專利名稱：雄甾－1，4雙烯－3，17－雙酮生物轉(zhuǎn)化濁點系統(tǒng)的優(yōu)化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物技術領域。具體涉及雄甾-1，4雙烯-3，17-雙酮生物轉(zhuǎn)化濁點系統(tǒng)的優(yōu)化方法背景技術生物催化劑的特殊性質(zhì)使得生物轉(zhuǎn)化技術重新受到企業(yè)界和科研工作者的重視。特別是高選擇性和反應條件溫和，特別適合于合成和修飾天然化合物。即使對某一生物轉(zhuǎn)化反應開發(fā)了簡單的化學合成途徑，生物轉(zhuǎn)化的高化學選擇性和空間選擇性也可排除化學合成途徑中必要的保護和去保護步驟。然而，盡管人們對生物轉(zhuǎn)化有著濃厚的興趣，工業(yè)應用常受到實際困難的制約。如疏水性底物在水中的溶解度低，限制了其生物利用度；底物、產(chǎn)物可能抑制或毒害微生物。非水介質(zhì)因其獨特的功能在生物轉(zhuǎn)化中起著重要的作用，近年來取得了很大的進步。本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種新系統(tǒng)，該系統(tǒng)是非離子表面活性劑膠束溶液，在溫度高于其濁點或有誘導物存在的條件下，會自動分相形成表面活性劑稀相和富含表面活性劑的凝集層相。即采用一種或一種以上非離子表面活性劑形成濁點低于微生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)溫度的水溶液系統(tǒng)即濁點系統(tǒng)(cloud point system，CPS)，作為微生物轉(zhuǎn)化的介質(zhì)。在CPS中，形成了油包水和水包油的微觀乳濁液。表面活性劑液滴具有增溶能力，充當著底物的儲藏庫和產(chǎn)物的抑制劑。強化了底物的利用度，排除了產(chǎn)物的抑制。連續(xù)的表面活性劑相中存在水泡，相當于一個微反應噐，能使微生物免受表面活性劑的毒害作用。濁點系統(tǒng)的生物相容性和對底物生物利用度的強化作用已被證實。
利用Mycrobacterium sp.NRRL B-3683進行膽固醇的邊鏈切除生產(chǎn)ADD(雄甾-1，4雙烯-3，17-雙酮)和4-AD(雄甾-4烯-3，17-雙酮)的途徑如式1所示。在這微生物轉(zhuǎn)化中，ADD和4-AD的摩爾比為10∶1。
式1膽固醇的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)ADD和4-AD的途徑 盡管引入新的甾體藥物已很有限，但提高選擇性微生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)率，特別是甾醇的邊鏈切除的產(chǎn)率以便利用價格低廉的天然原料一直是人們努力的方向。人們嘗試了各種方法以增加底物的溶解度或排除產(chǎn)物的抑制作用，如雙水相系統(tǒng)、有機溶劑兩相系統(tǒng)、有機介質(zhì)、脂質(zhì)體系統(tǒng)等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于設計濁點系統(tǒng)應用中提高生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的優(yōu)化方法，特別是提供膽固醇邊鏈切除生產(chǎn)ADD(雄甾-1，4雙烯-3，17-雙酮)和4-AD(雄甾-4烯-3，17-雙酮)的濁點系統(tǒng)轉(zhuǎn)化優(yōu)化生產(chǎn)方法。
本發(fā)明經(jīng)大量的實驗證明，在濁點系統(tǒng)中表面活性劑濃度和底物濃度對轉(zhuǎn)化產(chǎn)率具有較大的影響。本發(fā)明通過優(yōu)化底物、表面活性劑濃度，建立了生產(chǎn)ADD和4-AD的CPS的優(yōu)化條件，底物濃度和轉(zhuǎn)化效率和其它轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相比都有明顯提高。
本發(fā)明公開的優(yōu)化生產(chǎn)ADD和4-AD的濁點系統(tǒng)參數(shù)為非離子表面活性劑采用Triton X-100和Triton X-114，其質(zhì)量比是1∶0.5-1.5；混合表面活性劑的濃度是5-10g/100ml；底物膽固醇的濃度是0.5-2.0g/100ml；微生物菌種采用Mycrobacterium sp.NRRL B-3683，微生物轉(zhuǎn)化時間為5-9天。在此優(yōu)化條件下，ADD+4-AD產(chǎn)率高達3.5-10g/L，對應的轉(zhuǎn)化率為80-93％。
下面通過具體的實驗過程對本發(fā)明以膽固醇為原料生產(chǎn)ADD和4-AD的CPS的優(yōu)化條件作進一步描述1、微生物與培養(yǎng)微生物微生物菌種Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能實現(xiàn)膽固醇的邊鏈切除，生成產(chǎn)物ADD和4-AD，其比例為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100ml)0.5g酵母浸出膏，1.2g瓊脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O。
種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g膽固醇，0.2g TritonX-100。
轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，一定量的膽固醇和混合表面活性劑Triton X-100∶Triton X-114＝1∶1)。
微生物培養(yǎng)微生物在28℃、220rpm、有氧、20/250ml裝量條件下活化培養(yǎng)3天，取活化種子按1∶10比例在裝量為22/250ml條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)7天。取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液分析。
2、分析方法取1ml樣品用4ml甲醇浸泡2hr。離心后取0.8ml上清進行HPLC分析。用Hypersil C18柱，流動相為甲醇∶水(4∶1)，流速為0.7ml/min，檢測波長為254nm。
3、結果與討論1)微生物轉(zhuǎn)化時間的優(yōu)化混合表面活性劑的質(zhì)量比為Triton X-100與Triton X-114之比為1∶1。以底物濃度為1.5g/100ml、表面活性劑濃度為4g/100ml進行微生物轉(zhuǎn)化，時間的影響如圖1所示。圖1為微生物轉(zhuǎn)化的時間曲線。結果表明7天時的產(chǎn)物濃度最高。再延長轉(zhuǎn)化時間反而降低。這表明產(chǎn)物可被微生物進一步降解。可能菌種誘變時使ADD和4-AD進一步降解的關鍵酶，9a-羥化酶沒有完全失活。
2)混和表面活性劑濃度的影響混和表面活性劑濃度為0.5～4.0g/100ml，底物濃度為0.5g/100ml時微生物轉(zhuǎn)化的結果如圖2所示。圖2為最終產(chǎn)物濃度隨表面活性劑濃度的變化。在表面活性劑濃度較低時，產(chǎn)率隨表面活性劑濃度的增加而增加，這可歸因于表面活性劑的增溶能力。表面活性劑膠束充當?shù)孜锏膬Υ鎺旌彤a(chǎn)物的萃取劑，隨表面活性劑濃度的增加，底物的生物利用度增加且產(chǎn)物的抑制作用被解除。但在表面活性劑濃度較高時，產(chǎn)率隨表面活性劑濃度的增加而降低，表現(xiàn)出高表面活性劑濃度的抑制作用。最終產(chǎn)物濃度隨表面活性劑濃度變化的曲線表明，對一定底物濃度存在最優(yōu)的表面活性劑濃度。
3)底物濃度的影響底物濃度為0.025～3g/100ml，混和表面活性劑濃度為2g/100ml時微生物轉(zhuǎn)化結果如圖3所示。圖3為產(chǎn)物隨底物濃度的變化。在底物濃度較小，產(chǎn)率隨底物濃度的增加而穩(wěn)定地增加且表現(xiàn)出較好的線性關系。當?shù)孜餄舛容^高時，產(chǎn)率穩(wěn)定于一個常數(shù)。這可歸因于表面活性劑的增溶能力。結果表明，要得到較高的產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化率，對一定的表面活性劑濃度存在一個對應的臨界底物濃度(如表面活性劑濃度為2g/100ml，最大終產(chǎn)物濃度為6200mg/L，對應的臨界底物濃度為0.85g/100ml)。
4)底物濃度的優(yōu)化高底物濃度是影響微生物轉(zhuǎn)化經(jīng)濟性的一個重要因素。底物和表面活性劑濃度相互影響著最終產(chǎn)物濃度。故采用底物濃度1～2.2g/100ml，不同的混和表面活性劑濃度進行微生物轉(zhuǎn)化，結果如圖4所示。圖4為底物濃度的優(yōu)化。從圖4可估計出在一定表面活性劑濃度時最大最終產(chǎn)物濃度對應的臨界底物濃度。結果如圖5所示。圖5為臨界底物濃度和表面活性劑濃度的相互關系。在表面活性劑濃度為2～8g/100ml時，對應一定表面活性劑濃度時的最大產(chǎn)物濃度隨表面活性劑濃度的增加而增加。當表面活性劑濃度達到10g/100ml時，其最大產(chǎn)物濃度不再明顯增加，高表面活性劑濃度時最大產(chǎn)物濃度出現(xiàn)停滯現(xiàn)象。隨表面活性劑濃度的增加，可能導致物質(zhì)傳遞，特別是氧傳遞受到抑制。
表1 微生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基本參數(shù)底物產(chǎn)物 介質(zhì) 微生物底物濃度 轉(zhuǎn)化率膽固醇 ADD，4-AD雙水相系統(tǒng)分枝桿菌 1g/L 80％谷甾醇 4-AD 有機介質(zhì) 固定化分枝桿菌12mM 89％植物甾醇4-AD PPG溶劑 分枝桿菌 5-30g/L 90％有機兩相系谷甾醇 4-AD 統(tǒng)固定化分枝桿菌5g/L 70％膽固醇 ADD，4-AD濁點系統(tǒng) 分枝桿菌 1.45g/100ml 93％定義轉(zhuǎn)化率為ADD和4-AD與膽固醇的摩爾數(shù)之比。1g膽固醇完全轉(zhuǎn)化時可到0.74g ADD和4-AD(ADD∶4-AD＝10∶1)。從圖6可得到在表面活性劑濃度為8g/100ml時對應的臨界底物濃度為1.45g/100ml。如表1所示，轉(zhuǎn)化率，特別是底物濃度(對應著最終產(chǎn)物濃度)都有很大的提高。
結論表面活性劑濃度和底物濃度對轉(zhuǎn)化產(chǎn)率相互影響。本發(fā)明通過優(yōu)化底物、表面活性劑濃度，建立了CPS的優(yōu)化條件。底物的濃度和轉(zhuǎn)化效率和其它轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相比都有明顯提高，表明CPS是優(yōu)良的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。


圖1微生物轉(zhuǎn)化的時間曲線圖2最終產(chǎn)物濃度隨表面活性劑濃度的變化圖3產(chǎn)率隨底物濃度的變化圖4底物濃度的優(yōu)化表面活性劑濃度(g/100ml)×(2)；◇(4)；△(6)；○(8)；●(10)圖5臨界底物濃度和表面活性劑濃度的相互關系
具體實施例方式
實施例膽固醇的邊鏈切除，優(yōu)化CPS的系統(tǒng)參數(shù)實施例1.
1.微生物與培養(yǎng)微生物微生物菌種Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能實現(xiàn)膽固醇的邊鏈切除，生成產(chǎn)物ADD和4-AD，其比例為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100ml)0.5g酵母浸出膏，1.2g瓊脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O。
種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g膽固醇，0.2g TritonX-100。
轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，1.5g膽固醇，10g表面活性劑(TritonX-100∶Triton X-114＝1∶1)。
微生物培養(yǎng)微生物在28℃、220rpm、有氧、20/250ml裝量條件下活化培養(yǎng)3天，取活化種子按1∶10比例在裝量為22/250ml條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)7天。取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液分析。
分析方法取1ml樣品用4ml甲醇浸泡2hr。離心后取0.8ml上清進行HPLC分析。用Hypersil C18柱，流動相為甲醇∶水(4∶1)，流速為0.7ml/min，檢測波長為254nm。
結果產(chǎn)物濃度(ADD∶4-AD＝10∶1)為10g/L.
實施例2.
1.微生物與培養(yǎng)微生物微生物菌種Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能實現(xiàn)膽固醇的邊鏈切除，生成產(chǎn)物ADD和4-AD，其比例為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100ml)0.5g酵母浸出膏，1.2g瓊脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O。
種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g膽固醇，0.2g TritonX-100。
轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，1.5g膽固醇，6g表面活性劑(TritonX-100∶Triton X-114＝1∶1.2)。
微生物培養(yǎng)微生物在28℃、220rpm、有氧、20/250ml裝量條件下活化培養(yǎng)3天，取活化種子按1∶10比例在裝量為22/250ml條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)7天。取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液分析。
分析方法取1ml樣品用4ml甲醇浸泡2hr。離心后取0.8ml上清進行HPLC分析。用Hypersil C18柱，流動相為甲醇∶水(4∶1)，流速為0.7ml/min，檢測波長為254nm。
結果產(chǎn)物濃度(ADD∶4-AD＝10∶1)為8g/L.
實施例3.
1.微生物與培養(yǎng)微生物微生物菌種Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能實現(xiàn)膽固醇的邊鏈切除，生成產(chǎn)物ADD和4-AD，其比例為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100ml)0.5g酵母浸出膏，1.2g瓊脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O。
種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g膽固醇，0.2g TritonX-100。
轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，1.0g膽固醇，10g表面活性劑(TritonX-100∶Triton X-114＝1∶0.8)。
微生物培養(yǎng)微生物在28℃、220rpm、有氧、20/250ml裝量條件下活化培養(yǎng)3天，取活化種子按1∶10比例在裝量為22/250ml條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)7天。取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液分析。
分析方法取1ml樣品用4ml甲醇浸泡2hr。離心后取0.8ml上清進行HPLC分析。用Hypersil C18柱，流動相為甲醇∶水(4∶1)，流速為0.7ml/min，檢測波長為254nm。
結果產(chǎn)物濃度(ADD∶4-AD＝10∶1)為7g/L.
權利要求
1.雄甾-1，4雙烯-3，17-雙酮生物轉(zhuǎn)化濁點系統(tǒng)的優(yōu)化方法，該方法以膽固醇為原料，以微生物Mgcobacterium sp.NRRL B 3683.為菌種進行微生物轉(zhuǎn)化，其特征在于該方法所用的介質(zhì)為濁點系統(tǒng)，各參數(shù)為非離子表面活性劑采用質(zhì)量比是1∶0.5-1.5的Triton X-100和TritonX-114，混合表面活性劑的濃度是5-10g/100ml，底物膽固醇的濃度是0.5-2.0g/100ml，微生物轉(zhuǎn)化時間為5-9天。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物技術領域。本發(fā)明提供了濁點系統(tǒng)在微生物轉(zhuǎn)化中應用的優(yōu)化方法，特別是公開了從膽固醇生產(chǎn)ADD和4－AD的濁點系統(tǒng)的優(yōu)化參數(shù)。采用本發(fā)明方法底物濃度為0.5－2.0/100ml時，可使微生物轉(zhuǎn)化ADD和4－AD產(chǎn)率高達3.5－10g/L，對應的轉(zhuǎn)化率為80－93％，顯著優(yōu)于其它轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。
文檔編號C12P33/00GK1483833SQ0314211
公開日2004年3月24日 申請日期2003年8月7日 優(yōu)先權日2003年8月7日
發(fā)明者陳代杰, 王志龍, 戈梅, 葉偉東, 金一平 申請人:上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責任公司, 上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責