專利名稱：微液滴振蕩型硅槽式聚合酶鏈式反應生物芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療儀器領域，特別涉及適于高通量、快速、自動化的核酸PCR臨床診斷生物芯片的設計。
近年來隨著微加工技術的發(fā)展，用于臨床檢驗研究的微芯片得到了廣泛的重視。建立在微芯片基礎上的微全分析系統(tǒng)(Micro Total Analysis Systems)成為分析化學、臨床醫(yī)學、生物學的研究熱點，而作為微全分析系統(tǒng)中的重要組成部分的微PCR芯片吸引了眾多研究者注意。自從1993年首次報道了微PCR芯片的工作后，許多研究小組相繼投入微PCR芯片的研究工作之中。由于芯片的特征尺度處于微米量級，微PCR芯片能夠實現(xiàn)很高的升降溫速率(一般在10℃/s的量級或更高)，從而大大提高了PCR過程的時間效率，使得通常需要數(shù)小時或數(shù)十分鐘的檢測過程加快至十幾甚至幾分鐘內(nèi)完成；同時微PCR芯片所需要的樣品量非常少(微升甚至納升的量級)，能夠大幅度的降低PCR過程的費用，并減小污染的可能。1999年，我國專利99114416.3提出了一種PCR微陣列探針循環(huán)檢測型生物芯片，采用常規(guī)方法給予實現(xiàn)，其示意圖如

圖1所示。圖中1為微通道，2，3，4，5為微反應器，6為PCR反應體系，7為小鐵塊，8為磁鐵。它的工作原理是PCR反應溶液6事先注入微通道1中的兩小鐵塊7之間，然后以一透明薄膜覆蓋密封，試樣由注射器或其它進樣器穿透薄膜注入PCR反應溶液中，然后以玻璃片壓緊固定；輕搖混勻后，即可開始PCR反應，首先在2區(qū)進行變性，然后由磁鐵8帶動微溝槽中的小鐵塊7連同反應體系溶液1迅速移到3區(qū)進行退火，再移到4區(qū)進行延伸，延伸后迅速移到2區(qū)開始第二個循環(huán)，或先移到5區(qū)進行雜交反應后再移到2開始第二個循環(huán)；如此繼續(xù)循環(huán)過程，直到獲得所需結果。上述芯片采用液滴循環(huán)通過三個外部實現(xiàn)的恒溫區(qū)域來完成PCR過程，具有較多優(yōu)點。該微PCR芯片的不足之處在于1)不是基于硅微加工技術，與IC工藝不兼容，使得芯片需要較為復雜龐大的外部設備提供控制和通訊等，難以低成本大批量生產(chǎn)；2)結構尺寸大，完成PCR過程時間長；3)對同一陣列各通道內(nèi)的PCR操作需要具有相同的變性、退火和延伸溫度；4)難以實現(xiàn)自動控制，效率低。2001年，我國專利01103687.7提出了一種由MEMS工藝在硅基片上制作的微井式反應室、集成鉑電阻加熱子和溫度傳感器于一體，并且封裝在PCB板上構成的DNA-PCR生物芯片，采用硅微加工工藝實現(xiàn)，其示意圖如圖2所示。圖中9為微井式反應室，10為微溝槽，11為玻璃蓋片，12為進樣孔，13為氮化硅薄膜，14為集成于芯片的鉑電阻加熱子和溫度傳感器。它的工作原理是PCR反應溶液由進樣孔12經(jīng)微溝槽10進入微井式反應室9，在鉑電阻加熱子和溫度傳感器14以及外流體冷卻的作用下實現(xiàn)PCR過程的升降溫要求。該微PCR芯片的不足之處在于1)芯片接近密閉微腔，在PCR變性過程中，由于溫度接近工質沸點，容易產(chǎn)生氣泡而導致芯片結構毀壞；2)不是基于微流體技術，較難與其他微器件集成構成真正意義的芯片實驗室(Lab-on-Chip)；3)該芯片采用外流體(空氣)實現(xiàn)降溫過程，降溫速率較低。
本發(fā)明的特征在于它是一種以硅作基材且用硅微加工工藝制作的生物芯片，它含有一個直微槽，它使PCR混合液以液滴形式在它的槽中振蕩運動以實現(xiàn)PCR的變性、退火和延伸過程；恒溫區(qū)，它至少有兩個，它位于上述直微槽背面，各恒溫區(qū)之間用絕熱微槽彼此相隔開；電阻式微溫度傳感器，它位于上述恒溫區(qū)中心；微電加熱器它對稱地置于上述電阻式微溫度傳感器兩側。
試驗證明它適于硅微加工，與IC工藝兼容，具有成本低、體積小、速度快、性能好等優(yōu)點。
本實施例采用硅微加工方法對傳感器結構進行加工，基本加工過程如圖7所示，由于中心橫截面能夠完全說明加工過程，因此圖7中只完整地畫出了芯片中心橫截面的加工過程。
首先是在<100>硅片25上下表面用濕熱氧化方法形成一層厚為6000的二氧化硅層26，作為濕法腐蝕硅的掩膜(圖6-a)；然后通過光刻膠27保護，單面光刻形成制造加熱絲、溫度傳感器和電接觸片的窗口(圖6-b)；金屬化及剝離并生長電阻材料(Cr/Pt，28)形成加熱絲、溫度傳感器和電接觸片(圖6-c)；硅基另一面光刻去除二氧化硅形成濕法腐蝕開孔(圖6-d)；濕法腐蝕(EPW腐蝕液)形成微槽道(圖6-e)；漂去微槽道開口側硅基表面殘余二氧化硅(圖6-f)，并進行硅—玻璃鍵合(通道面與玻璃29鍵合)，形成玻璃載體與完整微槽道(圖6-g)；另一側硅基表面光刻去除二氧化硅形成濕法腐蝕開孔(圖6-h)；濕法腐蝕(EPW腐蝕液)形成隔熱槽(圖6-i)。
本發(fā)明的工作原理是基于液滴在具有三個恒溫區(qū)的微槽內(nèi)振蕩運動來實現(xiàn)PCR過程，但與國內(nèi)專利99114416.3不同的是本發(fā)明采用適合于硅微加工的方案，能夠實現(xiàn)低成本大批量生產(chǎn)，且與IC工藝兼容，可以將控制電路集成；芯片結構尺寸小，完成PCR過程的時間短；恒溫區(qū)與微槽集成在同一芯片上，可以根據(jù)PCR的需要調整同一陣列不同通道的控制溫度；能夠實現(xiàn)自動控制。與國內(nèi)專利01103687.7不同的是本發(fā)明采用新型的液滴微流體技術，不僅可以避免在變性階段可能出現(xiàn)的氣泡對芯片的毀壞，同時能夠與其他微流體器件集成，構成真正意義的芯片實驗室(Lab-on-Chip)；本發(fā)明通過PCR反應溶液連續(xù)經(jīng)過三個恒溫區(qū)來實現(xiàn)PCR過程溫度變化的要求，從而能夠實現(xiàn)遠大于微井式PCR芯片的升降溫速率。
本發(fā)明的特點和應用范圍1.采用硅微加工技術來制造，具有尺寸小，成本低，性能好的特點；2.采用液滴微流體技術，使液滴在具有三個恒溫區(qū)的微槽內(nèi)振蕩運動來實現(xiàn)PCR過程，升降溫速度快，樣品與反應物的消耗量??；3.恒溫區(qū)與微槽道集成在同一芯片上，可以根據(jù)PCR的需要調整同一陣列不同通道的控制溫度；4.本發(fā)明可以在不同的場合下應用，特別適合于高度自動化、快速、高通量要求下的臨床檢測。
權利要求
1.微液滴振蕩型硅槽式聚合酶鏈式反應生物芯片含有微反應器和恒溫區(qū)，其特征在于，它是一種以硅作基材且用硅微加工工藝制作的生物芯片，它含有一個直微槽它使PCR混合液以液滴形式在它的槽中振蕩運動以實現(xiàn)PCR的變性、退火和延伸過程；恒溫區(qū)它至少有兩個，它位于上述直微槽背面，各恒溫區(qū)之間用絕熱微槽彼此相隔開；電阻式微溫度傳感器它位于上述恒溫區(qū)中心；微電加熱器它對稱地置于上述電阻式微溫度傳感器兩側。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微液滴振蕩型硅槽式聚合酶鏈式反應生物芯片。包括微槽，以及微槽背面由絕熱槽隔開的恒溫區(qū)，在微槽背面的電阻式微溫度傳感器，對稱置于該溫度傳感器兩側的微加熱器。在生物基因組研究、法醫(yī)學、遺傳分析、治療效果評估和醫(yī)療診斷等領域中有廣泛應用。樣品與反應物以微液滴形式在具有三個恒溫區(qū)的槽中振蕩運動以實現(xiàn)聚合酶鏈式反應(PCR)的變性、退火和延伸過程，減小了生物芯片工作時所需要的驅動壓力，避免了可能產(chǎn)生的氣泡對芯片功能的影響；集成于芯片上的恒溫區(qū)有利于PCR反應混合物實現(xiàn)快速的升降溫過程，并便于改變工作區(qū)溫度以優(yōu)化PCR過程，或實現(xiàn)某些特殊要求；采用硅微加工技術制造，便于大批量生產(chǎn)，尺寸小，成本低。
文檔編號C12P19/34GK1477208SQ0313763
公開日2004年2月25日 申請日期2003年6月9日 優(yōu)先權日2003年6月9日
發(fā)明者李志信, 羅蓉, 王瑋, 呂樹海 申請人:清華大學, 中國電子科技集團公司第十三研究所