專利名稱：表達(dá)人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的酵母重組株及rhGM-CSF的純化方法
專利說明表達(dá)人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激 因子的酵母重組株及rhGM-CSF的純化方法 本發(fā)明涉及利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)或多肽藥物的領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及分泌型表達(dá)人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子重組載體、酵母重組工程菌株及rhGM-CSF的純化方法。目前，國內(nèi)生產(chǎn)的rhGM-CSF，多為大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物，存在主要工藝缺點是大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)為包含體型，生產(chǎn)過程中需要復(fù)性，復(fù)性率低，最高不超過40％，其中60％為非復(fù)性物，不能去除，因而比活性低(最高只有1.0×107單位/毫克蛋白)，副作用大；釀酒酵母工程菌株的表達(dá)屬非整合型表達(dá)，存在表達(dá)不穩(wěn)定、產(chǎn)物表達(dá)量較低和基因易丟失等缺陷。為了克服上述缺陷，本發(fā)明的目的是采用酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)取代大腸桿菌包涵體型表達(dá)系統(tǒng)，目標(biāo)蛋白rhGM-CSF不需要復(fù)性，大幅提高其生物比活性，減少副作用，降低生產(chǎn)成本。
分泌表達(dá)rhGM-CSF的酵母重組株的構(gòu)建方法為將克隆修飾的rhGM-CSF基因插入pGAPZα-A之GAP啟動子/α-factor信號肽下游位點，刪除Kex2(Lys-Arg)位點之后的Ste13位點(Glu-Ala-Glu-Ala)和啟始密碼子ATG，構(gòu)建成rhGM-CSF分泌型表達(dá)載體；利用澳大利亞Invitrogen公司的Pichia EasyComp Transformation Kit的方法作改進(jìn)，將rhGM-CSF分泌型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母(Pichia pastoris)的菌株GS115，構(gòu)建成分泌型表達(dá)rhGM-CSF的酵母重組工程菌株-rhGM-CSF/pGAPZα-A/GS115；通過抗生素篩選、SDS-PAGE分析及生物比活性測定，獲得目標(biāo)酵母重組工程菌株。
上述的酵母重組工程菌株目標(biāo)蛋白rhGM-CSF的表達(dá)量約占分泌總蛋白的50％，比活性為3.4×107單位/毫克蛋白左右；目標(biāo)蛋白rhGM-CSF具有與天然rhGM-CSF相同的免疫原性。本工程菌株接受外源基因是以整合于基因組形式，這與大腸桿菌、釀酒酵母的獨立染色體組外質(zhì)粒表達(dá)體系有顯著差別，故本工程菌株較大腸桿菌、釀酒酵母穩(wěn)定，不易發(fā)生外源基因丟失現(xiàn)象，以工程菌作為樣品模板，通過PCR、分子雜交等技術(shù)鑒定選擇出來的陽性菌株其準(zhǔn)確率達(dá)100％，且其目標(biāo)表達(dá)產(chǎn)物rhGM-CSF直接表達(dá)分泌在培養(yǎng)液中，因此檢測其蛋白表達(dá)量及目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性非常簡易，這較大腸桿菌表達(dá)體系表達(dá)產(chǎn)物需復(fù)性優(yōu)越得多；另外，酵母是一種簡單的真核生物，其表達(dá)后加工模式類似高等真核生物，故用它表達(dá)的基因產(chǎn)物不僅具有天然產(chǎn)物相同的生物活性，而且副作用低，產(chǎn)品成本低，適用性廣。
rhGM-CSF的純化方法為利用獲得的高產(chǎn)物表達(dá)量、高產(chǎn)物活性的酵母重組株進(jìn)行發(fā)酵，離心收集上清液，加硫酸銨，過Phenyl Sepharose柱層析，收集目標(biāo)洗脫峰，過DEAE Sepharose柱層析，收集目標(biāo)洗脫峰，過Sephacryl S-200柱層析，收集目標(biāo)峰，得到rhGM-CSF原液，純度大于95％，比活性大于3.4×107單位/毫克蛋白。
本發(fā)明提供的rhGM-CSF的純化方法，提高了GM-CSF蛋白質(zhì)的比活性，減少了分離純化步驟，降低了生產(chǎn)成本，減少了臨床副作用，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用將取得良好的經(jīng)濟(jì)效益。

圖1為rhGM-CSF酵母表達(dá)載體構(gòu)建圖譜。
pGAPZα-A/rhGM-CSF表達(dá)載體分子大小為3.534kb。其中pGAPZα-A為3.147kb，rhGM-CSF為387bp(包含終止密碼子3bp)；rhGM-CSF插入于載體pGAPZα-A第747bp(XhoI位點)與第824bp(XbaI位點)之間。
pGAPZα-A載體結(jié)構(gòu)為GAP啟動子區(qū)域第1-483bppGAP引物位點第455-476bpα-factor肽信號序列第493-759bpα-factor引物位點第696-716bp載體多克隆位點第760-828bpmyc抗原決定簇包第827-856bp多聚組氨酸包第872-889bp3’-AOX1引物位點第974-994bpAOX1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域第893-1233bpTEF1啟動子區(qū)域第1234-1644bp
EM7啟動子第1645-1712bpSh ble閱讀框第1713-2087bp(編碼zeocin抗性)CYC1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域第2088-2405bpColE1復(fù)制點(來源于pUC載體)第2416-3089bp圖2是GM-CSF的純化各步驟的SDS-PAGE電泳分析圖。圖中從左至右依次為泳道1-7，其中泳道1為發(fā)酵液表達(dá)量圖譜；泳道2為Phenyl Sepharose柱層析純化圖譜；泳道3為DEAE Sepharose柱層析純化圖譜；泳道4、5、7為Sephacryl S-200柱層析純化圖譜；泳道6為分子量標(biāo)記物圖譜。
圖3是GM-CSF原液純度鑒定圖譜。圖中從左至右依次為泳道1-7，其中泳道1為分子量標(biāo)記物圖譜；泳道2、4、6為GM-CSF原液還原電泳圖譜；泳道為3、5、7為GM-CSF非還原電泳圖譜。
圖4是GM-CSF原液純度鑒定圖譜，圖中從左至右依次為泳道1-10，其中泳道1、2、3、8、9、10為GM-CSF原液非還原電泳圖譜；泳道4、5、6為GM-CSF原液還原電泳圖譜；泳道7為分子量標(biāo)記物圖譜。
圖5是rhGM-CSF曲線圖以O(shè)D值為Y軸，以板上稀釋梯度對數(shù)為X軸，作標(biāo)準(zhǔn)品曲線和待檢品的量效關(guān)系圖，其結(jié)果比活性＝3.77×107u/mg。
圖6是rhGM-CSF曲線圖以O(shè)D值為Y軸，以板上稀釋梯度對數(shù)為X軸，作標(biāo)準(zhǔn)品曲線和待檢品的量效關(guān)系圖，其結(jié)果比活性＝3.81×107u/mg。
圖7是rhGM-CSF曲線圖以O(shè)D值為Y軸，以板上稀釋梯度對數(shù)為X軸，作標(biāo)準(zhǔn)品曲線和待檢品的量效關(guān)系圖，其結(jié)果比活性＝3.66×107u/mg。下面結(jié)合實施例詳細(xì)介紹本發(fā)明在rhGM-CSF重組酵母工程菌株的構(gòu)建和rhGM-CSF純化工藝中的具體應(yīng)用。
實施例1一、rhGM-CSF酵母工程菌的構(gòu)建(一)材料1.rhGM-CSF基因2.pGAPZα-A、P.pastoris Strain GS115(his4)購自澳大利亞Invitrogen公司。
(二)方法1.基因PCR擴(kuò)增(1)引物設(shè)計在5’端引物中刪除Kex2(Lys-Arg)位點之后的Ste13位點(Glu-Ala-Glu-Ala)和啟始密碼子ATG。
P1-5’GCTCGAGAAAAGAATGGCTCCAGCCCGT3’(“ATG”被刪除)XhoI Lys-Arg(Kex2位點)P2-5’GTCTAGATTACTCCTGGACTGGCTC3’XbaI(2)熱循環(huán)95℃，5’；95℃，30”→43℃，30”→72℃，40”；72℃，10’；擴(kuò)增30個循環(huán)。
2.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收與克隆(1)rhGM-CSF基因經(jīng)擴(kuò)增電泳后獲得約400bp的DNA帶；(2)用德國寶靈曼公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物高純度試劑盒回收目標(biāo)片段并進(jìn)行T-Vector克隆。
3.基因序列分析采用美國PE公司生產(chǎn)的ABI 377A DNA自動測序儀進(jìn)行DNA序列分析。
4.酵母分泌型表達(dá)載體構(gòu)建采用基因克隆技術(shù)將rhGM-CSF基因通過XhoI/XbaI插入pGAPZα-A之GAP啟動子/α-factor信號肽下游的XhoI/XbaI位點，構(gòu)建成含α-factor信號肽的分泌型酵母表達(dá)載體；表達(dá)載體轉(zhuǎn)化GS115(his4)利用澳大利亞Invitrogen公司生產(chǎn)的PichiaEasyComp Transformation Kit(Cat.No.K1730-01)經(jīng)稍作改進(jìn)的方法進(jìn)行。具體操作如下(1)挑取畢赤氏酵母(Pichia pastoris)GS115單菌落，在30℃，300轉(zhuǎn)/分鐘條件下以YPD+Zeocin100毫克/升培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)至OD600＝1.3-1.5；取0.2-0.3毫升菌液至20毫升同樣培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600＝6-8，取10ml培養(yǎng)液，以5000轉(zhuǎn)/分鐘、室溫離心5分鐘，去上清，用10毫升溶液I重懸，離心去上清，再用2毫升溶液I重懸，即制成感受態(tài)細(xì)胞；(2)取50微升感受態(tài)，加入5微升線性化的rhGM-CSF重組表達(dá)載體，再加1000毫升溶液II，混勻后30℃培養(yǎng)1小時，期間每隔15分鐘作一次振動混和處理；(3)42℃熱激處理10分鐘；(4)將培養(yǎng)物以5000轉(zhuǎn)/分鐘、室溫離心15分鐘，去上清，用500毫升溶液III重懸，離心去上清，再用150-200毫升溶液III重懸，涂布于YPD+Zeocin100毫克/升平板，30℃培養(yǎng)3-5天，直至產(chǎn)生單菌落。
5.高表達(dá)酵母工程菌株的篩選用Zeocin抗生素篩選獲得陽性菌株后，提取工程菌基因組DNA，進(jìn)一步以引物P1/P2作PCR分析和以德國寶靈公司生產(chǎn)的DiG Labelling and Detection Kit標(biāo)記rhGM-CSF基因之400bp DNA片段作為雜交探針，進(jìn)行Southern blotting等技術(shù)鑒定篩選出陽性菌株，再用SDS-PAGE銀染色電泳篩選高表達(dá)目標(biāo)蛋白的rhGM-CSF/pGAPZα-A/GS115工程菌株。
實施例2rhGM-CSF的純化方法1.菌種保存構(gòu)建高效表達(dá)rhGM-CSF酵母工程菌(rhGM-CSF/pGAPZα-A/GS115)后，-80℃保存菌種，或者脫脂奶冷凍干燥后密封保存。
2.菌種活化平板培養(yǎng)基配方(％)酵母粉1.0蛋白胨2.0葡萄糖2.0瓊脂2.0取一支菌種，挑菌液劃平板，然后30℃培養(yǎng)24小時3.一級種子液YPD培養(yǎng)基配方(％)酵母粉1.0蛋白胨2.0葡萄糖2.0在YPD培養(yǎng)基中加100mg/Lzeocin，然后取活化菌液按接種量1％接種，30℃培養(yǎng)12小時。
4.二級種子液YPD培養(yǎng)基配方(％)酵母粉1.0蛋白胨2.0葡萄糖2.0按接種量1％接種，30℃培養(yǎng)12小時。
5.發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基配方(％)酵母粉1.0 蛋白胨2.0 0.1N磷酸鉀沖液PH6.0YNB1.34生物素4×10-5甘油3.0其中YNB，生物素過濾除菌，發(fā)酵接種時加入發(fā)酵罐內(nèi)，其余培養(yǎng)基成分于發(fā)酵罐中121℃，20分鐘滅菌。
接種量8-10％培養(yǎng)條件30℃，PH6.0，DO＞30％，NBS發(fā)酵罐培養(yǎng)時間72小時PH調(diào)節(jié)5NNaOH調(diào)節(jié)PH6.0補(bǔ)料50％的甘油5.分離純化離心收集發(fā)酵上清液，按終濃度加20％硫酸銨，上Phenyl Sepharose柱，收集5％硫酸銨洗脫峰；經(jīng)三次25mMTris-HCl緩沖液攪拌透析，每次6h，然后，上DEAE Sepharose柱，收集0.4M NaCl洗脫峰；接著用截留分子量3000 Dalton的超濾器超濾濃縮，濃縮液蛋白濃度大于5mg/ml(lowry法)，過Sephacryl S-200柱層析，收集目標(biāo)蛋白峰，得到純度大于95％的rhGM-CSF原液，蛋白濃度大于500μg/ml，蛋白回收率為30％。
純度檢測法(1)SDS-PAGE銀染色電泳法，上樣量5μg，只有一個顯色斑點；(2)HPLC法，只有單一色譜峰。
生物活性檢測MTT法，比活性大于3.4×107單位/毫克蛋白。
rhGM-CSF活性檢測二、材料1、1640液RPMI1640(GIBCO產(chǎn)品)按說明書配制。
2、基本培養(yǎng)液1640液添加10％胎牛血清。
3、完全培養(yǎng)液基本培養(yǎng)液添加GM-CSF至終濃度4ng/ml。
4、MTT(噻唑蘭)Fluka產(chǎn)品，用磷酸鹽緩沖液配制成5.0mg/ml的溶液，過濾除菌后，4℃避光保存。
5、溶解液二甲基亞砜(分析純)6、標(biāo)準(zhǔn)品暫用美國先靈葆雅公司重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(生百能)替代。(標(biāo)示量50μg效價0.555×106μ/ml)7、TF-1細(xì)胞用完全培養(yǎng)液37℃5％CO2條件下培養(yǎng)，間隔48-72小時傳代。
三、方法操作(TF-1細(xì)胞增殖反應(yīng)/MTT比色法)1、TF-1細(xì)胞懸液的制備取生長良好的FT-1細(xì)胞，1000rpm離心10min，棄上清，沉淀細(xì)胞用培養(yǎng)液洗滌3次后，懸浮于基本培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為4×105個/ml，備用。
2、樣品的配制標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋將標(biāo)準(zhǔn)品用1640液稀釋成5×103倍，作為初始濃度。
待檢品的稀釋將待檢品用1640液稀釋成2×105倍，作為初始濃度。
3、活性檢測A、在96孔板上從第一排A→B向低濃度制備標(biāo)準(zhǔn)品和待檢品倍比稀釋梯度，每個樣品11個梯度，每個梯度2孔。每孔留50ml余液，第12排做空白對照組。
B、每孔加入細(xì)胞懸液50μl，置37℃5％CO2培養(yǎng)45小時。
C、每孔加入MTT20μl，置37℃，5％CO2培養(yǎng)4小時。
D、棄上清，每孔加入溶解液150μl，混勻后比色。設(shè)定波長492nm，測其OD值。
四、結(jié)果計算1、以O(shè)D值為Y軸，以板上稀釋梯度對數(shù)為X軸，作標(biāo)準(zhǔn)品曲線和待檢品的量效關(guān)系圖。
2、按取各樣品曲線在半效OD值處的稀釋梯度對數(shù)為該樣品值，用字母C表示。
3、公式待檢品效價＝標(biāo)準(zhǔn)品效價×2C1-C2×D1/D2其中C1為標(biāo)準(zhǔn)品C值C2為待檢品C值D1為待檢樣品預(yù)稀釋倍數(shù)D2為標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)，結(jié)果見附圖5、6、權(quán)利要求
1.一種表達(dá)重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的分泌型表達(dá)載體，其特征在于，該載體含有重組的rhGM-CSF序列，其被插入pGAPZα-A之GAP啟動子/α-factor信號肽下游位點，刪除Kex2(Lys-Arg)位點之后的Ste13位點(Glu-Ala-Glu-Ala)和啟始密碼子ATG，構(gòu)建成rhGM-CSF分泌型表達(dá)載體。
2.一種酵母重組菌株，其特征在于被權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酵母重組菌株，其特征在于所述的菌株為rhGM-CSF/pGAPZα-A/GS115。
4.一種rhGM-CSF的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵權(quán)利要求3所述的酵母重組菌株，收集其分泌產(chǎn)物。
5.一種rhGM-CSF的純化方法，其特征在于直接由分泌型rhGM-CSF酵母重組工程菌株(rhGM-CSF/pGAPZα-A/GS115)接種發(fā)酵，再從發(fā)酵液中分離純化rhGM-CSF離心收集發(fā)酵上清液，加硫酸銨，過Phenyl Sepharose柱層析，收集目標(biāo)洗脫峰，過DEAE Sepharose柱層析，收集目標(biāo)洗脫峰，過Sephacryl S-200柱層析，收集目標(biāo)峰，得到rhGM-CSF原液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM－CSF)的分泌型表達(dá)載體和一種簡易純化方法，用該分泌型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及用上述表達(dá)載體的畢赤氏酵母重組工程菌株發(fā)酵表達(dá)rhGM－CSF的方法。本發(fā)明采用酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)取代大腸桿菌包涵體表達(dá)系統(tǒng)，目標(biāo)蛋白rhGM－CSF不需要復(fù)性，其生物比活性可達(dá)到3.4×10
文檔編號C12N15/63GK1487086SQ0313720
公開日2004年4月7日 申請日期2003年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月26日
發(fā)明者梁國棟, 周鵬, 夏中寧, 蒲廣西, 陳海寧 申請人:海南國棟藥物研究所