專利名稱：Bex1和lmo2及snf5的相互作用及其對神經(jīng)元細(xì)胞的增殖影響的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為利用酵母雙雜交及共純化、免疫共沉淀等技術(shù)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了這三個蛋白間的相互作用，并通過Northern、原位雜交、轉(zhuǎn)染、激光共聚焦共定位技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、EMSA、等技術(shù)確定了SNF5通過BEX1影響LMO2在細(xì)胞中的功能，對于揭示神經(jīng)系統(tǒng)中海馬細(xì)胞增殖的分子生物學(xué)有重大意義，對短期記憶和學(xué)習(xí)的生理生化基礎(chǔ)是一個重大發(fā)現(xiàn)。同時，也為其可能的異常情況奠定了相對的基因治療理論基礎(chǔ)。本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)中新方法、新基因、新蛋白的開發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)是動物(人)最為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，而學(xué)習(xí)和記憶又是高等動物所特有的功能，這一功能的行使需要更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)來支持。海馬是短期記憶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其神經(jīng)元與腦內(nèi)其他部位的神經(jīng)元不同，具有不斷增殖和遷移的特征，而這一特征被認(rèn)為與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)。
BEX1是近年來發(fā)現(xiàn)的腦和睪丸特異表達(dá)，定位于Xq22染色體上的，124個氨基酸的小蛋白。其同家族成員有BEX3和BEX2。BEX3被認(rèn)為參與P75NTR及14-3-3的凋亡信號途徑，但BEX1與BEX3僅有18.65％的一致性。
LMO2是重要的原癌蛋白，其在白細(xì)胞中錯誤的表達(dá)可引起急性白血病。文獻(xiàn)表明，轉(zhuǎn)LMO2基因小鼠因此單一因素即導(dǎo)致白血病。LMO2還是實(shí)質(zhì)瘤發(fā)生的必須因素之一，因?yàn)長MO2對于血管內(nèi)皮的發(fā)生是必須的，因此，可作為腫瘤治療的靶蛋白，具有潛在的基因治療開發(fā)意義。LMO2在神經(jīng)系統(tǒng)特異的表達(dá)于海馬，但其在神經(jīng)系統(tǒng)的功能知之甚少。
SNF5又稱為INI1，BAF47，是SWI/SNF復(fù)合體的共有組分。SWI/SNF復(fù)合體是近年來的研究熱點(diǎn)之一，它可依賴水解ATP打開核小體八聚體。與其他的remodeling complex不同的是，這一復(fù)合體具有不確定性，即，它是根據(jù)“需要”的，由此，可使其他的蛋白發(fā)揮活性，如DNA的修復(fù)，或是轉(zhuǎn)錄等。SNF5被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合者，許多文獻(xiàn)表明，SNF5與一些轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子結(jié)合后，可促進(jìn)其功能。SNF5的缺失可導(dǎo)致兒童多發(fā)性腫瘤(MRT)因此許多文獻(xiàn)認(rèn)為其是抑癌基因。SNF5及SWI/SNF復(fù)合體的功能如今正被研究的日益深入，已經(jīng)在高等動物中發(fā)現(xiàn)了這一復(fù)合體的多個“版本”，而本發(fā)明即是發(fā)現(xiàn)了此復(fù)合體在人和小鼠的海馬神經(jīng)元中的一個新“版本”。
發(fā)明目的通過原位雜交發(fā)現(xiàn)了BEX1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的特異表達(dá)-以海馬最高；通過酵母雙雜找到了另一在海馬特異表達(dá)的基因LMO2。此外還發(fā)現(xiàn)了其上游作用分子SNF5，這對于闡明海馬--這一學(xué)習(xí)和短期記憶的重要物質(zhì)基礎(chǔ)--的分子機(jī)理有重大理論意義。
由于發(fā)現(xiàn)了BEX1的增殖作用，則其錯誤的表達(dá)很可能導(dǎo)致癌的發(fā)生。其三者(BEX1、LMO2、SNF5)的相互作用是海馬中特有和正常的，如其異常，亦可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。雖然目前尚無這類病例的發(fā)現(xiàn)，但一旦出現(xiàn)，可為其相映的基因治療提供靶向治療。
長遠(yuǎn)來看，這一發(fā)明對于闡明學(xué)習(xí)和記憶的分子基礎(chǔ)是一個嶄新的視角，可能具有潛在的巨大的研究和開發(fā)前景。
內(nèi)容與要求在高等哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)和短期記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)—海馬中發(fā)現(xiàn)了一個新的SWI/SNF復(fù)合體，這一復(fù)合體中含有BEX1和LMO2。而且，BEX1對于培養(yǎng)細(xì)胞有促進(jìn)增殖的功能。這一功能因它和LMO2這一重要的原癌蛋白的相互作用以及SNF5的促進(jìn)轉(zhuǎn)錄功能得以解釋。
這一發(fā)明涉及以下幾個實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.原位雜交對BEX1的表達(dá)部位的描述，2.Northern印記雜交對小鼠胚胎不同時期及成熟后的表達(dá)量的比較，3.BEX1對SNF5的pull-down，4.BEX1對LMO2的pull-down，5.BEX1和LMO2及SNF5的激光共聚焦亞細(xì)胞共定位。
6.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測S-phase increment，7.BEX1參與LMO2在EMSA中的超遷移分析，8.LMO2和SNF5在海馬細(xì)胞的免疫共沉淀。
以上所述及的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果也即本發(fā)明的技術(shù)指標(biāo)。


圖1.
BEX1與BEX3的序列比較，兩蛋白的一致性為18.6％圖2.
BEX1的全胚胎原位雜交左圖為正義探針雜交結(jié)果，為對照，右圖為反義探針雜交結(jié)果，可見BEX1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)，特別是前腦和側(cè)腦。在菱腦也有表達(dá)。
在脊髓有低量表達(dá)。
圖3.
BEX1的中樞神經(jīng)系統(tǒng)切片原位雜交a.b.海馬40倍，c.海馬100倍，d.頂葉皮層40倍，e.顳葉皮層40倍，f.橋腦面神經(jīng)核40倍，g.橋腦其他核團(tuán)40倍，h.小腦蒲肯野細(xì)胞40倍，i.頸髓前腳運(yùn)動神經(jīng)元，j.胸髓后腳神經(jīng)元圖4.
Northern印跡雜交泳道1、210天胚胎，3、412天胚胎，5、614天胚胎，7、816天胚胎，9成年鼠腦a.BEX1基因，b.LMO2基因，c.ACT-B基因圖5.
免疫熒光激光共聚焦共定位
a.BEX1的亞細(xì)胞定位b.LMO2的亞細(xì)胞定位c.重疊d.BEX1的亞細(xì)胞定位e.SNF5的亞細(xì)胞定位f.重疊圖6.
Pull-down分析SNF5與BEX1的相互作用CK0是M17細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體，CK1是細(xì)胞轉(zhuǎn)染SNF5-Myc，為分析非特異結(jié)合，空sephrose和GST-sephrose亦對轉(zhuǎn)染SNF5-Myc的細(xì)胞裂解液進(jìn)行Pull-down(CK2和CK3)。CK4為流過液，箭頭所指為SNF5-Myc。
圖7.
Pull-down分析BEX1與LMO2的相互作用CK1為sephrose4B-GST-hBEX1。因BEX1與LMO2的分子量大小相似，為分析是否交叉反應(yīng)造成假陽性而設(shè)此對照。CK2為空sephrose4B的Pull-down，CK3為sephrose4B-GST(CK3)的Pull-down，箭頭所指處為LMO2。
圖8.
EMSA分析BEX1是否參與了LMO2復(fù)合體的作用元件。
探針E1(tcg gcg cca ggt gct gcg tcc cga tag ggg ccg)由一個E-box和一個GATA-box組成所用于超遷移的抗體anti-LMO2 antiserum and anti-hBEX1 antiserum，此二者的抗體均為GST融合蛋白免疫新西蘭大白兔所得。
A為超遷移，B為核抽提物與探針形成的結(jié)合遷移，C為自由探針泳道3-7和11-15為冷探針競爭證明結(jié)合特異性泳道1，9(CK1)僅加入探針，泳道2，1O(CK2)加入探針和核抽提物作為對照。
圖9.
EMSA分析BEX1是否參與了LMO2復(fù)合體的作用元件。
探針E2(agc cga cca tct gtt cag gta aac aga tgg tcg aca)由兩個E-box組成。
其他同上。
圖10.
用原核表達(dá)的BEX1作為競爭物以表明anti-bex1抗體形成的超遷移的特異性。
探針為E2。
CK0為僅加探針，CK1為僅加探針和核抽提物，CK2為免疫前血清CK3為anti-LMO2
其他泳道的抗體均為anti-bex1圖11.
LMO2與SNF5的免疫共沉淀泳道1為anti-LMO2抗血清，泳道2為鼠海馬蛋白提取物，泳道3為流過液，泳道4為免疫共沉淀。沉淀用血清為自制新西蘭大白兔的anti-LMO2，所用檢測抗體為SANTA CRUTZ的商品化抗體(人與鼠)。
圖12。
培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染SNF5、BEX后的各細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)量。
所使用的細(xì)胞株為Hela和G-401。
Hela的BEX1表達(dá)量很低，而G-401是SNF5的缺失型細(xì)胞株各對照在圖旁有注。
實(shí)施例1.酵母雙雜交篩選與BEX1的相互作用蛋白將Hbex1構(gòu)建于Pas2-1中，轉(zhuǎn)化酵母Y190，測定自激活，而后將從CLONTECH公司購買的胎腦文庫(構(gòu)建于pACT2上)轉(zhuǎn)化含有BEX1的Y190酵母。
所得克隆經(jīng)β半乳糖苷酶活性的檢測后，其陽性克隆提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)測序確定讀碼框后再與誘餌蛋白共轉(zhuǎn)化SFY526以排除假陽性。在此中，即發(fā)現(xiàn)兩個克窿，其一編碼SNF5，另一個編碼LMO2。
2重組蛋白質(zhì)表達(dá)小量培養(yǎng)鑒定1)將經(jīng)鑒定的原核重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，涂布于含有相應(yīng)抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)10-16小時。
2)挑選4-6個單菌落分別接種到含抗生素的5ml LB管中，于37℃劇烈搖動培養(yǎng)8～12小時。
3)取上述培養(yǎng)物按1/20的比例接種到兩個含抗生素的5ml新鮮LB管中，37℃劇烈搖動培養(yǎng)1～1.5小時，使菌液的OD600nm達(dá)到0.6-0.8。
4)向上述其中一個轉(zhuǎn)接管中加入終濃度為0.1～1mmol/L的IPTG，37℃劇烈搖動，繼續(xù)培養(yǎng)3～4小時。另一管為不誘導(dǎo)對照。
5)分別用1.5ml離心管收集培養(yǎng)液各約1ml，12000rpm，離心30秒，收集菌體。
6)菌體沉淀以100μl 1×sample buffer重懸混勻，于100℃水浴煮沸10分鐘，SDS-PAGE上樣前12000rpm離心2分鐘。取10～20μl上清上樣，進(jìn)行12％SDS-PAGE。
7)按照分子克隆所述的方法(19)制備12％SDS-PAGE分離膠，混勻后，將其灌入預(yù)先制備好的制膠板內(nèi)(Bio-Rad公司的Mini-Cell制膠系統(tǒng))，室溫凝固45分鐘。制備5％SDS-PAGE濃縮膠。電泳首先以8V/cm進(jìn)行，待上樣緩沖液進(jìn)入分離膠后調(diào)整為15V/cm，電泳約2小時。
8)待溴酚藍(lán)即將出膠時，停止電泳。0.25％考馬斯亮藍(lán)R250染液染膠2h，脫色液(30％甲醇，10％乙酸)脫色至蛋白帶型清晰可見時，分析蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果，以表達(dá)量最高的陽性質(zhì)粒作為質(zhì)粒種子保存。
重組蛋白質(zhì)的大量表達(dá)1)自經(jīng)過鑒定的陽性質(zhì)粒保存板中挑單菌落加入100ml新鮮的含相應(yīng)抗生素的LB錐形瓶中。37℃劇烈搖動培養(yǎng)過夜。
2)將過夜菌液按1/20比例接種到500ml含相應(yīng)抗生素的LB錐形瓶中，37℃劇烈搖動培養(yǎng)，至菌液的OD600nm值達(dá)0.6-0.8。
3)加入適當(dāng)濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3-4小時。
4)收集培養(yǎng)液，5000rpm離心10分鐘，棄上清。PBS(138mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4)洗菌體沉淀。
5)按照5ml/g(約為菌液體積的1/25，即20ml)的量用PBS(或結(jié)合緩沖液，見3.1)重懸菌體沉淀，冰浴下以工作10秒/冷卻20秒/300W/25次的參數(shù)，超聲破碎細(xì)胞。12000rpm離心20分鐘，分別取少量上清(含可溶形式表達(dá)蛋白)和沉淀(含包涵體蛋白)，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析蛋白質(zhì)在胞內(nèi)表達(dá)形式。其余于-70℃凍存?zhèn)溆谩?br> *誘導(dǎo)條件，包括誘導(dǎo)時菌液濃度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度，需根據(jù)所表達(dá)的蛋白質(zhì)不同進(jìn)行優(yōu)化。
可溶形式GST融合蛋白的親和純化1)蛋白質(zhì)樣品的前期處理見2.2。超聲破菌離心后以0.45μm濾膜過濾上清。
2)輕混Glutathione Sepharose 4B樹脂，使其與保存液混勻呈完全懸浮狀態(tài)。吸取一定量樹脂(1ml沉積的樹脂可純化5mg目的蛋白質(zhì))懸液加到聚丙烯柱內(nèi)，使樹脂在重力作用下沉積。
3)以5倍柱體積的PBS洗柱。
4)上樣，使樣品靠重力緩慢流過柱子。
5)以30倍柱體積PBS淋洗。
6)加入1倍柱體積的GST洗脫緩沖液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/LGlutathione)，室溫孵育10min后，收集流出液，其中含有被純化蛋白質(zhì)。
7)重復(fù)步驟6)一次。
8)以5倍柱體積的PBS洗柱，再生柱子。
3.脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染法(LIPOFECTAMINETM2000 Reagent)1).轉(zhuǎn)染前一天，用胰蛋白酶進(jìn)行消化以收獲對數(shù)期生長的細(xì)胞，計數(shù)，以0.5-1.0×106重新接種于6孔板中培養(yǎng)過夜至細(xì)胞達(dá)到90-95％匯合時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
2).轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)基換成不含抗生素的培養(yǎng)基。
3).在兩個無菌的1.5ml離心管中各加入250μl不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)液。在其中一個加入1μg質(zhì)粒DNA，另一個加入3μl LIPOFECTAMINETM2000，單獨(dú)混勻后室溫放置約3分鐘后，將兩管溶液混合，室溫放置20分鐘。
4).將混合液加入培養(yǎng)板中的一個孔。37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)24-48hr。
*對不同的細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑的用量需進(jìn)行優(yōu)化。
4.GST Pull-Down實(shí)驗(yàn)1)在兩個平行裝有50μl Glutathione Sepharose 4B的柱中，分別加入GST-HSD-0.7(1.1nmol)和GST(1.3nmol)，并以10倍柱體積的PBS沖洗。
2)在兩個柱中各加入500μl睪丸提取液，孵育1h后，以50倍柱體積PBS-T(138mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4，0.05％Tween 20)沖洗。
3)以100μl GST Elution Buffer(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10mmol/L Glutathione)洗脫。
4)洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE，并以相應(yīng)抗體進(jìn)行Western印跡分析。
5.細(xì)胞免疫熒光(24)A.試劑濃酸濃硝酸∶濃鹽酸＝2∶1(V/V)4％多聚甲醛固定液60ml水中加入4g多聚甲醛，60～80℃水浴中滴加1mol/L的NaOH至溶解透明。待溶液冷卻至15℃時用HCl將pH調(diào)至7.0。最后用PBS補(bǔ)充至100ml。
透化液0.5％Triton/PBS封閉液3％BSA/PBS封片劑以預(yù)先配制的2％DABCO/PBS(Triethy lenediamine)制備90％的甘油II.實(shí)驗(yàn)步驟1).蓋玻片的處理將蓋玻片分次置入濃酸中浸泡2小時，用去離子水洗凈后室溫干燥。將經(jīng)酸處理過的蓋玻片投入十倍稀釋的多聚賴氨酸溶液中，室溫放置5min后取出于60℃干燥1hr或室溫過夜。用前將蓋玻片浸泡于75％乙醇中至少30min。
2).質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按方法18.3進(jìn)行。
3).細(xì)胞免疫熒光染色(1)細(xì)胞固定轉(zhuǎn)染后48hrs用PBS清洗細(xì)胞兩次，取出蓋玻片，用濾紙將殘留液體吸干，以4％多聚甲醛固定液室溫固定10～15min。
(2)PBS漂洗，3×5min。
(3)細(xì)胞透化室溫下，0.5％Triton/PBS透化處理10min。
(4)PBS漂洗，3×5min。
(5)細(xì)胞封閉以3％BSA/PBS封閉，37℃，30min或4℃過夜。
(6)一抗孵育在Parafilm膜上加入50μl以PBS按一定的稀釋度稀釋的一抗(如果進(jìn)行雙免疫熒光分析則同時加入兩種一抗)，將蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下伏于一抗上，密封于濕盒中，37℃，30min。
(7)PBS漂洗，3×5min。
(8)二抗孵育在Parafilm膜上加入50μl以PBS按1∶50稀釋的熒光素標(biāo)記的二抗(如果進(jìn)行雙免疫熒光分析則同時加入兩種二抗)，37℃，30min。
(9)PBS漂洗，3×5min。
(10)去離子水漂洗去鹽，2×5min。
(11)封片取10μl封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下封片，四周用指甲油封住。立刻用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。
6.免疫共沉淀I.試劑細(xì)胞裂解液20mmol/L HEPES(pH7.5) 150mmol/L NaCl1％NP40 1mmol/L EDTA100mmo/L NaF 10mmol/L焦磷酸鈉20mmol/L β-甘油磷酸鈉1mmol/L釩酸鈉*1mmol/L DTT*2mmol/L PMSF*10μg/ml Aprotinin**使用時新鮮加入I.實(shí)驗(yàn)步驟1).細(xì)胞的裂解 鼠拉頸處死開顱取海馬，加入5倍體積的冰預(yù)的裂解液，放置冰上勻漿裂解至細(xì)胞核破裂。其間追加一次PMSF，細(xì)胞裂解物于4℃14000rpm離心20min后收集上清凍存于-70℃。
3).免疫共沉淀1ml細(xì)胞裂解液中加入40μl 50％protein A agarose，4℃振搖3hrs以除去非特異吸附的蛋白質(zhì)。12000rpm離心20sec收集上清。將40μl anti-0.7的免疫兔血清加入上清中，4℃振搖1hr后再追加50μl50％protein A agarose，繼續(xù)振搖1hr。樣品經(jīng)上樣緩沖液處理，用抗SNF5的商品化抗體作為一抗，用堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗山羊抗體作為二抗進(jìn)行Western Blot檢測顯色。
7.RNA的制備和Northern印跡分析將受孕后不同天數(shù)的(10、12、14、16)孕鼠麻醉后剖腹取胚胎，以及將成年鼠引頸處死后取腦。將這些組織用Trizoil法提取總RNA，電泳后轉(zhuǎn)膜，紫外交聯(lián)。
以隨機(jī)引物法標(biāo)記的BEX1及LMO2 cDNA全長序列為探針，進(jìn)行Northern Blot雜交分析。同時，以哺乳動物組織恒定表達(dá)的β-actin基因?yàn)閷φ?，監(jiān)測所用RNA質(zhì)量及Northern Blot結(jié)果。
8.原位雜交原位雜交所用探針為小鼠BEX1基因序列中最為特異的一段，其序列為1 cactctctcc agcccgccat ccctaacgga ggcacctgtt cctggtggcg cagctcctgg61 tggcgcagag cacgcgggcc cgggcggcgc ggaaagcagc aggaggagga agagcggagc121 aggtctgaga agcagaagct tcgcggcgca cctggtggtg agcatctcta gaaagaggag181 aaggcaa具體方法見羅氏公司所引原位雜交試劑盒說明書。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及三個蛋白-BEX1，LMO2，及BEX1，SNF5之間的相互作用的發(fā)現(xiàn)以及BEX1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(特別是海馬)的分布，以及BEX1是使培養(yǎng)細(xì)胞增殖的重要因素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之三個蛋白BEX1、LMO2、SNF5之間的相互作用，其特征在于，這種相互作用是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中海馬神經(jīng)元細(xì)胞所特有的正常的相互作用，其中，BEX1是聯(lián)系LMO2和SNF5之間的中介分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述之BEX1，其特征在于，其表達(dá)部位在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一些特異的神經(jīng)元中，而以海馬最為特異。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述之BEX1，其特征在于，其在胚胎各時期表達(dá)教高，而在出生后表達(dá)量降低。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述之LMO2，其特征在于，其在胚胎各時期表達(dá)教高，而在出生后表達(dá)量降低。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述之BEX1，其特征在于，其單一因素可使培養(yǎng)細(xì)胞的S-期增多
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述之LMO2，其特征在于，LMO2基因是重要的原癌基因，在神經(jīng)系統(tǒng)中亦特異表達(dá)于海馬，在造血系統(tǒng)中，表達(dá)于低分化的白細(xì)胞。其在分化的白細(xì)胞中錯誤的表達(dá)可引起白血病，并且，其表達(dá)為實(shí)質(zhì)瘤血管內(nèi)皮形成所需，因此是潛在的基因治療的靶蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、6、7所述之BEX1，其錯誤的表達(dá)亦可能導(dǎo)致細(xì)胞的非正常增殖，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，因此是潛在的基因治療的靶蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、6、7、所述之BEX1與SNF5及BEX1與LMO2之間的相互作用，因其異?；蛞蛲蛔儗?dǎo)致相互作不能發(fā)生可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生，因此，這就為與此相關(guān)的疾病提供了理論依據(jù)和可能的治療方案。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述之BEX1，其可參與LMO2及其他蛋白與一定的DNA序列所形成的復(fù)合體并在凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)中與其相映的抗體形成超遷移帶。
全文摘要
本發(fā)明涉及三個蛋白－BEX1，LMO2，及BEX1，SNF5之間的相互作用的發(fā)現(xiàn)，以及發(fā)現(xiàn)BEX1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(特別是海馬)的分布。本研究還發(fā)現(xiàn)BEX1是使培養(yǎng)細(xì)胞增殖的重要因素。SNF5是活化染色質(zhì)的復(fù)合體核心成員，其與BEX1的相互作用理論上可促進(jìn)LMO2的功能。LMO2基因是重要的原癌基因其作用為維持細(xì)胞的幼稚性，在神經(jīng)系統(tǒng)中亦特異表達(dá)于海馬。海馬是短期記憶的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其細(xì)胞有終生維持增殖的特性。本發(fā)明的重要之處，(特征)既在于發(fā)現(xiàn)了在神經(jīng)系統(tǒng)中這三個蛋白的協(xié)同作用，這就為與次相關(guān)的疾病(例如BEX1錯誤的表達(dá)于其他的細(xì)胞引起腫瘤，或在海馬中低表達(dá)導(dǎo)致記憶缺陷)提供了理論依據(jù)和可能的治療方案。
文檔編號C12N15/63GK1548530SQ0313697
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月21日
發(fā)明者韓春雨, 劉瑾, 彭小忠, 袁建剛, 強(qiáng)伯勤 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所