例中有骨骼損失。然而，在某些初級甲狀旁腺機能亢進病例中(19，20，21)報道了脊髓密度的增加，而次級甲狀旁腺機能亢進交織腎衰竭(renalfailure)。Kalu和Walker觀察到長期地低劑量地投藥甲狀旁腺提取物導(dǎo)致大鼠的骨的硬化(22)。Tam等用四環(huán)素標記研究低鈣飲食對大鼠的骨無機質(zhì)添附速率的作用，發(fā)現(xiàn)盡管由于組織的骨吸收增加而產(chǎn)生骨的損失(次級甲狀旁腺機能亢進的結(jié)果)，但骨無機質(zhì)的添附速率提高了(23)。還發(fā)現(xiàn)有23名患中度初級甲狀旁腺機能亢進的病人中，骨無機質(zhì)添附速率增加了(24)。當成功地將四名病人的甲狀旁腺瘤摘除后，其速率降到對照個體中觀察到的水平。也已經(jīng)觀察到PTH的無機質(zhì)添附速率的刺激具有劑量依賴性。1～34片段和完整的PTH激素的效價在按一摩爾計時，似乎大約是相同的。這同PTH分子的1～34片段具有完整激素的生物活性相一致。還觀察到給藥PTH對骨骼體內(nèi)平衡的最終效果依賴于激素的如何給藥。如每天以相同的劑量給藥并且每天所給的激素是一次注射給藥，骨體積表現(xiàn)出劑量依賴的增加。然而，每天相同的劑量以皮下微滲透泵持續(xù)地浸入給藥，其結(jié)果是骨損失。間斷地注射實際上對血清鈣水平不產(chǎn)生效果，而浸入則引起血清鈣劑量依賴的增加，通過這兩種途徑給藥PTH對用四環(huán)素標記所測得的無機質(zhì)添附速率的效果是相同的。還不了解這種不同效果的原因(25)。
已給出對骨生長及其調(diào)控的一般認識，包括骨質(zhì)減少和伴有的失調(diào)疾病的各種途徑的治療被例示于專利文獻中。例如，公開于1992年9月17日的PCT專利申請No.9215615描述了一源于豬胰臟的蛋白，該蛋白的作用為抑制血清鈣水平來治療引起血清鈣水平升高的骨失調(diào)病。公開于1992年9月23日的歐洲專利申請No.504983描述了用二或三肽抑制胱氨酸蛋白酶來治療骨病。公開于1992年9月3日的PCT專利申請No.9214481公開了一種用于誘導(dǎo)骨生長的組合物，該組合物含有活性素(activin)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)。公開于1992年8月19日的歐洲專利申請No.499242描述了細胞生長因子組合物的用途，認為該組合物對包括骨質(zhì)減少的骨病有作用，因為它們引起成骨細胞的增殖。公開于1992年6月17日的PCT專利申請No.40396565描述了一種含有人PTH N—末端1～37片段的藥物。公開于1992年9月16日的歐洲專利申請No.451867描述了甲狀旁腺激素肽的拮抗劑用于治療與鈣或磷酸相關(guān)的代謝障礙，如骨質(zhì)疏松癥。
血清中相對短的PTH半衰期和PTH的間斷注射的相對長效使本研究人員得出假設(shè)，即PTH以某些方式導(dǎo)致誘導(dǎo)第二因子進入循環(huán)系統(tǒng)。因此，已經(jīng)研究在大鼠和人的血清中出現(xiàn)的這樣的第二因子。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，能從大鼠血清中分離出一種多肽物質(zhì)，該物質(zhì)施給不能產(chǎn)生PTH的大鼠(甲狀旁腺切除的大鼠)，產(chǎn)生所觀察的骨無機質(zhì)添附速率的增加，還進一步觀察到至少在所研究的劑量范圍和時間期間內(nèi)，骨添附速率隨著分離物質(zhì)給藥劑量的增加而增加。該物質(zhì)以兩種形態(tài)被分離出來，第一個較大的多肽的分子量大約是第二個較小多肽的二倍。較小多肽最先的11個氨基酸序列已經(jīng)測出，為Gly Pro GlyGly Ala Gly Glu(SEQ ID No2)。較大多肽的最先的7個氨基酸已經(jīng)測出，為Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr lys Pro Ile(SEQ ID No1)。這兩個NH2—末端序列的相似性得出較大的多肽可能是第一肽的二聚體這一見解。
依據(jù)大鼠肽氨基酸順序而合成的一核酸探針用來篩選人類胎兒肝cDNA文庫以便分離編碼人骨添附多肽的核酸序列。根據(jù)其序列而化學(xué)合成了一多肽Gly Ile Gly Lys ArgThr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile lys Pro Asn Thr LeuHis Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn GlnPro(SEQ ID No11)。認為很可能有活性的多肽是前述序列的二聚體，所示序列的兩多肽間通過二硫鍵而形成二聚體。
已經(jīng)觀察到大鼠中骨添附速率的增加依賴于該化學(xué)合成化合物的給藥劑量的增加。
在下面的描述中

圖1是給兔子間隔48小時靜脈內(nèi)注射土霉素，該兔子的骨形成位點的土霉素帶的示跡(tracing)垂直的箭頭標明給定的注射點。“P”表示示跡圖上這些點間的距離。光學(xué)放大倍數(shù)×250；機械放大倍數(shù)×55.6。該距離也能從峰—峰間估測出來。
圖2是MPV—CD儀器用于測量骨無機質(zhì)添附速率的校準線。設(shè)備內(nèi)的顯微鏡方格網(wǎng)被掃描所測的觀察的距離對比方格網(wǎng)距離在方格紙上標出位置。誤差棒表示±1標準差(S.D.)。
圖3是Sephadex G50柱的校準線。該層析柱為內(nèi)徑2.5cm和90cm長。流動相為20mM ris Cl(pH7.2)和50mMNaCl，流速為2.5毫升/分。用人的IgG(MW110K)牛血清白蛋白(MW66K)、卵清蛋白(45K)和細胞色素C(12.4K)作為分子量標準。10毫升餾分時收集要素成分。單一餾分O.D.280的吸收值被表示出來。
圖4表示一些血清組分對骨形成的效果。骨形成速率用四環(huán)素標記來測量。該法的細節(jié)將在文中詳述。根據(jù)分子量大小用凝膠滲透將食用鈣充足飲食(0.5％鈣)的大鼠的血清或食用鈣缺乏飲食(0.1％鈣)分級分離(fractioned)。檢驗餾分(fractions)，分子量在66K和45K之間的(對照組的大鼠數(shù)＝3檢驗組的大鼠數(shù)＝4)，在45K和12.4K之間的(對照組N＝4，檢驗組N＝4)，和在12.4K以下的(每組的N＝4)。用1只250～300g甲狀旁腺摘除的大鼠檢驗來自兩只大鼠血清的餾分。
有3個對照組和3個檢驗組。接受分子量低于12.4K餾分的檢驗組比其相應(yīng)的對照組表現(xiàn)出較高的骨無機質(zhì)添附速率(P＜0.05)。誤差棒表示±1標準差(S.E.)。
圖5至圖9是用C18反相HPLC層析分離來自鈣缺乏大鼠的MW＜12.4K的按大小分的餾分。用高于50％的CH3CN洗脫，55分鐘前的一些洗脫物(run)有一個峰(標為“e”)。當在摘取甲狀旁腺的大鼠上檢驗時，該峰與其它一些峰(標為C.B.D.E)相比表現(xiàn)為有明顯的刺激效果。圖9所示的對照洗脫物來自于正常大鼠的血清。在圖6和圖8中最高的峰記錄是在214nm。
圖10表示C18柱洗脫物質(zhì)的生物活性。共享峰冷凍干燥后用2.5ml緩沖液重新溶解。將其中0.4ml注射到甲狀旁腺摘除的試驗動物中。兩只動物用于作個體峰?！皒”表示個別試驗動物的速率而直方圖代表平均值。因為動物數(shù)少，設(shè)有做統(tǒng)計分析。
圖11表示峰“C”內(nèi)物質(zhì)對骨形成的劑量依賴效應(yīng)。用Belford試劑確定多肽的濃度。第一組的三只大鼠(圖中中間的柱)每只施用6μg，第二組的三只大鼠(最后的柱)每只施用12μg。對照組的三只大鼠(第一柱)接受載體緩沖液。所用的動物是預(yù)先摘除了甲狀旁腺的。存在劑量依賴反應(yīng)(P＜0.05)。誤差棒表示±1標準差(S.E.).
圖12表示鈣缺乏大鼠血清分子量在30～3K之間部分的丙烯酰胺凝膠電泳。將鈣缺乏血清用30K和3K的MWCO(分子量隔斷)膜超過濾來獲得MW在30K和3K之間的部分。將用Belford試劑確定的該部分100μg上樣到15％磷酸丙烯酰胺凝膠上。用100mM pH6.9含0.1％SDS的Tris磷酸制膠。樣品用不含還原劑的100mM pH6.9含0.1％SDS的Tris磷酸在60℃處理30分鐘。然后將樣品上樣，在100V穩(wěn)定電壓下(大約8V/cm)跑2小時后用考馬斯亮藍染色。5條低分子量帶被分辨出來，并將其標記為TA，TB，TE，TF，TG。
圖13表示從丙烯酰胺凝膠電泳帶洗脫下來的物質(zhì)的生物活性。切下凝膠中的帶，將相應(yīng)的聚集起來于20mMTris.Cl(pH7.2)，50mM NaCl，0.1％Triton×1mM DTT和1mMPMST中浸泡48小時。將洗脫物用3.5K的MWCO膜以20mM Tris.Cl(pH7.2)；50mM NaCl，1mMPMST和1mM DTT的緩沖液充分滲析，并濃縮至500ml.用Belford試劑確定蛋白質(zhì)含量。24μg該物質(zhì)用前述的預(yù)先摘除了甲狀旁腺的大鼠進行檢驗。用4只動物作對照組，該組接受載體緩沖液。只有TA帶(n＝3)，TB帶(N＝3)和TE帶(N＝4)含有足夠的用于檢驗的物質(zhì)。TB和TE表現(xiàn)出對骨形成的顯著的刺激作用(P＜0.025)而TA沒表現(xiàn)出效果。誤差表示±1標準差(S.E.)。
圖14是在大腸桿菌中表達的人類多肽的色譜圖(C3柱上的HPLC)。大腸桿菌培養(yǎng)在12,000G離心二次，每次15分鐘。用YMS膜(MWCO 3K)濃縮10次。在用磷酸鈉(pH7.2)濃縮前先將培養(yǎng)基的鹽濃度調(diào)整到100mM。在與那些從人血清中分離的多肽相似的條件下洗脫高分辨的峰，也就是，在CH2CN62～63％時。
圖15描述大腸桿菌中表達的人類多肽對大鼠骨形成的作用。給對照大鼠(N＝6)注射載體緩沖液。給第一組測試組大鼠(N＝4)注射0.7O.D.(280nm)單位的該表達多肽，而給第二測試組大鼠(N＝6)注射0.3O.D單位的多肽。與對照組相比，表達產(chǎn)物表現(xiàn)出生物活性(P＜0.05)。誤差棒表示±IS.D.。
圖16表示人類化學(xué)合成的多肽的麥黃酮SDS電泳凝膠(SEQ ID NO11)。
圖17表示的是大鼠的右下肢股骨的縱切面。下骺由標為A的箭頭指示出來。陰影區(qū)代表所取骨的下干骺端B部分和中干部分。
圖18表示注射了25μg化學(xué)合成的人類多肽的大鼠的骨添附率(μm每天)，第一方柱(N＝9)。給對照組A，第二方柱(N＝9)注射的是含0.1％BSA的0.1％乙酸溶液1ml。給對照組B，第三方柱(n＝7)注射的是煮沸10分鐘以變性BSA的含0.1％BSA的0.1％乙酸溶液。
圖19表示大鼠右下肢股骨的縱切面圖。陰影區(qū)代表所取用于測量骨添附的骨的下骺A部分。骺軟骨由箭頭B指示出來。
血20表示大鼠右下肢股骨的橫切面圖。在下股骺的骨內(nèi)表面所圍的橫紋骨的30個骨形成點上進行骨添附測量。部分區(qū)域顯示已被系統(tǒng)地覆蓋了。短線顯示掃描部分，箭頭顯示為覆蓋該區(qū)顯微鏡的移動狀態(tài)。
圖21圖解描述對化學(xué)合成的人類多肽(SEQ ID NO11)的量劑量依賴的大鼠骨無機質(zhì)添附率(μm每天)對多肽給藥重量(μg)的函數(shù)。
圖22圖解描述對化學(xué)合成的人類多肽(SEQ ID NO11)的量劑量依賴的大鼠骨無機質(zhì)添附率(百分比變化)對多肽給藥重量的函數(shù)。
大鼠甲狀旁腺狀態(tài)的誘導(dǎo)用于誘導(dǎo)甲狀旁腺狀態(tài)的鈣缺乏飲食(目錄#113034，種類#0186—3)購自Dyets，美國賓西法尼亞州18017，Bethlehem，東大街2508。該食含有0.1％的鈣和0.05％的磷。給對照動物用的鈣充足飲食(目錄#113035，種類#01864)含有據(jù)生產(chǎn)商，Dyets，所稱的0.25％的鈣和0.05％的磷。兩種飲食含有濃度為1i.u./g的維生素D。將該食物在食盤(pallet)內(nèi)制成顆粒飼料，每只動物每天喂給10粒顆粒飼料并喂以去除礦質(zhì)的水。給測試動物喂食該飲食2周。
將來自Charles River Laboratory的Sprague—Dawley的大鼠做為標準測試動物。使用購買時體重在200到250g的雄性大鼠，并將其成對養(yǎng)于同一籠子中。四環(huán)素標記以確定大鼠骨無機物的添附率(26)已經(jīng)證明按每kg體重24mg劑量靜脈注射到大鼠體內(nèi)的四環(huán)素在半小時內(nèi)從循環(huán)系統(tǒng)中清除。也就是此時血清中的四環(huán)素水平不能通過活體檢定測得。還已經(jīng)表明間歇標記劑量從6到24mg/kg體重，結(jié)果所測的內(nèi)添附率是一致的。因此，間斷性地施給四環(huán)素，即在此劑量范圍內(nèi)脈沖標記看來是用以研究骨無機物添附令人滿意的骨標記方法。
然而，也還表明，在骨形成點——BMU，礦化的骨基質(zhì)的沉積可能會中斷。當兩劑四環(huán)素的間隔超過7天時，這樣的中斷就很可能發(fā)生。該中斷可能是由于在相同的基質(zhì)表面位點有不只一組成骨細胞相繼被激活的緣故。該成骨細胞的活化可能是隨機的或非隨機的。為了避免這種現(xiàn)象對骨無機質(zhì)沉積速率的測量的影響，標記間的間隔采用48小時。全部采用鹽酸四環(huán)素，該鹽酸四環(huán)素當使用劑量為治療劑量時，其在血清中的半衰期為8小時。
四環(huán)素用遠UV光(即，近藍光區(qū)的范圍)來激發(fā)，并發(fā)出亮黃的熒光，該熒光用熒光顯微鏡觀察在骨切片內(nèi)能被檢測。當新形成的膠原蛋白基質(zhì)開始摻入鈣時用四環(huán)素標記骨表面，而此時切開該表面，四環(huán)素顯示為黃色的熒光帶。后來施給的四環(huán)素顯示為位于第一條帶表面的第二條帶。兩條帶間的距離代表兩劑藥之間間隔期所形成的骨基質(zhì)厚度。切掉不垂直于骨生長表面的那些，誤差就會被引入。為減少該誤差，只采用那些兩條帶清楚明確并相互平行的位點。為達到該要求，在隨機選取的10個位點進行測量，選擇給出接近于速率算術(shù)平均值的讀數(shù)。
所用的測量系統(tǒng)是Leitz掃描光學(xué)顯微鏡光度計MPV—CD，該光度計具有由100W穩(wěn)定的水銀燈提供的UV光源。一般采用移動掃描裂隙用16X接物鏡放大切片。光帶的強度被放大并記錄下來。光信號被轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號輸出并記錄下四環(huán)素強度的剖面。兩強度峰之間的距離作為兩四環(huán)素帶間的距離，如圖1所示。儀器的機械誤差小于5％。測得的距離定期地用顯微鏡方格網(wǎng)校準，并發(fā)現(xiàn)相關(guān)性很好，如圖2所示。用于研究大鼠骨無機質(zhì)添附骨骼位點除非另有指明外，一般選擇右股的下干骺端作為測量點。此點位于下股生長面之上大約1mm處，并向上軸向延伸大約5mm距離。大鼠骨材料的組織學(xué)制備殺死動物后骨樣品從動物內(nèi)分離出來。將骨樣品立即放入由5mM磷酸鹽緩沖液緩沖的10％的福爾馬林水溶液中固定。低的pH將使四環(huán)素從骨基質(zhì)中濾出。經(jīng)過24小時的固定，樣品依下述步驟處理。
然后將樣品包埋于新更換的Spurr介質(zhì)中，并45℃處理24小時；然后再在80℃處理24小時。
用裝有鋁石刀的Leitz切片機鋸將該處理塊切成400μm厚的切片。相對厚的切片在預(yù)先粗糙化的兩研靡磨玻璃平板間磨薄到最終厚度為大約10μm，用水作研磨潤滑劑。將薄刀片干燥并在Permount(Fisher)內(nèi)不染色裝片。用于分析試驗材料對骨添附的效果的大鼠的甲狀旁腺的切除在全身戊巴比妥麻醉下，切除200到250g的雄性Sprague Dawley大鼠的甲狀旁腺。通過反復(fù)冷凍和融化而將該甲狀旁腺破環(huán)。手術(shù)一周后，再次麻醉動物并從尾靜脈采血0.5ml。然后該動物被禁食過夜。第二天上午，該動物再次被麻醉并從尾靜脈采血0.5ml。測量禁食前和禁食后的血清鈣。將在禁食狀態(tài)血清鈣下降到1.8mM或更低作為手術(shù)成功的表示。然后該試驗材料尾靜脈注射或肌肉內(nèi)注射，接下來給第一劑四環(huán)素。48小時后進行第二次四環(huán)素標記，此后24小時通過二氧化碳麻醉殺死該動物。然后取骨樣品做骨無機質(zhì)添附率測量。通過凝膠滲透初步篩選大鼠血清蛋白質(zhì)和肽血清內(nèi)的蛋白質(zhì)和肽的分子量范圍寬并且液里循環(huán)的蛋白質(zhì)和肽的數(shù)量很大。用凝膠滲透初步劃分血定分子大小范圍的血清蛋白組分，并測驗這些分類和順利骨基質(zhì)的添附的生物應(yīng)。材料和方法采用直徑為2.5cm長為90cm的Pharmacia玻璃柱。采用購自Sigma的Sephadex G50提供細?；|(zhì)介質(zhì)。將干Sephadex基質(zhì)(25g)注入100ml的錐形瓶中，加入800ml含0.02％NaN3的去離子水以溶脹干基質(zhì)，室溫下靜置過夜以充分溶脹該基質(zhì)。
Sephadex基質(zhì)溶脹后，柱子的頂端連接一填充池使溶脹的基質(zhì)用大約3小時裝入柱子。然后移去該池，裝置柱子的頂端設(shè)備，并且柱子用含有20mM pH7.2的Tris.Cl和50mMNaCl的緩沖液平衡。緩沖液通過計量蠕動泵(Pharmacia)以每分鐘2.5ml的速率分液。在此步期間，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)進一步裝入柱子里，而且用基質(zhì)周期地再裝柱子直至完全裝是必要的。然后該柱用同一緩沖液在4℃進一步平衡3小時。
用由下列組成的分子量標準樣準Sephadex G50柱
這些試劑購自Sigma，并溶于2ml去離子水中以備上樣。上樣分子量標準，用校準緩沖液以每分2.5ml的速率洗脫，收集了50個10ml餾分。通過Varian UV/VIS分光光度計測量單個餾分在280nm的UV光吸收。
使用了40只在到達實驗室時體重為173到212g的雄性Sprague—Dawley大鼠。其中的4只在實驗過程中生病(診斷為呼吸道感染)，并且被排除掉。剩下的36只大鼠被分成測試組和對照組，每組18只。如前所述。給測試組的大鼠飼喂鈣缺乏飲食而那些對照組的大鼠飼喂鈣充足飲食。然后處死所有的動物并收集血清合并，用比色法和購自Worthington的試劑盒測量合并的血清內(nèi)的鈣和磷濃度。用于凝膠滲透的大鼠血清的制備取自大鼠個體的死后血樣用使用JS4.2轉(zhuǎn)子的Beckman J6B離心機以2000rpm離心15分鐘。將來自同一組大鼠的血清合并在一起。分別加入至濃度為1mM的PMSF(Sigma)和二硫蘇糖醇。然后將血清貯于-85℃冷凍。為使凝膠涌透，將冷凍血清融化后用使用JA17轉(zhuǎn)子的BeckmanJ2—21離心機以12,000g離心30分鐘以去除樣品中的顆粒物質(zhì)和脂類。處理過的大鼠血清的凝膠滲透層析上樣10ml血清，用同平衡相同的緩中液層析。上樣前，柱子用緩沖液平衡3小時，然后從每分鐘2.5ml的速率跑樣品，洗脫物以10ml的餾分收集。
根據(jù)分子量將收集的餾分合并，然后使用2.5cm寬的MWCO3500的Spectrophor透析袋在含有PMSF和DTT各1mM的100mlpH7.2的20mM的TrisCl中透析。透析在4℃換三次透析緩沖液，持續(xù)24小時以上。然后將透析過的樣品在Virtus冷凍干燥器內(nèi)冷凍干燥，并于-20℃貯存。血清餾分的生物活性的檢測由于餾分內(nèi)的組分濃度的差異，按重量比較餾分間的活性有一定的難度。任意地，將來自兩只大鼠的個餾分施給一只試驗動物。該劑溶于0.5ml pH7.2mM的20mM Tris.Cl和50mM NaCl中，并肌肉內(nèi)注射到1只PTX試驗動物內(nèi)。然后立即按前面所述方式靜脈給藥鹽酸四環(huán)素。24小時后靜脈給藥另一劑四環(huán)素，24小時以后，殺死該大鼠，并且如前述估測骨無機質(zhì)天附率。包括大鼠多肽分離的初步結(jié)果分子量標準參照物的洗脫分布圖示于圖3和表1。
表1凝膠滲透的分子量標準的洗脫圖
在來源于鈣缺乏飲食和鈣充足飲食的大鼠血清中的鈣和磷濃度之間沒有發(fā)現(xiàn)確定的差異，盡管前者的鈣濃度看起來低一些(2.25mM對應(yīng)于鈣充足飲食大鼠血清的2.85mM)。前者的磷濃度為0.33mM而后者為0.43mM。這些差異可能是飲食鈣缺乏飲食的大鼠的代償性次級甲狀旁腺機能亢進的結(jié)果。然而，此點通過對飲食鈣缺乏飲食大鼠內(nèi)PTH分析還沒有得到證實。
根據(jù)由表1所示的分子量范圍將來自對照和試驗的動物血清餾分合并在一起。
40只切除甲狀旁腺的大鼠中，只有25只從手術(shù)中活了過來。這25只大鼠非禁食狀態(tài)的血清鈣為2.57±S.D.0.05mM，而禁食狀態(tài)的血清鈣為1.70±S.D.0.04mM。結(jié)論是這些動物的手術(shù)是成功的。對分子量大于110,000和在110,000和66,000之間的餾分設(shè)有做測試，因為出現(xiàn)的蛋白質(zhì)的量太大以致于無法在對動物無副作用的情況下以單一劑量投藥。因此，對鈣充足飲食血清和鈣缺乏飲食血清只有3個餾分做了測試。每個餾分，用4只動物，一只接受鈣充足血清分子量在66,000和45,000之間餾分的大鼠，在麻醉狀態(tài)下靜脈施給四環(huán)素時死了。結(jié)果示于圖4。
發(fā)現(xiàn)在接受分子量小于14,500的鈣充足餾分的大鼠和接受鈣缺乏血清相應(yīng)餾分的大鼠的骨無機質(zhì)添附率之間存在統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(P＜0.05)。這些初步結(jié)果表明含有分子量小于14,500組分的血清餾分對礦化的骨基質(zhì)的添附率只有刺激效應(yīng)。自鈣缺乏大鼠血清中獲得的含有低分子量血清組分的試驗材料和方法采用每只體重在200g和250g之間的50只雄性Sprague—Danley大鼠。該鼠的一半喂以鈣缺乏飲食，一半喂以鈣充足飲食。飼喂特定的飲食2周后，用二氧化碳麻醉法殺死這些大鼠。死后通過心臟穿刺立即將尸體血液采集到血清真空管中。在Beckman J6B離心機內(nèi)以2000rpm在4℃離心20分鐘以收集血清。按照測試血清(鈣缺乏)和對照血清(鈣充足)將血清樣品合并起來，并取100μl用于測量鈣和磷的濃度。分別加入PMSF(苯甲基磺酰氟)和DTT(二硫蘇糖醇)至濃度為1mM。然后血清在-85℃冷凍。大鼠血清分級分離步驟凝膠滲透接著進行反相HPLC
按上面所述用Sephadex G50柱進行初步凝膠滲透。收集分子量小于14,500的餾分，透析和冷凍干燥如前所述。
冷凍干燥的材料溶于由pH7.5 25mM Tris.Cl；150mMNaCl；1mM PMSF和1mM DTT組成的5ml緩沖液中。發(fā)現(xiàn)一些材料不能溶解，并將其通過使用JA17轉(zhuǎn)子的Beckman J2—21離心機在12,000g離心沉淀下來并棄去。取800μl溶解的材料用于做蛋白質(zhì)測定。
相應(yīng)地，將含0.5mg材料1ml的上述緩沖液在上樣前通過Hewlett Packer樣品過濾器使之過濾。所用的柱子是購自Beckman的2.12×150cm的預(yù)先制備好的C18柱。溶劑傳遞系統(tǒng)是具有BeckmanUV Model 167探測器的BeckmanGradient Solvent Model 126傳遞系統(tǒng)。用Beckman System Gold軟件分析數(shù)據(jù)，通過—Valco注射器手工注射樣品，并以每分鐘2ml的流速洗脫。梯度設(shè)置如下溶劑A含0.1％三氟乙酸的水溶液溶劑B含0.1％三氟乙酸的95％的乙腈水溶液方案0～5’ 100％A 0％5～75’ 40％A 60％B75～80’100％A 0％B80’終止將洗脫組分每0.5分鐘收集于Gilson流分收集器Model202內(nèi)并將4輪洗脫相應(yīng)的峰合并在一起進行冷凍干燥。
發(fā)現(xiàn)合并的試驗血清的鈣濃度為2.50mM而合并的對照血清的為0.45mM。冷凍干燥后再次溶解的材料的蛋白質(zhì)濃度，對試驗樣品為1.2mg/ml而對照樣品為1.5m/ml。試驗和對照材料的洗脫分布圖形示于圖5～9。發(fā)現(xiàn)在試驗血清和對照血清的不同輪次間的洗脫分布圖形有一些差別。試驗材料的4輪洗脫中的3輪就在55分鐘前有一特征洗脫峰。而對照恰在55分鐘之后出現(xiàn)2個峰。自鈣缺乏血清的大鼠血清獲得的餾分對骨添附率的試驗材料和方法只對試驗血清進行了不同餾分對礦化骨添附率效應(yīng)的生物試驗。這些試驗的目的是找出一具有生物活性的組分。4輪相應(yīng)的峰合并在一起并溶于2.5ml 10mM pH7.2的trisCl和50mM NaCl中。0.8ml的材料用于測驗，其余的材料冷凍起來備用。
切除10只Sprague—Dawley大鼠的甲狀旁腺并將每個峰0.4ml的材料注射到每只試驗動物內(nèi)。用2只動物作圖5A至8標為A至E的收集的5個峰。按已經(jīng)描述過的方法通過四環(huán)素標記估測骨無機質(zhì)添附率。
試驗的5個峰中，對骨無機質(zhì)添附率峰A，B，D和E顯示大致相同的效果，而峰C似乎引起比其它組較高的速率。參見圖10。骨無機質(zhì)添附率對用反相HPLC自大鼠血清分需的一特別餾分的劑量依賴將峰C(1.7ml)材料融化，取400μl并稀釋到800μl用Belford方法測定其蛋白質(zhì)濃度。用相同的溶解緩沖液將剩余部分調(diào)整到每100μl 3μg的濃度，并將9只大鼠的甲狀旁腺切除，其非禁食和禁食的血清鈣濃度表示手術(shù)是成功的。3只大鼠通過靜脈注射接受200μl體積來自峰C試驗材料6μg。3只大鼠接受注射體積用溶解緩沖液調(diào)整到200μl的該試驗材料3μg。3只大鼠接受200μl溶解緩沖液，用作對照。用前面描述的方法測定骨無機質(zhì)添附率。
發(fā)現(xiàn)對照大鼠的添附率為0.81μm/天(S.D.＝0.09)；接受峰C3μg的大鼠，1％15μm/天(S.D.＝0.23)；而接受峰C6μg的大鼠，2.36μm/天(S.D.＝0.25)在組間存在顯著差異(P＜0.05)。參見圖11。
因此已經(jīng)證明喂食鈣缺乏飲食2周的大鼠，發(fā)現(xiàn)其血清內(nèi)的一類蛋白蛋或肽能刺激大鼠內(nèi)無機質(zhì)骨的添附。對1只大約300g的大鼠，這種效應(yīng)為直至6μg的劑量依賴。對來自鈣缺乏飲食大鼠血清的低分子量分的電泳分級分離具有分子量小于30,000的血清組分通過分子量聚丙烯酰胺凝膠電泳層析分離。材料和方法飼喂20只Sprague—Dawley雄性大鼠鈣缺乏飲食3周。其時的體重在209到245g之間。飼喂2周后，其體重在248到302g之間。然后通過二氧化碳麻醉殺死大鼠并通過心臟穿刺采死后的血液。按前述方法收集血清樣品并合并在一起。發(fā)現(xiàn)血清鈣為2.56mM和磷為0.33mM。血清的總體積為92ml。分別加入PMSF和DTT至1mM。然后將血清在使用JA17轉(zhuǎn)子的Beckman J2—21離心機內(nèi)以12,000g離心30分鐘。
收集分子量在3,000到30,000之間的餾分，并且以超過濾濃縮。首先將血清在具有YM30膜的50ml Amicon濃縮器內(nèi)超過濾，分子分界(cut—off)點為30,000。收集濾液。當滯留體積自最初的92ml降到10ml時，加入由10mM pH7.2Tris.Cl，50Mm NaCl，1mM PMSF和1mM DTT組成的緩沖液40ml，并進一步進行超過濾直至滯留體積再次降至10ml。將第二次濾液和第一次的合并，棄去最終的滯留體積。
用具有分子分界點為3,000的YM3膜的相同的設(shè)備將合并的濾液進一步超過濾。這次棄去濾液而保留滯留體積。當滯留體積降至10ml時，加入同樣的緩沖液40ml并繼續(xù)進行超過濾。重復(fù)此步驟一次。當最終的滯留體積降至10ml時，將其轉(zhuǎn)移至一10ml容量的Amicon濃縮器內(nèi)，進一步濃縮至終體積為1ml。超過濾在4℃每平方英寸55磅預(yù)先純化的氮氣條件下進行。丙烯酰胺凝膠電泳采用Hoeffer Mighty Small垂直凝膠儀。制0.75mm厚15％磷酸凝膠制備并運引如下分離膠30％丙烯酰胺(19∶1)15ml1M Tris.磷酸pH6.9 3ml10％SDS0.3ml10％過硫酸胺 150μlTEMED 50μl
加水至30ml積層膠30％丙烯酰胺(19∶1) 2.3ml1M Tris.磷酸pH6.9 1ml10％SDS 50ml10％過硫酸胺 30μlTEMED 30μl加水至10ml跑膠緩沖液1M Tris.磷酸pH6.9 15ml10％SDS 3ml加水至300ml凝膠在100V直流電壓下預(yù)先跑膠30分鐘。樣品在100V恒壓下跑2小時。通過該儀器的冷卻裝置使水在20℃循環(huán)。
用Belford方法估測蛋白質(zhì)濃度。向樣品內(nèi)加入終濃度等于電泳緩沖液里濃度的pH6.9的Tris.磷酸和SDS。調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至每15μl100μg。樣品的總體積為1.65ml。樣品上樣前在60℃溫育30分鐘?！狟DH的低分子量標準參照物以同樣品同樣的方式進行處理。將每個標準參照物的濃度調(diào)整到為每12ml1μg。15μl的樣品和標準參照物上樣于0.5cm寬的孔中?！姿崮z電泳的結(jié)果示于圖12。有一個巨大的和幾個高分子量的窄帶。也出現(xiàn)了幾個低分子量的帶，它們被標為TA，至TE。丙烯酰胺凝膠分級分離的大鼠血清組分的生物活性。
對圖12所示的磷酸凝膠的各帶進行了生物活性檢驗。
前面部分超過濾樣品剩下的1.5ml經(jīng)層析后用于檢驗。用由100mM Tris.磷酸(pH6.9)，0.1％SDS組成的相同的上樣緩沖液調(diào)整樣品的濃度。然后在上樣前將調(diào)整后的樣品有60C溫育30分鐘。
以前面部分相同的方式制備丙烯酰胺凝膠，只是凝膠厚度為1mm除外。上樣體積為每槽20μl。凝膠預(yù)先跑膠半小時，樣品在100V恒壓下電泳2小時。總體積1.5ml跑10個凝膠。
不檢驗高分子量的材料。用考馬斯亮藍染色后將TA至TE的5條帶切下。將各帶合并起來并將其在硅化的玻璃試管內(nèi)研磨成碎塊，并在4℃將其浸于5ml緩沖內(nèi)24小時，該緩沖液由10mM Tris.Cl(pH7.2)，50mM NaCl，1mM DTT，1mM PMSF 0.1％Triton X—100組成。然后將浸泡緩沖液轉(zhuǎn)入MWCO3500的Spectrophor透析袋中。材料用100X體積的由Tris.Cl(pH7.)，50mM NaCl和lmM DTT組成的緩沖液在4℃，更換5次緩沖液透析48小時。然后將透析過的樣品用使用具有MWCO3,000的YM3膜的Amicon 10ml容量的濃縮器進行濃縮。
用水將樣品(80μl)稀釋至800μl并用Belford方法估測其蛋白質(zhì)濃度。用透析緩沖液將材料的濃度調(diào)整至每100μl12μg。
按上面所述的方法將16只雄性Sprague—Dawley大鼠的甲狀旁腺切除，進行四環(huán)素標記檢驗。其前—PTX和后—PTX血清鈣水平分別為2.51(S.D.＝0.002)和1.53(S.D.＝0.001)。給每只動物注射試驗材料(200μl)。4只大鼠用于檢驗每條帶洗脫的材料的活性。給4只對照組大鼠注射載體緩沖液200μl。
收集的5條帶中的3條含有足夠檢驗的材料，可得到的材料的量為帶TE50μg，帶TB55μg和帶TA59μg。帶TC和TD的蛋白質(zhì)濃度太低以致于不能檢出。沒對這些帶進行檢驗。在尾靜脈穿刺的麻醉過程中1只接受TA的大鼠和1只接受TB的大鼠死亡。
圖13表示試驗材料對甲狀旁腺切除的大鼠的骨無機質(zhì)添附率的效應(yīng)。接受緩沖液的對照組大鼠表現(xiàn)的添附著為1.27μm/天(S.D.＝0.21)。接受試驗材料的大鼠對帶TA，TB和TE而言分別為1.27μm/天(S.D.＝0.21)，2.14μm/天(S.D.＝0.14)和2.24μm/天(S.D.＝0.28)。帶TB和帶TE的速率顯著地高于對照組和帶TA的速率(P＜0.025)。似乎因不明的原因該試驗中對照組大鼠較前面試驗的高。
因此看來至少存在兩個活性多肽，分子量為大約6至6.5千道爾頓(TB)和12至13千道爾頓(TE)。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，還不知道此兩肽之間的關(guān)系。測定分離自大鼠血清組分的電泳分級發(fā)離的帶的氨基酸序列材料和方法將前面超過濾的材料100μl用于測序。用下列組成100mM Tris磷酸pH6.9；0.1％SDS；1mM DTT；和50mMNaCl的緩沖液將材料稀釋成濃度為15μl內(nèi)100μg。按前面部分描述的相同的方式進行磷酸凝膠電泳。凝膠厚度為1mm。5個泳道上樣100μl使用BDH作低分子量標準。采用小型的Hoeffer蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移儀。將凝膠放到PVDF膜(Millipore)上并在250伏恒壓下轉(zhuǎn)移1小時。采用雙層膜以保證所有的蛋白質(zhì)被膜捕獲。轉(zhuǎn)移后，該膜用考馬斯亮藍染色。切下各條帶用于標記。
按照熟知的步驟在測序?qū)嶒炇覝y得的序列為TB序列(SEQ ID NO1)Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu ThrLys Pro IleTE序列(SEQ ID NO2)Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu因此發(fā)現(xiàn)TB和TE之間是有關(guān)系的，在于其N—末端的至少前6個氨基酸具有相同的氨基酸序列。從這些結(jié)果還不能搞清TB是否是TE的活性片段或者TE是TB的二聚體或多聚體。包括合成人類多肽的試驗編碼循環(huán)多肽的DNA序列的人類cDNA文庫的篩選根據(jù)測得的自大鼠血清中分離的多肽的氨基酸順序合成核酸探針，并進行人類cDNA文庫的篩選。已知合成循環(huán)血清肽和蛋白質(zhì)的一個主要位點是肝臟并且已有報道得慢性肝病的病人經(jīng)?；脊菗p失。因此，篩選來源于肝組織的人類cDNA文庫。材料和方法從胎文庫中分離cDNA采用來源于Clontech的人類cDNA文庫。從妊娠22周的不辨性別的人類胎兒制備該文庫。母親的血型是O型(目錄#HL1064A)。用寡聚dT引物做分離的肝mRNA的引物，用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一條鏈，接下來Sl核酸消化并收由DNA聚合酶合成第二條鏈，把ECoRl接頭和平端雙鏈cDNA連續(xù)起來并克隆到入gt10上。
然后進行cDNA文庫的繁殖。用SM培養(yǎng)基對該文庫進行一系列稀釋。制備含有0.2％麥芽糖的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)的高頻溶源化的大腸肝菌C600培養(yǎng)物，并且使培養(yǎng)物在穩(wěn)定的晚生長期培養(yǎng)(通常是過夜培養(yǎng))。向100μl體積的稀釋的文庫懸浮液中加入SM300μl和600μl高頻溶源化的大肝桿菌C600過夜培養(yǎng)物，并且，在37℃溫育20分鐘。將該懸浮液加到3ml0.7％的瓊脂糖頂層瓊脂上，并在50℃保持熔化狀態(tài)。將其立即倒入預(yù)溫到37℃的90mm的圓形LB瓊脂平板內(nèi)，使頂層的軟瓊脂糖在室溫下固化。并將培養(yǎng)皿在37℃溫育直至噬菌斑可見時為止，即，直徑稍小于1mm。記錄每個平板上稀釋效應(yīng)為30,000的噬菌斑，并用于進一步的繁殖。
然后將cDNA文庫固定到硝酸纖維素膜上。每個cDNA文庫以每個90mm平板以30,000個噬菌斑的濃度鋪極。當噬菌斑長至直徑略小于1mm時，平板在4℃冷凍過夜。接著第二天，將硝酸纖維素濾紙(0.45u購自Amersham)鋪到軟瓊脂糖的上面并停留3分鐘。為將來使膜(或?qū)⑵浞派錁擞?和平板對應(yīng)起來在3處或更多處不對稱地用針刺入膜和瓊脂平板。然后將膜揭下，使DNA面朝上將其置于含有0.4N NaOH的培養(yǎng)皿中，并在原位漂浮20分鐘。此后將其轉(zhuǎn)移到6×SSC中20分鐘，并空氣干燥以備雜交。
采用亞磷酰胺化學(xué)通過Cyclone—plus寡聚核苷酸合成儀(Milligen)合成32聚體的寡核苷酸探針。合成該探針余下的完整的DMT基團用后來的反相HPLC純化。以0.2微摩爾的規(guī)模合成該探針。合成后，探針用4ml氫氧化銨在室溫下去保護24小時。去保護的材料分4等分在Speed—vae濃縮器內(nèi)干燥。所用的核酸探針的序列(SEQ ID NO3)Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro5′-GG(TC)CC(TC)GG(TC)GG(TC)GC(TC)GG(TC)GA(AG)AC(TC)AA(AG)CC(TC)AT-3′括號內(nèi)的堿基表示簡并密碼子。給出了對應(yīng)于核苷酸的假定蛋白質(zhì)鑒定序列(identifier)SEQ ID NO4。
用反相HPLC純化該探針。將1等分干燥的材料溶于1ml 100mM的TEAA(pH7.0)中。通過Hewlett Packer樣品過濾器過濾該樣品并將其上柱到7.5×150mm的Beckman半制備的Cl8柱子上。樣品以前述方法在Beckman設(shè)備內(nèi)層析。梯度設(shè)計如下容劑A100mM TEAA pH7.2溶劑B乙腈時間(分鐘)持續(xù)
0 95％A5％B5 80％A40％B152550％A50％B104095％A5％B 565終止不成功的序列先洗脫下來，完整的序列在大約35分鐘時后洗脫下來。將峰收集起來并干燥。然后加入1％TFA以脫去DMT的三苯甲基，并再次干燥。干燥后加入100μl體積的3％的氫氧化銨以中和殘余的TFA。將材料再次干燥并重新溶于水中。將100μl溶解的材料通過0.1ml的G25旋轉(zhuǎn)柱子然后并通過260nm的光吸收測量DNA的濃度。260nmlO.D.單位視為代表濃度的為每毫升33μg。
然后探針用激酶作用。50pmol的探針和50pmol的活性為每mM＞3,000Ci 10μci/μl的32P標記的ATP(Pharmacia)用T4 DNA激酶(Pharmacia)作用。
然后使探針和固化在硝酸纖維素膜上的DNA雜交。將干燥的硝酸纖維素膜在預(yù)雜交液里于42℃溫育2小時。體積為50μl。然后加入標記的50mol該探針，并使之在42℃過夜雜交。50ml雜交液里膜的數(shù)量為50張。第二天，用2×SSC300ml在室溫下洗膜4次，每次5分鐘。然后將膜在50ml1×SSC內(nèi)于68℃溫育1小時，于室溫用1×SSC漂洗一閃并且干燥。將1μl體積的放射性墨水(0.5ml發(fā)出1000cps)點到濾膜的穿刺部分以標記膜的位置。然后將膜于85℃曝光18小時到具有增感屏的Amersham高級膠片上。沖洗膠片并結(jié)合瓊脂糖平板以鑒定克隆。挑出陽性克隆并重新在瓊脂糖平板內(nèi)繁殖一次并重新雜交以進行肯定。
篩選了大約300,000噬菌斑后鑒定了1個陽性克隆。人類循環(huán)的骨生長因子的cDNA序列的擴增該cDNA在克按照Maniatic等(27)的步驟進行擴增。用無菌的巴斯德吸管挑取陽性噬菌斑HL1—7，并將其置于1ml的60％的SM和40％的甘油中，先在37℃放置2小時，然后在4℃放置過液。
將高頻溶源化大腸桿菌C600的1個菌落接種到100ml含0.2％麥芽糖的LB液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物37℃在200rpm的振蕩恒溫箱(Queue)中過夜生長。第二天早晨，將HL1—7的懸浮液100μl接種到300μ1的SM和600μl高頻溶源化的大腸桿菌μlC600的過夜培養(yǎng)物中并于37℃溫育20分鐘。然后將一接種環(huán)的該培養(yǎng)物劃線接種到LB瓊脂平板上，并于30℃溫育直至肉眼可見的菌落出現(xiàn)為止。選取幾個菌落并將其標號并將每個菌落劃線接種到兩個LB瓊脂平板上。
將一個平板上30℃溫育而另一個在40℃溫育。只有那些在30℃溫育而另一個在40℃溫育。只有那些在30℃生長而在40℃裂解的菌落用于HL1—7的繁殖。
將1個HL1—7溶源化的菌落接種于含0.2％麥芽糖的10ml的LB液體培養(yǎng)基中，并在振蕩搖床中于30℃培養(yǎng)直到培養(yǎng)物變稠。測量600nm的O.D值。600nm的1O.D.單位被視為代表的濃度為每ml含8×108個大腸桿菌細胞。用500ml體積的預(yù)溫的NZCYM培養(yǎng)基接種1010個細胞并用另500ml培養(yǎng)基做類似的接種。兩瓶培養(yǎng)基于37℃在200rpm的振蕩恒溫箱中過夜培養(yǎng)。第二天早晨，向每500ml的培養(yǎng)物中加入10ml氯仿，并繼續(xù)溫育30分鐘。當培養(yǎng)物冷卻至室溫后，向其中加入DNA酶和RNA酶A至濃度為每ml1μg。培養(yǎng)物于室溫保持半小時，并向其中加入NaCl至濃度為1M。將培養(yǎng)物置冰上半小時然后將細菌碎片用不超過11,000g力離心下來。向每500ml培養(yǎng)物中加入量為50g的PEG8000，當該PEG溶解后，將該培養(yǎng)物另外在冰上保持1小時。于4℃以11,000g離心10分鐘將噬菌體沉淀下來，并棄去上清液。將沉淀重新懸浮于16ml的TM中，并用等體積的氯仿抽提該溶液。向水相中加入4ml甘油并按下述制備梯度濃度。
向超透明的Beckman超離心管底加一層CsCl(比重1.6)，并在底層之上鋪一層CsCl(比重1.4)。將HL1—7懸浮液鋪到CsCl梯度上。于4℃用使用了Ti6O固定角轉(zhuǎn)子的BeckmanL8—70超速離心機于35,000rpm離心兩小時。在兩層CsCl梯度之間噬菌體顆粒顯示為藍色的帶。用與注射器相連的針頭，通過刺穿管壁，將噬菌體顆粒自離心管中吸出。該懸浮液用苯酚抽提一次，然后用苯/氯仿1∶1抽提一次，然后再用氯仿抽提兩次，用乙醇沉淀以重新收集噬菌體DNA(加入濃度為0.5M的NaCl和兩倍體積的乙醇，在-85℃冷凍10分鐘)。通過260nm處的光吸收估測存在的DNA插入片段的大小。將15μg的HL1—7DNA在150μl體積的消化緩沖液中消化，該消化緩沖液由2×的Pharmacia one—phor—all緩沖液組成。用25單位的ECoRl(Pharmacia)于35℃消化1.5小時，消化后按前述方法用苯酚氯仿抽提純化DNA，并用乙醇沉淀。倒注0.5cm后1.2％seakem GTG級的瓊脂糖凝膠。采用具有5個孔，孔寬為8mm的梳子。將消化的DNA上樣到一個孔中，并且用PharmaciaΦ×174標準物作標準。以每厘米凝膠8V的電壓在TBE緩沖液中跑膠，然后凝膠用溴化乙錠染色。
通過毛細管電泳用濃度為10μg/ml的DNA水溶液確定大小。電泳緩沖液為89mM的硼酸和89mM Tris pH8.5，2mM的EDTA和0.5％的羥丙基甲基纖維素(Sigma)。儀器為Beckman毛細管電泳儀，Model 2100。以電動力(electrokineticforce)7kV作用7秒將樣品引入到27cm長DB17包被的內(nèi)徑為100μm的毛細管內(nèi)(JBW Scientiflc Inc)。接下來通過壓力注射5秒鐘進行水塞的壓力注射。在6.25kV恒壓下進行電泳12分鐘。用Beckman System Gold Software記錄260nm處的吸收值。采用Boehringer Manheim DNA分子標準參照物VI作標準。
然后將噬菌體DNA進行PCR擴增。通過乙醇沉淀將噬菌體DNA從1ml噬菌體懸浮液中沉淀下來。與噬菌體相連的蛋白質(zhì)用4M高氯酸鈉剝離，接著用苯酚/氯仿抽提兩次，然后再用氯仿抽提兩次。用乙醇沉淀兩次重新收集DNA用水通過centricon 30(Amicon)進行洗滌。用水將DNA溶液的終體積調(diào)整到0.5ml。
用熱循環(huán)儀(thermocycler)(M.J.Research Inc.)進行PCR。緩沖液由50mM KCl，10mM TrisCl(pH8.3)，2.5mMMgCl2，0.1％明膠，0.45％Tween 20和0.4％的NP40組成。緩沖液含有每種擴增引物(Clontech目錄#5411)50pmol，125mM的dNTPs，1mM的DTI和2.5單位的Tag DNA聚合酶。將10μl體積的純化的噬菌體用作模板。一引物與HindIII位點5′上游的ECoR1位點結(jié)合，該引物序列如下5′—AAGCTT CAC ACC ACG AAC CAG—3′(SEQ ID NO5)。另一引物與HL1—7ECoR1位點3′端下游結(jié)合，其序列如下5′—TTA TGA GTA TTT CTT CAA GGG—3′(SEQ ID NO6)。
PCR方案如下步驟(分鐘)溫度(℃)時間1 95 52 96 13 74 34 95 15 56 16 74 37 循環(huán)步驟4-630圈8 95 19 56 11074 7114 512停止產(chǎn)物用氯仿/苯酚抽提一次，用氯仿抽提兩次，乙醇沉淀并重新溶于100μl水中。每升培養(yǎng)物噬菌體DNA的產(chǎn)量為大約15到18μg。重新收集的DNA其260與280的比值為大約1.7，具有適當?shù)募兌取?br> 通過瓊脂糖電泳和毛細管電泳兩者確定大小的結(jié)果顯示該插入片段為大約300堿基對。毛細管電泳所觀察到的大小為大約600堿基對，不過其中包括來自載體5′端的285額外堿基對(HindIII到ECoR1位點)噬菌體HL1—7cDNA的測序15μg的噬菌體DNA用氫氧化鈉變性并用乙酸鈉(pH4.5)和乙醇使其沉淀。該DNA與引物(Clontech Ca#6184和6186)中的一個退火。用Pharmacia T7DNA聚合酶測序試劑盒通過Sanger雙脫氧鏈終止法進行測序。用32P dATP(Amersham比活性)3,000 ci/mM和10μCi/μl)作放射性標記。使用Base Runner Unit(IBI)于45cm長的凝膠內(nèi)測序。進行測序的恒定功率為45瓦。跑完膠后，干燥凝膠并在-85℃下使之曝光到Amersham Hyperfilm片上，并沖洗之。
測序的結(jié)果如下如示。成熟的CDIA編碼53個氨基酸。前17個氨基酸可能代表信號序列。TTT GGC TTT ATT CAT AGC GGT AAT TAA TGA TCA AGA CAG TTG ATT ACTMet Thr Ala Gln Asn Thr Asp LeuCGT AAG CAC TAT TAA AAA TTT GCA ATG ACT GCT CAA AAT ACA GAC CTTAsn Gln Leu Ser Asn Ser Phe Thr Leu Gly Ile Gly Lys Arg Thr AsnAAC CAA CTA TCC AAC AGT TTC ACT TTA GGG ATC GGA AAA CGA ACA AATGlu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys LysGAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAAAla Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro TERGCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA TAA AGG ATCTGC AGC TTA TGT CTT CTA GTT TAT CTT TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAGACT TTA ATG GTA ATT GCC AAA ATC AAC CAT AAA GGA TCT GC上面所列的核酸序列被定為SEQ ID NO7；其氨基酸序列被定為SEQ ID NO8。減去前導(dǎo)肽的該多肽大小為大約4000。其大小相應(yīng)于自大鼠血清中分離的多肽的TB帶的大小。
將含有上述序列一部分的核酸序列定為SEQ ID NO9，如下面部分所描述其接下來被克隆到表達質(zhì)粒內(nèi)。應(yīng)理解為本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用適當?shù)牟⒎沁@里連用的載體和表達媒介物能夠。得到類似的結(jié)果。
來源子在類兒肝臟cDNA文庫的DNA序列編碼部分的表達。
將通過合成寡聚核苷酸合成的下列序列克隆到質(zhì)粒中從用于表達。ECoR 1START Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His ThrAATTCTTAGGATCCTAGGATG GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACGGAATCCTAGGATCCTAC CCC TAG CCT TTT GCT TGT TTA CTT GTA TGCAla Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala GluGCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAGCGT CTA ACA TTT TAA TTT GGC TTG TGG AAC GTA TTT TTT CGA CGT CTCThr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro TERACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT GAA CCA TAA AGA TCT TGA TCGA -5TGA AAT TAC CAG GAA CTG GTT TTA CTT GGT ATT TCT AGA ACT HIND III將上面所列的核酸序列的有意鏈定為SEQ ID NO9；該序列的反意鏈定為SEQ ID NO10；并將上面列出的多肽順序定為SEQ ID NO11。
此結(jié)構(gòu)中存在以連接到pUC8質(zhì)粒中由ECoRl和HindIII剪接的兩個限制位點。然后將構(gòu)建的質(zhì)粒引入大腸桿菌JM103菌株。通過在含有每ml35μg氨芐青霉素的LB瓊脂板上鋪板挑選轉(zhuǎn)化克隆。
所構(gòu)建的序列不包括被認為在cDNA克隆內(nèi)編碼的信號序列。其氨基酸順序Gly—Ile—Gly—Lys—同大鼠多肽的前四個氨基酸順序具相似性，推測其為人類多肽的成熟肽的起點。
將細菌在Terrific培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時以達到緩慢生長期，Terrific培養(yǎng)基由17mM pH7.2的磷酸鉀緩沖液，4％的甘油和35μg/ml的氨芐青霉素從及LB培養(yǎng)基中的胰蛋白胨和酵母膏組成。8小時培養(yǎng)后，稍離心沉淀下細菌以更換為表達培養(yǎng)基。表達培養(yǎng)基的組成為2％的酪蛋白氨基酸；17mM磷酸緩沖液(pH7.2)；4％的甘油；40μm的維生素B1；2mM IPTG；和35μg.ml的氨芐青霉素。
將細菌沉淀物用同原初Terrific培養(yǎng)基體積相等體積的該培養(yǎng)基重新懸浮。于37℃在200rpm的振蕩恒溫箱中繼續(xù)過夜培養(yǎng)。
將培養(yǎng)物稍離心兩次(于12,000g，每次15分鐘)，以使細菌全部沉淀下來。然后用YM3膜將培養(yǎng)基濃縮10次。在與前面所述相同的條件下，將1ml體積的該材料用C3反相HPLC。
用大約含62～63％的乙腈洗脫得到單一高分辨的峰。洗脫時間同自人類血清中分離多肽的時間相同，并被示于圖14。自50ml的培養(yǎng)物中，能獲得純化后用Belford試劑估測為大約1mg的多肽。表達產(chǎn)物的生物活性。
用400～420g的完好的雄性大鼠做檢驗。對照組接受50mM磷酸鈉載體緩沖液(pH7.2)。一個試驗組接受0.7O.D.單位的表達多肽，而另一試驗組接受0.3O.D.單位的該多肽。如圖15所示，表達產(chǎn)物表面為對骨形成具有刺激效應(yīng)。
按照傳統(tǒng)的固相化學(xué)法(28)合成具有與由cDNA文庫(SEQ ID NO7)的選擇核酸序列相對應(yīng)的氨基酸順序的多肽。選擇的序列如下(SEQ ID NO11)；Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile LysPro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu AspGln Asn Gln Pro根據(jù)其HPLC圖譜，合成肽的純度為99％。分別通過質(zhì)譜儀和氨基酸順序分析對該肽進行鑒定。觀察到的分子質(zhì)量確定為4043.36道爾頓，而其單體的理論質(zhì)量為4043.66道爾頓。該肽的氨基酸分析如下
Asp(5)5.23，Thr(4)3.74，Glu(4)4.49，Gly(2)1.72，Ala (3)3.09，Val(1)1.09，Met(1)1.04，Ile(2)1.54，Leu(3)3.20，His(2)2.07，Lys(5)4.90，Arg(1)0.99，Pro(2)2.15.
使用前，將15mg的多肽溶于15ml0.1％的乙酸中，將其分成1ml等分的15份，并進行冷凍干燥。將該肽貯有于-20℃。
檢驗前，將合成的多肽進行Tricine SDS凝膠電泳。從圖16可見，大部分的多肽以二聚體形式存在。
通過將1等分的肽(1mg)溶于1ml去離子水中來制備給藥該藥的檢驗溶液，使其濃度為每μl1μg。向350μl該液中加入溶于0.1％乙酸的1％熱滅活的BSA(參見下一自然段)至終體積為14ml。得到的終肽濃度為每ml25μg。
通過將0.5g的BSA(Sigma)溶于40ml去離子水中制備牛血清。加入50μl乙酸后，用去離子水將體積加至總體積為50ml。因此，該最終組合物為0.1％乙酸的1％的BSA。將此注射載體在56℃水浴中溫育90分鐘以滅活BSA。將該溶液于4℃貯存。
通過將350μl的該肽溶解于去離子水中以制備用于對照組B的熱滅活肽，按此部分前面描述方法制備。將其置于帶蓋的聚丙烯試管(Sarsted)內(nèi)在微波爐里煮沸10分鐘。將此溶液冷卻。向其中加入為活性肽的制備的載體至終體積14ml。因此，滅活的肽濃度也為每ml25μg。
通過將360mg四環(huán)素堿(Sigma)溶于50ml去離子水中以產(chǎn)生每ml7.2mg的濃度來制備四環(huán)素標記溶液。對每只體重大約300g的大鼠施給四環(huán)素的量(1ml標記溶液)大約為每千克體重24mg?；瘜W(xué)合成肽的生物活性采用體重大約250g來自Charles River Laboratory的雄性Sprague—Dawley大鼠。該動物單養(yǎng)于籠子里并維持自桶中隨時供應(yīng)水和Purina Rat Chow無限制飲食。
每種溶液1ml通過大腿肌肉內(nèi)給藥。每個試驗組有12只大鼠對照組A—每只動物通過肌肉注射到右臀大肌接受1ml含0.1BSA的0.1％乙酸。接著進行腹膜內(nèi)注射四環(huán)素標記溶液1ml。對照組B—每只動物通過肌肉注射到右臀大肌。
接受1ml含有經(jīng)加熱煮沸10分鐘(參見上面)的肽的含0.1％BSA的0.1％乙酸。接著進行腹膜內(nèi)注射四環(huán)素標記溶液1ml。試驗組—每只動物通過肌肉注射到右臀大肌接受1ml試驗溶液(1ml載體內(nèi)含25μg肽，參見上面)。接著進行腹膜內(nèi)注射四環(huán)素標記溶液1ml。
48小時后，每只大鼠再次施給四環(huán)素標記溶液。施給第二劑四環(huán)素后24小時，用二氧化碳麻醉法殺死動物。
動物死后立即通過心臟穿剌采取血樣。用大約3ml肝素抗凝血測量骨堿性磷酸酶。這是骨形成的血清指標。按照常規(guī)技術(shù)進行人類骨堿性磷酸酶的測量。其結(jié)果不能形成結(jié)論。
對做組織學(xué)檢驗和用以確定骨生長率的骨樣進行如下選擇右股骨，右脛骨，右肱骨，右 骨和第5腰椎體。該樣品在解剖前于4℃貯存。解剖右股骨以進行組織學(xué)檢查和確定化學(xué)合成的人類多肽的骨無機質(zhì)添附率將3組動物的與右股骨附著的肌肉、鍵和骨膜分離去掉。按下面所述和圖17所表示的方式對該骨的下干骺端和中干進行橫切。
將該骨的橫切片轉(zhuǎn)入80％的乙醇中并輕輕地振動過夜。
將該股骨的橫切片做下列步驟的處理。
1.通過換2次100％的乙醇—每次2小時，脫水2.用100％的丙酮作用2小時去脂肪3.丙酮/Spurr＇s培養(yǎng)基1∶1過夜Spurr＇s培養(yǎng)基的組成如下NDA(壬烯基琥珀酐)130gERL(乙烯基環(huán)己烯二氧化物)50gDER(丙二醇的二環(huán)氧甘油醚)30gDMAE(二甲氨基乙醇)2g
將骨橫切片轉(zhuǎn)入100％Spurr′s培養(yǎng)基，使該培養(yǎng)基滲入骨組織達6小時。然后將該培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基。后施加15分鐘25磅/平方英寸的負壓。
將下切表面對著包埋模底和聚合樹脂，即Spurr′s培養(yǎng)基使來自下干骺端的橫切片定位，使之于55℃過夜進行。
然后將部分聚合的下股骨干骺端的組織塊于80℃再保藏12小時。同時，將中干留在液體樹脂里過第二夜，然后于80℃保藏12小時。
第二天，在取自下股骨干骺端的組織塊的兩切面間中間水平位置切下1片400μm厚的切片。用手工將這些厚切片在兩層用金鋼砂(具100砂石no.粗糙)預(yù)先毛化的玻璃間研磨至終厚度為大約8μm。用水作研磨潤滑劑。然后將磨薄的切片進行不染色裝片以用于檢查。從股骨塊的兩切面之間中間水平處類似制備每個股骨的中干切片。對股骨干骺端的組織切片進行隨機編號以用于骨添附的盲檢。
將塑料包埋的不染色切片置熒光顯微鏡下用X16的物鏡和×10的目鏡做系統(tǒng)觀察，涵蓋觀察由骨內(nèi)表面所圍的橫紋骨區(qū)域。
對隨機選取的由2條四環(huán)素帶明確限定的骨形成位點進行測量，采取此步以減少由于斜切通過形成表面而引起的誤差。以μm記錄的兩四環(huán)素帶間的距離除以2(標記間隔為2天)以得到速率μm每天。對每只動物隨機選取的30個位點進行測量并用其算術(shù)平均值做統(tǒng)計分析。
結(jié)果列于表2和示于圖18表2組算術(shù)平均值組間的比較
生長對化學(xué)合成的肽的劑量依賴效應(yīng)把40只雄性Sprague—Dawley大鼠分成10只的4組。組1至組4的平均體重分別為294，297，296和279克。
如同前面的試驗，制備在1％乙酸內(nèi)具有濃度為每ml1mg的肽貯存液。省去BSA?；瘜W(xué)合成的多肽的3種不同濃度的溶液如下制備肽溶液1用0.1％乙酸將1.1ml貯存液稀釋成5.5ml以得到肽濃度為每0.5ml100μg的溶液。
肽溶液2用0.1％乙酸將0.55ml的貯存液稀釋成5.5ml以得到每0.5ml體積50μg的肽濃度。
肽溶液3用0.1％乙酸將0.3ml的貯存液稀釋到6ml以得到每0.5ml體積25μg的肽濃度。
將288mg的四環(huán)素堿溶于40ml去離子水中產(chǎn)生每ml7.2mg的濃度制備四環(huán)素標記溶液。每只大鼠用1ml溶液給藥(參見下面)，也就是每千克體重大約24g。
對4組大鼠做試驗組A—每只動物接受1次肌肉注射0.5ml的肽溶液1(100μg的肽)，接著腹膜內(nèi)注射1ml四環(huán)素溶液。
試驗組B—每只動物接受1次肌肉注射0.5ml的肽溶液2(50μg的肽)，接著腹膜內(nèi)注射1ml四環(huán)素溶液。
試驗組C—每只動物接受1次肌肉注射0.5ml的肽溶液3(25μg的肽)，接著腹膜內(nèi)注射1ml四環(huán)素溶液。
對照組D—每只動物接受1次肌肉注射0.5ml0.1％的乙酸，接著腹膜內(nèi)注射1ml四環(huán)素溶液。每只大鼠不接受肽。
第二種四環(huán)素標記溶液通過將288mg的四環(huán)素堿(Sig-ma)溶于40ml去離子水中以產(chǎn)生每ml 7.2mg四環(huán)素的濃度來制備。
每只大鼠自首次給藥后大約48小時接受腹膜內(nèi)注射1ml四環(huán)素標記溶液(大約每千克體重24mg)，并且24小時后通過二氧化碳麻醉法處死之。
通過心臟穿刺，從每只大鼠采到大約3ml的尸體血液，并將其注入了肝素的試管中。然后將血漿于-20℃凍存。
從每只動物解剖出下列骨樣兩股骨骨，兩脛骨骨，兩骨；骨和前兩尾椎骨。這些骨樣在用200mM磷酸緩沖液緩沖到pH7.4的10％的甲醛中固定。解剖右股骨以確定骨無機質(zhì)添附率的劑量依賴研究右股骨的下骺而非下干骺端。將如圖19所表示的下股骨骺解剖出來。
將骨組織浸于80％乙醇中，并輕輕振動之達6小時，然后將其轉(zhuǎn)入95％乙醇中。第二天，將該骨組織轉(zhuǎn)入100％乙醇中，每過8小時更換該乙醇。第三天，將該骨組織轉(zhuǎn)入丙酮中。過大約27小時后，將該組織轉(zhuǎn)入丙酮和Spurr′s培養(yǎng)基1∶1的混合物中。經(jīng)過大約18小時之后，將該組織轉(zhuǎn)入100％的Spurr′s培養(yǎng)基中，并輕輕振動大約24小時。更換Spurr′s培養(yǎng)基，將該組織于37℃溫育另外24小時。此時，似乎來自下骺的塊部分聚合了，也就是說塑料已變成稠汁。將該塊轉(zhuǎn)入恒溫箱中并于45℃處理 小時以變硬包埋介質(zhì)。最終處理步驟是在80℃處理4小時。
在該骨塊的上切面下1mm平面處切400μm的切片。將此厚切片用手工在兩研磨玻璃板間研磨至終厚度為8μm，該研磨玻璃板是用金剛砂預(yù)先毛化了的。研磨時用水作潤滑劑。這些薄切片在Permount(Fisher)內(nèi)不染色裝片。
使用在前面的試驗中描述的測量方法。測量下股骨骺骨內(nèi)表包圍的橫紋骨內(nèi)的30個骨形成位點。以圖20所示的方式系統(tǒng)地涵蓋所有的部分。樣品在測量前編號。
結(jié)果總結(jié)于表3。表3組間算術(shù)平均值的比較
表3結(jié)果圖解描述于圖21和22。這些結(jié)果表明在所用劑量范圍和時間間隔內(nèi)，化學(xué)合成的多肽對大鼠的刺激效果隨肽給藥量的增加而增加。
當然應(yīng)理解為，在保持了這這里公開的對骨有刺激效應(yīng)的多肽的三級空間結(jié)構(gòu)的同時，對氨基酸的替換不受限制。因此，可以預(yù)期在非極性脂肪族中性氨基酸甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，纈氨酸和異亮氨酸間進行互換是可能的。同樣，可以在極性脂肪族中性氨基酸絲氨酸，蘇氨酸，蛋氨酸，半胱氨酸。天門冬酰胺和谷氨酰胺間進行替換。這就是說，由二硫鍵將肽連接起來是至關(guān)重要的，如果單個半胱氨酸殘基能保持完整而序期其它處能形成二硫連接的其它氨基酸不被替換的活。在帶電荷的酸性氨基酸，天冬氨酸和谷氨酸之間可以進行替換，在帶電荷的堿性氨基酸，賴氨酸和精氨酸之間可以進行替換。在芳香族氨基酸，包括苯丙氨酸，組氨酸，色氨酸和酪氨酸之間也可能可以替換。本領(lǐng)域的技術(shù)人員對這些各類替換和互換是熟知的。其它的替換也可能是可以的。
至于一個或多個氨基酸的缺失，可能在該序列的每端缺失少數(shù)幾個氨基酸是可以的。甚而，在保持三維構(gòu)象的同時，進行對稱的或近似于對稱的缺失有可能是最可能的。盡管有可能可以進行一定限度的內(nèi)部缺失，但應(yīng)該少做內(nèi)部缺失并且數(shù)量不超過大約5個氨基酸，優(yōu)選再少些。
上面所列的對序列的修飾，末端增加，缺失或替換很可能是最有用的，因這樣的修飾能起到不同的作用例如用于放免分析中的鑒定基團；或連接其團?？够瘜W(xué)合成的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO11)的抗體的合成按下面描述。用3種不同的交聯(lián)劑將化學(xué)合成的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO11)與KLH(鑰孔血蘭素)偶合。戊二醛偶合用由2.7mM KCl，1.2mM KH2PO4，138mM NaCl，8.1mM Na2HPO4配成的PBS溶液2.5ml稀釋5mg的肽(SEQ ID NO11)以得到2mg/ml的最終肽濃度。將10mg的KLH稀釋于0.5mlPBS中以得到2mg/ml的終濃度。向1.25ml，KLH溶液中加入1.25ml的肽溶液。加入終濃度為0.25％的戊二醛。將所得的溶液于室溫攪拌小時。攪拌后，將該溶液用1升的PBS透析。更換PBS三次。碳化二亞胺(EDC)偶合按前一部分所描述的制備肽和KLH溶液。向1.25mlKLH溶液中加入1.25ml肽溶液。向所得的溶液中加入2.5mg的EDC。將該溶液于室溫經(jīng)常性地攪拌4小時，然后用1升PBS透析。更換PBS三次。M—馬來酰亞胺基苯甲酰基—N—羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)偶合向500μl水中加入5mg肽并用NaOH調(diào)pH至8.5以得到10mg/ml的終濃度。用水稀釋檸康酐至濃度為10mg/ml。將500μl的酐溶液加入100μl肽溶液，每改加液過程中調(diào)pH至8.5。將該溶液于室溫不時地攪拌1小時。接著向其中加入100μl1M磷酸鈉緩沖液(pH7.2)，然后加入900μl100mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.2)。用水稀釋磺基—MBS至濃度為25mg/ml，并將400μl該溶液加入肽溶液以得到大約50mg/ml的MBS濃度。將此溶液于室溫不時地攪拌30分鐘。加入6μlβ—巰基乙醇到β—巰基乙醇的終濃度為35mM。不時地攪拌溶液于室溫達1小時。將KLH溶于PBS至3mg/ml，并將其2.5ml加入到肽溶液。不時地室溫攪動該溶液3小時，然后將其用1升的PBS透析，更換三次PBS。肽的終濃度為大約1mg/ml，而KLH的終濃度為大約1.5mg/ml?？贵w的產(chǎn)生按下面所述給兔子注射合成的肽溶液。將各250μl的戊二醛—和EDC—交聯(lián)的肽溶液與500Freud佐劑混合起來。將此溶液肌肉注射到兔子后腿，每腿500μl。注射的肽總量為0.5mg。將用MBS與KLH偶合起來的合成肽500μl和Freud佐劑混合。將此溶液肌肉注射到另一只兔子的后腿，每腿500μl。注射的肽總量為0.5mg。
將合成肽上樣到凝膠(18％分離跑膠(running)，5％積層膠)的兩個泳道，1.5μg和4μg。該膠于30V過夜染跡(blot)，并用含3％牛奶的PBS封閉。將該凝膠與用1％牛奶/PBS稀釋為1∶250的兔血清一起溫育，接著與1∶1000稀釋的羊抗兔堿性磷酸酶溫育1小時。然后用底物對凝膠顯色。通過考馬斯亮藍染色可看見合成肽。每只兔子的該肽通過第二次取血得以檢出而兩只兔子通過免前血清均未檢出該肽。
通過用BIAcoreTM測表面胞質(zhì)團共振來進一步研究固定化肽和血清抗體之間的相互作用。合成肽通過胺偶合共價固定化到葡聚糖介質(zhì)上。將不同稀釋的兔血清注射到其表面之上5分鐘，并測定結(jié)合到固定化肽的抗體量。將得出陽性反應(yīng)的血清的最后稀釋度確定為效價，也就是大于50個共振單位。用這種方式發(fā)現(xiàn)兩只兔子的血清中都存在抗體，并且通過將血清與肽一起預(yù)保溫能封閉其相互作用。發(fā)現(xiàn)兔子血清內(nèi)的抗體不與固定化的無關(guān)肽相互作用。
因此方法和產(chǎn)物可以推廣到使用抗多肽的抗體以檢測與該抗體結(jié)合的多肽上。例如，可將抗體和幾個已熟知的報告系統(tǒng)的任意一個相連接或接合，該報告系統(tǒng)指示多肽和抗體的陽性結(jié)合。已熟知的報告系統(tǒng)包括放射免疫測定(RIAs)或免疫放射性測定(IRMAs)。另外，同RIAs和IR-MAs一樣，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)具有相對高的敏感度，但其一般不依賴于放射性同位素的使用。可能產(chǎn)生肉眼可見的物質(zhì)或者至少一種用分光光度計可檢測的物質(zhì)?？梢允褂靡蕾囉诒灰獪y定的酶結(jié)合的物質(zhì)的熒光的測定法。應(yīng)理解為根據(jù)本發(fā)明，有許多可用的報告系統(tǒng)用以檢測特定多肽的存在。通過標準化的樣品采集和處理，對血清內(nèi)存出的閾值以上的多肽量都能很好地測定。
可以對這樣的基于對化學(xué)合成的人類多肽(SEQ IDNO11)抗原應(yīng)答的方法進行推廣，并且如上所述由氨基酸替換，缺失，增加，(和接合)而得的多肽變體可被預(yù)篩為潛在的骨刺激固子。然后對那些與抗已知肽的抗體進行陽性反應(yīng)的多肽用在此描述的系統(tǒng)，例如大鼠做體內(nèi)骨刺激效應(yīng)檢驗。
如此的抗體——連接的報告系統(tǒng)可用測定主體血清中是否含有不足量的多肽的方法。將給型的主體的血清中的這樣的多肽的正常閾濃度給定，就可能制成檢測試劑盒。
如本領(lǐng)域所知，通過嵌合形式的蛋白質(zhì)可獲得進一步的好處。因此，例如可將編碼整個蛋白質(zhì)，或該蛋白質(zhì)一部分的DNA序列和編碼大腸桿菌β—半乳糖苷酶C—末端部分的序列連接起來以產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)。以類呼吸合胞體病毒的糖蛋白F和G的表達系統(tǒng)被描述于例如，1994年2月20日公開的美國專利No.5,288,630，在此引用的參考文獻中。
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序列表(1)總信息(I)申請人徹克興泰姆(II)發(fā)明名稱骨刺激因子(III)序列數(shù)11(IV)通信地址(A)地址Blake，Cassels&Graydon(B)街道Box 25，Commerce Court West(C)城市多倫多(D)州安大略(E)國家加拿大(F)郵編M5L 1A9(V)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型Diskette， 英寸，1.4Mb容量(B)計算機COMPAQ，IBM AT相容機(C)操作系統(tǒng)MS—DOS 5.1(D)軟件WORD PERFECT(VI)本申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(VII)在先申請數(shù)據(jù)申請?zhí)朥S08/031,036；US08/120,127
(B)申請日1993年3月12日；1993年9月13日(VIII)律師/代理人信息姓名格瑞，布萊恩W(B)登記號(C)參考/案卷號46913/00008(IX)通訊信息(A)電話(416)863—3256(B)電傳(416)863—2653或863—4335(2)SEQ ID NO1信息(I)序列特征長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學(xué)線形(Ⅺ)序列描述SEQ ID NO1Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr Lys Pro Ile(2)SEQ ID NO2信息(I)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學(xué)線形(XI)序列描述SEQ ID NO2Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu(2)SEQ ID NO3信息(I)序列特征
(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲學(xué)線形(XI)序列描述SEQ ID NO3GGY CCY GGY GGY GCY GGY GAR ACY AARGly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Thr LysCCY ATPro Ile(2)SEQ ID NO4信息(I)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學(xué)線形(XI)序列描述SEQ ID NO4Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu thr Lys Pro(2)SEQ ID NO5信息(I)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線形(XI)序列描述SEQ ID NO5AAG CTT CAC ACC ACG AAC CAG
(2)SEQ ID NO6信息(I)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線形(XI)序列描述SEQ ID NO6TTA TGA GTA TTT CTT CAA GGG(2)SEQ ID NO7信息(I)序列特征(A)長度329個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線形(II)分子類型由cDNA到mRNA(XI)序列描述SEQ ID NO7TTTGGCTTTA TTCATAGCGG TAATTAATGA TCAAGACAGT TGATTACTCG TAAGCACTATTAAAAATTTG CA ATG ACT GCT CAA AAT ACA GAC CTT AAC CAA CTA TCCMet Thr Ala Gln Asn Thr Asp Leu Asn Gln Leu Ser1 5 10AAC AGT TTC ACT TTA GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCAAsn Ser Phe Thr Leu Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala15 20 25GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACTAsp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Aia Ala Glu Thr30 35 40TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA TAAAGGATCT GCAGCTTATGLeu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro45 50TCTTCTAGTT TATCTTTTGC ATAAAAAAGC TGCAGAGACT TTAATGGTAA TTGCCAAAATCAACCATAAA GGATCTGC(2)SEQ ID NO8信息(I)序列特征(A)長度53個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學(xué)線形(XI)序列描述SEQ ID NO8Met Thr Ala Gln Asn Thr Asp Leu AsnGln Leu Ser Asn Ser Phe Thr Leu GlyIle Gly Lys Arg Thr Asn Glu His ThrAla Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn ThrLeu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu
Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro(2)SEQ ID NO9信息(I)序列特征(A)長度141個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線形(VI)反意否(XI)序列描述SEQ ID NO9AATTCTTAGG ATCCTAGGAT G GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACGGly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr1 5 10GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAGAla Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu15 20 25ACT TTA ATG GTC CTT GAC CAA AAT GAA CCA TAAAGATCTT GAThr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro30 35(2)SEQ ID NO10信息(I)序列特征(A)長度141個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線形(VI)反義是(XI)序列描述SEQ ID NO10AGCTTCAAGA TCTTTATGGT TCATTTTGGTCAAGGACCATTAAAGTCTCT GCAGCTTTTT TATGCAAGGTGTTCGGTTTAATTTTACAAT CTGCCGTATG TTCATTTGTTCGTTTTCCGATCCCCATCCT AGGATCCTAA G(2)SEQ ID NO11信息(I)序列特征(A)長度36個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學(xué)線形(VI)反義否(XI)序列描述SEQ ID NO11Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu HisThr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro AsnThr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu ThrLeu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro
權(quán)利要求
1.一種具有氨基酸序列為NH2—Gly—Ile—Gly—Lys—Arg—Thr—Asn—Glu—His—Thr—Ala—Asp—Cys—Lys—Ile—Lys—Pro—Asn—Thr—Leu—His—Lys—Lys—Ala—Glu—Thr—Leu—Met—Val—Leu—Asp—Gln—Asn—Gln—Pro—CO2H的多肽。
2.一種二聚體多肽，其中多肽的每個單體包含下列氨基酸序列NH2—Gly—Ile—Gly—Lys—Arg—Thr—Asn—Glu—His—Thr—Ala—Asp—Cys—Lys—Ile—Lys—Pro—Asn—Thr—Leu—His—Lys—Lys—Ala—Glu—Thr—Leu—Met—Val—Leu—Asp—Gln—Asn—Gln—Pro—CO2HH；其中的單體通過各自序列的半胱氨酸殘基之間的二硫橋鍵彼此連接起來。
3.一種在哺乳動物中表現(xiàn)出骨刺激活性的多肽，該多胞包括具有下列氨基酸序列NH2—Gly—Ile—Gly—Lys—Arg—Thr—Asn—Glu—His—Thr—Ala—Asp—Cys—Lys—Ile—Lys—Pro—Asn—Thr—Leu—His—Lys—Ala—Ala—Ala—Glu—Thr—Leu—Met—Val—Leu—Asp—Gin—Asn—Gin—Pro—CO2H的單體和其二聚體；其中的單體通過其各自序列的半胱氨酸殘基之間的二硫橋鍵彼此連接起來。
4.一種在哺乳動物中表現(xiàn)出骨刺激活性的多肽，該多肽具有與下列氨基酸序列NH2—Gly—Ile—Gly—Lys—Arg—Thr—Asn—Glu—His—Thr—Ala—Asp—Cys—Lys—Ile—Lys—Pro—Asn—Thr—Leu—His—Lys—Lys—Ala—Glu—Thr—Leu—Met—Val—Leu—Asp—Gln—Asn—Gln—Pro—CO2H的部分或全部相對應(yīng)的序列；其類似物，其中序列中的氨基酸可作取代，缺失或增加，只要保持源于該序列三維構(gòu)象的在哺乳動物中的骨刺激活性；及該多肽或其類似物的軛合物。
5.一種在哺乳動物中表現(xiàn)出骨刺激活性的多肽，該多肽包括具有序列部分或全部對應(yīng)于下列氨基酸序列NH2—Gly—Ile—Gly—Lys—Arg—Thr—Asn—Glu—His—Thr—Ala—Asp—Cys—Lys—Ile—Lys—Pro—Asn—Thr—Leu—His—Lys—Lys—Ala—Glu—Thr—Leu—Met—Val—Leu—Asp—Gln—Asn—Gln—Pro—CO2H的肽的二聚體；其中該二聚體的肽通過各自肽的半胱氨酸殘基之間的二硫橋鍵彼此連接起來；其類似物，其中序列中的氨基酸可作替換，缺失或增加，只要保持源于該序列三維構(gòu)象的在哺乳動物中的骨刺激活性；及該肽或其類似物的軛合物。
6.一種在哺乳動物中表現(xiàn)出骨刺激活性的多肽，該多肽包括具有序列部分或全部對應(yīng)于下列氨基酸序列NH2—Gly—Ile—Gly—Lys—Arg—Thr—Asn—Glu—His—Thr—Ala—Asp—Cys—Lys—Ile—Lys—Pro—Asn—Thr—Leu—His—Lys—Lys—Ala—Glu—Thr—Leu—Met—Val—Leu—Asp—Gln—Asn—Gln—Pro—CO2H的單體和其二聚體，其中單體通過各自序列的半胱氨酸殘基之間的二硫橋鍵彼此連接起來；其類似物，其中序列中的氨基酸可作替換，缺失或增加，只要保持源子該序列三維構(gòu)象的在哺乳動物中的骨刺激活性；及該多肽或其類似物的軛合物。
7.一種編碼下列氨基酸序列NH2—Gly—Ile—Gly—Lys—Arg—Thr—Asn—Glu—His—Thr—Ala—Asp—Cys—Lys—Ile—Lys—Pro—Asn—Thr—Leu—His—Lys—Lys—Ala—Glu—Thr—Leu—Met—Val—Leu—Asp—Gln—Asn—Gln—Pro—CO2H及其類似物的DNA序列，其中序列中的氨基酸可被替換，缺失或增加，只要含該氨基酸序列的多肽保持了源于該序列三維構(gòu)象的在哺乳動物中的骨刺激活性。
8.一種編碼下列氨基酸序列NH2—Gly—Ile—Gly—Lys—Arg—Thr—Asn—Glu—His—Thr—Ala—Asp—Cys—Lys—Ile—Lys—Pro—Asn—Thr—Leu—His—Lys—Lys—Ala—Glu—Thr—Leu—Met—Val—Leu—Asp—Gln—Asn—Gln—Pro—CO2H及其類似物的DNA序列，其中序列中的氨基酸可被替換，缺失或增加，只要含該氨基酸序列的多肽保持了源子該序列三維構(gòu)象的在哺乳動物中的骨刺激活性；及同該DNA雜交并編碼在哺乳動物中表現(xiàn)骨刺激活性的多肽的氨基酸序列的序列。
9.一種包含權(quán)利要求7所述的DNA的載體。
10.一種包含權(quán)利要求8所述的DNA的載體。
11.一種獲得能誘導(dǎo)增加的骨添附率的多肽的方法，包括步驟(a)自哺乳動物血清樣品中分離具有分子量小子大約30,000道爾頓和大于大約3000道爾頓的多肽和蛋白質(zhì)；和(b)通過去除具有pI大約為9的多肽從所得的多肽中得到所需的多肽。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中哺乳動物血清是人血清并且步驟(b)包括通過陰離子交換式譜方式分離所需多肽。
13.權(quán)利要求12所述的方法，還包括通過凝膠電泳按分子量分辨自步驟(b)得到的多肽的步驟。
14.權(quán)利要求13所述的方法，還包括從分辨的多肽中分離具有分子量為大約8000道爾頓的肽的步驟。
15.權(quán)利要求l4所述的方法，其中分離肽包括將分辨的多肽轉(zhuǎn)到聚合物膜上，分離含有具有分子量為大約8000道爾頓的肽的膜部分并從該部分膜中移去該肽。
16.權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟(a)包括過濾樣品。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求1l所述方法得到的多肽。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求12所述方法得到的多肽。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求13所述方法得到的多肽。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求14所述方法得到的多肽。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求15所述方法得到的多肽。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求16所述方法得到的多肽。
23.一種對權(quán)利要求1所述的多肽產(chǎn)生抗原應(yīng)答的蛋白質(zhì)。
24.一種對權(quán)利要求2所述的多肽產(chǎn)生抗原應(yīng)答的蛋白質(zhì)。
25.一種對權(quán)利要求3所述的多肽產(chǎn)生抗原應(yīng)答的蛋白質(zhì)。
26.一種對權(quán)利要求4所述的多肽產(chǎn)生抗原應(yīng)答的蛋白質(zhì)。
27.一種對權(quán)利要求5所述的多肽產(chǎn)生抗原應(yīng)答的蛋白質(zhì)。
28.一種對權(quán)利要求6所述的多肽產(chǎn)生抗原應(yīng)答的蛋白質(zhì)。
29.一種對權(quán)利要求11所述的多肽產(chǎn)生抗原應(yīng)答的蛋白質(zhì)。
30.一種用于測定權(quán)利要求4所述的多肽存在的診斷試劑盒，含有同報告系統(tǒng)相連的抗該多肽的抗體，其中當預(yù)先確定的該多肽量和該抗體結(jié)合在一起時報告系統(tǒng)產(chǎn)生可檢測的反應(yīng)。
31.一種用于測定根據(jù)權(quán)利要求11所述方法得到的多肽存在的診斷試劑盒，含有同報告系統(tǒng)相連的抗多肽的抗體，其中當預(yù)先確定的該多肽量和該抗體結(jié)合在一起時報告系統(tǒng)產(chǎn)生可檢測的反應(yīng)。
32.權(quán)利要求30所述的診斷試劑盒，其中的報告系統(tǒng)包括用于測該反應(yīng)與所述的預(yù)先預(yù)先確定的該多肽量相關(guān)的裝置。
33.權(quán)利要求31所述的診斷試劑盒，其中的報告系統(tǒng)包括用于測該反應(yīng)與所述的預(yù)先確定的該多肽量相關(guān)的裝置。
34.一種能誘導(dǎo)增加的骨添附速率的多肽，通過由以下步驟組成的方法獲得(a)從哺乳動物的血清中分離分子量小于大約30,000道爾頓并大于大約3000道爾頓的多肽和蛋白質(zhì)；和(b)通過去除具有pI大約為9的多肽從所得的分離多肽中得到所需的多肽；其類似物，其中序列中的氨基酸替換，缺失或增加，只要保持源子該序列的三維構(gòu)象的在哺乳動物中的骨刺激活性；及該肽或其類似物的軛合物。
35.一種產(chǎn)生能誘導(dǎo)增加的骨添附速率的純化蛋白質(zhì)的方法，包括步驟(a)在適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)由含有下列序列的DNA序列GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CATACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AAC ACCTTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATGGTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA轉(zhuǎn)化的細胞和(b)從所述的培養(yǎng)基中分離純化所述的蛋白質(zhì)。
36.一種產(chǎn)生能誘導(dǎo)增加的骨添附速率的純化蛋白質(zhì)的方法，包括步驟(a)在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)由編碼下列氨基酸序列NH2—Gly—Ile—Gly—Lys—Arg—Thr—Asn—Glu—His—Thr—Ala—Asp—Cys—Lys—Ile—Lys—Pro—Asn—Thr—Leu—His—Lys—Lys—Ala—Glu—Thr—Leu—Met—Val—Leu—Asp—Gln—Asn—Gln—Pro—CO2H的DNA序列轉(zhuǎn)化的細胞；和(b)從所述的培養(yǎng)中分離純化所述的蛋白質(zhì)。
37.一種由權(quán)利要求7所述的DNA轉(zhuǎn)化的寄主細胞。
38.一種由權(quán)利要求8所述的DNA轉(zhuǎn)化的寄主細胞。
39.一種檢測在哺乳動物中表現(xiàn)出骨刺激活性的蛋白質(zhì)存在的方法，該方法包括步驟自哺乳動物采集血清樣品；和至少將該樣品的一部分，暴露于同報告系統(tǒng)相連的抗體，其中該抗體能同具有序列NH2—Gly—Ile—Gly—Lys—Arg—Thr—Asn—Glu—His—Thr—Ala—Asp—Cys—Lys—Ile—Lys—Pro—Asn—Thr—Leu—His—Lys—Lys—Ala—Glu—Thr—Leu—Met—Val—Leu—Asp—Gln—Asn—Gln—Pro—CO2H的多肽相結(jié)合，并且其中該蛋白質(zhì)和抗體結(jié)合在一起能引起該報告系統(tǒng)指示所述的結(jié)合。
40.一種通過以治療有效量的，具有氨基酸序列NH2—Gly—Ile—Gly—Lys—Arg—Thr—Asn—Glu—His—Thr—Ala—Asp—Cys—Lys—Ile—Lys—Pro—Asn—Thr—Leu—His—Lys—Lys—Ala—Glu—Thr—Leu—Met—Val—Leu—Asp—Gln—Asn—Gln—Pro—CO2H的多肽進行給藥而在哺乳動物中增加骨生長的方法。
41.一種含有充分重復(fù)SEQ ID NO11中所列的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，根據(jù)對哺乳動物如大鼠給藥，該蛋白質(zhì)促進骨生長。
42.一種與SEQIDNO11中所列的序列具有至少50％同源性的蛋白質(zhì)。
43.一種含有充分重復(fù)SEQID NO11中所列的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由在嚴謹條件下與編碼SEQ IDNO11中所列的蛋白質(zhì)的DNA雜交的DNA編碼。
44.一種含有SEQ ID NO11中所列的氨基酸序列的嵌合的骨刺激因子，或其一部分。
45.一種自血清中分離的實質(zhì)上純的多肽，所述多肽(a)能誘導(dǎo)增加的骨添附速率和(b)具有下列N—末端氨基酸順序Gly—Pro—Gly—Gly—Ala—Gly—Glu—Thr—Lys—Pro—Ile。
46.權(quán)利要求45所述的多肽，分離自大鼠血清。
47.權(quán)利要求45所述的多肽，其中的該多肽具有大約5,000道爾頓的分子量，和其二聚體和多聚體及類似物。
48.一種用于測定樣品中能誘導(dǎo)增加的骨添附速率的多肽存在的診斷試劑盒，該試劑盒包含抗具有N—末端氨基酸序列Gly—Pro—Gly—Gly—Ala—Gly—Glu—Thr—Lys—Pro—Ile的多肽的與報告系統(tǒng)相連的抗體，其中當預(yù)先確定的多肽量和該抗體結(jié)合在一起時該報告系統(tǒng)產(chǎn)生可檢測的反應(yīng)。
49.權(quán)利要求48所述的檢測試劑盒，其中的報告系統(tǒng)包括用于測該反應(yīng)與所述的預(yù)先確定的該多肽量相關(guān)的裝置。
50.一種對具有N—末端氨基酸序列Gly—Pro—Gly—Gly—Ala—Gly—Glu—Thr—Lys—Pro—Ile的多肽產(chǎn)生抗原反應(yīng)的蛋白質(zhì)。
51.一種自大鼠血清中產(chǎn)生具有N—末端氨基酸序列Gly—Pro—Gly—Gly—Ala—Gly—Glu—Thr—Lys—Pro—Ile的多肽的方法，包括步驟血清的蛋白質(zhì)餾分的獲得從該餾分中去除分子量大于大約30,000道爾頓的蛋白質(zhì)；和分離該多肽。
52.權(quán)利要求51所述的方法，其中該多肽的分離包括從反相高性能液相色譜柱中收集該蛋白質(zhì)。
53.權(quán)利要求52所述的方法，其中該蛋白質(zhì)的分離包括用含有至少大約百分之62至63乙腈的洗脫液從用具有3個碳側(cè)鏈基團連接的硅膠填充的反相高性能液相色譜柱中洗脫該多肽。
54.一種通過給藥治療有效量的從哺乳動物血清中分離的并且具有分子量為大約5,000道爾頓和具有N—末端氨基酸順序為Gly—Pro—Gly—Gly—Ala—Gly—Glu—Thr—Lys—Pro—Ile序列的多肽增加人類中骨生長的方法。
55.一種從哺乳動物中獲得能誘導(dǎo)增加的骨添附速率的多肽的方法，包括步驟(a)用鈣缺乏飲食飼喂該動物以提高該哺乳動物血清中該多肽的水平；(b)該哺乳動物的血清的樣品分離；和(e)從該樣品中收集實質(zhì)上純化形態(tài)的具有N—末端氨基酸序列Gly—Pro—Gly—Gly—Ala—Gly—Glu—Thr—Lys—Pro—Ile的多肽。
56.一種從血清中分離的實質(zhì)上純的循環(huán)多肽，所述的多肽(a)能誘導(dǎo)增加的骨添附速率，和(b)具有大約3,000道爾頓的分子量，和其二聚體和多聚體及類似物。
57.一種哺乳動物中骨質(zhì)疏松癥疾病的診斷方法，該方法包括步驟從哺乳動物中采集血清樣品；確定能誘導(dǎo)增加的骨添附速率的多肽的量是否超過了預(yù)先確定的水平；其中所述的該多肽的量低于預(yù)先確定的水平表示具有所述的病癥。
58.權(quán)利要求57所述的方法，其中報告系統(tǒng)是同所述的多肽的抗體相連的，并且確定步驟包括向抗體暴露至少該樣品的一部分，其中該多肽和抗體結(jié)合在一起引起報告系統(tǒng)顯示所述的結(jié)合。
59.權(quán)利要求57所述的方法，還包括該樣品的蛋白質(zhì)餾分的分離和在確定該多肽的量前去除具有分子量大于大約30,000道爾頓的蛋白質(zhì)的步驟。
60.包含下列核酸序列ATG ACT GCT CAA AATACA GAC CTT AAC CAA CTA TCC AAC AGT TTCACT TTA GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAACAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AACACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTAATG GTC CTT GAC CAA AAT CAA CCA的DNA。
61.一種編碼下列氨基酸序列NH2—Gly—Ile—Gly—Lys—Arg—Thr—Asn—Glu—His—Thr—Ala—Asp—Cys—Lys—Ile—Lys—Pro—Asn—Thr—Leu—His—Lys—Lys—Ala—Glu—Thr—Leu—Met—Val—Leu—Asp—Gln—Asn—Gln—Pro—CO2HH的DNA序列。
62.一種由權(quán)利要求60所述的核酸序列編碼的多肽。
全文摘要
一種自大鼠血清中分離的多肽物質(zhì)，根據(jù)對不能產(chǎn)生PTH的大鼠(甲狀旁腺切除的大鼠)給藥，產(chǎn)生所觀察的骨無機質(zhì)添附率的增加。已分離出兩種形式的該物質(zhì)，第一種較大多肽的分子量大約是第二種較小多肽分子量的2倍。較小多肽的最前的11個氨基酸順序已被測定，為Gly Pro Gly Gly Ala gly Glu Thr Lys Pro Ile。較大的多肽的最前的7個氨基酸已被測定，為Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu。較大的多肽可能是較小多肽的二聚體。用基于該大鼠肽的氨基酸序列的核酸探針篩選人類肝臟cDNA胎兒文庫。因此按照序列Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Gln His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro化學(xué)合成了一種多肽。鼠的骨添附率以依賴于此種化學(xué)合成的化合物給藥劑量的方式增加。
文檔編號C12P21/08GK1119457SQ94191456
公開日1996年3月27日 申請日期1994年3月14日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月12日
發(fā)明者徹克·興·泰姆 申請人:骨藥有限公司